CN109640959A - 靶向先天免疫系统以诱导长期耐受性及解决动脉粥样硬化中的巨噬细胞累积 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过杂化的纳米颗粒诱导长期耐受性的方法和组合物。本发明提供了包含杂化的纳米颗粒的组合物和制剂,所述杂化的纳米颗粒对先天免疫细胞具有固有的亲和力。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年4月29日提交的美国临时专利申请序列号62/329,676的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助R01HL118440、R01HL125703、R01CA155432、R01EB009638、K25EB016673和P30CA008748的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
本发明提供了通过杂化的纳米颗粒诱导长期耐受性的方法和组合物。本发明提供了包含杂化的纳米颗粒的组合物和制剂,所述杂化的纳米颗粒对先天免疫细胞具有固有的亲和力。
背景技术
无期限的同种异体移植物存活仍然是器官移植中难以实现的目标。移植需要抑制免疫系统以防止器官排斥。接受器官移植的患者通常接受免疫抑制药物混合物,包括但不限于皮质类固醇、他克莫司、环孢菌素和西罗莫司(雷帕霉素)1-3。这种免疫抑制疗法显著改善了器官移植的短期结果。然而,所有的免疫抑制剂都有严重的不良作用(例如感染)和相当大的代谢毒性4。因此,一直需要减少慢性免疫抑制治疗产生的毒性以及通过延期改善长期存活。尽管努力以较低毒性的方式使用目前可用的免疫抑制剂,但是没有替代方案能严重挑战这些药物几乎普遍的使用。
从历史角度,移植免疫学家试图通过靶向适应性免疫响应机制来开发新的耐受性方案。这种工作基于这样的观察,即T细胞是诱导同种异体移植物排斥必需的并且足以诱导同种异体移植物排斥。然而,在小鼠模型中实现的移植耐受性的诱导不能通过仅靶向适应性免疫的机制完全解释,例如缺失活化的T细胞5-7。我们对许多非特异性响应如何影响免疫活性的理解的最新进展揭示了先天免疫系统如何(a)对器官移植作出反应以及(b)严重影响诱导同种异体移植物耐受性的适应性免疫响应8-14。然而,先天免疫系统是一种潜在的体内治疗靶点,该靶点尚未在器官移植中成功探索。
雷帕霉素是移植中使用最广泛的免疫抑制药物之一。该药通过mTOR抑制来阻断T和B淋巴细胞激活,并有效地抑制T细胞增殖18。然而,使用该药伴有严重的副作用19,20,包括增加的易感性。
在目前的治疗中,同种异体移植物存活需要免疫抑制药物的混合物。靶向先天免疫系统的实验性抗体已经显示出诱导长期耐受性,具有严重的副作用。
因此,需要能够调节先天免疫系统并诱导长期耐受性而几乎没有副作用的治疗剂。
世界上,动脉粥样硬化是导致死亡和残疾的主要原因之一。动脉粥样硬化包括在动脉腔表面上沉积脂肪斑块,进而造成狭窄,即动脉变窄。最终,这种沉积阻断了病变远端的血流,引起缺血性损伤。
仍然需要开发用于动脉粥样硬化的更有效的治疗剂和靶向斑块炎症的新型治疗剂。
发明内容
本公开内容包括在患者中延长同种异体移植物存活的方法,该方法包括将有效量的本发明的组合物施用于有此需要的患者。
本公开内容提供了在患者中降低中树突细胞刺激能力的方法,包括将有效量的本发明的组合物施用于有此需要的患者。
本公开内容提供了在患者中促进调节性巨噬细胞增长(development)的方法,包括将有效量的本发明的组合物施用于有此需要的患者。
本公开内容提供了在患者中诱导移植耐受性的方法,包括将有效量的本发明的组合物施用于有此需要的患者。
本公开内容提供在患者中靶向骨髓细胞的方法,包括将有效量的本发明的组合物施用于有此需要的患者,其中mTOR-HDL降低患者循环中的Mo/MΦ数。
在某些实施例中,本发明的组合物特异性靶向骨髓细胞。
在某些实施例中,患者已经历移植并且移植的组织是肺组织、心脏组织、肾组织、肝组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、肌腱组织、骨髓或血管组织。在某些实施例中,移植的组织是完整的器官。
在某些实施例中,患者已接受同种异体(allogeneic)组织或器官移植。在某些实施例中,本发明的方法在进行同种异体组织或器官移植之前进行。在某些实施例中,该方法与同种异体组织或器官移植一起进行。在某些实施例中,该方法在同种异体组织或器官移植后至少两周内进行。
在某些实施例中,受试者(subject)或患者是人。
在某些实施例中,组合物通过静脉内或动脉内施用。
在某些实施例中,本发明的方法还包括向患者施用一种或多种免疫抑制剂,例如环孢菌素A或FK506。
本公开内容提供了一种诱导免疫耐受性的方法,包括向患者施用有效量的(i)包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂,以及任选地(ii)包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。在某些实施例中,mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。在某些实施例中,CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒。
在某些实施例中,该施用促进Ly-6Clo Mo/MΦ增长。
在某些实施例中,患者患有选自以下组成的组的自身免疫疾病:乳糜泻、I型糖尿病、多发性硬化症、甲状腺炎、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、硬皮病、牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、秃头症、强直性脊柱炎、Churg-Strauss综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、白塞病综合征、克罗恩病、皮肌炎,肾小球性肾炎、格林-巴利综合征、肠易激综合征(IBD)、狼疮性肾炎、重症肌无力、心肌炎、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、风湿热、结节病、干燥综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
在某些实施例中,患者易患或患有动脉粥样硬化疾病,包括:冠状动脉粥样硬化、糖尿病性动脉粥样硬化、动脉粥样硬化后遗症,例如急性冠脉综合征、心肌梗死、心绞痛、周围性血管疾病、间歇性跛行、心肌缺血、中风、心力衰竭及其组合。
本公开内容提供了一种治疗动脉粥样硬化的方法,该方法包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。在某些实施例中,CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒。
在某些实施例中,本发明的方法还包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂。在某些实施例中,mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。在某些实施例中,HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(1-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-phosphocholine)(MHPC),并且还包含ApoA-I。
在某些实施例中,动脉粥样硬化包括:冠状动脉粥样硬化、糖尿病性动脉粥样硬化、动脉粥样硬化后遗症,例如急性冠脉综合征、心肌梗死、心绞痛、周围性血管疾病、间歇性跛行、心肌缺血、中风、心力衰竭及其组合。
本公开内容提供了一种靶向斑块或血管炎性部位中的巨噬细胞和/或单核细胞的方法,该方法包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。在某些实施例中,CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒。
在某些实施例中,本发明的方法还包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂。在某些实施例中,mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。在某些实施例中,HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
本公开内容提供了一种用于预防器官或组织排斥的方法,该方法包括向有此需要的患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物的步骤,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂。在某些实施例中,mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。在某些实施例中,HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
在某些实施例中,患者已经历器官或组织移植,并且移植的组织是肺组织、心脏组织、肾组织、肝组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、肌腱组织、骨髓或血管组织。
在某些实施例中,组合物通过静脉内或动脉内施用。
在某些实施例中,本发明的方法还包括向患者施用一种或多种免疫抑制剂。
本公开内容还包括一种用于减缓动脉粥样硬化进展的方法,该方法包括向有此需要的患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物的步骤,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。在某些实施例中,CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒。在某些实施例中,HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
本公开内容提供了一种包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂。在某些实施例中,HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。在某些实施例中,DMPC与MHPC的重量比为约3:1。在某些实施例中,mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL或雷帕霉素-HDL)。
在某些实施例中,药物组合物还包含一种或多种免疫抑制剂或抗炎剂。在某些实施例中,免疫抑制剂是环孢菌素A或FK506。
本公开内容还包括一种包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。在某些实施例中,HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。在某些实施例中,DMPC与MHPC的重量比为约8:1至约9:1。在某些实施例中,CD40-TRAF6抑制剂是6877002,或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒。
本公开内容还提供了一种药物组合物,其包含a)药学有效量的本发明组合物,和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
本公开内容提供了一种药物组合物,其包含a)包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,和b)包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。
本公开内容提供了一种包含本发明的组合物的试剂盒。在某些实施例中,m-TOR抑制剂是雷帕霉素。在某些实施例中,试剂盒还包含一种或多种免疫抑制剂,例如环孢菌素A、FK506或雷帕霉素。在某些实施例中,CD40-TRAF6抑制剂是6877002。
本公开内容提供了包含mTOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)以及任选地(ii)包含CD40-TRAF6抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)在制备用于诱导免疫耐受性的组合物中的用途。
本公开内容提供了包含CD40-TRAF6抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)在制备用于治疗动脉粥样硬化的组合物中的用途。
本公开内容提供了包含CD40-TRAF6抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)在制备用于靶向斑块或血管炎性部位中的巨噬细胞和/或单核细胞的组合物中的用途。
本公开内容提供了包含mTOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)在制备用于预防器官或组织排斥的组合物中的用途。
本公开内容提供了包含CD40-TRAF6抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)在制备用于减缓动脉粥样硬化进展的组合物中的用途。
本公开内容提供了本发明的纳米颗粒在制备用于在有此需要的患者中延长同种异体移植物存活的组合物中的用途。
本公开内容提供了本发明的纳米颗粒在制备用于在有此需要的患者中降低树突细胞刺激能力的组合物中的用途。
本公开内容提供了本发明的纳米颗粒在制备用于在有此需要的患者中促进调节性巨噬细胞生长的组合物中的用途。
本公开内容提供了本发明的纳米颗粒在制备用于在有此需要的患者中诱导移植耐受性的组合物中的用途。
本公开内容提供了本发明的纳米颗粒在制备用于在有此需要的患者中靶向骨髓细胞的组合物中的用途。在某些实施例中,mTOR-HDL降低患者循环中的Mo/MΦ数。
附图说明
图1A-G显示了mTOR-HDL纳米免疫疗法、同种异体移植物模型、生物分布和免疫细胞靶向的概览。图1A显示了由磷脂、人APOA1和雷帕霉素合成的mTOR-HDL纳米颗粒具有盘状形状,如通过透射电子显微镜(TEM)评估的,并且它们可以用89Zr放射标记。图1B显示了BALB/c供体心脏(H2d)移植到接受mTOR纳米免疫疗法的完全同种异体C57BL/6受体(H2b)中,对C57BL/6受体进行放射标记用于PET成像和生物分布,或荧光标记用于先天和适应性免疫系统的细胞亚群的分布。图1C是小鼠静脉内施用89Zr放射标记的mTOR-HDL(89Zr-mTOR-HDL)24小时后代表性的micro-PET/CT 3D融合图像。CT图像用作解剖学参考以创建感兴趣的区域来确定移植心脏中的放射性浓度(3D影像提供为S2A)。图1D是放射性计数图,显示了注射后24小时89Zr-mTOR-HDL在感兴趣的组织(肾脏、肝脏、脾脏、血液、骨、皮肤和肌肉)中的生物分布。放射性含量表示为%注射剂量/每克组织(%ID/g)。误差棒是平均值的标准误差(standard error of the mean,SEM),n=3。图1E是放射自显影确定的在相同的受体中静脉内施用89Zr-mTOR-HDL 24小时后,在天然(N)和移植心脏(Tx)中的放射性示踪剂分布。使用Image J软件进行定量。误差棒是标准偏差(SD),n=3。图1F是用于区分血液、脾脏和移植心脏中的骨髓细胞的流式细胞术设门(gating)策略的图示。灰色直方图显示与对照(黑色直方图)相比,在注射DiO标记的mTOR-HDL的小鼠中免疫细胞的分布。图1G示出了血液、脾脏和移植心脏中嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、Ly-6Clo和Ly-6Chi单核细胞/巨噬细胞、树突细胞和T细胞的平均荧光强度(MFI)。误差棒是平均值的标准误差(SEM),n=4;ANOVA*P≤0.05;**P≤0.01。
图2A-C显示了mTOR-HDL纳米免疫疗法重新平衡先天免疫系统。图2A显示了移植物浸润白细胞(graft-infiltrating leukocytes)、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞的总数。示出了移植后第6天,安慰剂、口服-Ra和mTOR-HDL处理的受体的移植心脏中不同细胞亚群的流式细胞术分析(ANOVA*P≤0.05;**P≤0.01)。图2B显示了来自安慰剂、口服-Ra和mTOR-HDL处理的受体的移植心脏中Ly-6Chi vs.Ly-6Clo巨噬细胞的频率。数据代表平均值±SEM;每组n=4;ANOVA*P≤0.05;**P≤0.01。图2C显示了GSEA基因阵列分析的图像。结果表明来自mTOR-HDL处理的受体的Ly-6Clo移植物内巨噬细胞中mTOR途径下调。显示了来自所选基因的GSEA数据的热图,所述基因在Ly-6Clo巨噬细胞中达到p<0.05,所述巨噬细胞来自移植后第6天mTOR-HDL处理的受体的同种异体移植物(每组n=3的平均值)。
图3A-G显示了HDL纳米免疫疗法诱导调节性巨噬细胞累积并促进移植物接受。图3A显示了移植后第6天来自安慰剂和mTOR-HDL处理的小鼠的移植物浸润Ly-6Clo和Ly-6ChiMΦ和Ly-6G嗜中性粒细胞的功能表征。代表性和定量流式细胞术结果表明了来自安慰剂和mTOR-HDL处理的同种异体移植物受体的CD45+CD11b+同种异体移植物、骨髓细胞亚群中的Ly-6C和Ly-6G表达(顶部)。测量了来自安慰剂和mTOR-HDL处理的小鼠的移植物浸润性Ly-6Clo MΦ的体外抑制能力。显示了CFSE CD8+T细胞定量的流式细胞术结果,以及72小时后通过CSFE稀释测量细胞增殖百分比(中间)。评估了来自安慰剂和mTOR-HDL处理的小鼠的移植物浸润性Ly-6Clo MΦ的体外T-reg扩增能力。流式细胞术分析表明共培养72小时后CD4+T细胞上Foxp3表达的百分比(底部)。数据显示为平均值±SEM;每组n=4;t检验**P≤0.01。图3B显示了来自安慰剂和mTOR-HDL处理的同种异体移植物受体的移植物浸润性CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞的百分比。数据显示为平均值±SEM;每组n=4;t检验**P≤0.01。图3C的散点图和图表显示了移植后第6天来自mTOR-HDL处理的小鼠在Ly-6Clo MΦ消耗(depletion)后移植物浸润性Ly-6Clo和Ly-6Chi MΦ和Ly-6G嗜中性粒细胞的表型特征。接受DT用于Ly-6CloMΦ消耗的mTOR-HDL处理的CD169-DTR受体的移植物浸润CD45+CD11b+骨髓细胞亚群的代表性和定量流式细胞术结果。数据显示为平均值±SEM;每组n=4;t检验**P≤0.01。图3D的Kaplan-Meier曲线显示了在mTOR-HDL处理的受体中Ly-6Clo巨噬细胞消耗后的移植物存活。结果表明野生型单核细胞的过继转移在mTOR-HDL处理的巨噬细胞消耗的受体中恢复耐受性(每组n=4只小鼠;Kaplan-Meier**P≤0.01)。图3E的箱形图是从安慰剂和mTOR-HDL处理的受体的同种异体移植物获得的Ly-6Clo巨噬细胞中CD40表达的基因阵列(每组n=3的平均值;t-检验**P≤0.01)。图3F的Kaplan-Meier曲线显示了在有或没有TRAF6i-HDL纳米免疫疗法的情况下体内接受激动刺激性CD40mAb的mTOR-HDL受体的移植物存活(每组n=5只小鼠;Kaplan-Meier**P≤0.01)。图3G的Kaplan-Meier曲线显示了安慰剂、口服-Ra、mTOR-HDL和mTOR-HDL/TRAF6i-HDL联合治疗的移植物存活曲线(每组n=8只小鼠,Kaplan-Meier生存分析;P≤0.001安慰剂相对于mTOR-HDL,P≤0.01口服-Ra相对于mTOR-HDL,P≤0.01TRAF6i-HDL相对于mTOR-HDL/TRAF6i-HDL,P≤0.01mTOR-HDL相对于mTOR-HDL/TRAF6i-HDL)。
图4的透射电子显微图像显示了盘状形态的mTOR-HDL。
图5A-C显示了C57/B16野生型小鼠中的生理性生物分布和mTOR-HDL靶向。图5A显示了在移植前24小时注射PBS对照(第一排器官)或DiR标记的mTOR-HDL的器官的代表性近红外荧光图像(NIRF),显示了在肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏和肌肉中累积。右边具有误差棒的图表明每个器官中对照相对于mTOR-HDL-DiR累积比率,通过除以对照和mTOR-HDL-DiR组中每个器官的总信号计算。误差棒是平均值的标准误差(SEM),n=4;*P≤0.05;**P≤0.01,***P≤0.001。图5B显示了血液和脾脏中骨髓细胞分布。灰色直方图(右)表示与对照动物中的分布(黑色直方图)相比,在注射DiO标记的mTOR-HDL的小鼠中的分布。图5C显示了血液和脾脏中嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞库、Ly-6Clo/Ly-6Chi单核细胞和树突细胞的平均荧光强度(MFI)。误差棒是平均值的标准误差(SEM),n=4;*P≤0.05;**P≤0.01。
图6显示了根据移植的心脏、肾脏、肝脏和脾脏(n=3)中的平均%ID/g的PET定量摄取值。
图7A-B的图和流式细胞术图像显示了mTOR-HDL纳米免疫疗法不靶向T淋巴细胞。图7A的散点图显示了用于区分血液和移植心脏中的T细胞的流式细胞术设门(gating)策略。灰色直方图(右)显示了与对照动物中的分布(黑色直方图)相比,在注射DiO标记的mTOR-HDL的小鼠中的T细胞分布。图7B显示了血液和移植心脏中单核细胞/巨噬细胞、CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞的平均荧光强度(MFI)。误差棒是平均值的标准误差(SEM),n=4;**P≤0.01;***P≤0.001。
图8显示了在移植后第6天从安慰剂、口服-Ra和mTOR-HDL处理的同种异体移植物受体的血液和脾中回收的细胞悬浮液的流式细胞术分析。数据显示为平均值±SEM;每组n=4;*P≤0.05;**P≤0.01。
