ES2913073T3 - Direccionamiento del sistema inmunitario innato para inducir tolerancia a largo plazo y resolver la acumulación de macrófagos en aterosclerosis - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL), que comprende rapamicina, 1,2-(dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero- fosfocolina (MHPC) y ApoA-1 para su uso en la profilaxis del rechazo de órgano o tejido en un paciente.

Description

DESCRIPCIÓN

Direccionamiento del sistema inmunitario innato para inducir tolerancia a largo plazo y resolver la acumulación de macrófagos en aterosclerosis

Campo de la invención

Se proporcionan métodos y composiciones para inducir tolerancia a largo plazo mediante nanopartículas híbridas. Se proporcionan composiciones y formulaciones que comprenden nanopartículas híbridas con afinidad inherente por células inmunitarias innatas.

Antecedentes

La supervivencia indefinida del aloinjerto sigue siendo un objetivo difícil de alcanzar en el trasplante de órganos. El trasplante requiere la supresión del sistema inmunitario para prevenir el rechazo de órganos. Los pacientes sometidos a trasplante de órganos generalmente reciben una mezcla de fármacos inmunosupresores que incluye, pero no se limita a, corticosteroides, tacrolimus, ciclosporina y sirolimús (rapamicina)1-3 Tal terapia inmunosupresora ha mejorado drásticamente los resultados a corto plazo del trasplante de órganos. Sin embargo, todos los agentes inmunosupresores tienen efectos adversos graves, tales como infecciones, y toxicidad metabólica considerable4. Por consiguiente, existe una necesidad continua de reducir la toxicidad derivada del tratamiento inmunosupresor crónico y, por extensión, de mejorar la supervivencia a largo plazo. A pesar de los esfuerzos para usar agentes inmunosupresores disponibles actualmente de maneras menos tóxicas, ningún régimen alternativo ha desafiado seriamente el uso casi universal de estos fármacos.

Históricamente, los inmunólogos de trasplante han intentado desarrollar protocolos tolerogénicos novedosos dirigidos al mecanismo de respuesta inmune adaptativa. Tal trabajo se ha basado en la observación de que las células T son necesarias y suficientes para inducir el rechazo de aloinjertos. Sin embargo, la inducción de la tolerancia al trasplante lograda en modelos murinos no puede explicarse completamente por mecanismos que se dirigen solo a la inmunidad adaptativa, tal como la deleción de células T activadas5-7. Avances recientes en nuestra comprensión de cómo numerosas respuestas no específicas influyen en la actividad inmunitaria han revelado cómo el sistema inmunitario innato (a) reacciona al trasplante de órganos e (b) influye de manera crítica en la respuesta inmunitaria adaptativa hacia la inducción de la tolerancia a aloinjerto8-14. Sin embargo, el sistema inmunitario innato es una diana terapéutica in vivo potencial que no se ha explorado con éxito en el trasplante de órganos.

La rapamicina es uno de los fármacos inmunosupresores usados más ampliamente en el trasplante. Este fármaco bloquea la activación de linfocitos T y B a través de la inhibición de mTOR e inhibe eficazmente la proliferación de células T18. Sin embargo, el uso de este fármaco está asociado con efectos secundarios graves1920, incluyendo mayor susceptibilidad a la infección.

El documento US 6440990 da a conocer derivados de rapamicina como inmunosupresores.

En los presentes tratamientos, la supervivencia de aloinjerto requiere un cóctel de fármacos inmunosupresores. Se ha mostrado que los anticuerpos experimentales que se dirigen al sistema inmunitario innato inducen tolerancia a largo plazo, con efectos secundarios graves.

Por lo tanto, existe la necesidad de agentes terapéuticos que puedan modular el sistema inmunitario innato e inducir tolerancia a largo plazo con pocos efectos secundarios.

La aterosclerosis es una de las principales causas de muerte y discapacidad en el mundo. La aterosclerosis implica la deposición de placas grasas en la superficie luminal de arterias, lo que a su vez causa estenosis, es decir, estrechamiento de la arteria. En última instancia, esta deposición bloquea el flujo sanguíneo distal a la lesión provocando daño isquémico.

Todavía existe la necesidad de desarrollar agentes terapéuticos más eficaces para la aterosclerosis y novedosos que se dirigen a la inflamación de la placa.