图9A-B的图表涉及来自安慰剂、口服-Ra和mTOR-HDL处理的同种异体移植物受体的血液和脾脏中Ly-6Chi相对于Ly-6Clo单核细胞的频率。图9B显示了安慰剂、口服-Ra和mTOR-HDL处理的同种异体移植物受体的血液、脾脏和移植心脏中Ly-6Chi对Ly-6Clo单核细胞的比率。数据显示为平均值±SEM;每组n=4;*P≤0.05;**P≤0.01。
图10显示了移植后第6天来自安慰剂、口服-Ra和mTOR-HDL处理的同种异体移植物受体的血清中的TNF-α分泌,通过ELISA分析。
图11A-B的透射电子显微图像显示了盘状形态的TRAF6i-HDL。纳米颗粒的平均流体力学半径为19.2±3.1nm,药物掺入效率为84.6±8.6%,分别通过DLS和HPLC测定。图11B显示了当颗粒堆叠形成时可以辨别TRAF6i-HDL颗粒的圆盘形状,而当从顶部向下观察颗粒时可以评估纳米颗粒的尺寸。
图12A-B的图像和Kaplan-Meier曲线显示了mTOR-HDL纳米免疫疗法显著延长皮肤同种异体移植物存活。图12A显示了在移植后的不同时间点对照和mTOR-HDL处理的小鼠中皮肤同种异体移植物排斥,用数码相机的显微镜记录。图12B是皮肤同种异体移植物的Kaplan-Meier曲线(每组n=4只小鼠,安慰剂和mTOR-HDL之间P≤0.01)。
图13A-B显示了肾脏和肝脏图像(图13A)和心脏免疫组织化学(IHC)(图13B)用于毒性评估。苏木精/伊红(H&E)、过碘酸希夫(PAS)和Masson三色(Masson)染色的IHC的肾脏和肝脏代表性图像未显示出毒性迹象。在移植第100天后收集来自mTor/TRAF6i-HDL处理的受体的肾脏和肝脏(n=4;放大倍数×200)。在图13B中,H&E和天狼星红染色的IHC的代表性图像未显示慢性移植物血管病(CAV)的迹象。在移植第100天后收集来自mTor-HDL/TRAFi-HDL处理的受体的心脏同种异体移植物(n=4;放大倍数×200)。对于图13B,慢性移植物血管病分析,这些切片显示出轻度周围炎症而无动脉炎,并且没有内膜增生的迹象。小鼠主动脉节段没有表现出任何组织学改变,也没有内膜增厚和CAV迹象。
图14A-G的图像、示意图和图表显示了TRAF6i-HDL纳米颗粒生物分布和摄取。8周龄Apoe-/-小鼠喂食高胆固醇饮食12周,然后静脉注射89Zr-、DiR-或DiO-标记的TRAF6i-HDL纳米颗粒。24小时后,小鼠用于PET/CT成像或处死小鼠用于离体NIRF成像或流式细胞术分析。图14A是TRAF6i-HDL的示意图,其通过结合人apoA-I、脂质(DMPC和MHPC)和CD40-TRAF6相互作用的小分子抑制剂而产生。图14B的研究概述显示了为研究TRAF6i-HDL而采取的后续步骤。图14C显示了89Zr标记的TRAF6i-HDL在Apoe-/-小鼠中的药代动力学,显示了施用后24小时的血液衰减曲线(左图)和全身3D渲染的PET/CT融合图像(右图),表明肝脏、脾脏和肾脏中摄取量最高。图14D是施用后24小时89Zr标记的TRAF6i-HDL分布的γ计数图。主动脉的放射自显影显示了主动脉根部中可见的TRAF6i-HDL累积,主动脉根部是小鼠模型中动脉粥样硬化发展的优先位置。图14E显示了在小鼠主动脉(n=2)中DiR标记的TRAF6i-HDL分布的NIRF成像,相应的图表显示了TRAF6i-HDL在主动脉根部区域中的累积。图14F是DiO标记的TRAF6i-HDL的整个小鼠主动脉(n=8)的流式细胞术数据,显示了巨噬细胞和Ly6Chi单核细胞的高靶向效率,而谱系阳性CD11b阴性细胞不摄取纳米颗粒。***p<0.001。图14G是骨髓、血液、脾脏和主动脉细胞的流式细胞术分析图像,表明Ly6Chi单核细胞和巨噬细胞摄取DiO标记的TRAF6i-HDL。嗜中性粒细胞、Ly6Clo单核细胞和树突细胞也摄取DiO-TRAF6i-HDL,而谱系阳性细胞(所有非骨髓细胞)则不摄取。误差棒代表平均值的标准误差。
图15A-B表明了TRAF6i-HDL治疗减少斑块巨噬细胞含量(通过组织学评估)。8周龄Apoe-/-小鼠喂食高胆固醇饮食12周,随后在7天过程中接受4次静脉注射PBS(n=10)、rHDL(n=10)或TRAF6i-HDL(n=10)处理。最后一次注射后24小时,将主动脉根部切片(4μM)并用免疫组织化学方法染色。图15A是主动脉根部的图像和图表,显示了处理组之间的斑块大小(H&E)、胶原蛋白含量(天狼猩红)或增殖细胞数(Ki67染色)没有差异。图15B的图像和图表显示了主动脉根部的Mac3染色,表明巨噬细胞阳性面积明显降低以及降低的巨噬细胞对胶原蛋白的比率。**p<0.01,***p<0.001。
图16A-E显示了由于Ly6Chi单核细胞募集受损,TRAF6i-HDL减少斑块炎症。8周龄Apoe-/-小鼠喂食高胆固醇饮食12周,并在一周内四次静脉注射安慰剂(PBS)、rHDL或TRAF6i-HDL来处理。图16A的FMT/CT成像表明与安慰剂(n=8)处理组相比,TRAF6i-HDL处理组(n=7)中主动脉根部的蛋白酶活性显著降低。图16B是整个主动脉的流式细胞术分析图像,表明与安慰剂(n=27)和rHDL(n=26)相比,TRAF6i-HDL(n=27)处理组中巨噬细胞数量显著减少。在TRAF6i-HDL组中Ly6Chi单核细胞也显著减少的事实表明Ly6Chi单核细胞募集受损。图16C是骨髓、血液和脾脏的流式细胞术分析的图像和图表,表明斑块Ly6Chi单核细胞含量的降低不能归因于Ly6Chi单核细胞的全身性降低。图16D是体内BrdU掺入实验的图像,表明TRAF6i-HDL对斑块巨噬细胞增殖没有影响。图16E是用安慰剂、rHDL、TRAF6i-HDL、裸CD40-TRAF6小分子抑制剂或rHDL+裸CD40-TRAF6小分子抑制剂的组合处理24小时的RAW264.7巨噬细胞中BrdU掺入的体外实验(n=3)的图,表明对巨噬细胞增殖没有影响。**p<0.01,***p<0.001。
图17A-D反映了来自斑块单核细胞/巨噬细胞的全转录组分析的数据,表明了TRAF6i处理对细胞迁移的影响,以及其他受影响的过程。8周龄ApoE-/-小鼠喂食高胆固醇饮食12周,然后在7天内4次静脉注射安慰剂(n=10)或TRAF6i-HDL(n=10)处理。在最后一次注射后24小时,处死小鼠并通过激光捕获显微切割将主动脉根部的冷冻切片用于分离斑块巨噬细胞,然后进行RNA分离和测序。图17A的火山图显示了斑块单核细胞/巨噬细胞中差异表达的(DE)基因的分布。图17B显示了根据FDR阈值0.2的截止值明显上调和下调的基因的总数。FDR<0.2对应于p值<0.009。图17C显示了基因本体(GO)数据库中DE基因集的基因富集分析,显示了显著富集DE基因的15个GO术语(补充表3)。图17D是巨噬细胞的示意图,显示了两个明显改变的途径(粘着斑(focal adhesion)和内吞作用),通过将416个DE基因用京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(KEGG)通路工具进行作图而鉴定。还描述了8个最显著的DE基因,FDR<0.05,并且它们位于细胞内(深黑色基因上调,浅灰色基因下调,基因列于图23-24)。
图18A-C表明了TRAF6i-HDL治疗在非人灵长类动物中未显示毒性作用。6只非人灵长类动物输注安慰剂(n=3)或1.25mg/kg TRAF6i-HDL(n=3)。在多个时间点收集血液,并在输注后72小时处死动物。图18A是全血计数的图,表明TRAF6i-HDL治疗对淋巴细胞、红细胞和血小板没有影响。图18B是广泛的血液化学分析图,表明TRAF6i-HDL输注对肝脏、肾脏、胰腺或肌肉细胞生物标志物没有毒性作用。脂质、葡萄糖、蛋白质(白蛋白和球蛋白)和电解质也不受影响。图18C是来自肝脏、肾脏和脾脏的样品的图像,其被切片并染色(H&E)用于组织学分析并由病理学家评估。在任何组织中均未发现组织损伤或组织结构紊乱的迹象。
图19A-D显示了非人灵长类动物中TRAF6i-HDL的生物分布。6只非人灵长类动物输注89Zr标记的TRAF6i-HDL(1.25mg/kg)。输注后60分钟内获得动态PET图像。在24、48和72小时进行静态PET/MRI扫描。72小时后处死NHP。收集器官用于离体分析。图19A是1、5、15、30和60分钟的动态PET图像。将图像分开以分别可视化肝脏和其他器官。该图显示了在不同时间点代表性的器官中的量化摄取。右侧的旋转图像显示了60分钟时分布的3D表示。图19B是在24、48和72小时另外的静态PET/MR图像,显示了TRAF6i-HDL的分布和累积。该图显示了在不同时间点代表性的器官中的量化摄取。图19C包括反映89Zr-TRAF6i-HDL施用后24和72小时NHP中γ计数分布的图表和图像。图19D显示了89Zr-TRAF6i-HDL在NHP中的血液时间-活性曲线。
图20的表显示了安慰剂、HDL和TRAF6i-HDL处理的Apoe-/-小鼠的全血细胞计数值。用Kruskal Wallis检验计算P值。
图21的表显示了安慰剂和TRAF6i-HDL处理的Apoe-/-小鼠的血液化学值。通过MannWhitney U检验计算P值。除了碱性磷酸酶轻微增加外,在任何组之间没有观察到显著差异。
图22的表格显示了基因本体术语中基因的差异表达。通过激光捕获显微切割分离来自Apoe-/-小鼠主动脉窦斑块的CD68阳性细胞。15个GO术语显示了富集差异表达的基因。P值显示为调整的p值。
图23的表显示了在两种主要鉴定的KEGG通路中基因的差异表达。通过激光捕获显微切割分离来自Apoe-/-小鼠主动脉窦斑块的CD68阳性细胞。在安慰剂和TRAF6i-HDL处理的Apoe-/-小鼠之间,两种显著的KEGG通路(粘着斑和内吞作用)中基因的差异表达。P值显示为未调整的p值。
图24的表显示了基因的差异表达,FDR<0.05。通过激光捕获显微切割分离来自Apoe-/-小鼠主动脉窦斑块的CD68阳性细胞。显示了安慰剂和TRAF6i-HDL处理的Apoe-/-小鼠之间基因的差异表达。P值显示为调整的p值。
图25的表显示了参与增殖、细胞凋亡和迁移运出(migratory egress)的基因的差异表达。通过激光捕获显微切割分离来自Apoe-/-小鼠主动脉窦斑块的CD68阳性细胞。显示了安慰剂和TRAF6i-HDL处理的Apoe-/-小鼠之间基因的差异表达。显示了未调整的p值。
具体实施方式
已经开发出高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL),以将雷帕霉素递送至先天免疫细胞。杂化的HDL纳米颗粒,称为雷帕霉素-HDL(例如mTOR-HDL),其将雷帕霉素包封在天然磷脂和载脂蛋白A-I(APOA1)的冠状物中,开发为延长同种异体移植物存活。HDL-纳米颗粒包含APOA1,其通过清道夫受体B-1型(sr-b1)和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白A1(ABCA1)有效地结合巨噬细胞21,22。结果,mTOR-HDL纳米颗粒在体内特异性地将雷帕霉素递送至先天免疫细胞。mTOR-HDL纳米颗粒,直径约15nm,雷帕霉素包封率高达约65%。在移植的心脏中观察到放射标记的mTOR-HDL特异性累积并且主要与骨髓细胞关联。结果表明在移植的心脏中Ly-6Chi/Ly-6Clow以及CD25-/CD25+细胞显著减少。这种治疗还导致同种异体移植物存活显著增加。
另外,发明人发展了HDL纳米生物学,其掺入了针对TRAF6上的CD40结合结构域的小分子抑制剂(TRAF-STOP)(下文称为TRAF6i-HDL)。使用6877002抑制剂开发该TRAF6i-HDL(6877002抑制剂描述于Chatzigeorgiou等(2014)以及美国专利号9,408,829中,以及其他抑制剂)。TRAF6i-HDL纳米颗粒的平均流体力学半径为19.2±3.1nm,药物掺入效率为84.6±8.6%。TRAF6i-HDL纳米颗粒可以单独使用或与本文所述的mTOR-HDL纳米颗粒组合使用。
在替代的实施例中,其他CD40-TRAF6抑制剂如SMI 6860766(描述于Van der Berg等(2015)中)可用于形成替代的TRAF6i-HDL。这些抑制剂可以单独使用或与本文所述的任何其他纳米生物制剂组合使用。用于阻断CD40-TRAF6相互作用的其它合适的化合物描述于美国专利号9,408,829中。
使用实验性心脏移植模型结合分子成像和免疫学技术,本发明的数据证明mTOR-HDL限制树突细胞的有效刺激能力,促进调节性巨噬细胞的增长,并且无限期地延长心脏同种异体移植物存活。该方案在移植后第一周仅包含三次静脉内尾静脉注射5mg/kg当量雷帕霉素。使用体内正电子发射断层扫描与计算机断层扫描(PET-CT)成像和一系列免疫测定的组合,我们评估了心脏同种异体移植物靶向和细胞特异性。我们随后广泛地研究了先天免疫响应、同种异体移植物存活和治疗机制。我们的数据表明,mTOR-HDL纳米颗粒治疗促进无限期的心脏同种异体移植物存活。另外,发明人能够将这些结果扩展到皮肤移植模型中。这些结果提供了关于如何在临床中操纵免疫响应来诱导供体特异性无响应以及鉴定可以预防人类同种异体移植物排斥的新治疗靶标的关键信息。
此外,本发明的数据表明,mTOR-HDL与抑制性CD40-TRAF6特异性纳米免疫疗法(TRAF6i-HDL)组合的短期治疗性治疗协同促进器官移植接受,导致无限期的同种异体移植物存活。
总之,结果表明,基于HDL的纳米疗法代表了诱导移植耐受性的有效治疗范例。该研究为开发新的治疗性纳米药物化合物和治疗提供了基础,所述治疗性纳米药物化合物和治疗产生诱导耐受性的免疫调节性巨噬细胞。此外,TRAF6i-HDL治疗已被证明可以解决动脉粥样硬化中的巨噬细胞累积,并在非人类灵长类动物中表现出所需的安全性和有效性。
定义和方法
在某些实施例中,本发明的组合物包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL),所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂(表示为mTOR-抑制剂-HDL),其中例如m-TOR抑制剂的实例是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(一种示例性的mTOR-HDL)。在替代的实施例中,组合物可以包含一种或多种雷帕霉素衍生物和雷帕霉素信号级联(S6K)的潜在靶标。
在某些实施例中,组合物还可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
在某些实施例中,HDL组合物可以与一种或多种其他免疫抑制剂组合施用,例如环孢菌素A、FK506或硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)及其任何类似物(例如依维莫司、ABT-578、CCI-779、和AP23573)。
在一个实施例中,“患者”或“受试者”是指哺乳动物并且包括人和兽受试者。在一个实施例中,受试者是哺乳动物。
在一个实施例中,复合物以组合物施用,所述组合物包含药学上可接受的载体。
在某些实施例中,本发明涉及一种治疗或预防由同种异体移植物排斥介导的病症或疾病的方法,包括向有此需要的患者施用治疗有效量的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL),所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)或其药物组合物。在一个实施例中,受试者有同种异体移植物排斥的风险,并且该方法用于防止(即预防)或抑制同种异体移植物排斥。
另外,由于任何移植都有排斥的风险,因此实施例包括使用本文所述的任何方法或组合物的辅助治疗以预防任何移植排斥。
由同种异体移植物排斥介导的疾病包括但不限于心脏移植、皮肤移植、肝移植、肺移植、闭塞性细支气管炎综合征(BOS)、肾移植、胰腺移植、胰岛移植(pancreatic isletstransplant)、肠移植、骨移植、视网膜移植、骨髓移植、胰岛移植(islet transplantation)和角膜移植。在某些实施例中,通过施用mTOR-HDL促进治疗。在其他实施例中,通过施用mTOR-HDL和TRAF6i-HDL的组合来促进治疗,mTOR-HDL和TRAF6i-HDL的组合在单一的HDL中或两种单独的HDL组合物中。
在某些实施例中,本发明涉及一种治疗或预防由同种异体移植物排斥介导的病症或疾病的方法,包括向有此需要的患者施用治疗有效量的(i)包含m-TOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL),其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)或其药物组合物以及任选地(ii)包含CD40-TRAF6抑制剂的TRAFi-HDL纳米颗粒,其中CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶形物、互变异构体或前药,配制为HDL纳米颗粒(TRAFi-HDL),或其药物组合物。在某些实施例中,mTOR-HDL和TRAFi-HDL纳米颗粒组合施用或依次施用于有此需要的患者。在一个实施例中,受试者有同种异体移植物排斥的风险,并且该方法用于防止(即预防)或抑制同种异体移植物排斥。由同种异体移植物排斥介导的疾病包括但不限于心脏移植、皮肤移植、肝移植、肺移植、闭塞性细支气管炎综合征(BOS)、肾移植、胰腺移植、胰岛移植、肠移植、骨移植、视网膜移植和角膜移植。
在其他实施例中,本发明涉及一种治疗或预防自身免疫疾病的方法。自身免疫性疾病的实例包括乳糜泻、I型糖尿病、多发性硬化症、甲状腺炎、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、硬皮病、牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、秃头症、强直性脊柱炎、Churg-Strauss综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、白塞病综合征、克罗恩病、皮肌炎,肾小球性肾炎、格林-巴利综合征、IBD、狼疮性肾炎、重症肌无力、心肌炎、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、风湿热、结节病、干燥综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
用本发明的组合物和方法也可以治疗的病症包括与增加的炎症有关的疾病。Schwarz等,Identification of differentially expressed genes induced bytransient ischemic stroke,Brain Res Mol Brain Res.2002;101(1-2):12-22。
本发明的组合物和方法可以用于治疗或预防心血管疾病,例如动脉粥样硬化、狭窄、再狭窄、高血压、心力衰竭、左心室肥大(LVH)、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、中风、短暂性脑缺血发作、受损循环、心脏疾病、胆固醇和斑块形成、缺血、缺血再灌注损伤、周围性血管疾病、心肌感染、心脏病(例如胸痛和介入性手术的风险分层)、心肺复苏、肾衰竭、血栓症(例如静脉血栓症、深静脉血栓症、门静脉血栓症、肾静脉血栓症、颈静脉血栓症、脑静脉窦血栓症、动脉血栓症等)、血栓形成、血栓形成事件或并发症、布加综合症、Paget-Schroetter病、冠状动脉心脏病、冠状动脉病、需要冠状动脉血运重建、外周动脉疾病、肺循环系统疾病、肺栓塞、脑血管疾病、细胞增生和内皮功能障碍、移植物闭塞或失败、外周旁路移植术后需要或不良临床结果、冠状动脉搭桥(CABG)手术后需要或不良临床结果、血管成形术失败或不良结果、内乳动脉移植失败、静脉移植失败、自体静脉移植、静脉移植物闭塞、缺血性疾病、血管内凝血、脑血管疾病或任何其他与肥胖或超重状况有关的心血管疾病。
可以治疗任何类型的动脉粥样硬化病变,例如冠状动脉粥样硬化、糖尿病性动脉粥样硬化、动脉粥样硬化及其后遗症(例如急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、心绞痛、周围性血管疾病、间歇性跛行、心肌缺血、中风、心力衰竭等)。
在某些实施例中,可以通过向分子中加入长烷基链来改变化合物(例如雷帕霉素或本文所述的任何化合物)的疏水性。
在本发明的方法中使用的化合物包括本发明所用化合物的所有水合物、溶剂化物和络合物。如果在本发明的化合物中存在手性中心或另一种形式的异构中心,则本文旨在涵盖所有形式的此类一种异构体或多种异构体,包括对映异构体和非对映异构体。含有手性中心的化合物可以以外消旋混合物、富含对映异构体的混合物使用,或者可以使用已知的技术分离外消旋混合物并且可以独立地使用单独的对映异构体。本发明中描述的化合物是外消旋形式或单独的对映异构体。可以使用已知的技术分离对映异构体,例如在Pureand Applied Chemistry69,1469-1474,(1997)IUPAC中描述的那些技术。在化合物具有不饱和碳-碳双键的情况下,顺式(Z)和反式(E)异构体均在本发明的范围内。在化合物可以以互变异构形式存在的情况下,例如酮-烯醇互变异构体,考虑将每种互变异构形式包括在本发明中,无论是以平衡形式存在还是主要以一种形式存在。
当本发明中使用的化合物的结构包括不对称碳原子时,这种化合物可以以外消旋体、外消旋混合物和分离的单一对映异构体形式存在。这些化合物的所有这些异构形式明确地包括在本发明中。每个立体异构碳可以是R或S构型。因此应当理解,除非另有说明,否则由这种不对称性造成的异构体(例如,所有对映异构体和非对映异构体)都包括在本发明的范围内。通过经典的分离技术和通过立体化学控制的合成(例如在“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,J.Jacques,A.Collet和S.Wilen;John Wiley&Sons出版社,NY,1981中描述的那些),这些异构体可以以基本上纯的形式获得。例如,可以通过手性柱的制备色谱进行分离。
本发明还旨在包括本文公开的化合物存在的所有原子同位素的用途。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的原子。作为一般实例而非限制,氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括碳-13和碳-14。
应当注意,当在没有进一步表示的情况下使用时,本申请中所有结构中的碳的任何符号旨在表示碳的所有同位素,例如12C、13C或14C。此外,含有13C或14C的任何化合物可以具体地具有本文公开的任何化合物的结构。
还应当注意,当在没有进一步表示的情况下使用时,本申请中所有结构中的氢的任何符号旨在表示氢的所有同位素,例如1H、2H或3H。此外,含有2H或3H的任何化合物可以具体地具有本文公开的任何化合物的结构。
通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文公开的实例中所述的那些类似的方法(使用适当的同位素标记的试剂代替所用的未标记的试剂)来制备同位素标记的化合物。
本发明的化合物可以是盐的形式。本文所用的“盐”是本发明化合物的盐,其通过制备化合物的酸或碱、盐而被改性。在化合物用于治疗癌症的情况下,盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐、酸性残基(例如酚基)的碱性或有机盐。可以使用有机酸或无机酸制备盐。此类酸盐是氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等。酚盐是碱土金属盐、钠、钾或锂。在这方面,术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐。这些盐可以在本发明的化合物最终分离和纯化过程中原位制备,或者通过用合适的有机或无机酸或碱分别处理游离碱或游离酸形式的本发明的纯化化合物并分离由此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘二甲酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如,Berge等(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。
如本文所用,“烷基”包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂肪族烃基,并且可以是未取代的或取代的。烷基是C1-C10烷基,或其子集或个体。在一个非限制性实例中,其中烷基是如“C1-C5烷基”中的C1-C5,其定义为包括具有1、2、3、4或5个碳的直链或支链排列的基团,并且具体地包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和戊基。烷基可以任选地被苯基或取代的苯基所取代,以提供取代或未取代的苄基。
杂环基是指饱和或部分不饱和的单环基团,其含有3-8个环原子,优选5-6个环原子但不限于吡咯烷,所述环原子选自碳或氮。
本文所用的术语“芳基”是指含有5-15个碳原子的芳香族单环或多环基团。芳基包括但不限于这样的基团,例如未取代或取代的苯基。当提及所述芳基被取代时,所述取代可以在环上的任何位置,除了与本发明化合物的其他环系统的连接点。因此,芳环上的任何氢原子都可以被本发明限定的取代基取代。在芳基是苯环的实施例中,所述取代可以相对于连接点位于间位和/或邻位和/或对位。芳基可以任选地被杂环基-C(O)-部分(moiety)取代,所述杂环基-C(O)-部分包括吡咯烷基-C(O)-部分。
本文所用的术语“杂芳基”表示在每个环中具有至多10个原子的稳定的单环、双环或多环,其中至少一个环是芳香族并且含有1-4个杂原子或特别是1-2个杂原子,所述杂原子选自O、N和S。双环芳香族杂芳基包括(a)与具有一个氮原子的6元芳香族(不饱和)杂环稠合的、(b)与具有两个氮原子的5或6元芳香族(不饱和)杂环稠合的、(c)与具有一个氮原子以及一个氧或一个硫原子的5元芳香族(不饱和)杂环稠合的,或(d)与具有一个杂原子(选自O、N或S)的5元芳香族(不饱和)杂环稠合的苯基、吡啶、嘧啶或哒嗪环。该定义范围内的杂芳基包括但不限于:苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、二氢吲哚基、吲哚基、吲嗪基(indolazinyl)、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘吡啶基(naphthpyridinyl)、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑基、四唑吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、氮丙啶基、1,4-二噁烷基、六氢氮杂基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡咯唑基(pyrrazolyl)、吲哚基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。在杂芳基取代是双环且一个环是非芳族的或不含杂原子的情况下,应当理解,分别通过芳香环或通过含杂原子的环连接。如果杂芳基含有氮原子,则应当理解其相应的N-氧化物也包括在该定义中。
在本发明的化合物中,可以通过将一个或多个氢原子替换为替代的非氢基团,可以进一步取代烷基、芳基或杂芳基。这些包括但不限于选自烷基、烷氧基、卤素、羟基、巯基、氨基、羧基、氰基和氨基甲酰基的1-4个基团。
术语“取代的”是指如上所述的官能团中,包含氢原子的一个或多个键被非氢或非碳原子的键取代,条件是保持正常的价态并且取代产生稳定的化合物。取代基还包括这样的基团,其中含碳原子或氢原子的一个或多个键被包含杂原子的一个或多个键(包括双键或三键)取代。取代基的实例包括上述官能团,特别是卤素(即F、Cl、Br和I)、烷基(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和三氟甲基)、羟基、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基)、芳氧基(如苯氧基)、芳基烷氧基(如苄氧基(苯基甲氧基)和对三氟甲基苄氧基(4-三氟甲基苯基甲氧基))、杂芳氧基、磺酰基(如三氟甲磺酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基)、硝基、亚硝酰基、巯基、硫烷基(如甲硫基、乙硫基和丙硫基)、氰基、杂环基-C(O)-部分、氨基(如氨基、甲氨基,二甲氨基,乙氨基和二乙氨基)和羧基。当公开或要求保护多个取代基部分时,取代的化合物可以独立地被一个或多个公开的或要求保护的取代基部分单独或多个取代。独立地被取代是指(两个或更多个)取代基可以相同或不同。
应当理解,本领域普通技术人员可以选择本发明的化合物上的取代基和取代模式,以提供化学稳定的化合物,并且这些化合物可以通过本领域已知的技术以及如下所述的那些方法由容易获得的原料容易地合成。如果取代基本身被多于一个基团取代,则应理解这些多个基团可以在相同的碳上或不同的碳上,只要产生稳定的结构即可。
在选择本发明的化合物时,本领域技术人员将意识到,各种取代基(即R1、R2等)应根据已知的化学结构连接原理进行选择。此外,在本文的碳基结构中未显示氢的情况下,隐含的氢理解为满足所需的化合价。
本发明的化合物可以是盐的形式。如本文所用,“盐”是本发明的化合物的盐,其通过制备化合物的酸或碱、盐而被改性。在化合物用于治疗癌症的情况下,盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的实例包括但不限于,碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐,酸性残基(例如酚)的碱性或有机盐。盐可以使用有机酸或无机酸制备。此类酸盐是氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等。酚盐是碱土金属盐、钠、钾或锂。在这方面,术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐。这些盐可以在本发明的化合物最终分离和纯化过程中原位制备,或者通过用合适的有机或无机酸或碱分别与游离碱或游离酸形式的本发明的纯化化合物反应,并分离由此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘二甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如,Berge等(1977)“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.66:1-19)。
在本文对任何参数提供数值范围的情况下,应当理解,该数值范围的所有数值子集以及其中包含的所有单个整数值都作为本发明的一部分提供。因此,C1-C10烷基包括1-3个碳原子的烷基子集、2-5个碳原子的烷基子基等,以及具有1个碳原子的烷基、具有3个碳原子的烷基、具有10个碳原子的烷基等。
在一个实施例中,本文讨论的嘌呤是腺苷、肌苷、次黄嘌呤或腺嘌呤中的一种或多种。在一个实施例中,本文使用的“确定”是指实验确定。
术语“组合物”,如在药物组合物中,旨在包括这样的产品,其包含活性成分和构成载体的惰性成分(药学上可接受的赋形剂),以及任何这样的产品,其直接或间接地来自任何两种或更多种成分的组合、复合(complexation)或聚集,或来自一种或多种成分的解离,或来自一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用。因此,本发明的药物组合物包括通过混合包含m-TOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)化合物的化合物和药学上可接受的赋形剂制备的任何组合物,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
本文所用的术语“任选地”是指随后描述的事件可能发生或不发生,并且包括发生的事件和不发生的事件。
本文所用的术语“被一个或多个基团取代”是指用指定的一个或多个取代基取代(多取代度),直至用相同或不同的取代基取代所有氢原子,除非明确说明了取代基的数目。在未明确说明取代基的数目的情况下,是指一个或更多个。
本文所用的“本发明的化合物”是指式I的化合物,或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物。
本文所用的术语“溶剂化物”是指由溶质(例如,式I的化合物或其盐)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。用于本发明目的的这些溶剂不干扰溶质的生物活性。合适的溶剂的实例包括但不限于水、丙酮、甲醇、乙醇和乙酸。优选地,使用的溶剂是药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的实例包括水、乙醇和乙酸。最优选地,溶剂是水。
在某些实施例中,术语“生理功能衍生物”是指这样的化合物(例如药物前体),其在体内转化以产生包含m-TOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL),或该化合物药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。转化可以通过各种机制(例如,通过代谢或化学过程)发生,例如通过在血液中水解。前药是此类的衍生物,并且T.Higuchi和W.Stella(“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”,A.C.S.研讨会系列第14期)以及Bioreversible Carriers in Drug Design(EdwardB.Roche编辑,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987)提供了关于前药使用的讨论。另外,该术语可以包括这样的化合物(例如药物前体),其在体内转化以产生HDL化合物,所述HDL化合物包含CD40-TRAF6抑制剂,例如TRAF6i-HDL。
除非本文另有说明或上下文明显矛盾,否则本文所述的各种要素的所有组合均在本发明的范围内。虽然每个变量的实施例通常在上面分别针对每个变量列出,但本发明还包括这些化合物,其中几个或每个实施例用于包含m-TOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物选自上文列出的每个实施例,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。因此,本发明旨在包括用于每个变量的实施例的所有组合。
在某些实施例中,本发明还包括这样的化合物,其还包含TRAF6i-HDL(也称为CD40-TRAF6抑制剂),其中所述抑制剂是6877002(描述于Zarzycka,T.等,J.Chem.Inf.Model.55:294-307(2015)中)或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒(TRAF6i-HDL),选自上文列出的任何实施例。因此,本文考虑用于每个变量的实施例的所有组合。
包含m-TOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)化合物(其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL))及其盐、溶剂化物和生理功能衍生物,被认为对治疗有同种异体移植物排斥风险的受试者有用,并且该方法用于防止(即预防)或抑制同种异体移植物排斥。应当注意,任何移植都有同种异体移植物排斥的风险,因此本文所述的组合物和方法预期用于任何移植病症的治疗用途。此外,将TRAF6i-HDL组合物与mTOR-HDL治疗方案组合,在防止(即预防)或抑制同种异体移植物排斥方面提供了协同效应。
在另一个实施例中,本发明提供了高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物,或其生理功能衍生物在制备用于治疗由某些水平的免疫反应物介导的疾病的药物中的用途,所述免疫反应物指示免疫不耐受的可能性,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
因此,本发明还提供了一种药物组合物,其包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物和生理功能衍生物,和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物及其盐、溶剂化物和生理功能衍生物如上所述,所述化合物包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。在与制剂的其他成分相容并且对其受体无害的意义上,载体、稀释剂或赋形剂必须是可接受的。根据本发明的另一个方面,还提供了一种制备药物组合物的方法,包括将高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物或其盐、溶剂化物和生理功能衍生物与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
本发明还提供了一种药物组合物,其包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物及其盐、溶剂化物和生理功能衍生物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂,其中CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成CD40-TRAF6纳米颗粒(TRAF6i-HDL)。高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物及其盐、溶剂化物和生理功能衍生物如上所述,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂,其中CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成CD40-TRAF6纳米颗粒(TRAF6i-HDL)。在与制剂的其他成分相容并且对其受体无害的意义上,载体、稀释剂或赋形剂必须是可接受的。根据本发明的另一个方面,还提供了一种制备药物组合物的方法,包括将高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物或其盐、溶剂化物和生理功能衍生物与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF抑制剂,其中CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成CD40-TRAF6纳米颗粒(TRAF6i-HDL)。
另外,在某些实施例中,考虑了包含CD40-TRAF6抑制剂和m-TOR抑制剂的复合组合物,配制为组合的HDL纳米颗粒制剂。在这种复合组合物中,活性剂/化合物可以如上所述,但任何适当带电的CD40-TRAF6抑制剂或m-TOR抑制剂可以配制成组合的HDL纳米颗粒制剂。
本发明的药物组合物可以以单位剂量形式存在,每单位剂量含有预定量的活性成分。这样的单位可以包含例如5μg-1g,优选地1mg-700mg,更优选地5mg-100mg的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL),取决于所治疗的病症、给药途径和患者的年龄、体重和病情。因此,这样的单位剂量可以每天施用超过一次。优选的单位剂量组合物是包含日剂量或亚剂量(每天施用多于一次)的活性成分的那些,如上所述,或其适当部分。此外,此类药物组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备。小鼠中的示例性剂量包括5mg/kg。
本发明的药物组合物可以适于通过任何适当的途径施用,例如通过口服(包括口腔或舌下)、吸入、鼻、眼或肠胃外(包括静脉内和肌肉内)途径。这种组合物可以通过药学领域中已知的任何方法制备,例如通过使活性成分与载体或赋形剂结合。
治疗有效量的本发明的化合物将取决于许多因素,包括例如动物的年龄和体重、需要治疗的精确病症及其严重程度、制剂的性质和给药途径,并且最终由主治医师或兽医酌情决定。然而,有效量的高密度脂蛋白衍生纳米颗粒(HDL)的化合物,用于治疗与同种异体移植物排斥相关的疾病或病症—包括心脏移植、皮肤移植、肝移植、肺移植、闭塞性细支气管炎综合征(BOS)、肾移植、胰腺移植、胰岛移植、肠移植、骨移植、视网膜移植和角膜移植,通常为每天5μg-100mg/kg受体(哺乳动物)体重,更通常为每天5μg-10mg/kg体重,所述高密度脂蛋白衍生纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。该量可以以每天单次剂量或更通常以每天多个(例如2、3、4、5、6)亚剂量给予,使得每日总剂量相同。有效量的其盐或溶剂化物可以确定为有效量的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物的一比例,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)本身。
本发明的化合物及其盐和溶剂化物及其生理功能衍生物可以单独使用或与其它治疗剂组合使用,用于治疗与同种异体移植排斥相关的疾病和病症—包括心脏移植、皮肤移植、肝移植、肺移植、闭塞性细支气管炎综合征(BOS)、肾移植、胰腺移植、胰岛移植、肠移植、骨移植、视网膜移植和角膜移植。
因此,根据本发明的组合疗法包括施用至少一种高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或其生理功能衍生物,以及使用至少一种其它药物活性剂,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物和其它药物活性剂可以一起或分开施用,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL),当分开施用时,可以同时或以任何顺序依次进行。为了达到所需的联合治疗效果,选择高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的化合物和其它药物活性剂的量以及相关的施用时间,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
在某些实施例中,根据本发明的组合疗法因此包括施用(i)包含m-TOR抑制剂的高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)或其药物组合物,其中m-TOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL),和(ii)包含CD40-TRAF6抑制剂的TRAF6i-HDL纳米颗粒或其药物组合物,其中CD40-TRAF6抑制剂为6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成TRAF6i-HDL纳米颗粒(通常也称为CD40-HDL)。
本领域技术人员将清楚,在适当的情况下,其他治疗成分可以以盐(例如作为碱金属盐或胺盐或酸加成盐),或前药,或酯(例如低级烷基酯),或溶剂化物(例如水合物)的形式使用,以优化治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特性,例如溶解度。还将清楚的是,在适当的情况下,治疗成分可以以光学纯的形式使用。
上述提及的组合可以方便地以药物组合物的形式提供,因此包含如上定义的组合以及药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物代表本发明的另一方面。
这些组合的各个化合物可以在分开的或组合的药物组合物中按顺序或同时施用。优选地,各个化合物在组合的药物组合物中同时施用。本领域技术人员容易理解已知治疗剂的适当剂量。
本发明的化合物可以通过多种方法制备,包括标准化学。除非另有说明,否则任何先前定义的可变因素继续具有先前定义的含义。以下列出了说明性的一般合成方法,并且在实例中制备了本发明具体的化合物。
本发明的化合物可以通过有机合成领域中已知的方法制备,如以下合成方案部分所述。在以下描述的所有方案中,应当理解,根据化学的一般原理,在必要时使用用于敏感或反应性基团的保护基团。根据有机合成的标准方法操作保护基团(T.W.Green和P.G.M.Wuts(1991)Protecting Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons)。使用本领域技术人员显而易见的方法,在化合物合成的方便阶段除去这些基团。保护基团的选择以及反应条件和反应步骤的顺序应与本发明化合物的制备一致。本领域技术人员将意识到本发明的化合物中是否存在立构中心。因此,本发明包括所有可能的立体异构体,并且不仅包括立体异构体的混合物(例如外消旋化合物),还包括单独的立体异构体。当希望化合物为单一对映异构体时,其可以通过立体定向合成或通过拆分最终产物或任何方便的中间体来获得。最终产物、中间体或原料的拆分可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。参见,例如,E.L.Eliel,S.H.Wilen和L.N.Mander的Stereochemistry of Organic Compounds(Wiley-Interscience,1994)。