Descripción de los dibujos

Las figuras 1A-G son diagramas que muestran una visión general de la nanoinmunoterapia con mTOR-HDL, modelo de aloinjerto, biodistribución y direccionamiento a células inmunitarias. La figura 1A es un diagrama que muestra que nanopartículas de mTOR-HDL, sintetizadas a partir de fosfolípidos, APOA1 humana y rapamicina, tenían una forma discoidal según lo evaluado por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y que pueden radiomarcarse con 89Zr. La figura 1B es un esquema que muestra corazones de donantes BALB/c (H2d) trasplantados en receptores C57BL/6 completamente alogénicos (H2b) que reciben nanoinmunoterapia con mTOR, que o bien están radiomarcados para obtención de imágenes por PET y biodistribución, o bien marcados fluorescentemente para la distribución entre subconjuntos celulares del sistema inmunitario innato y adaptativo. La figura 1C son imágenes representativas de fusión micro-PET/TC 3D de ratones 24 horas después de la administración intravenosa de mTOR-HDL radiomarcada con 89Zr (89Zr-mTOR-HDL). La imagen de TC se usó como referencia anatómica para crear regiones de interés para determinar la concentración de radioactividad en el corazón trasplantado (se proporciona película 3D como S2 A). La figura 1D es un gráfico del recuento de radiactividad que muestra la biodistribución de 89Zr-mTOR-HDL en tejidos de interés (riñón, hígado, bazo, sangre, hueso, piel y músculo) 24 horas después de la inyección. El contenido de radiactividad se expresó como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID/g). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), n=3. La figura 1E es la distribución de radiomarcadores determinada por autorradiografía en nativo (N) frente a corazón trasplantado (Tx) 24 h después de la administración intravenosa de 89Zr-mTOR-HDL en el mismo receptor. La cuantificación se llevó a cabo usando el software Image J. Las barras de error son desviaciones estándar (SD), n=3. La figura 1F son representaciones gráficas de estrategia de selección por citometría de flujo para distinguir células mieloides en sangre, bazo y el corazón trasplantado. Los histogramas grises muestran la distribución de células inmunitarias en los ratones inyectados con mTOR-HDL marcada con DiO en comparación con el control (histograma negro). La figura 1G son gráficos que muestran la intensidad de fluorescencia media (MFI) de neutrófilos, monocitos/macrófagos, monocitos/macrófagos Ly-6ClD y Ly-6Chi, células dendríticas y células T en la sangre, se muestra el bazo y el corazón trasplantado. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), n= 4; ANOVA *P< 0,05; **P <0,01.

Las figuras 2A-C son imágenes y gráficos que muestran que la nanoinmunoterapia con mTOR-HDL reajusta el sistema inmunitario innato. La figura 2A son gráficos que muestran el número total de leucocitos, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas infiltrantes de injerto. Análisis de citometría de flujo de diferentes subconjuntos de células en el corazón trasplantado de placebo, Se muestra a los receptores tratados con Oral-Ra y mTOR-HDL el día 6 después del trasplante (ANOVA *P < 0,05; **P < 0,01). La figura 2B son representaciones gráficas que muestran la frecuencia de macrófagos Ly-6Chi frente a Ly-6ClD en el corazón trasplantado de placebo, se muestran receptores tratados con Oral-Ra y mTOR-HDL. Los datos representan la media ± Se M; n=4 por grupo; ANOVA *P < 0,05; **P < 0,01. La figura 2C visualiza imágenes del análisis de matriz de genes GSEA. Los resultados indican que la ruta de mTOR está regulada por disminución en macrófagos intrainjerto Ly-6ClD de receptores tratados con mTOR-HDL. Se muestran matrices cromáticas derivadas de los datos de GSEA de genes seleccionados que logran p < 0,05 en macrófagos Ly-6ClD de los aloinjertos de receptores tratados con mTOR-HDL el día 6 después del trasplante (medias de n=3 por grupo).

Las figuras 3A-G son diagramas y gráficos que muestran que la nanoinmunoterapia con HDL induce la acumulación de macrófagos reguladores y promueve la aceptación del injerto. La figura 3A son imágenes que muestran la caracterización funcional de MO Ly-6ClD y Ly-6Chi y neutrófilos Ly-6G infiltrantes de injerto de ratones tratados con placebo y mTOR-HDL 6 días después del trasplante.