“可移植的移植物”是指可以施用于受试者的生物材料,例如细胞、组织和器官(全部或部分)。可移植的移植物可以是例如生物材料的自体移植物、同种异体移植物或异种移植物,所述生物材料如器官、组织、皮肤、骨、神经、肌腱、神经元、血管、脂肪、角膜、多能细胞、分化细胞(在体内或体外获得或衍生)等。在某些实施例中,可移植的移植物例如由软骨、骨、细胞外基质或胶原基质形成。可移植的移植物也可以是单细胞、细胞悬浮液和可以移植的组织和器官中的细胞。可移植细胞通常具有治疗功能,例如,在受体受试者中缺乏或减弱的功能。可移植的细胞的一些非限制性实例是胰岛细胞、β-细胞、肝细胞、造血干细胞、神经元干细胞、神经元、神经胶质细胞或髓鞘细胞。可移植的细胞可以是未修饰的细胞,例如从供体受试者获得并且可用于移植而无需任何遗传或表观遗传修饰的细胞。在其他实施例中,可移植的细胞可以是修饰的细胞,例如从具有遗传缺陷的受试者获得的细胞,其中遗传缺陷已经被修正,或者来自重编程细胞的细胞,例如来自受试者的细胞的分化细胞。
“移植”是指将可移植的移植物(例如来自供体受试者、来自体外来源(例如,分化的自体或异源天然或诱导的多能细胞))转移(移动)到受体受试者内和/或在相同的受试者中从一个身体位置转移到另一个身体位置的过程。
“不希望的免疫响应”是指任何不希望的免疫响应,所述不希望的免疫响应由暴露于抗原而引起,促进或加剧本文所提供的疾病、紊乱或病症(或其症状),或者是有本文所提供的疾病、紊乱或病症的症状。此类免疫响应通常会对受试者的健康产生负面影响,或者是有对受试者健康产生负面影响的症状。
在一个实施例中,移植的组织是肺组织、心脏组织、肾组织、肝组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、肌腱组织或血管组织。
在一个实施例中,移植的组织作为完整的器官被移植。
本文所用的“受体受试者”是将接受或已经接受来自另一受试者的移植细胞、组织或器官的受试者。
本文所用的“供体受试者”是在将该细胞、组织或器官移植到受体受试者之前从中移除待移植的细胞、组织或器官的受试者。
在一个实施例中,供体受试者是灵长类动物。在其他实施例中,供体受试者是人。在一个实施例中,受体受试者是灵长类动物。在一个实施例中,受体受试者是人。在一个实施例中,供体和受体受试者均为人。因此,本发明包括异种移植的实施例。
本文所用的“免疫系统排斥”描述了受体受试者免疫系统的超急性、急性和/或慢性响应事件,免疫系统将来自供体的移植细胞、组织或器官识别为非自身的并导致免疫响应。
术语“同种异体的”是指来自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时,称两个或更多个体彼此是同种异体的。
术语“自体的”是指来自同一个体、随后将其重新引入该同一个体的任何材料。
本文所用的“免疫抑制药物”是用于抑制受体受试者的免疫响应的药学上可接受的药物。非限制性实例包括环孢菌素A、FK506和雷帕霉素。
如本文所用,“预防有效”量是在施用该物质的受试者中有效地预防或延迟给定病理状况发作的物质的量。预防有效量是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量。通常,由于在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量,因此预防有效量将小于治疗有效量。
如本文所用,“治疗有效”量是在患病的受试者中有效治疗、改善或减轻给定病理状况的症状或原因的物质的量。
在一个实施例中,治疗或预防有效量为每次给药约1mg药剂/kg受试者至约1g药剂/kg受试者。在另一个实施例中,治疗或预防有效量为约10mg药剂/kg受试者至500mg药剂/受试者。在另一个实施例中,治疗或预防有效量为约50mg药剂/kg受试者至200mg药剂/kg受试者。在另一个实施例中,治疗或预防有效量为约100mg药剂/kg受试者。在又一个实施例中,治疗或预防有效量选自50mg药剂/kg受试者、100mg药剂/kg受试者、150mg药剂/kg受试者、200mg药剂/kg受试者、250mg药剂/kg受试者、300mg药剂/kg受试者、400mg药剂/kg受试者和500mg药剂/kg受试者。
“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”状况、紊乱或病症包括:
(1)在可能患有或易患该状况、紊乱或病症但尚未经历或显示该状况、紊乱或病症的临床症状的人中预防或延迟该状况、紊乱或病症的临床症状的出现;或
(2)抑制状况、紊乱或病症,即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床症状、体征或测试;或
(3)缓解疾病,即导致状况、紊乱或病症或其至少一种临床或亚临床症状或体征的消退。
对待治疗的受试者的益处是统计学上明显的或至少对患者或医生是可察觉的。
“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量。通常,由于在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量,因此预防有效量将小于治疗有效量。
用于治疗用途的可接受的赋形剂、稀释剂和载体在制药领域中是公知的,并且描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Lippincott Williams&Wilkins(A.R.Gennaro编辑.2005)。药物赋形剂、稀释剂和载体的选择可以根据预期的给药途径和标准药学实践来选择。
本文所用的短语“药学上可接受的”是指当施用于人时,分子实体和组合物“通常被认为是安全的”,例如生理上可耐受的并且通常不产生过敏或类似的不良反应,例如胃部不适、头晕等。优选地,本文所用的术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典(the U.S.Pharmacopoeia)或其他公认的药典中列出为用于动物,尤其是人类。
“患者”或“受试者”是指哺乳动物,包括人和兽受试者。某些兽受试者可能包括禽类。
从下面的实验细节可以更好地理解本发明。然而,本领域技术人员容易理解,所讨论的具体方法和结果仅仅是对本发明的说明,如在下文的权利要求中更全面地描述的。
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook、Fritsch和Maniatis(1982和1989年第2版,2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版社,冷泉港实验室,纽约;Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港实验室,纽约;Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,学术出版社,圣地亚哥,加利福尼亚州)。标准方法也出现在Ausbel等(2001)Current Protocols in MolecularBiology,第1-4卷,约翰威立出版有限公司(John Wiley and Sons,Inc.),New York,NY,其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。
描述了蛋白质纯化的方法,包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,约翰威立出版有限公司,NewYork)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、产生融合蛋白、蛋白质的糖基化(参见,例如Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,约翰威立出版有限公司,New York;Ausubel等(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第3卷,约翰威立出版有限公司,New York,NY,pp.16.0.5-16.22.17;Sigma-Aldrich,Co(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO;pp.45-89;Amersham PharmaciaBiotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology,第1卷,约翰威立出版有限公司,New York;Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,冷泉港实验室出版社,冷泉港实验室,NY;Harlow和Lane,同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可利用的(参见,例如Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,约翰威立出版有限公司,New York)。
雷帕霉素是已知的大环内酯类抗生素,由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)产生。雷帕霉素合适的衍生物包括例如式I的化合物,其中R1为CH3或C3-6炔基,R2为H或-CH2-CH2-OH,X为.dbd.O,(H,H)或(H,OH),条件是当X是.dbd.O且R1是CH3时,R2不是H。雷帕霉素的结构如下所示:
例如,在美国专利号5,665,772、6,440,990、5,985,890和6,200,985中公开了式I的化合物,其通过引用并入本文。它们可以如所公开的或类似于这些参考文献中描述的方法那样制备。
优选的化合物是32-脱氧雷帕霉素(32-deoxorapamycin)、16-戊-2-炔氧基-32-脱氧雷帕霉素(16-pent-2-ynyloxy-32-deoxorapambycin)、16-戊-2-炔氧基-32(S)-二氢-雷帕霉素(16-pent-2-ynyloxy-32(S)-dihydro-rapamycin)、16-戊-2-炔氧基-32(S)-二氢-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素(16-pent-2-ynyloxy-32(S)-dihydro-40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin),更优选地,40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素(40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin)(此后称为化合物A),如美国专利号5,665,772和6,440,990的实施例8所公开的。
基于观察到的活性,例如结合macrophilin-12(也称为FK-506结合蛋白或FKBP-12),例如在WO94/09010、WO95/16691或WO96/41807中所述,已经发现式I的化合物是有用的,例如作为免疫抑制剂,例如治疗急性同种异体移植物排斥。
实施例还包括包含雷帕霉素衍生物的纳米颗粒,其具有改善的疏水性和/或混溶性。例如,雷帕霉素可以与烷基链缀合,如Zhao等(Augmenting drug-carriercompatibility improves tumour nanotherapy efficacy,Nature Communications 7,文章编号:11221(2016)doi:10.1038/ncomms11221)所述。
在某些实施例中,加入胆固醇使制剂稳定并且使包封效率提高。在某些实施例中,胆固醇的重量百分比为纳米颗粒、脂质或组合物的约0%至约10%(w/w),约1%(w/w)至约10%(w/w),约2%(w/w)至约10%(w/w),约3%(w/w)至约10%(w/w),约4%(w/w)至约10%(w/w),约5%(w/w)至约10%(w/w),约6%(w/w)至约10%(w/w),约7%(w/w)至约10%(w/w),约8%(w/w)至约10%(w/w),约1%(w/w)至约9%(w/w),约1%(w/w)至约8%(w/w),约1%(w/w)至约7%(w/w),或约1%(w/w)至约6%(w/w)。
递送载体(例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可用于引入靶向先天免疫系统的本发明的组合物,例如靶向巨噬细胞以诱导移植耐受性。除了配制成mTOR-HDL的纳米疗法之外,靶向巨噬细胞的化合物可以配制成以多种不同的形式和方法递送,包括包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒中等。
脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。最近,开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外,已经描述了脂质体和类脂质体制剂作为潜在的药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。
脂质体已经成功地与许多细胞类型一起使用,这些细胞类型通常对其他过程的转染具有抗性。此外,脂质体没有DNA长度限制,DNA长度限制在基于病毒的递送系统中是典型的。脂质体已经有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和别构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外,已经完成了几项成功的临床试验,这些试验检验脂质体介导的药物递送的有效性。
脂质体由磷脂形成,磷脂分散在水性介质中并自发地形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV通常具有25nm至4μm的直径。超声处理MLV导致形成小单层囊泡(SUV),直径为在核中含有水溶液。
或者,可以使用靶向先天免疫系统的本发明的组合物的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式包埋(entrap)物质。为了避免由细胞内聚合物过载引起的副作用,应该使用能够在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。
“合成的纳米载体”是指未在自然界中发现的离散物体,其具有至少一个小于或等于5微米的尺寸。白蛋白纳米颗粒通常被包含在合成的纳米载体中,然而在某些实施例中,合成的纳米载体不包括白蛋白纳米颗粒。在某些实施例中,合成的纳米载体不包括壳聚糖。在其他实施例中,本发明合成的纳米载体不是脂质基纳米颗粒。在其他实施例中,合成的纳米载体不包括磷脂。
合成的纳米载体可以是但不限于一种或多种的脂质基纳米颗粒(在本文中也称为脂质纳米颗粒,即这样的纳米颗粒,其中构成其结构的大部分材料是脂质)、聚合物纳米颗粒、金属纳米颗粒、表面活性剂基乳液、树枝状大分子、巴基球、纳米线、类病毒颗粒(即主要由病毒结构蛋白组成但不具有传染性或感染性低的颗粒)、肽或蛋白质基颗粒(在本文中也称为蛋白质颗粒,即这样的颗粒,其中构成其结构的大部分材料是肽或蛋白质)(例如白蛋白纳米颗粒)和/或使用纳米材料的组合形成的纳米颗粒(例如脂质-聚合物纳米颗粒)。合成的纳米载体可以是各种不同的形状,包括但不限于球形、立方形、金字塔形、椭圆形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成的纳米载体包括一个或多个表面。适用于本发明的实践的示例性合成的纳米载体包括:(1)美国专利号5,543,158(Gref等)公开的可生物降解的纳米颗粒;(2)公开的美国专利申请20060002852(Saltzman等)的聚合物纳米颗粒;(3)公开的美国专利申请20090028910(DeSimone等)的光刻构造的纳米颗粒;(4)WO2009/051837(vonAndrian等)公开的;(5)公开的美国专利申请2008/0145441(Penades等)中公开的纳米颗粒;(6)公开的美国专利申请20090226525(de los Rios等)中公开的蛋白质纳米颗粒;(7)公开的美国专利申请20060222652(Sebbel等)中公开的类病毒颗粒;(8)公开的美国专利申请20060251677(Bachmann等)中公开的核酸偶联的类病毒颗粒;(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中公开的类病毒颗粒;(10)在P.Paolicelli等的“Surface-modifiedPLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6):843-853(2010)中公开的纳米沉淀的纳米颗粒;或(11)美国公开2002/0086049中公开的凋亡细胞、凋亡小体或合成或半合成的模拟物。在实施例中,合成的纳米载体可以具有大于1:1、1:1.2、1:1.5、1:2、1:3、1:5、1:7或大于1:10的长宽比(aspect ratio)。
合成的纳米载体的最小尺寸可以等于或小于约100nm,优选地等于或小于100nm,不包括具有羟基的表面(所述羟基激活补体),或者包括基本上由非羟基部分组成的表面(所述羟基激活补体)。在某些实施例中,合成的纳米载体的最小尺寸等于或小于约100nm,优选地等于或小于100nm的,不包括基本上激活补体的表面或包括基本上由基本上不激活补体的部分组成的表面。在某些实施例中,合成的纳米载体的最小尺寸等于或小于约100nm,优选地等于或小于100nm,不包括激活补体的表面或包括基本上由不激活补体的部分组成的表面。在实施例中,合成的纳米载体排除类病毒颗粒。在实施例中,合成的纳米载体可以具有大于1:1、1:1.2、1:1.5、1:2、1:3、1:5、1:7或大于1:10的长宽比。
在某些实施例中,本发明的组合物包含一种或多种类型的磷脂(基本上由其组成或由其组成)。
合适的磷脂的实例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂或其他神经酰胺,以及含磷脂的油,例如卵磷脂油。可以使用磷脂的组合或磷脂和其他物质的混合物。
可用于本发明的组合物的磷脂的非限制性实例包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂基磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dimyristoylphosphatidylglycerol)(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(dioleoylphosphatidylglycerol)(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)及其混合物。
在某些实施例中,当本发明的组合物包含两种或更多种类型的磷脂(基本上由其组成或由其组成)时,两种类型的磷脂的重量比可以为约1:10至约10:1,约2:1至约4:1,约1:1至约5:1,约2:1至约5:1,约6:1至约10:1,约7:1至约10:1,约8:1至约10:1,约7:1至约9:1,或约8:1至约9:1。例如,两种类型的磷脂的重量比可以为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。
在一个实施例中,本发明的高密度脂蛋白(HDL)衍生的纳米颗粒包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC)(基本上由其组成或由其组成)。DMPC与MHPC的重量比可以为约1:10至约10:1,约2:1至约4:1,约1:1至约5:1,约2:1至约5:1,约6:1至约10:1,约7:1至约10:1,约8:1至约10:1,约7:1至约9:1,或约8:1到大约9:1。DMPC与MHPC的重量比可为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。
mTor抑制剂和与其他药物活性成分的组合
mTOR抑制剂的实例包括雷帕霉素及其类似物(例如CCL-779、RAD001、AP23573、C20-甲代烯丙基雷帕霉素(C20-methallylrapamycin)(C20-Marap)、C16-(S)-丁基磺酰胺基雷帕霉素(C16-BSrap)、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(C16-iRap)(Bayle等,Chemistry&Biology 2006,13:99-107))、AZD8055、BEZ235(NVP-BEZ235)、大黄根酸(大黄酚)、雷帕霉素(deforolimus)(MK-8669)、依维莫司(RAD0001)、KU-0063794、PI-103、PP242、西罗莫司和WYE-354(获得自Selleck,Houston,Tex.,USA)。
在某些实施例中,可以组合使用靶向PIRb+巨噬细胞并促进同种异体移植物存活的一种或多种另外的或替代的活性成分。任何一种或多种这些活性成可以配制在一个剂量单位中,或者是以组合的形式,如mTOR-HDL纳米颗粒可与包含第二种或第三种活性成分的脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球组合施用。其他合适的活性剂包括一种或多种免疫抑制剂。
治疗方案/选择
mTOR-HDL可以与靶向适应性免疫响应(例如T细胞和B细胞消耗)的其他诱导疗法组合使用。例如,对于肾脏活体供体,可以在移植前和移植后不久对移植受体进行治疗。目前免疫抑制治疗的患者可以转为mTOR-HDL治疗或联合mTOR-HDL/TRAF6i-HDL治疗。在另外的情况下,患者在移植前和移植后不久接受mTOR-HDL治疗,mTOR-HDL治疗可以每6或12个月重复一次,目的是消除或强烈减少免疫抑制治疗。在另外的情况下,患者接受mTOR-HDL治疗或联合mTOR-HDL/TRAF6i-HDL治疗而无需任何额外的免疫抑制治疗。
示例性免疫抑制剂包括但不限于他汀类药物;mTOR抑制剂,例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物;TGF-β信号转导剂;TGF-β受体激动剂;组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂;皮质类固醇;线粒体功能抑制剂,如鱼藤酮;P38抑制剂;NF-.κ..β.抑制剂;腺苷受体激动剂;前列腺素E2激动剂;磷酸二酯酶抑制剂,如磷酸二酯酶4抑制剂;蛋白酶体抑制剂;激酶抑制剂;G蛋白偶联受体激动剂;G蛋白偶联受体拮抗剂;糖皮质激素;维甲酸;细胞因子抑制剂;细胞因子受体抑制剂;细胞因子受体激活剂;过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂;过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂;组蛋白去乙酰化酶抑制剂;钙调磷酸酶抑制剂;磷酸酶抑制剂和氧化的ATP。免疫抑制剂还包括IDO、维生素D3、环孢菌素A、芳香烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤内酯醇、白细胞介素(如IL-1、IL-10)、环孢菌素A、siRNA靶向细胞因子或细胞因子受体等。他汀类药物的实例包括阿伐他汀(LIPITOR.RTM.,TORVAST.RTM.)、西立伐他汀,氟伐他汀(LESCOL.RTM.,LESCOL.RTM.XL)、洛伐他汀(MEVACOR.RTM.,ALTOCOR.RTM.,ALTOPREV.RTM.)、美伐他汀(COMPACTIN.RTM.)、匹伐他汀(LIVALO.RTM.,PIAVA.RTM.)、罗苏伐他汀(PRAVACHOL.RTM.,SELEKTINE.RTM.,LIPOSTAT.RTM.)、罗苏伐他汀(CRESTOR.RTM.)和辛伐他汀(ZOCOR.RTM.,LIPEX.RTM.)。
在同种异体心脏移植小鼠模型中测试mTOR-HDL纳米疗法。该方案在移植后第一周内仅包括三次静脉内尾静脉注射5mg/kg当量雷帕霉素。使用体内正电子发射断层扫描与计算机断层扫描(PET-CT)成像和一系列免疫分析的组合,评估心脏同种异体移植物靶向和细胞特异性。随后,分析先天免疫响应以及同种异体移植物存活和治疗机制。这些结果证明,mTOR-HDL纳米颗粒治疗促进无限期的心脏同种异体移植物存活。另外,对于皮肤移植模型也观察到类似的结果。这些结果证明了如何操纵免疫响应,在临床中诱导供体特异性无响应并鉴定可预防人类中同种异体移植物排斥的新治疗靶标。
实例
实例1
开发mTOR-HDL纳米颗粒
通过将包含雷帕霉素和磷脂的脂质膜与PBS中的APOA1水合来合成mTOR-HDL纳米颗粒(参见图1A)。随后,在剧烈均质化后,超声样品以产生mTOR-HDL纳米颗粒,其具有62±11%雷帕霉素包封效率和12.7±4.4nm平均流体力学直径,分别通过高效液相色谱和动态光散射确定。纳米颗粒的尺寸可以变化,但通常为约10nm至约250nm。
如通过透射电子显微镜(图4)所揭示的,mTOR-HDL具有盘状结构,盘状结构是HDL基纳米颗粒的典型16。使用离体近红外荧光(NIRF)成像和流式细胞术,在C57Bl/6野生型小鼠中评估了1,1'-二-N-十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三羰花青碘化物(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide)(DiR)标记的mTOR-HDL的生物分布和细胞特异性。表明mTOR-HDL主要累积在肝脏、脾脏和肾脏中(图5A),同时在血液和脾脏中对单核细胞显示出比树突细胞(DC)或嗜中性粒细胞更高的亲和力(图5B,C)(分别地:P≤0.001,P≤0.01和P≤0.01,P≤0.01)。
将mTOR-HDL治疗用于心脏移植小鼠模型(图1B)。使用体内PET-CT成像(图1B)和离体技术确定mTOR-HDL的生物分布、同种异体移植物靶向和细胞特异性。随后,利用一系列免疫学读数,包括流式细胞术、酶联免疫吸附分析和混合淋巴细胞反应,来评估短期mTOR-HDL纳米治疗方案的效果(图1B)。
mTOR-HDL纳米疗法靶向先天免疫系统
为了定量研究组织靶向性和特异性,用89Zr放射标记mTOR-HDL纳米颗粒(89Zr-mTOR-HDL)。将心脏移植到小鼠腹部6天后,小鼠静脉内接受89Zr-mTOR-HDL。在小鼠进行体内PET-CT成像之前,允许纳米颗粒循环并分布24小时。在心脏同种异体移植物中观察到标记的89Zr-mTOR-HDL存在(图1C)。成像后,处死小鼠,收集器官,通过离体放射自显影进行89Zr-mTOR-HDL定量。确定同种异体移植物心脏(Tx)活性(25.2±2.4×103计数/单位面积)比天然心脏(N)(11.1±1.9×103计数/单位面积)高,是其2.3倍(图1F)。伽玛计数评估89Zr-mTOR-HDL的完全生物分布。离体放射自显影表明89Zr-mTOR-HDL靶向许多组织(图1D),表明药物的全身生物分布,与载药HDL纳米颗粒的典型分布模式一致17。
有利的器官分布模式和心脏同种异体移植物摄取,引导发明人评估心脏同种异体移植物、血液、脾脏和骨髓中细胞水平的mTOR-HDL靶向性和特异性。用荧光染料3,3'-二-N-十八烷基氧代羰花青高氯酸盐(DiO)标记mTOR-HDL纳米颗粒,静脉内施用并允许循环24小时。根据几种组织类型,提取骨髓细胞,包括嗜中性粒细胞;单核细胞/巨噬细胞(Mo/MΦ)池,包括Ly-6Clo和Ly-6Chi单核细胞、DC和T细胞,通过流式细胞术分析。
在心脏同种异体移植物、血液和脾脏中观察到骨髓细胞靶向性(图1F和1G)。重要地,发明人观察到对Mo/MΦ池和嗜中性粒细胞的细胞特异性,在心脏、血液和脾脏中,Mo/MΦ池对mTOR-HDL的摄取明显高于DC或嗜中性粒细胞(分别地:P≤0.01,P≤0.01,P≤0.05,以及P≤0.01,P≤0.01,P≤0.05)。相反,实际上T细胞没有摄取DiO标记的mTOR-HDL(图1F,1G),表明纳米疗法的先天免疫细胞特异性。总之,数据表明mTOR-HDL对发炎部位(例如心脏同种异体移植物)表现出高特异性,并且被骨髓细胞(包括单核细胞、DC和嗜中性粒细胞)强烈摄取。
mTOR-HDL明显减少骨髓细胞区室
分析了白细胞群体,更广泛地分析了接受安慰剂、口服雷帕霉素(口服-Ra)和mTOR-HDL治疗的小鼠的血液、脾脏和同种异体移植物中骨髓细胞区室(compartment)(包括嗜中性粒细胞、Mo/MΦ和DC),其中治疗方案包括在移植当天以及移植后第2天和第5天静脉注射mTOR-HDL。与靶向性数据一致,与安慰剂(P≤0.05和P≤0.01)或口服-Ra治疗受体相比,在mTOR-HDL治疗受体的血液、脾脏和同种异体移植物中观察到明显降低的总白细胞(图2A和图8)。此外,这些数据表明,与安慰剂(P≤0.05,P≤0.05和P≤0.05)和口服-Ra治疗受体(P≤0.05)相比,mTOR-HDL治疗降低了血液、脾脏和同种异体移植物中的嗜中性粒细胞水平。此外,与安慰剂(P≤0.05,P≤0.01和P≤0.05)或口服-Ra治疗受体(P≤0.05)相比,mTOR-HDL治疗大幅降低循环、脾脏和心脏同种异体移植物中的Mo/MΦ数。最后,与安慰剂(P≤0.05,P≤0.01和P≤0.05)或口服-Ra治疗受体(P≤0.05)相比,mTOR-HDL治疗大幅降低循环、脾脏和同种异体移植物中的DC。总之,这些结果表明,mTOR-HDL治疗通过干扰移植的同种异体移植物中骨髓细胞累积来限制同种异体反应性免疫响应。
在这些骨髓细胞研究之后,评估了mTOR-HDL纳米疗法对Mo/MΦ组织分布的影响。Mo/MΦ包括两个不同的子集(Ly-6Chi和Ly-6Clo),具有区域迁移特性23。移植6天后,未治疗和口服-Ra治疗的小鼠的血液、脾脏和心脏同种异体移植物中累积的骨髓细胞数量增加(图2B和图9A)。此外,升高的Mo/MΦ群体含有高百分比的炎性Ly-6Chi单核细胞(图9A和2B)。相比之下,mTOR-HDL受体比安慰剂和口服-Ra治疗的动物在血液(60%vs.12%和13%)、脾脏(55%vs.29%和44%)和心脏同种异体移植(56%vs.20%和18%)中累积了显著更多的Ly-6Clo单核细胞(图2B,图9A)。因此,在mTOR-HDL治疗组中比在安慰剂或口服-Ra治疗接受者(分别为P≤0.05和P≤0.05)中鉴定出明显更少的循环Ly-6Chi单核细胞。脾脏和移植器官中的Mo/MΦ子集比例反映了外周血液中的水平(图1E)。数据表明,虽然Ly-6Chi单核细胞在移植排斥中主导骨髓响应,但Ly-6Clo单核细胞在耐受性期间主导骨髓响应。这表明mTOR-HDL治疗促进调节性Ly-6Clo MΦ累积,并且可以重新平衡骨髓区室以有利于体内平衡。
mTOR-HDL负调节mTOR通路
使用mRNA的基因集富集分析法(GSEA),研究了mTOR-HDL纳米免疫疗法靶向的分子通路,mRNA分离自流式分选的MΦ,MΦ来自安慰剂或mTOR-HDL治疗受体的同种异体移植物。基因阵列结果表明,mTOR-HDL负调节mTOR(图2C)通路。
mTOR-HDL治疗有利于通过促进调节性Ly-6Clo MΦ的增长来诱导移植耐受性
然后,在体外评估了移植物浸润Ly-6Clo Mo/MΦ同种异体移植物的抑制功能。通过在体外抑制羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的CD8+T细胞增殖的能力来评估Ly-6Clo MΦ的调节性抑制功能。本发明的结果表明,从mTOR-HDL治疗的受体小鼠的同种异体移植物获得的调节性Ly-6Clo MΦ在体外阻止T细胞增殖(图3A)。发明人还观察到,与从安慰剂受体小鼠的同种异体移植物获得的Ly-6Clo MΦ不同,从mTOR-HDL治疗的受体的同种异体移植物获得的Ly-6Clo MΦ扩增免疫抑制性Foxp3表达T-regs(图3A)。与这些数据一致,发明人观察到同种异体移植物CD4+CD25+T细胞数量明显增加(图3B;图10)。这表明mTOR-HDL治疗可能有利于通过促进调节性Ly-6Clo MΦ的增长(development)来诱导移植耐受性。
mTOR-HDL纳米疗法阻止树突细胞的强效T细胞刺激
由于树突细胞(DC)摄取mTOR-HDL纳米颗粒(图1F-G),因此研究了mTOR-HDL对免疫细胞激活、抗原呈递和DC介导的T细胞刺激的作用。首先,利用酶联免疫吸附分析(ELISA)评估肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。这些数据表明,与安慰剂和口服-Ra相比,mTOR-HDL治疗明显降低血清TNF-α水平(图10;P≤0.05和P≤0.01)。然后,检查在急性排斥期间上调的共刺激和粘附分子的表达25,26。流式细胞术表明,与安慰剂和口服-Ra治疗的受体相比,来自mTOR-HDL治疗的受体的白细胞中的CD40和CD54分子均明显降低(图10)。使用Y-Ae单克隆抗体(mAb),其识别由受体MHC II类I-Ab分子呈递的供体来源的I-Ed肽,评估mTOR-HDL对抗原呈递的影响。与来自安慰剂或口服-Ra的受体相比,在mTOR-HDL治疗受体的主动脉旁淋巴结和脾脏中观察到明显更少的抗原呈递Y-Ae+细胞。然后,评估了从mTOR-HDL受体获得的DC在体外刺激抗原特异性T细胞的能力。将从安慰剂和mTOR-HDL处理的小鼠的脾脏中提取的CD11c+MHC-II+DC用作引发剂(initiator)以在体外刺激混合淋巴细胞反应(MLR)。分离抗原特异性TEa CD4+T细胞作为响应者(responder),因为这些T细胞识别与Y-Ae mAb识别所相同的肽和MHC的I-Ed-I-Ab复合物,用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞并如前所述用CD11c+MHC-II+脾脏DC培养27。通过流式细胞术测量T细胞中CFSE稀释度来测试CD11c+MHC-II+脾脏DC的刺激性质。这些数据表明,来自mTOR-HDL受体的DC在体外刺激初始T细胞增殖的能力明显低于从对照小鼠获得的DC。然后,测试了从移植的小鼠获得的T细胞的增殖能力。这些数据表明,类似于从安慰剂排斥小鼠获得的T细胞,来自mTOR-HDL受体的T细胞能够产生体外免疫响应。总之,这些结果说明,mTOR-HDL纳米颗粒治疗阻止DC介导的移植反应性T细胞免疫响应。
mTOR-HDL纳米疗法促进抑制性巨噬细胞的增长
在确定mTOR-HDL纳米颗粒靶向Mo/MΦ(图1F和1G)并影响它们的组织分布后,测试了在耐受性诱导期间同种异体移植物中累积的Ly-6Clo Mo/MΦ的功能特性。移植6天后收获供体心脏同种异体移植物,并通过流式细胞术分析骨髓区室。通过关注活CD45+CD11b+受体移植物浸润骨髓细胞,基于Ly-6Chi Mo/MΦ、Ly-6Clo Mo/MΦ和Ly-6G嗜中性粒细胞的差异表达模式,我们辨别出三个主要群体(图1D)。与安慰剂受体相比,流式细胞术分析证实在mTOR-HDL治疗的小鼠的同种异体移植物中存在比Ly-6Chi Mo/MΦ更多的Ly-6Clo Mo/MΦ(图1D)。各组间Ly-6G嗜中性粒细胞频率无差异。
在mTOR-HDL治疗的受体的同种异体移植物中累积的Ly-6Clo巨噬细胞的基因阵列表征表明,mTORC1通路在这些小鼠中被负调节。这证实了mTOR-HDL治疗靶向移植物浸润巨噬细胞。
阻止成功器官移植的共刺激分子的综合分析表明,mTOR-HDL治疗增加了CD40表达。与该观察结果一致,发明人发现激动性CD40mAb治疗在mTOR-HDL治疗的受体中消除延长的同种异体移植物存活率(图3F)。这表明表达CD40L的T细胞可刺激受体MΦ中的CD40信号传导,最终导致移植物损失。为了抑制有害的CD40信号传导,发明人开发了第二种纳米免疫疗法治疗,其由CD40-TRAF6抑制性HDL(称为CD40-HDL或TRAF6i-HDL;图11A-B)组成。小分子抑制剂CD40-TRAF6针对TRAF6上CD40的结合结构域并阻断CD40信号传导,导致Ly6Chi炎性巨噬细胞向抗炎表型极化。
mTOR-HDL无限期地延长同种异体移植物存活
最后,评估了纳米免疫疗法治疗防止器官排斥和延长同种异体移植物存活的能力。将Balb/c(H2d)供体心脏同种异体移植物移植到完全同种异体的C57Bl/6(H2b)受体中,所述C57Bl/6(H2b)受体用以下物质处理:(1)安慰剂,(2)口服-Ra,(3)mTOR-HDL,(4)TRAF6i-HDL或(4)mTOR-HDL+TRAF6i-HDL。为了评估移植物存活,受体经受腹部触诊直至心脏收缩完全停止。本发明的数据表明,mTOR-HDL纳米疗法在50天内明显延长移植物存活,同种异体移植存活率超过85%(图3G)。相比之下,在相同的时间段内口服雷帕霉素治疗仅使同种异体移植物存活率延长了35%(P≤0.01,P≤0.01)。这是一个显著的结果,特别是考虑到在移植后第一周内方案仅包括三个剂量。
作为第二终点,我们在联合治疗100天后评估了同种异体移植物的组织学(图13A-B)。图13B显示了轻度周围炎症而无动脉炎,并且没有内膜增生的迹象。小鼠主动脉节段没有表现出任何组织学改变,没有内膜增厚,也没有慢性同种异体移植物血管病变(CAV)的迹象。此外,使用心脏同种异体移植物模型,发明人评估了在移植后的前五天内三次注射mTOR-HDL和TRAF6i-HDL的组合治疗方案。如图3G所示,组合mTOR-HDL/TRAF6i-HDL治疗协同促进器官移植,导致移植100天内存活率大于70%,明显优于mTOR-HDL和TRAF6i-HDL单一疗法。
治疗的时间可以变化,并且可以在移植前、伴随移植或移植后开始。在一个实施例中,在器官移植前1-2天开始mTOR-HDL或组合mTOR-HDL/TRAF6i-HDL治疗。
为了测试在mTOR-HDL治疗的受体中体外抑制性Ly-6Clo Mo/MΦ是否介导延长的移植物存活,发明人消耗了体内的Ly-6Clo Mo/MΦ,如最近所述9。简言之,在移植当天将Balb/c(H2d)供体心脏同种异体移植物移植到完全同种异体的CD169白喉毒素(DT)受体(DTR)(H2b)受体小鼠中以消耗受体Ly-6Clo巨噬细胞。在移植后第6天,通过流式细胞术检查移植物浸润白细胞,以确认Ly-6Clo体外抑制性巨噬细胞的特异性消耗(图3B)。随后的移植物存活实验表明,尽管进行mTOR-HDL治疗,但Ly-6Clo Mo/MΦ消耗导致第15天(12.3±1.8)的移植物排斥(图3D)。野生型单核细胞的过继转移恢复了同种异体移植物存活,证明纳米免疫疗法通过调节性MΦ发挥其作用。这些实验表明,mTOR-HDL治疗刺激调节性Ly-6Clo巨噬细胞在体内增长,而调节性Ly-6Clo巨噬细胞阻止T细胞介导的免疫响应,从而促进延长的同种异体移植物存活。
为了进一步研究mTOR-HDL的一般治疗适用性,将本文所述的mTOR-HDL纳米疗法应用于完全同种异体的皮肤移植模型,在该模型中宏观监测排斥(图12A和12B)。使用相同的三剂量方案,mTOR-HDL纳米医学治疗显著增强移植物存活。mTOR-HDL治疗的受体中平均存活时间显著增加,第50天存活率大于75%;另一方面,安慰剂组的排斥率为100%(P≤0.01)(10.5±2.9天)。总之,这些实验和结果表明,mTOR-HDL纳米疗法阻止DC介导的T细胞刺激、促进Ly-6Clo Mo/MΦ的增长并显著延长同种异体移植物存活。
图13A-B示出了与mTOR-HD治疗相比口服-Ra相关的毒性。受体小鼠接受mTOR-HDL治疗方案或给予口服-Ra治疗,增加口服-Ra的剂量以达到相同的治疗结果(n=4,灰色)或(n=4,黑色)。mTOR-HDL对血液尿素氮(BUN,如图13A所示)或血清肌酐(如图13B所示)没有明显影响,但肾脏毒性参数表明口服-Ra和mTOR-HDL之间的统计学差异,同时输注后30天没有观察到同系(syngeneic)和mTOR-HDL受体之间的差异(ANOVA*P≤0.05,**P≤0.01)。
来自肾脏的组织学切片,由H&E、PAS和Masson Trichrome染色并由肾病理学家检查,在肾实质的三个区室没有显示出明显变化(图13A)。有正常的肾小球而没有肾小球硬化的迹象。肾小管未显示出明显的萎缩或上皮细胞损伤的任何迹象,包括空泡形成、刷状缘丧失或有丝分裂。动脉和小动脉分别没有显示出内膜纤维化或小动脉透明变性的迹象。由H&E、PAS和Masson Trichrome染色并由肝脏病理学家检查的肝切片显示正常的腺泡和小叶结构。门静脉和肝实质中没有炎症或纤维化的迹象。肝细胞是正常的并且没有胆汁淤积、内含物或细胞凋亡的迹象(图13A)。在图13B中,该切片显示出轻微的周围炎症而没有动脉炎,并且没有内膜增生的迹象。小鼠主动脉节段没有表现出任何组织学改变且没有内膜增厚,也没有慢性同种异体移植血管病变(CAV)的迹象。
讨论
用免疫抑制药物治疗移植患者以避免器官排斥30。免疫抑制剂靶向适应性免疫系统并具有严重的副作用31,32。目前的移植免疫学研究寻求使用不同的实验移植模型来开发新的耐受性方案。将基础免疫学与创新的纳米医学相结合是促进免疫耐受性的有前景的新方法。动物模型的使用在该研究中起着至关重要的作用。不幸的是,虽然一些实验的耐受性方案可以在小鼠和灵长类动物中诱导无限期的同种异体移植物存活33,34,但血栓栓塞性并发症阻止了这些方法转化为临床治疗35。因此,一直存在对免疫调节的替代方法的需求,例如靶向先天免疫系统,以防止移植排斥11,12,36。
在目前的研究中,数据表明,保守剂量的HDL包封的雷帕霉素延长了移植物存活。这表明只有包封的雷帕霉素——即非游离形式——可以用于诱导免疫耐受性,如最近所述37。数据还在机制上表明,mTOR-HDL降低血液、脾脏和同种异体移植物中的白细胞。与先前的研究38-41一致,降低的白细胞粘附和迁移与更好的移植物存活相关。更具体地,在同种异体移植物中观察到明显更低的Mo/MΦ和嗜中性粒细胞计数伴随着较少的骨髓细胞浸润。与本发明靶向骨髓区室的mTOR-HDL纳米疗法相比,95%吸收的口服雷帕霉素与红细胞结合42。因此,本发明的纳米疗法递送策略提供了一种创新的方式来显著提高药物的生物利用度。
与其减少移植器官中细胞浸润的能力相关,体内mTOR-HDL施用显著减少了促炎分子的产生并降低了DC诱导T细胞增殖的能力。这些结果符合先前的报道,而先前的报道表明在体外用雷帕霉素调节DC减少促炎介质并延长同种异体移植物存活43。另外,这些数据表明,mTOR-HDL纳米疗法还通过抑制DC的刺激功能来影响DC,从而表明同种异体抗原特异性T细胞激活可以被治疗性地调节。本发明的数据还证明,mTOR-HDL治疗减少同种异体抗原呈递至CD4+T细胞。这些免疫调节作用在移植期间是至关重要的,其中抗原呈递细胞介导针对移植器官的特异性同种异体反应性44。
本发明的数据表明,mTOR-HDL治疗介导抑制性巨噬细胞的累积,抑制性巨噬细胞抑制细胞毒性T细胞响应。此外,来自HDL治疗受体的Ly-6Clo巨噬细胞在体外扩增Foxp3+Treg并且与体内移植物内Foxp3+Treg累积相关。移植器官中的调节性Ly-6Clo巨噬细胞累积似乎对TOR-HDL介导的延长的同种异体移植物存活至关重要,因为尽管进行mTOR-HDL治疗,但消耗Ly-6Clo巨噬细胞仍阻止耐受性诱导。这些结果与表明Ly-6Clo巨噬细胞抑制细胞毒性T细胞增殖、介导Treg扩增和促进移植耐受性的研究一致9。结果表明,基于HDL的纳米颗粒代表了开发靶向体内巨噬细胞的药物递送系统的新型治疗方法。
总的来说,这些数据表明,HDL纳米颗粒技术有效地将免疫抑制药物递送至先天免疫系统。mTOR-HDL阻止DC激活、促进调节性巨噬细胞增长并诱导无限期的同种异体移植物存活。mTOR-HDL技术是一种创新、有效且有潜力的转化治疗方法,其靶向先天免疫细胞以诱导长期的同种异体移植物存活。临床测试和优化的GMP方案的实施将确认长期的安全性和有效性。由于mTOR-HDL结合了现有的FDA批准的药物,其开发——或开发释放其他FDA批准的免疫抑制剂的HDL纳米颗粒系统——可能具有直接的转化途径。
材料和方法
纳米颗粒合成
本发明的靶向方法使用新合成的高密度脂蛋白纳米颗粒平台递送药物雷帕霉素。使用改良的脂质膜水合法合成mTOR-HDL纳米颗粒。简言之,将重量比3:1:0.5的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC)(均购自Avanti Polar Lipids)和雷帕霉素(Selleckchem)溶解在氯仿/甲醇(10:1v/v)混合物中。蒸发溶剂后,加入人APOA1(在PBS中)以水合脂质膜,磷脂与APOA1的重量比为5:1,并在冰浴中孵育20分钟。在冰浴中使用探头超声波仪(probe sonicator)将所得的混合物均质15分钟,得到mTOR-HDL纳米颗粒。洗涤mTOR-HDL并使用10kDa分子量截留(MWCO)过滤管通过离心过滤来浓缩。使用离心和过滤(0.22μm)除去聚集体。口服雷帕霉素溶液(口服-Ra)由PBS中4%乙醇、5%PEG300和5%TWEEN80组成,而静脉内雷帕霉素溶液(i.v.-Ra)包括在PBS中的4%乙醇和5%TWEEN80。在移植当天以及移植后第2天和第5天,动物接受口服剂量或静脉内尾注射(对于mTOR-HDL或i.v.-Ra)5mg/kg剂量的雷帕霉素。