Resultados de citometría de flujo representativos y cuantitativos para la expresión de Ly-6C y Ly-6G en aloinjertos CD45+CD11b+, subconjuntos de células mieloides de los receptores de aloinjerto tratados con placebo y mTOR-HDL (parte superior). Se midió la capacidad supresora in vitro de MO Ly-6ClD infiltrante de injerto a partir de ratones tratados con placebo y mTOR-HDL. Se muestran resultados cuantitativos de citometría de flujo para células T CD8+ con CFSE, con el porcentaje de proliferación celular medido por dilución de CSFE después de 72 horas (parte central). Se evaluó la capacidad de expansión de T-reg in vitro de MO Ly-6ClD infiltrante de injerto a partir de ratones tratados con placebo y mTOR-HDL. El análisis de citometría de flujo indica el porcentaje de expresión de Foxp3 sobre células T CD4+ después del cocultivo durante 72 horas (parte inferior). Los datos se muestran como media ± SEM; n = 4 por grupo; prueba de la t **P < 0,01. La figura 3B son imágenes que muestran el porcentaje de células T CD4+CD25+ frente a CD4+CD25' infiltrantes de injerto a partir de receptores de aloinjerto tratados con placebo y mTOR-HDL. Los datos se muestran como media ± s EM; n=4 por grupo; prueba de la t **P < 0,01. La figura 3C son gráficos y diagramas de dispersión que muestran la caracterización fenotípica de MO Ly-6ClD y Ly-6Chi y neutrófilos Ly-6G infiltrantes de injerto, el día 6 después del trasplante, a partir de ratones tratados con mTOR-HDL después de la reducción de MO Ly-6ClD. Resultados de citometría de flujo representativos y cuantitativos de subconjuntos de células mieloides CD45+CD11b+ infiltrantes de injerto de receptores CD169-DTR tratados con mTOR-HDL que recibieron DT para la reducción de MO Ly-6ClD. Los datos se muestran como media ± SEM; n=4 por grupo; prueba de la t **P < 0,01. La figura 3D es una curva de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia del injerto después de la reducción de macrófagos Ly-6ClD en receptores tratados con mTOR-HDL. Los resultados indican que la transferencia adoptiva de monocitos de tipo silvestre restaura la tolerancia en receptores reducido en cuanto a macrófagos Ly-6ClD tratados con mTOR-HDL (n = 4 ratones en cada grupo; Kaplan-Meier **P< 0,01).

La figura 3E es un diagrama de cajas de la matriz génica para la expresión de CD40 en macrófagos Ly-6Clo obtenidos a partir de los aloinjertos de receptores tratados con placebo frente a mTOR-HDL (medias de n=3 por grupo; prueba de la t **P < 0,01). La figura 3F es una curva de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia del injerto de receptores de mTOR-HDL que reciben AcM CD40 estimulante agonista in vivo con o sin nanoinmunoterapia con TRAF6i-HDL (n=5 ratones en cada grupo; Kaplan-Meier **P < 0,01). La figura 3G es una curva de Kaplan-Meier que muestra las curvas de supervivencia de injerto de placebo, Oral-Ra, mTOR-HDL y terapia de combinación de mTOR-HDL/TRAF6i-HDL (n=8 ratones en cada grupo, análisis de supervivencia de Kaplan-Meier; P < 0,001 placebo frente a mTOR-HDL, P < 0,01 Oral-Ra frente a mTOR-HDL, P < 0,01 TRAF6i-HDL frente a mTOR-HDL/TRAF6i-HDL, P < 0,01 mTOR-HDL frente a mTOR-HDL/TRAF6i-HDL).

La figura 4 es una micrografía electrónica de transmisión que muestra la morfología discoidal de mTOR-HDL.

Las figuras 5A-C son gráficos e imágenes que muestran la biodistribución fisiológica y el direccionamiento de mTOR-HDL en ratones de tipo silvestre C57/B16. La figura 5A muestra imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano representativas (NIRF) de órganos inyectados con o bien control de PBS (primera fila de órganos) o bien mTOR-HDL marcada con DiR 24 horas antes del trasplante muestran acumulación en el hígado, bazo, pulmón, riñón, corazón y músculo. El panel derecho es un gráfico con barras que representan la relación de acumulación de mTOR-HDL-DiR con respecto a control en cada órgano, calculada dividiendo la señal total de cada órgano en los grupos de control y mTOR-HDL-DiR. Las barras de error son errores estándar de las medias (SEM), n=4; *P< 0,05; **P < 0,01, ***P < 0,001. La figura 5B es un gráfico que muestra la distribución de células mieloides en sangre y bazo. Los histogramas grises (derecha) muestran la distribución en ratones inyectados con mTOR-HDL marcada con DiO en comparación con la distribución en animales de control (histograma negro). La figura 5C son gráficos que muestran la intensidad de fluorescencia media (MFI) de neutrófilos, grupo de monocitos/macrófagos, monocitos Ly-6ClD / Ly-6Chi y células dendríticas en sangre y bazo. Las barras de error son errores estándar de las medias (SEM), n= 4; *P < 0,05; **P < 0,01.