根据与如上所述类似的方法合成CD40-HDL纳米颗粒。将重量比8.7:1:0.6的DMPC、MHPC和TRAF6-抑制剂(2E)-1-苯基-3-(2,5-二甲基苯胺基)-2-丙烯-1酮1((2E)-1-phenyl-3-(2,5-dimethylanilino)-2-propen-1one1)溶解在氯仿/甲醇混合物(10:1v/v)中,然后在真空下干燥以产生薄脂质膜。将含有APOA1的PBS加入到脂质膜中,磷脂与APOA1重量比为9.5:1,并在冰上孵育3小时直至膜水合并形成均匀的溶液。然后将溶液超声处理1小时以形成CD40-HDL纳米颗粒。随后,通过多个离心和过滤步骤纯化溶液。
小鼠
雌性C57BL/6J(B6WT,H-2b)、BALB/c(H-2d)小鼠购自塔科尼克实验室(TaconicLaboratory)。8周龄的C57BL/6J(Foxp3tm1Flv/J)小鼠购自杰克逊实验室(The JacksonLaboratory)。C57BL/6J CD169DTR小鼠来自Masato Tanaka(Kawaguchi,日本)。识别代表与II类I-Ab分子结合的I-Eα链(Eα肽)的残基52-68的肽的C57BL/6J CD4+转基因TEa小鼠来自Alexander Rudensky(纽约,美国)。在8至10周龄登记动物(体重,20-25g)。根据实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Utilization Committee)批准的方案,用8至12周龄的雌性匹配小鼠进行所有实验。
血管化的心脏移植
如前所述45,将BALB/c心脏以完全血管化的异位移植物移植到C57BL/6小鼠中。通过在供体和受体主动脉之间建立端-侧吻合以及在供体肺动脉干和受体下腔静脉之间建立端-侧吻合,将心脏移植到受体的腹膜腔中。随后通过每日触诊评估心脏同种异体移植物存活。排斥被定义为心脏收缩完全停止,并通过剖腹手术中的直接可视化来确认。使用Kaplan-Meier生存分析比较各组间的移植物存活。
Micro-PET/CT成像和生物分布研究
通过其侧尾静脉向小鼠(n=6;3只心脏移植和3只皮肤移植)[体重:18.8±1.0g])注射在0.2mL PBS溶液中的89Zr-mTOR-HDL(0.17±0.01mCi,~0.25mg APOA1)。在24小时时,用异氟烷(Baxter Healthcare,Deerfield,IL,USA)/氧气混合物(2%用于诱导,1%用于维持)麻醉动物,然后使用Inveon PET/CT扫描仪(Siemens Healthcare Global,Erlangen,Germany)进行扫描。进行15分钟全身PET静态扫描(记录至少3000万个重合事件)。能量和重合时间窗口分别为350-700keV和6ns。将图像数据归一化(normalized)以校正PET响应非均匀性、死时间计数损失、正电子分支比和注入时的物理衰变(physical decay),但没有应用衰减(attenuation)、散射或部分体积平均校正。使用系统校准因子将重建图像中的计数率转换为活性浓度(每克组织的注射剂量百分比[%ID]),所述系统校准因子来自对含有89Zr的小鼠体积水当量体模(phantom)成像。使用ASIPro VMTM软件(Concorde Microsystems,Knoxville,TN,USA)分析图像。使用设置在80kV电压和500μA电流的X射线管进行全身标准低放大倍数CT扫描。使用120个旋转步骤获得CT扫描,总共220度,产生120秒的估计扫描时间,每帧145ms的曝光。在PET/CT扫描后立即处死动物并收集感兴趣的组织:肾脏、心脏、肝脏、脾脏、血液、骨、皮肤和肌肉,称重并在Wizard2 2480自动伽玛计数器(Perkin Elmer,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)上计数以确定放射性含量。将这些值进行衰变校正并转换成每克注射剂量的百分比(%ID/g)。为了确定移植心脏内的放射性分布,将天然和移植的样品置于与磷光成像板(BASMS-2325,Fujifilm,Valhalla,NY)相对的膜盒中,在-20℃下保持4小时。用Typhoon 7000IP读板器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)以25μm的像素分辨率读板。使用ImageJ软件分析图像。
分离移植物浸润白细胞
用含有1%肝素的HBSS原位漂洗小鼠心脏。将外植的心脏切成小块并于37℃用在HBSS(Cellgro)中的400U/ml胶原酶IV(Sigma-Aldrich)、10mM HEPES(Cellgro)和0.01%DNase I(MP Biomedicals)消化40分钟。将消化的悬浮液通过尼龙网并离心,将细胞沉淀重悬于完全HBSS中,染色并通过流式细胞术(BD LSR-II;BD Biosciences)分析。
流式细胞术和细胞分选
对于骨髓细胞染色,对小鼠CD45(克隆30-F11)、CD11b(克隆M1/70)、CD11c(克隆N418)、F4/80(克隆CI:A3.1)、Ly-6C(克隆HK1.4)和相应的同种型对照特异性的荧光染料偶联的mAb购自eBioscience。Ly-6G(克隆1A8)mAb购自Biolegend。F4/80(克隆CI:A3.1)购自AbD Serotec。对于T细胞染色,针对CD45(克隆30-F11)、CD3(克隆2C11)、CD4(克隆GK1.5)、CD8(克隆53-6.7)、CD25(克隆PC61.5)、CD40(克隆1C10)和CD54(克隆YN1/1.7.4)的抗体购自eBioscience。使用countbright珠(Invitrogen)进行绝对细胞计数。为了检测抗原呈递,Y-Ae mAb购自eBioscience。在LSR II(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析,并用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)分析。结果以高于背景的细胞染色百分比或细胞计数(细胞/毫升)表示。在这些研究过程中定期滴定mAb以确保使用饱和浓度。为了纯化移植物浸润骨髓细胞,用InFlux细胞分选仪(BD)分选供体心脏单细胞悬浮液,以在西奈山伊坎医学院(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)的流式细胞仪共享资源设施中获得>96%的纯度。
混合的淋巴细胞反应
将抗原特异性TEa(H-2b)小鼠的脾脏轻轻解离成单细胞悬浮液,并使用低渗ACK裂解缓冲液除去红细胞。用5μM浓度的CFSE细胞增殖标记物(来自Invitrogen的分子探针)标记脾脏细胞,然后在冰上用抗CD4mAb染色30分钟。使用FACS Aria II分选仪(BDBiosciences)分选响应者CFSE+CD4+T细胞,纯度>98%。使用EasySep Mouse CD11c阳性选择试剂盒(StemCell)富集来自mTOR-HDL处理的受体和安慰剂处理的受体脾脏细胞的CD11c+细胞。将富集的CD11c+脾脏细胞在冰上用抗小鼠CD11c mAb染色30分钟。使用FACSAria II分选仪(BD Biosciences)分选CD11c+细胞,然后用于刺激响应者CFSE+CD4+T细胞。将细胞在5%CO2培养箱中于37℃培养4天,并通过CFSE稀释的流式细胞术在CD4+T细胞上分析测量CFSE+CD4+T细胞增殖。
体外抑制分析
将C57BL/6(H-2b)小鼠的脾脏轻轻解离成单细胞悬浮液,并使用低渗ACK裂解缓冲液除去红细胞。用5μM浓度的CFSE(来自Invitrogen的分子探针)标记脾脏细胞,然后在冰上用抗CD8mAb染色30分钟。使用FACS Aria II(BD Biosciences)分选响应者CFSE+CD8+T细胞,纯度>98%。CFSE+CD8+T细胞与抗CD3/CD28微珠一起用作刺激物。将受刺激的CFSE+CD8+T细胞与移植物浸润Ly-6Clo巨噬细胞、mTOR-HDL或安慰剂一起在5%CO2培养箱中于37℃培养72小时。通过CFSE稀释的流式细胞术在CD8+T细胞上分析测量T细胞增殖。
Treg扩增分析
将C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J(H-2b)小鼠的脾脏轻轻解离成单细胞悬浮液,并使用低渗ACK裂解缓冲液除去红细胞。将脾脏细胞在冰上用抗CD4mAb染色30分钟。使用FACSAriaII(BD Biosciences)分选响应者CD4+,纯度>98%。CD4+T细胞与抗CD3/CD28微珠一起用作刺激物。将受刺激的CD4+T细胞与移植物浸润Ly-6Clo巨噬细胞、mTOR-HDL或安慰剂一起在5%CO2培养箱中于37℃培养72小时。通过Foxp3-RFP的流式细胞术在CD4+T细胞上分析测量Treg扩增。
微阵列
在移植后第6天,从mTOR-HDL处理的受体和安慰剂排斥的受体中分选移植物浸润受体Ly-6Clo巨噬细胞。用FACS Aria II分选仪(BD Biosciences)将细胞分选两次以达到>98%的纯度。用总共6个Affymetrix Mouse Exon GeneChip 2.0阵列对分选的细胞进行微阵列分析,Affymetrix Mouse Exon GeneChip 2.0阵列与感兴趣的样品运行三次。来自Affymetrix表达控制台(Affymetrix Expression Console)的原始CEL文件数据进行了背景校正、归一化,并使用RMA进行汇总。使用制造商提供的注释文件在转录本meta-probeset级别计算汇总表达得分。使用基因过滤器包基于IQR(0.25)过滤器过滤基因表达。log2归一化和过滤的数据(调整的P<0.05)用于进一步分析。在来自mTOR-HDL和安慰剂处理的受体的移植物内Ly6Clo巨噬细胞之间进行基因标记比较。使用来自Gene pattern version 3.9.6的GSEA版本17进行GSEA。用于分析的参数如下。基因集c2.cp.biocarta.v5.1.symbols.gmt、c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt、c2.cp.reactome.v5.1.symbols.gmt、c6.all.v5.1.symbols.gmt(致癌标记)、c7.all.v5.1.symbols.gmt(免疫标记)和h.all.v5.1.symbols.gmt(特征)用于运行GSEA,1000个排列(permutation)用于计算p值,排列类型设置为基因集。每个基因集独立运行。所有基本和高级字段都设置为默认值。为了从每个基因集结果中选择显著通路,将0.25的fdrq-值设定为截止值。只考虑促进核心富集的基因。
体内巨噬细胞消耗
为了消耗表达CD169的Ly-6Clo巨噬细胞,在移植后24、48和72小时,杂化CD169-DTR受体腹膜内注射10ng/g体重的DT(Sigma-Aldrich)。
统计分析
结果表示为平均值±SEM。使用曼-惠特尼检验评估2组之间的统计学比较。进行Kaplan-Meier生存图,并且组的对数秩比较计算P值。P≤0.05的值被认为是统计学显著的。IBM SPSS Statistics 22用于统计分析。
近红外荧光成像
C57/B6野生型小鼠接受单次静脉内注射DiR染料标记的5mg/kg mTOR-HDL或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。24小时后,处死小鼠并用PBS灌注。收集肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏和肌肉组织用于NIRF成像。用745nm激发滤光片和820nm发射滤光片,使用IVIS 200系统(Xenogen)以2秒曝光时间获得荧光图像。每个组织内的平均辐射效率以及与对照的比例都已定量。
放射标记mTOR-HDL纳米颗粒
根据先前描述的步骤制备89Zr-mTOR-HDL[15]。简言之,在初始配方中以1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)为代价,通过加入1mol%的磷脂螯合剂1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-1,8-二氮杂-9-芴酮(DSPE-DFO)来获得随时可标记的mTOR-HDL[44]。通过使携带DFO的纳米颗粒与89Zr-草酸盐在PBS(pH=7.1)中于37℃反应1小时来实现89Zr的放射标记。使用10kDa分子量截留管通过离心过滤分离89Zr-mTOR-HDL。放射化学收率为75±2%(n=2)。
89Zr-mTOR-HDL的生物分布
在PET/CT扫描后立即处死小鼠并收获、印迹和称重感兴趣的组织(血液、心脏、肾脏、肺、肝脏、脾脏、骨、皮肤、肌肉和移植物),然后在Wizard2 2480自动伽玛计数器(珀金埃尔默股份有限公司(Perkin Elmer),Waltham,MA,USA)上进行放射性计数。然后将放射性含量转换成放射性浓度并表示为注射剂量/每克组织的百分比(%ID/g)。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
在移植后第6天收获血液,在室温下孵育并短暂离心后,使用1.1ml Z-Gel微管(Sarstedt)纯化血清。根据制造商的方案通过ELISA(eBiosciences)评估血清中的TNF-α分泌(每组n=4)。根据制造商的指南(R&D系统),使用用于IL-6和TNFα的商业ELISA试剂盒在上清液中测定同种异体移植细胞因子的产生。
超声成像
使用移植心脏的短轴横截面B模式图像监测心脏同种异体移植物移植速率(每分钟心跳次数,BPM),其中M模式光标线穿过其最大尺寸并追踪左心室壁。
皮肤移植
如前所述[42]放置全厚度躯干皮肤同种异体移植物。从BALB/C收获皮肤,切成0.5cm的片并置于C57BL/6受体中。将同种异体移植皮肤置于稍大的移植物床上,所述移植物床在受体的胸部上制备并使用凡士林、纱布和绷带固定。每天对移植物进行视觉评分以获得排斥反应的证据。通过数字显微镜摄影监测皮肤同种异体移植物排斥,并且当其>90%坏死时认为完全排斥。使用Kaplan-Meier生存分析比较各组间的移植物存活。
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实例2
靶向的CD40-TRAF6抑制解决动脉粥样硬化中巨噬细胞的累积
在动脉粥样硬化中,巨噬细胞累积与斑块的不稳定和破裂直接相关,造成急性动脉粥样硬化血栓形成事件。循环的单核细胞进入斑块并分化成巨噬细胞,其中它们通过CD40-CD40配体信号传导由CD4+T淋巴细胞激活。在此,我们示出了单核细胞/巨噬细胞中这种信号通路的阻断在动脉粥样硬化的ApoE-/-小鼠模型中发挥快速的抗炎作用。为此,我们开发了一种难熔重组高密度脂蛋白纳米颗粒,其携带CD40与肿瘤坏死因子受体相关因子6相互作用的小分子抑制剂。我们示出了我们的纳米免疫疗法的单核细胞/巨噬细胞特异性靶向,这削弱了它们的迁移能力。通过该疗法快速减少斑块炎症代表了治疗动脉粥样硬化的新策略,具有很高的临床转化潜力,如非人灵长类动物中有利的毒性特征所示。
分化为巨噬细胞的循环单核细胞的募集是加重动脉粥样硬化斑块炎症的关键过程[1]。在斑块中这种动态巨噬细胞的累积与动脉粥样硬化血栓形成事件的发展直接相关[1]。
早在20世纪90年代,人们就认识到CD4+T淋巴细胞通过CD40-CD40配体(CD40-CD40L)信号传导激活斑块巨噬细胞在促成斑块炎症中起着核心作用[2]。载脂蛋白e敲除(Apoe-/-)小鼠中CD40L的遗传破坏大幅降低了动脉粥样硬化病变的发展并减少了斑块T淋巴细胞和巨噬细胞的含量[3]。用抗小鼠CD40L抗体治疗低密度脂蛋白受体敲除(LDLr-/-)小鼠和Apoe-/-具有相似的动脉粥样硬化保护作用[4-6]。进一步的研究表明,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)在推动巨噬细胞内CD40信号级联反应中具有特殊的重要性[7]。TRAF是衔接蛋白,可以结合CD40的细胞质结构域,并将受体复合物与几种不同的信号转导途径偶联[8]。事实上,骨髓细胞中CD40-TRAF6相互作用的缺陷已被证明减少单核细胞向斑块的募集并消除Apoe-/-小鼠中动脉粥样硬化斑块的形成[7]。
虽然CD40-TRAF6相互作用提供了有前景的治疗靶标,但主要的限制与其抑制有关。除了CD40-TRAF6相互作用在骨髓细胞中的作用外,它还能部分地控制B淋巴细胞的成熟和长寿血浆细胞的产生[9]。因此,长期抑制CD40-TRAF6相互作用可能会导致免疫缺陷,使其成为动脉粥样硬化不可行的治疗方法。
为了解决这个问题,我们开发了一种靶向的免疫疗法,其能够在单核细胞/巨噬细胞中特异性阻断CD40-TRAF6相互作用。为此,我们在重组的高密度脂蛋白中加入了最近开发的CD40-TRAF6相互作用的小分子抑制剂(TRAF6i-HDL)[10,11]。我们在动脉粥样硬化的Apoe-/-小鼠模型中显示了TRAF6i-HDL靶向单核细胞/巨噬细胞,而淋巴细胞不吸收纳米颗粒。在一周的TRAF6i-HDL免疫疗法后,观察到斑块炎症的快速减少和单核细胞募集的减少。与这些发现一致,整个转录组分析表明,细胞迁移是受影响的细胞过程之一。最后,为了评估其转化潜力,我们在非人灵长类动物(NHP)中评估了TRAF6i-HDL的药代动力学、生物分布和安全性。
结果
TRAF6i-HDL特性
该研究的目的是通过靶向的纳米免疫疗法(TRAF6i-HDL)特异性抑制单核细胞/巨噬细胞中的CD40-TRAF6相互作用来减少斑块炎症。TRAF6i-HDL纳米颗粒从人载脂蛋白A-I(apoA-I)和磷脂1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)构造,其中包封了CD40-TRAF6相互作用的亲脂性小分子抑制剂(SMI 6877002)[8,11]。因为apoA-I本身具有调节作用,所以纳米免疫疗法设计为具有低的apoA-I对药物比率。得到的TRAF6i-HDL纳米颗粒,在图14A中示意性地示出,测得直径为22.6+/-12nm(PDI=0.3),如通过动态光散射和透射电子显微镜(TEM)测定的。合成TRAF6i-HDL变体,其包含荧光染料(DiO或DiR)或锆-89(89Zr)放射标记的磷脂,以允许通过荧光技术、正电子发射断层扫描(PET)、γ计数和放射自显影检测。
示意图
研究设计的示意图如图14B所示。该研究的第一部分在患有动脉粥样硬化的小鼠(高胆固醇饮食的Apoe-/-小鼠)中进行。在这些小鼠中,我们首先研究了TRAF6i-HDL的毒性、药代动力学、生物分布和动脉粥样硬化斑块单核细胞/巨噬细胞靶向性效率。随后,我们评估了一周TRAF6i-HDL方案的斑块消退效力(plaque regression efficacy),一周TRAF6i-HDL方案包括四次静脉输注。接下来,我们使用全转录组分析研究了TRAF6i-HDL影响斑块单核细胞/巨噬细胞的机制。该研究的第二部分集中于TRAF6i-HDL纳米免疫疗法的转化性。为此,我们研究了TRAF6i-HDL的毒性和药代动力学,同时进行了体内正电子发射断层扫描和磁共振(PET/MRI),以纵向研究非人类灵长类动物中的生物分布和血管壁靶向性。
在Apoe-/-小鼠中的毒性、药代动力学和生物分布研究
一周TRAF6i-HDL治疗对红细胞、血小板或白细胞水平没有影响(图20)。与安慰剂相比,网织红细胞和淋巴细胞的数量有所增加。TRAF6i-HDL治疗不影响骨髓血液和脾脏中T细胞和B细胞的数量。尽管碱性磷酸酶有所增加,但没有观察到对肾和肝功能的毒性作用(图21)。脂质、葡萄糖、蛋白质和电解质未受影响。
为了研究其药代动力学和生物分布,Apoe-/-小鼠接受单次输注89Zr-放射标记的TRAF6i-HDL。在24小时内测量89Zr-TRAF6i-HDL的血液放射性清除率,并使用两相衰减非线性回归拟合数据。基于t1/2-快速为13.7分钟以及t1/2-慢速为195分钟,最终计算加权血液半衰期(t1/2)为124.4分钟(图14C)。通过体内PET/CT成像评估生物分布(图14C)并通过离体γ计数验证,后者表示为每克组织注射剂量的百分比(%ID/g;图14D)。如预期的那样,PET/CT成像表明TRAF6i-HDL主要累积在肝脏、脾脏和肾脏中,它们是已知的吸收和代谢HDL的器官。γ计数数据证实了这些结果,表明肝脏中纳米颗粒摄取为12.8%ID/g,脾脏中为8.9%ID/g,肾脏中为7.9%ID/g。相比之下,心脏(类似大小的器官)仅含有1.1%ID/g(图14D)。输注后24小时,离体近红外荧光(NIRF)成像证实了PET/CT和γ计数观察结果,表明TRAF6i-HDL主要累积在肝脏、脾脏和肾脏中。
流式细胞术分析表明,血液、骨髓和脾脏中的Ly6Chi单核细胞和巨噬细胞摄取了DiO标记的TRAF6i-HDL。嗜中性粒细胞、Ly6Clo单核细胞和树突细胞也摄取了DiO-TRAF6i-HDL,而谱系阳性CD11b阴性细胞(所有非骨髓细胞)则没有摄取(图14G),表明骨髓细胞特异性。
TRAF6i-HDL在动脉粥样硬化病变中累积
整个主动脉的离体γ计数表明,在输注后24小时累积了1.3%ID/g的89Zr-TRAF6i-HDL(图14D)。特别地观察整个主动脉中TRAF6i-HDL纳米颗粒的分布,主动脉窦区域的摄取最高,主动脉窦区域是该小鼠模型中斑块发展的优先位点。虽然仅占总区域的6.4%,但主动脉窦区域产生约29%的信号,相当于5.9%ID/g(图1d)。NIRF成像表明在主动脉窦区域中DiR标记的TRAF6i-HDL类似的优先累积(图14E)。通过流式细胞术评估DiO标记的TRAF6i-HDL摄取在主动脉斑块中的细胞特异性。我们发现86%的巨噬细胞和81%的Ly6Chi单核细胞摄取了DiO-TRAF6i-HDL,而谱系阳性细胞(所有非骨髓细胞)几乎没有摄取(图14F)。此外,发现主动脉斑块中的大多数嗜中性粒细胞(64%)和树突细胞(61%)含有标记的纳米颗粒(图14G)。这些结果反映了我们在血液、骨髓和脾脏中的发现,表明骨髓谱系的细胞,特别是Ly6Chi单核细胞亚群和巨噬细胞,优先被TRAF6i-HDL纳米颗粒靶向。
TRAF6i-HDL对斑块炎症的体内作用