La figura 6 es un gráfico que muestra los valores de absorción cuantificados con PET según el % de ID/g medio en el corazón, riñón, hígado y bazo trasplantado, n = 3.

Las figuras 7A-B son gráficos e imágenes de citometría de flujo que muestran que la nanoinmunoterapia con mTOR-HDL no se dirige a linfocitos T. La figura 7A es un diagrama de dispersión que muestra la estrategia de selección por citometría de flujo para distinguir células T en sangre y el corazón trasplantado. Los histogramas grises (derecha) muestran la distribución de células T en ratones inyectados con mTOR-HDL marcada con DiO en comparación con la distribución en animales de control (histograma negro). La figura 7B son gráficos que muestran la intensidad de fluorescencia media (MFI) de monocitos/macrófagos, células T CD3+, T CD4+ y T CD8+ en sangre y el corazón trasplantado. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), n= 4; **P <0,01; ***P < 0,001.

La figura 8 son gráficos que muestran el análisis de citometría de flujo de suspensiones celulares recuperadas de sangre y bazo de placebo, Receptores de aloinjerto tratados con Oral-Ra y mTOR-HDL el día 6 después del trasplante. Los datos se muestran como media ± SEM; n=4 por grupo; *P < 0,05; **P <0,01.

Las figuras 9A-B son diagramas y gráficos relacionados con la frecuencia de monocitos Ly-6Chi frente a Ly-6ClD en la sangre y el bazo a partir de receptores de aloinjerto tratados con placebo, Oral-Ra y mTOR-HDL. La figura 9B son gráficos que muestran una relación de monocitos Ly-6Chi con respecto a Ly-6ClD en la sangre, bazo y corazones trasplantados de receptores de aloinjerto tratados con placebo, Oral-Ra y mTOR-HDL. Los datos se muestran como media ± SEM; n=4 por grupo; *P < 0,05; **P <0,01.

La figura 10 es un gráfico que muestra la secreción de TNF-a 6 días después del trasplante en sueros a partir de receptores de aloinjertos tratados con placebo, Oral-Ra y mTOR-HDL, según lo analizado por ELISA.

Las figuras 11A-B son micrografías electrónicas de transmisión que muestran la morfología discoidal de TRAF6i-HDL. Las nanopartículas tenían un radio hidrodinámico medio de 19,2 ± 3,1 nm y una eficacia de incorporación de fármaco de 84,6 ± 8,6 %, según lo determinado por DLS y HPLC, respectivamente. La figura 11B muestra que la forma de disco de las partículas TRAF6i-HDL puede apreciarse cuando las partículas están en formación apilada, mientras que el tamaño de las nanopartículas puede evaluarse cuando se observan partículas desde una perspectiva de arriba hacia abajo.

Las figuras 12A-B son imágenes y una curva de Kaplan-Meier que muestra que la nanoinmunoterapia con mTOR-HDL prolonga drásticamente la supervivencia de aloinjerto de piel. La figura 12A son imágenes que muestran el rechazo de aloinjerto de piel en ratones de control y tratados con mTOR-HDL en diferentes puntos temporales después del trasplante, como se documenta por un microscopio con una cámara digital. La figura 12b es una curva de Kaplan-Meier de aloinjertos de piel (n = 4 ratones en cada grupo, P < 0,01 entre placebo y mTOR-HDL).