为了评估TRAF6i-HDL的治疗效果,我们使用20周龄的Apoe-/-小鼠,其已经进行了12周高胆固醇饮食以发展动脉粥样硬化病变。虽然所有小鼠都维持高胆固醇饮食,但他们在7天内接受了四次静脉输注安慰剂、无有效负载的对照HDL纳米颗粒或TRAF6i-HDL。每次输注施用的CD40-TRAF6抑制剂剂量为5mg/kg。为了限制apoA-I自身明显的治疗效果,我们使用9mg/kg的低apoA-I剂量。在最后一次输注后24小时处死所有小鼠。
对于第一个实验,我们对用安慰剂、HDL或TRAF6i-HDL(每组n=10)处理的小鼠的主动脉窦区域中的斑块进行了定量组织学分析。用苏木精和伊红(H&E)和天狼星红(胶原蛋白)染色横切片,并对Mac3(巨噬细胞)和Ki67(增殖细胞)进行免疫染色。在组间未观察到斑块大小或胶原含量的明显差异(图15A)。然而,与安慰剂组和HDL组相比,Mac3阳性区域的百分比分别明显地降低了36%(p=0.001)和37%(p<0.001)(图15B)。结果,斑块中Mac3对胶原蛋白的比率也被有利地影响以表明TRAF6i-HDL组中更稳定的斑块表型,因为与安慰剂和HDL组相比,该比率降低了31%(p<0.001)和36%(p=0.004)(图15B)。所有组中增殖巨噬细胞的数量相似(图15A),表明观察到的斑块巨噬细胞减少不是由巨噬细胞局部增殖减少引起的。先前的研究表明,除了单核细胞募集外,局部巨噬细胞增殖在激起斑块炎症中起着关键作用[12]。
随后,我们进行了荧光分子断层扫描融合计算机断层扫描(FMT/CT)成像,以可视化主动脉窦区域的蛋白酶活性。安慰剂(n=8)和TRAF6i-HDL(n=7)处理的Apoe-/-小鼠在成像前24小时全部接受一次可激活的泛组织蛋白酶传感器注射。蛋白酶传感器被激活的巨噬细胞摄取,然后在内吞溶酶体(endolysosome)内切割蛋白酶传感器,产生作为酶活性函数的荧光。TRAF6i-HDL治疗使蛋白酶活性降低了60%(p=0.002,图16A)。然后,我们通过整个主动脉的流式细胞术来关注主动脉巨噬细胞含量的定量。再次,用安慰剂(n=27)、HDL(n=27)或TRAF6i-HDL(n=27)治疗高胆固醇饮食的20周龄Apoe-/-。与安慰剂组和HDL组相比,TRAF6i-HDL治疗组的主动脉巨噬细胞含量明显降低了66%和67%(两种比较均p<0.001)(图16B)。这些结果证实了组织学分析和FMT-CT的观察结果。此外,与安慰剂和HDL相比,在TRAF6i-HDL治疗组中主动脉T淋巴细胞含量分别降低了65%和49%。总之,这些数据表明,在仅一周的治疗后,TRAF6i-HDL在动脉粥样硬化斑块中具有强效的抗炎作用。
由于我们已经观察到增殖的Ki67+巨噬细胞的数量不受治疗的影响,因此我们假设斑块巨噬细胞含量和炎症的减少可能是由于单核细胞募集减少引起的[13,14]。为了进一步研究这一点,我们首先在与我们测量巨噬细胞含量相同的流式细胞术实验中定量了主动脉Ly6Chi单核细胞。我们观察到,分别与安慰剂组和HDL组相比,巨噬细胞的减少平行于主动脉中Ly6Chi单核细胞49%和52%的减少(两种比较的p<0.001)(图16B)。有趣的是,主动脉Ly6Chi单核细胞含量的减少不能通过Ly6Chi单核细胞的全身性减少来解释(图16C)。
其次,我们进行了一项实验,其中在处死小鼠前2小时腹膜内注射胸苷类似物5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)。BrdU掺入到新合成的DNA中,因此可用作增殖的标记。图16D表明,TRAF6i-HDL治疗未降低包含BrdU的斑块巨噬细胞的百分比。该结果与Ki67表达的组织学观察结果一致。在小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系的体外实验中,与CD40-TRAF6抑制化合物或TRAF6i-HDL一起孵育不影响增殖速率,小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系特征在于高增殖率[15](图16E)。
总之,这些数据表明TRAF6i-HDL治疗降低了斑块巨噬细胞含量以及蛋白酶活性。TRAF6i-HDL减少斑块炎症的作用机制可能通过减少单核细胞募集来介导,同时局部巨噬细胞增殖不受影响。
斑块单核细胞/巨噬细胞的比较全转录组分析
为了深入了解TRAF6i-HDL对斑块单核细胞/巨噬细胞基因表达的影响,我们通过激光捕获显微切割从安慰剂或TRAF6i-HDL治疗的小鼠的主动脉窦斑块中分离了CD68阳性细胞。分离这些细胞的全RNA用于测序。
我们鉴定了安慰剂和TRAF6i-HDL治疗的小鼠之间差异表达(DE)的基因。对多次测试进行了校正,伪发现率(FDR)<0.2(图17A)。共鉴定了416个DE基因,其中209个基因被下调而207个被上调(图17B)。使用基因本体(GO)-功能来注释DE基因,并找到明显富集DE基因的细胞组分(图17C)。在明显富集DE基因的15个富集的GO术语中,“粘着斑(focal adhesion)”是最感兴趣的。其他富集的GO术语,例如“细胞-基底粘附连接”、“细胞-基底连接”、“粘附连接”和“锚定连接”与“粘着斑”密切相关,并且这些GO术语中的基因重叠程度很高(图22)。粘着斑是一个动态过程,其中蛋白质复合物与细胞外基质连接并在单核细胞/巨噬细胞迁移中发挥核心作用[16]。在随后的分析中,使用京都基因和基因组百科全书(kyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)(KEGG)通路工具对相同的416个DE基因作图,通过该工具我们鉴定了两个明显改变的途径,即“粘着斑”和“内吞作用”(图17D,图23)。
最显著的DE基因,所有的FDR<0.05(图17D,图24),是Adcy3、Lgals3bp、Pltp和Stab1(上调)以及Impad1、Sept2、Slc4a7和Spcs2(下调)。在这些基因中,已知巨噬细胞衍生的PLTP发挥抗动脉粥样硬化作用[17],Stab1(编码Stabilin-1)在淋巴细胞归巢和细胞粘附中发挥作用并且与动脉粥样硬化保护性巨噬细胞表型相关[18,19]。已知Sept2(编码Septin2)在巨噬细胞中大量表达并且是吞噬体形成所必需的[20]。总之,转录组数据分析表明,在各种受影响的过程中,粘着斑明显受TRAF6i-HDL治疗影响。粘着斑(在细胞迁移中涉及的过程)受到重要影响的事实与我们的上述观察一致,上述观察即在TRAF6i-HDL治疗的小鼠中Ly6Chi单核细胞募集降低。我们没有观察到对与巨噬细胞增殖、凋亡或迁移运出相关的基因表达的影响(图25)。
在非人灵长类动物中的TRAF6i-HDL毒性、药代动力学和生物分布研究
为了评估TRAF6i-HDL治疗的转化性,我们在TRAF6i-HDL治疗的非人灵长类动物(NHP)中进行了全面的血液检测、组织学分析以及高级的(advanced)药代动力学和生物分布研究。六只NHP用于全面的血液学分析和死后组织学分析,另外六只用于生物分布成像(PET/MRI)和血液化学分析。NHP注射安慰剂或单剂量的TRAF6i-HDL(1.25mg/kg),并在72小时后处死或在多个时间点成像然后处死。
注射后72小时内7个时间点的全血细胞计数数据表明,安慰剂和TRAF6i-HDL治疗的动物在白细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板或任何其他指标方面没有差异(图18A)。另外,与安慰剂组相比,血液化学分析表明在TRAF6i-HDL治疗组中没有肝脏、肾脏、胰腺或肌细胞毒性的迹象(图18B)。此外,两组中脂质、葡萄糖和蛋白质(白蛋白和球蛋白)水平相等(图18B)。电解质也未受影响。将来自肝脏、肾脏和脾脏的样本切片并染色(H&E)用于组织学分析并由病理学家评估。没有发现组织损伤或组织结构受干扰的迹象(图18C)。
为了评估生物分布,在静脉内施用89Zr标记的TRAF6i-HDL后,对六只NHP进行全身PET/MR成像。在施用后第一个小时内对动物进行动态成像,同时在第1、24、48和72小时时进行随后的静态扫描。动态PET成像表明肝脏、脾脏和肾脏中快速的放射性累积,随后是在骨髓中明显摄取(图19A)。注射后1小时,PET图像由来自肾脏的强信号主导,其次是第1小时时间点的肝脏和脾脏(图19A)。在第24、48和72小时,放射性主要累积在肝脏和脾脏中(图19B)。在第72小时时间点处死动物后,组织γ计数表明最大量的注射剂量(%ID/g)可以追溯到肝脏和脾脏,然后是肾脏,这证实了PET/MRI成像的发现(图19C)。在不同时间点收集血液并使用两相衰变非线性回归拟合数据。t1/2-快速为14.2分钟,t1/2-慢速为513分钟,得到加权血液半衰期(t1/2)为272分钟(图19D)。
讨论
在当前的研究中,我们描述了HDL基纳米免疫疗法的开发,所述HDL基纳米免疫疗法靶向单核细胞/巨噬细胞中的CD40-TRAF6相互作用。我们的数据表明TRAF6i-HDL在动脉粥样硬化病变中累积,并且对单核细胞/巨噬细胞具有强亲和力。一周的治疗快速减少斑块巨噬细胞含量,这可以部分归因于单核细胞募集抑制。证明TRAF6i-HDL在非人灵长类动物中是安全的这一事实说明了这种疗法的转化潜力。
长期以来,人们已经认识到CD40-CD40L信号轴在引起动脉粥样硬化的免疫响应中发挥着必要的作用[2-5]。虽然其鉴定引起了很高的期望,但这种共刺激受体-配体对的治疗靶向性证明是麻烦的。抗CD40L抗体可有效减少小鼠动脉粥样硬化的发展[3-5],但由于血小板上CD40表达引起的血栓栓塞并发症阻碍了其在人体中的应用[21,22]。此外,CD40在B淋巴细胞上表达,而长时间的阻断会损害B淋巴细胞成熟,从而导致免疫缺陷[9]。在当前的研究中,我们通过特别是在单核细胞/巨噬细胞中靶向TRAF6与CD40细胞质结构域的相互作用来解决这些问题。这通过将HDL用作载有CD40-TRAF6相互作用的小分子抑制剂的纳米颗粒载体来实现。这些数据表明,我们的HDL基纳米颗粒将超过80%的单核细胞和巨噬细胞暴露于其负荷(cargo),而淋巴细胞不摄取任何纳米颗粒。
除了限制CD40-TRAF6抑制剂向单核细胞/巨噬细胞群体递送外,我们还旨在通过仅使用短短一周的疗程来最小化全身免疫抑制作用。先前靶向CD40-CD40L信号轴的治疗研究使用了延长的治疗时间[3-5]。我们发现在一周内斑块Ly6Chi单核细胞和巨噬细胞含量减少49%和66%的这一事实表明TRAF6i-HDL治疗的高效力。值得注意的是,我们证明了apoA-I对TRAF6i-HDL治疗效果的贡献很小。我们使用4次9mg/kg apoA-I输注,与先前发表的研究[24]相比相对较低,并且我们发现与安慰剂相比,空HDL对斑块单核细胞/巨噬细胞含量没有影响。
在如此短的时间内TRAF6i-HDL减少斑块炎症的机制可以由单核细胞募集减少部分地解释。通常,斑块巨噬细胞含量由单核细胞募集以及巨噬细胞增殖、细胞凋亡和迁移运出的平衡决定。前两个过程被认为是最重要的决定因素[25-28]。我们的数据未显示对巨噬细胞增殖、凋亡或迁移运出的影响,但我们确实观察到斑块Ly6Chi单核细胞含量减少,表明单核细胞募集减少。此外,我们没有发现血液单核细胞减少(血液单核细胞减少可能是斑块中单核细胞数量减少的原因)。先前的研究表明,单核细胞的高动力学[13,14,26-28]和减少的募集在4周内导致斑块巨噬细胞含量减少70%以上[26]。相反,由心肌梗塞引起的单核细胞募集突然增加导致斑块巨噬细胞含量在1-3周内明显增加[27]。这些观察结果与我们的发现一致,即减少的单核细胞募集导致一周内斑块巨噬细胞含量减少66%。
我们的转录组分析数据支持单核细胞募集受到影响。该分析未显示趋化因子受体或配体的明确作用。然而,GO功能分析表明,细胞迁移中的关键过程“粘着斑”明显富集了DE基因。KEGG通路分析也表明了“粘着斑”富集。在“粘着斑”通路中特别感兴趣的的基因是Rhoa、Rap1b和Rap1b,它们通过激活整联蛋白在调节单核细胞迁移中起核心作用[16]。它们都明显下调。这与先前在具有缺陷CD40-TRAF6信号传导的敲除小鼠模型中的观察结果一致,其中通过活体显微镜评估体内循环单核细胞与颈动脉的管腔粘连受损[7]。此外,巨噬细胞的迁移能力明显受到影响[7]。
TRAF6i-HDL的作用不限于“粘着斑”,如显示为受影响的各种其他基因表达所证实的那样。总之,本数据表明TRAF6i-HDL影响斑块单核细胞/巨噬细胞中的各种生物过程,包括单核细胞/巨噬细胞迁移受损。关于非人灵长类动物(NHP)的药代动力学、生物分布和安全性的广泛实验说明了这种治疗的可转化性。先前已经证实重组HDL的使用对于人是安全的,其中apoA-I剂量为40mg/kg[24]。由于我们使用了9mg/kg apoA-I,因此不存在安全问题。最近开发的CD40-TRAF6相互作用的小分子抑制剂迄今尚未在人中进行评估。89Zr标记的TRAF6i-HDL的生物分布与在小鼠、兔和猪动脉粥样硬化模型中先前观察到的89Zr标记的HDL相似[29]。我们观察到肝脏、脾脏和肾脏中的累积最高。肝脏和肾脏是apoA-I和HDL分解代谢的主要部位,脾脏是主要的次级淋巴器官,含有许多骨髓细胞,从循环中清除纳米颗粒。在肝脏、肾脏或脾脏中没有毒性作用的迹象,并且所有组织在组织学分析中显示正常的组织结构。此外,全血计数未显示对血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或红细胞数量的任何影响。安全性数据的评估一直进行到施用后72小时。在当前的研究中未评估长期安全性。
目前还没有解决斑块炎症的具体疗法,尽管目前正在大型III期临床试验中研究抗白细胞介素-1β抗体和低剂量甲氨蝶呤的慢性疗法[30-32]。免疫抑制在慢性疾病(例如动脉粥样硬化)中的挑战在于平衡风险与益处。与上述慢性免疫抑制策略相反,我们认为具有免疫调节特性的短期诱导纳米疗法可用于快速抑制心血管事件高风险患者中的斑块炎症。虽然靶向递送增强了药物的局部功效,但其短期应用最大限度地降低了与延长的免疫抑制相关的风险。患有急性冠状动脉综合征的患者可能是这种炎症诱导治疗的合适人群,因为在第一年内他们复发心肌梗死的风险明显增加,高达17.4%[33]。最近的研究已经提出,最初的心肌梗死本身会引起单核细胞募集到动脉粥样硬化斑块,导致它们发炎且斑块易于破裂[27]。在这种病理生理学背景下,我们认为在脆弱期快速抑制单核细胞募集的概念是预期相关的。通过靶向单核细胞/巨噬细胞中的CD40-TRAF6信号传导,该研究提供了一种快速诱导疗法以治疗动脉粥样硬化炎症的创新治疗方法。不溶性的TRAF6i-HDL纳米免疫疗法具有有前景的转化潜力,正如非人灵长类动物的有利安全性数据证明的那样。
鉴于这些结果,预期TRAF6i-HDL纳米颗粒也可用于与肥胖和胰岛素抵抗相关的病症。这些病症和并发症包括:胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病。阻断CD40-TRAF通路预期将导致缺乏胰岛素抵抗以及在饮食诱导的肥胖和类似病症中脂肪组织(AT)炎症和肝脂肪变性(hepatosteatosis)均减少。还预期本发明的TRAF6i-HDL纳米颗粒将能够防范AT炎症和与肥胖相关的代谢并发症。因此,单独或与其他标准护理治疗组合来施用TRAF6i-HDL纳米颗粒可改善患者结果并预防或逆转与这些病症相关的损伤。
方法
合成rHDL基纳米颗粒
基于先前发表的方法合成TRAF6i-HDL[34,23]。简言之,将CD40-TRAF6抑制剂6877002[10]与1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)(Avanti Polar Lipids)在氯仿/甲醇混合物(体积比为9:1)中混合,然后真空干燥,得到薄的脂质膜。将人载脂蛋白A1(apoA-I)的PBS溶液加入到脂质膜中。将混合物在冰上孵育1小时或直至膜水合并形成均匀溶液。然后将溶液超声处理20分钟以形成TRAF6i-HDL纳米颗粒。随后,通过多个离心过滤步骤纯化溶液。对于靶向性、成像和生物分布实验,通过掺入荧光染料DiR或DiO(Invitrogen)或磷脂螯合剂DSPE-DFO(1mol%,以DMPC为代价)制备TRAF6i-HDL的类似物,所述磷脂螯合剂DSPE-DFO允许放射标记89Zr[35]。
动物以及用于小鼠研究的饮食
雌性Apoe-/-小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc,n=103)用于该研究。所有动物护理和程序均基于西奈山伊坎医学院批准的机构协议。8周龄的Apoe-/-小鼠购自Jackson Laboratory。给所有小鼠喂食高胆固醇饮食(HCD)(0.2%重量胆固醇;15.2%kcal蛋白质,42.7%kcal碳水化合物,42.0%kcal脂肪;Harlan TD.88137),持续12周。
每个实验中的处理方案相同:将20周龄的Apoe-/-小鼠随机分成安慰剂(盐水)、空rHDL或TRAF6i-HDL(5mg/kg)组。在7天内4次静脉内注射来处理小鼠,同时在处理期间保持HCD。最后一次注射后24小时处死动物。
流式细胞术
将Apoe-/-小鼠安乐死并用PBS灌注,然后轻轻地清除主动脉根部到髂动脉分叉处的主动脉的脂肪并收集主动脉。将整个主动脉置于含有释放酶TH(4U/mL)(Roche)、脱氧核糖核酸酶(DNase)I(40U/ml)(Sigma-Aldrich)和透明质酸酶(60U/mL)(Sigma-Aldrich)的酶消化溶液中,切碎并置于37℃培养箱中60分钟。将细胞通过70μm过滤器,离心两次并重悬于含血清的培养基中。将脾脏称重并推过70μm细胞过滤器,离心,重悬于红细胞裂解缓冲液中4分钟,然后使用含血清的培养基灭活,离心并将每100mg脾脏组织重悬于1000μL含血清的培养基中。将EDTA处理的血液离心,重悬于红细胞裂解缓冲液中4分钟,然后使用含血清的培养基灭活,离心并重悬于100μl含血清的培养基中。从单个股骨获得骨髓。用70%乙醇冲洗完整的股骨,然后在冰冻的无菌PBS中洗涤三次。切下骨骺,用PBS冲洗骨髓。将细胞通过70μm过滤器,离心并重悬于红细胞裂解缓冲液中30秒,然后使用含血清的培养基灭活,离心并重悬于1000μL含血清的培养基中。使用以下抗体:F4/80-PE-Cy7(克隆BM8,BioLegend);CD11b-PerCP/Cy5.5(克隆M1/70,BioLegend);CD11c-APC(克隆N418,BioLegend);CD45-亮紫510(克隆30-F11,BioLegend);Ly-6C-PE(克隆AL-21,BDBiosciences);Ly6CFITC(克隆AL-21),BD Biosciences);CD90.2-eFluor 450(克隆53-2.1,eBioscience);CD90.2-PE(克隆53-2.1,BD Biosciences);Ter119-eFluor 450(克隆TER-119,eBioscience);NK1.1-eFluor 450(克隆PK136,eBioscience);NK1.1-PE(克隆PK136,BD Biosciences);CD49b-eFluor 450(克隆DX5,eBioscience);CD45R-eFluor450(克隆RA3-6B2,eBioscience);Ly-6G-Pacific Blue(克隆1A8,BioLegend);Ly-6G-PE(克隆1A8,BD Biosciences);CD3-PE(克隆17A2;Biolegend);CD19-PE(克隆1D3,BDBioscience)。
抗体稀释度为1:200至1:100。通过用溴脱氧尿苷(BrdU)进行体内标记来测定新制备的细胞对不同群体的贡献。根据制造商的方案(BD APC-BrdU试剂盒,552598),使用APC缀合的抗BrdU抗体测量掺入。使用与先前描述的方法类似的方法鉴定单核细胞和巨噬细胞[28]。具体地,Ly6Chi单核细胞被鉴定为CD11bhi、CD11clow、Lin-/low(Lin定义为CD90.2+、CD45R+、CD49b+、NK1.1+、Ly-6G+、Ter119+或CD90.2+、NK1.1+、Ly-6G+、CD19+、CD3+)F4/80low,其也是Ly-6Chi。巨噬细胞被鉴定为CD11bhi、CD11clow、Lin-/low、F4/80hi、CD11-/low。在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上获得数据,并用FlowJo v10.0.7(Tree Star,Inc.)分析。
组织学和免疫组织化学
收集用于组织学分析的组织,在福尔马林中固定过夜并包埋在石蜡中。将主动脉根部切成4μm切片,每个根部产生总共90-100个横切片。用苏木精和伊红(HE)染色八个横切片并用于动脉粥样硬化斑块大小测量。将其他切片脱石蜡,封闭,在95℃抗原修复溶液(DAKO)中孵育,并用MAC-3大鼠单克隆抗体(1:30;BD Biosciences)或抗Ki67兔多克隆抗体(1:200,Abcam)免疫标记。用天狼星红染色分析胶原蛋白含量。通过Immpact AMEC red(Vectorlabs)或二氨基联苯胺(DAB)来可视化抗体染色。使用Leica DM6000显微镜(LeicaMicrosystems)或VENTANA iScan HT载玻片扫描仪(Ventana)分析切片。
激光捕获显微切割和RNA测序
如前所述在24个主动脉根部切片(6μm)上进行LCM(20)。简言之,将冷冻的切片在梯度乙醇溶液中脱水(70%两次,95%两次,100%一次),用DEPC处理的水洗涤,用Mayer的苏木精、伊红染色并在二甲苯中清洗。对于每8个切片,1个切片用于CD68染色(Abdserotec,1:250稀释),其用于指导LCM。使用ArcturusXT LCM系统鉴定并切割斑块内CD68富集的区域。收集的CD68阳性细胞用于RNA分离(PicoPure RNA Isolation Kit,Arcturus),随后根据制造商的方案(Ovation Pico WTA System,NuGEN)进行RNA扩增和cDNA制备。用Agilent2100生物分析仪测量收集的样品的质量和浓度。
RNA测序。制备并验证了双端(pair-end)库。测定纯度、片段大小、产量和浓度。在簇生成期间,将库分子杂交到Illumina流动细胞上。随后,使用桥式扩增来扩增杂交的分子,产生异质的簇群。使用Illumina HiSeq 2500测序仪获得数据集。
差异表达和功能注释分析
使用tophat对齐器(bowtie2)将双端测序读数与人类基因组hg19比对[36]。在读数比对后,基于GENCODE基因模型释放22[38]使用HTSeq[37]来定量基因水平的基因表达。使用M值归一化法的修剪平均值,将基因表达原始读数计数归一化为每百万计数,以调整样品之间的测序库大小差异[39]。使用Bioconductor package limma[40]鉴定药物处理和安慰剂之间的差异表达基因。为了校正多重测试问题,在标签排列之后使用limma计算随机样本中的统计值和p值。重复该过程1000次以获得零t统计量和p值分布,用于估计所有基因的伪发现率(FDR)。差异表达的(DE)基因通过校正p值的截止值小于0.2而鉴定。GO-功能[41]用于注释DE基因,并且发现明显富集DE基因的细胞成分。还用KEGG Mapper将DE基因作图至京都基因和基因组(KEGG)通路百科全书[42]。