Las figuras 13A-B son gráficos que muestran imágenes de riñón e hígado (la figura 13A) e inmunohistoquímica cardíaca (IHC) (la figura 13B) para la evaluación de toxicidad. Las imágenes representativas de riñón e hígado de IHC para hematoxilina/eosina (H&E), el ácido peryódico Schiff (PAS) y el tricromo de Masson (Masson) no muestran signos de toxicidad. Se recogieron riñón e hígado a partir de receptores tratados con mTor/TRAF6i-HDL el día 100 después del trasplante (n=4; aumento X200). En la figura 13B las imágenes representativas de IHC para H&E y Sirio Rojo no muestran signos de vasculopatía de aloinjerto crónica (CAV). Se recogieron aloinjertos de corazón a partir de receptores tratados con mTor-HDL/TRAFi-HDL en el día 100 después del trasplante (n=4; aumento X200). Para la figura 13B, el análisis de vasculopatía de aloinjerto crónica, las secciones muestran inflamación circunferencial leve sin arteritis y no muestran signos de hiperplasia de la íntima. Los segmentos aórticos de ratón no mostraron ninguna alteración histológica sin engrosamiento de la íntima, y no mostraron signos de CAV.

Las figuras 14A-G son imágenes, esquemas y gráficos que muestran la biodistribución y absorción de nanopartículas de TRAF6Í-HDL. Se alimentaron ratones Apoe-/- de ocho semanas de edad con una dieta alta en colesterol durante 12 semanas y luego recibieron una inyección IV con o bien nanopartículas de TRAF6Í-HDL marcadas con o bien DiR-o bien DiO- o bien 89Zr-. Veinticuatro horas después, los ratones se usaron para la obtención de imágenes de PET/TC o se sacrificaron para la obtención de imágenes de NIRF ex vivo o el análisis de citometría de flujo. La figura 14A es una representación esquemática de TRAF6i-HDL, que se creó combinando apoA-I humana, lípidos (DMPC y MHPC) y un inhibidor de molécula pequeña de la interacción CD40-TRAF6. La figura 14B es una visión general del estudio que muestra las etapas posteriores que se tomaron para investigar TRAF6i-HDL. La figura 14C es un gráfico que muestra la farmacocinética de TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr en ratones Apoe-\-, que muestra la curva de decaimiento en sangre (panel izquierdo) y la imagen de fusión de PET/TC con representación en 3D de todo el cuerpo a las 24 horas después de la administración (panel derecho) que muestra la mayor absorción en el hígado, bazo y riñones. La figura 14D es un gráfico de recuento gamma de la distribución de TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr a las 24 horas después de la administración. La autorradiografía de la aorta muestra la acumulación visible de TRAF6i-HDL en la raíz aórtica, que es la ubicación preferencial del desarrollo de aterosclerosis en el modelo de ratón. La figura 14E muestra la obtención de imágenes de NIRF de distribución de TRAF6i-HDL marcadas con DiR en aorta de ratón (n=2), y gráficos correspondientes que muestran la acumulación de TRAF6i-HDL en el área de raíz aórtica. La figura 14F son datos de citometría de flujo de aortas de ratón completas (n=8) con TRAF6i-HDL marcadas con DiO, que muestran una alta eficiencia de direccionamiento de macrófagos y monocitos Ly6Chi, mientras que las células negativas para CD11b positivas para el linaje no absorbieron nanopartículas. ***p < 0,001. La figura 14G son imágenes del análisis de citometría de flujo de células de médula ósea, sangre, bazo y aorta, que muestran que los monocitos y macrófagos Ly6Chi captaron TRAF6i-HDL marcadas con DiO. Neutrófilos, monocitos Ly6Cloy células dendríticas también captaron DiO-TRAF6i-HDL, mientras que las células positivas para el linaje (todas las células no mieloides) no lo hicieron. Las barras representan el error estándar de la media.

Las figuras 15A-B son imágenes y gráficos que ilustran que la terapia con TRAF6i-HDL disminuyó el contenido de macrófagos en placa según lo evaluado por histología. Se alimentó a ratones Apoe-/- de ocho semanas de edad con una dieta alta en colesterol durante 12 semanas y posteriormente recibieron tratamiento con cuatro inyecciones i.v. de o bien PBS (n = 10), o bien rHDL (n=10) o bien TRAF6i-HDL (n=10), en el transcurso de siete días. Veinticuatro horas después de la última inyección, las raíces aórticas se cortaron en sección (4 |iM) y se tiñeron con métodos de inmunohistoquímica. La figura 15A son imágenes y gráficos de raíces aórticas que no muestran diferencias en el tamaño de la placa (H&E), contenido de colágeno (Sirio Rojo), o número de células proliferantes (tinción con Ki67) entre los grupos de tratamiento. La figura 15B son imágenes y gráficos que muestran la tinción con Mac3 de las raíces aórticas que ilustran una marcada disminución en el área positiva de macrófagos y una menor relación de macrófagos con respecto a colágeno. **p < 0,01, y ***p < 0,001.

Las figuras 16A-E son imágenes y gráficos que muestran que TRAF6i-HDL disminuye la inflamación de placa debido al reclutamiento de monocitos Ly6Chi deteriorado. Ratones Apoe-/- de ocho semanas de edad con una dieta alta en colesterol durante 12 semanas y se trataron con cuatro inyecciones i.v. de o bien placebo (PBS), o bien rHDL o bien TRAF6i-HDL en una sola semana. La figura 16A son imágenes y un gráfico de obtención de imágenes FMT/TC que muestran una actividad proteasa marcadamente disminuida en la raíz aórtica en el grupo tratado con TRAF6i-HDL (n=7) en comparación con el grupo tratado con placebo (n=8). La figura 16B son imágenes del análisis de citometría de flujo de aortas completas que muestran una reducción significativa en el número de macrófagos en el grupo tratado con TRAF6i-HDL (n = 27), en comparación con placebo (n = 27) y rHDL (n = 26). El hecho de que los monocitos Ly6Chi también se reduzcan notablemente en el grupo con TRAF6i-HDL indica el deterioro del reclutamiento de monocitos Ly6Chi. La figura 16C son imágenes y gráficos de análisis de citometría de flujo de médula ósea, sangre y bazo mostraron que la disminución en el contenido de monocitos Ly6Chi en placa no se pudo atribuir a disminuciones sistémicas en monocitos Ly6Chi. (La figura 16D son imágenes de experimentos de incorporación de BrdU in vivo que no muestran efecto de TRAF6i-HDL sobre la proliferación de macrófagos en placa. La figura 16E son gráficos a partir de experimentos in vitro (n=3) de incorporación de BrdU en macrófagos RAW 264.7 tratados durante 24 horas, con o bien placebo, o bien rHDL, o bien TRAF6i-HDL, o bien inhibidor de molécula pequeña de CD40-TRAF6 clásico o bien una combinación de rHDL inhibidor de molécula pequeña de CD40-TRAF6 clásico, no mostró ningún efecto sobre la proliferación de macrófagos. **p < 0,01, y ***p < 0,001.

Las figuras 17A-D son gráficos y diagramas que reflejan datos a partir del análisis del transcriptoma completo de monocitos/macrófagos en placa que ilustran el efecto del tratamiento con TRAF6i sobre la migración celular, entre otros procesos afectados. Se alimentó a ratones ApoE-/- de ocho semanas de edad con una dieta alta en colesterol durante 12 semanas y luego se trataron con cuatro inyecciones i.v. de o bien placebo (n=10) o bien TRAF6i-HDL (n=10) durante siete días. Veinticuatro horas después de la última inyección, se sacrificaron los ratones y se usaron secciones congeladas de raíces aórticas para el aislamiento de macrófagos en placa mediante microdisección de captura con láser, seguido de aislamiento y secuenciación de ARN. La figura 17A es un gráfico de tipo volcán, que muestra la distribución de genes expresados diferencialmente (DE) en monocitos/macrófagos en placa. La figura 17B es un gráfico que muestra el número total de genes significativamente regulados por aumento y disminución, según los valores de corte de un umbral de FDR de 0,2. La FDR < 0,2 corresponde a un valor de p < 0,009. (La figura 17C muestra el análisis de enriquecimiento génico del conjunto de genes DE dentro de la base de datos de ontología génica (GO), que muestra 15 términos de GO que están significativamente enriquecidos con genes DE. La figura 17D es una representación esquemática de un macrófago que muestra dos rutas significativamente alteradas (adhesión focal y endocitosis) identificadas mediante el mapeo de los 416 genes DE con la herramienta de ruta de la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG). También se representan los 8 genes DE más significativos con FDR < 0,05 y su ubicación dentro de la célula (los genes negros oscuros están regulados por aumento, los genes grises más claros están regulados por disminución, los genes se enumeran en las figuras 23-24).