荧光分子断层扫描与CT
喂食高脂肪饮食12周的雌性Apoe-/-小鼠在7天内用四次TRAF6i-HDL输注(5mg/kg,n=7)或盐水(n=8)处理。在成像前24小时静脉内施用5nmol的泛组织蛋白酶(pancathepsin)蛋白酶传感器(ProSense 680,PerkinElmer,Cat no.NEV10003)。对于FMT/CT成像,将动物置于定制的成像盒中,该成像盒在成像期间配置用于施用异氟烷。首先用高分辨率计算机断层扫描(CT;Inveon PET-CT,Siemens)扫描动物,通过尾静脉导管以55μL/min的速率连续输注CT造影剂(isovue-370,Bracco Diagnostics)。随后用FMT扫描仪(PerkinElmer)在同一盒中扫描动物。暴露时间为370-400ms的CT X-射线源在80kVp和500mA下操作。对比增强的高分辨率CT图像用于定位主动脉根部,其用于指导感兴趣的体积(volume)的放置,用于定量FMT蛋白酶活性图。图像融合依赖于基准标记。用OsiriXv.6.5.2(The OsirixFoundation,日内瓦)进行图像融合和分析。
放射标记HDL纳米颗粒
通过在配方混合物中包含1mol%的磷脂螯合物(phospholipidchelat)或DSPE-DFO(35)(以DMPC为代价)制备随时可标记的HDL纳米颗粒。然后如前所述(35)用锆-89(89Zr)标记含DFO的纳米颗粒。简言之,使纳米颗粒与89Zr-草酸盐在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.1)中于37℃反应1小时。使用10kDa分子量截止过滤管通过离心过滤进行纯化,并用新鲜无菌的PBS洗涤两次。放射化学产率为90±4%(n=3),放射化学纯度>97%,如通过尺寸排阻色谱法测定的。
小鼠中的药代动力学、生物分布和PET/CT成像研究
向喂食高脂肪饮食12周的雌性Apoe-/-小鼠(n=4,25.5±2.6g体重)注射89Zr-TRAF6i-HDL纳米颗粒(183±16μCi,5mg TRAF6i-HDL/kg)。在预定时间点(2、15和30分钟,以及1、4、8和24小时)采集血样,称重并使用2470Wizard自动伽玛计数器(Perkin Elmer)测量放射性含量。将数据转换为每克组织注射剂量的百分比[%ID/g],绘制在时间-活性曲线中,并使用Prism GraphPad(GraphPad Software inc,USA)中的非线性两相衰减回归拟合。最后计算加权血液放射性半衰期(t1/2)。
注射24小时后,在异氟醚/氧气混合物麻醉(2%用于诱导,1%用于维持)下在InveonPET/CT扫描仪(Siemens Healthcare Global)上扫描动物。PET静态扫描记录了至少2500万个重合事件并持续了10分钟。能量和重合时间窗口分别为350-700keV和6ns。将图像数据归一化以校正PET响应的不均匀性、死时间计数损失、正电子分支比和物理衰变到注入时间,但是不应用衰减、散射或部分体积平均校正。通过使用从含89Zr的小鼠大小的水当量体模的成像得到的系统校准因子,将重建图像中的计数率转换成活性浓度(%ID/g)。使用ASIProVMTM(Concorde Microsystems)和Inveon Research软件(Siemens HealthcareGlobal)分析图像。通过将在相邻感兴趣组织切片上绘制的至少5个ROI中的最大值进行平均来完成活性浓度的定量。使用设置为80kV电压和500μA电流的X-射线管进行全身标准低放大倍数CT扫描。使用120个旋转步骤获得CT扫描,总共220度,并且每帧的曝光量为145秒,估计扫描时间为120秒。在PET/CT扫描后立即处死动物并用PBS灌注。收集感兴趣的组织(肝脏、肾脏、脾脏、肺、肌肉、心脏、主动脉,骨和脑),印迹并称重。通过γ计数和放射性浓度测量放射性,表示为每克注射剂量的百分比[%ID/g]。
放射自显影
放射性计数后,将主动脉放置在与磷光成像板(BASMS-2325,Fujifilm,Valhalla,NY)相对的膜盒中,在-20℃下放置24小时,以确定放射性分布。用Typhoon 7000IP读板器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)以25μm的像素分辨率读板。
离体近红外荧光成像(NIRF)
雌性Apoe-/-小鼠喂食高脂肪饮食12周,接受单次静脉注射DiR(0.5mg/kg)标记的TRAF6i-HDL(5mg/kg,n=2)或生理盐水(n=1)。注射24小时后处死小鼠并用60mL PBS灌注。收集肝脏、脾脏、肺、肾脏、心脏和肌肉组织用于NIRF成像。使用IVIS 200系统(Xenogen)获得荧光图像,曝光时间为2秒,使用745nm激发滤光片和820nm发射滤光片。使用供应商提供的软件在每个组织上绘制ROI,然后使用这些ROI内的平均辐射效率进行定量分析。
血液检测
在处死时通过心脏穿刺收集小鼠血液。将血清送至IDEXX实验室(Totowa,NewJersey,USA)并用Olympus AU400化学分析仪分析。将全血收集至含EDTA的管中,并用IDEXXprocyte DX血液分析仪进行分析,以进行全血细胞计数分析。在输注后0和15分钟以及6、12、24、28、48和72小时收集非人灵长类动物血液。用Olymus AU400化学分析仪分析血清。还用IDEXX procyte DX血液分析仪分析全血样品。
非人灵长类动物研究
在肯塔基大学和西奈山的伊坎医学院用成年雄性食蟹猴(食蟹猕猴(Macacafascicularis))进行非人灵长类动物研究。动物平均年龄为7.3岁,体重为7.3±1.98千克(平均值±SD)。所有动物护理、程序和实验均基于西奈山伊坎医学院和肯塔基大学动物护理和使用委员会(University of Kentucky Institutional Anmial Care and UseCommittee)批准的机构协议。在可能的时候,在气候受控的12小时光照/黑暗周期条件下,配对饲养猴子。给猴子提供自由饮用的水并喂食Teklad Global 20%蛋白质灵长类饮食。对于肯塔基大学的实验,使用了六只雄性猴子。禁食过夜后,用氯胺酮(5mg/kg)和右美托咪定(0.0075-0.015mg/kg)麻醉猴子,并从股静脉采集血液。然后通过大隐静脉向猴子静脉注射载体(PBS,USP级)或TRAF6i-HDL,使得CD40-TRAF6抑制剂6877002的剂量为1.25mg/kg。注射后15分钟、6、12、24和48小时收集血液。抽血后,用阿替美唑(0.075-0.15mg/kg)逆转麻醉。注射72小时后,用氯胺酮(25mg/kg)麻醉禁食的猴子,最后一次采血,并在异氟烷(3-5%诱导,1-2%维持)麻醉的同时用全身盐水灌注放血安乐死。迅速取出组织并固定在10%中性缓冲福尔马林中。对血液进行全血计数(CBC)测试(ANTECH Diagnostics)。
对于西奈山伊坎医学院的实验,使用了六只雌性猴子。对于89Zr-PET/MRI成像,给动物输注58.9±17.9MBq的89Zr标记的TRAF6i-HDL(1.25mg/kg),并在不同时间点通过PET/MRI成像。在输注后的前60分钟内进行动态PET成像。在24、48和72小时进行额外的PET/MRI扫描。在组合的3T PET/MRI系统(Biograph mMR,Siemens Healthineers,Erlangen,Germany)上获得PET和MR图像。在第1天,用89Zr标记的TRAF6i-HDL注射后,直接使用覆盖胸部和腹部的一个床位置进行动态PET成像60分钟。同时,使用质子密度(PD)加权可变翻转角快速自旋回波(weighed Sampling Perfection with Application optimized Contrastsusingdifferent flip angle Evolution)(SPACE)序列获取解剖血管壁MR图像。MR成像参数为:采集平面,冠状面;重复时间(TR),1000ms;回波时间(TE),79ms;视场(FOV),300×187mm2;切片数量,144;平均数,4;带宽,601Hz/像素;加速因子(TF),51;回波序列/片,4;回波序列长度,192ms;回波间隔,3.7ms;采集持续时间,33分36秒。在动态PET采集后,使用3个连续的床位,每个10分钟,从颅骨到骨盆获得静态全身PET成像。与每个床同时,如上所述获取MR图像,除了仅使用1.4信号平均值(采集持续时间,每床11分44秒)。还使用3个床位置(每床的PET持续时间,30分钟;每床的MR持续时间,33分钟和36秒),在注射后24、48和72小时进行全身PET和MR成像。来自每床的全身MR图像由扫描仪自动整理在一起。采集后,使用西门子专有的e7tools和带有点扩散函数(PSF)校正的有序子集期望最大化(OSEM)算法,重建每床的PET原始数据并将它们离线整理在一起。双隔室(软组织和空气)衰减图用于衰减校正。
统计分析
除非另有说明,否则连续变量表示为平均值±标准偏差。通过使用非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验计算差异的显著性。概率值P<0.05被认为是显著的。使用社会科学统计软件包(SPSS)版本22.0.0.0进行统计分析。
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本文引用的所有参考文献均以引用的方式并入本文,其引用程度如同每个单独的出版物、数据库登录(例如Genbank序列或GeneID登录)、专利申请或专利被具体和单独地指出通过引用并入的那样。根据37 C.F.R.§1.57(b)(1),申请人打算以引用方式并入本声明,涉及每个单独的出版物、数据库登录(例如Genbank序列或GeneID登录)、专利申请或专利,其中每一个都根据37 C.F.R.§1.57(b)(2)明确标识,即使此类引用不是与专有的引用说明紧密相邻。在说明书中包含通过引用并入的专用声明(如果有的话),并不以任何方式削弱通过引用并入的一般性声明。本文引用的参考文献并非旨在承认该参考文献是相关的现有技术,也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。
本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上,除了本文所述的具体实施例之外,从前面的描述和附图中,本发明的各种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
前述书面的说明书足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所述的那些之外,从前面的描述中,本发明的各种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的,并且落入所附权利要求的范围内。
Claims (59)
1.一种诱导免疫耐受性的方法,包括向患者施用有效量的(i)包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂;和任选地(ii)包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL),并且其中所述CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成TRAF6i-HDL纳米颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述施用促进Ly-6Clo Mo/MΦ增长。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述患者患有自身免疫疾病,所述自身免疫疾病选自以下各项组成的组:乳糜泻、I型糖尿病、多发性硬化症、甲状腺炎、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、硬皮病、牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、秃头症、强直性脊柱炎、Churg-Strauss综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、白塞病综合征、克罗恩病、皮肌炎,肾小球性肾炎、格林-巴利综合征、肠易激综合征(IBD)、狼疮性肾炎、重症肌无力、心肌炎、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、风湿热、结节病、干燥综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述患者易患或患有动脉粥样硬化疾病,包括:冠状动脉粥样硬化、糖尿病性动脉粥样硬化、动脉粥样硬化后遗症,例如急性冠脉综合征、心肌梗死、心绞痛、周围性血管疾病、间歇性跛行、心肌缺血、中风、心力衰竭及其组合。
6.一种治疗动脉粥样硬化的方法,所述方法包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成TRAF6i-HDL纳米颗粒。
8.根据权利要求6或7所述的方法,还包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法,其中所述HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法,其中动脉粥样硬化包括:冠状动脉粥样硬化、糖尿病性动脉粥样硬化、动脉粥样硬化后遗症,例如急性冠脉综合征、心肌梗死、心绞痛、周围性血管疾病、间歇性跛行、心肌缺血、中风、心力衰竭及其组合。
12.一种靶向斑块或血管炎症部位中的巨噬细胞和/或单核细胞的方法,所述方法包括向患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成TRAF6i-HDL纳米颗粒。
14.根据权利要求12或13所述的方法,还包括向所述患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法,其中所述HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
17.一种预防器官或组织排斥的方法,所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物的步骤,所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含mTOR抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL)。
19.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法,其中所述患者已经经历器官或组织移植,并且移植的组织是肺组织、心脏组织、肾组织、肝组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、肌腱组织、骨髓或血管组织。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法,其中静脉内或动脉内施用所述组合物。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法,还包括向所述患者施用一种或多种免疫抑制剂。
23.一种减缓动脉粥样硬化进展的方法,所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL)的组合物的步骤,所述纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制成TRAF6i-HDL纳米颗粒。
25.根据权利要求23或24所述的方法,其中所述HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
26.一种组合物,其包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL),所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含m-TOR抑制剂。
27.根据权利要求26所述的组合物,其中所述HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
28.根据权利要求27所述的组合物,其中DMPC与MHPC的重量比为约3:1。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的组合物,其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为雷帕霉素纳米颗粒(mTOR-HDL或雷帕霉素-HDL)。
30.一种药物组合物,其包含a)药学有效量的权利要求26所述的组合物和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
31.根据权利要求30所述的药物组合物,还包含一种或多种免疫抑制剂或抗炎剂。
32.根据权利要求31所述的药物组合物,其中所述免疫抑制剂是环孢菌素A或FK506。
33.一种组合物,其包含高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒(HDL),所述高密度脂蛋白衍生的纳米颗粒包含CD40-TRAF6抑制剂。
34.根据权利要求33所述的组合物,其中所述HDL包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)和1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-磷酸胆碱(MHPC),并且还包含ApoA-1。
35.根据权利要求34所述的组合物,其中DMPC与MHPC的重量比为约8:1至约9:1。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的组合物,其中所述CD40-TRAF6抑制剂是6877002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药,配制为TRAF6i-HDL纳米颗粒。
37.一种药物组合物,其包含a)药学有效量的权利要求33所述的组合物和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
38.一种药物组合物,其包含权利要求30所述的药物组合物和权利要求37所述的药物组合物。
39.一种试剂盒,其包含权利要求26、30、33、37或38所述的组合物。
40.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述m-TOR抑制剂是雷帕霉素。
41.根据权利要求39所述的试剂盒,还包含一种或多种免疫抑制剂。
42.根据权利要求41所述的试剂盒,其中所述免疫抑制剂是环孢菌素A、FK506或雷帕霉素。
43.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述CD40-TRAF6抑制剂是6877002。
44.一种在患者中延长同种异体移植物存活的方法,包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求29、34或36所述的药物组合物。
45.一种在患者中降低树突细胞刺激能力的方法,包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求30、37或38所述的组合物。
46.一种在患者中促进调节性巨噬细胞增长的方法,包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求30、37或38所述的组合物。
47.一种在患者中诱导移植耐受性的方法,包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求30、37或38所述的组合物。
48.一种在患者中靶向骨髓细胞的方法,包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求30或38所述的组合物,其中所述mTOR-HDL降低患者循环中的Mo/MΦ数。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中所述组合物特异性靶向骨髓细胞。
50.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中所述患者已经经历移植,并且移植的组织是肺组织、心脏组织、肾组织、肝组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、肌腱组织、骨髓或血管组织。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述移植的组织是完整的器官。
52.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中所述患者已经接受同种异体组织或器官移植。
53.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中所述方法在进行同种异体组织或器官移植之前进行。
54.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中所述方法与同种异体组织或器官移植一起进行。
55.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中所述方法在同种异体组织或器官移植后至少两周内进行。
56.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中受试者是人。
57.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,其中静脉内或动脉内施用所述组合物。
58.根据权利要求44-48中任一项所述的方法,还包括向所述患者施用一种或多种免疫抑制剂药剂。
59.根据权利要求58所述的方法,其中所述免疫抑制剂是环孢菌素A或FK506。
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