Las figuras 18A-C son gráficos e imágenes que ilustran que la terapia con TRAF6i-HDL no muestra efectos tóxicos en primates no humanos. Seis primates no humanos se infundieron con o bien placebo (n = 3) o bien 1,25 mg/kg de TRAF6i-HDL (n=3). Se recogió sangre en múltiples puntos de tiempo y los animales se sacrificaron 72 horas después de la infusión. La figura 18A son gráficos de hemogramas completos que no muestran efectos de la terapia con TRAF6i-HDL sobre linfocitos, eritrocitos y plaquetas. La figura 18B son gráficos de análisis exhaustivos de química sanguínea que no muestran efectos tóxicos de la infusión de TRAF6i-HDL en biomarcadores de células hepáticas, renales, pancreáticas o musculares. Tampoco se vieron afectados lípidos, glucosa, proteína (albúmina y globulina) y electrolitos. La figura 18C son imágenes de muestras de hígado, riñones y bazo que se cortaron en sección y tiñeron (H&E) para análisis histológico y evaluado por un patólogo. No se encontraron signos de daño tisular o alteraciones en la arquitectura tisular en ninguno de los tejidos.

Las figuras 19A-D son imágenes y gráficos que muestran la biodistribución de TRAF6i-HDL en primates no humanos. Seis primates no humanos se infundieron con o bien TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr (1,25 mg/kg). Se adquirieron imágenes de PET dinámica en los 60 minutos posteriores a la infusión. Las exploraciones estáticas de PET/MRI se realizaron a las 24 horas, 48 horas y 72 horas. Se sacrificaron NHP después de 72 horas. Se recogieron los órganos para el análisis ex vivo. La figura 19a son imágenes de PET dinámica a 1, 5, 15, 30 y 60 minutos. Las imágenes se dividen para visualizar el hígado y otros órganos por separado. El gráfico muestra la absorción cuantificada en los órganos representados en los diferentes puntos de tiempo. La imagen de rotación a la derecha muestra una representación 3D de la distribución a los 60 min. La figura 19B son imágenes de PET/MR estática adicionales a las 24, 48 y 72 horas muestran la distribución y acumulación de TRAF6i-HDL. El gráfico muestra la absorción cuantificada en los órganos representados en los diferentes puntos de tiempo. La figura 19C incluye gráficos e imágenes que reflejan la distribución de recuento gamma en NHP a las 24 y 72 horas después de la administración de 89Zr-TRAF6i-HDL. La figura 19D es un gráfico que muestra la curva de actividad a lo largo del tiempo en sangre para 89Zr-TRAF6i-HDL en NHP.

La figura 20 es una tabla que muestra valores de hemograma completos de ratones Apoe-/- tratados con placebo, HDL y TRAF6i-HDL. Los valores de p se calcularon con las pruebas de Kruskal Wallis.

La figura 21 es una tabla que muestra valores de química sanguínea de ratones Apoe-/- tratados con placebo y TRAF6i-HDL. Los valores de P se calcularon mediante pruebas de la U de Mann Whitney. No se observaron diferencias significativas entre ninguno de los grupos, excepto por un aumento menor de la fosfatasa alcalina.

La figura 22 es una tabla que muestra la expresión diferencial de genes en términos de ontología génica. Se aislaron células positivas para CD68 a partir de placas de seno aórtico de ratones Apoe-/- mediante microdisección de captura con láser. 15 términos de GO mostraron enriquecimiento con genes expresados diferencialmente. Los valores P se muestran como valores de p ajustados.

La figura 23 es una tabla que muestra la expresión diferencial de genes en dos rutas de KEGG identificadas principales. Se aislaron células positivas para CD68 a partir de placas de seno aórtico de ratones Apoe-/- mediante microdisección de captura con láser. Expresión diferencial de genes en dos rutas significativas de KEGG, adhesión focal y endocitosis, entre los ratones Apoe-/- tratados con placebo y TRAF6i-HDL. Los valores de P se muestran como valores de p no ajustados.

La figura 24 es una tabla que muestra la expresión diferencial de genes con FDR < 0,05. Se aislaron células positivas para CD68 a partir de placas de seno aórtico de ratones Apoe-/- mediante microdisección de captura con láser. Se muestran la expresión diferencial de genes entre ratones Apoe-/- tratados con placebo y TRAF6i-HDL. Los valores de P se muestran como valores de p ajustados.

La figura 25 es una tabla que muestra la expresión diferencial de genes implicados en la proliferación, apoptosis y salida migratoria. Se aislaron células positivas para CD68 a partir de placas de seno aórtico de ratones Apoe-/-mediante microdisección de captura con láser. Se muestra la expresión diferencial de genes entre ratones Apoe-/-tratados con placebo y TRAF6i-HDL. Se muestran valores de p no ajustados.

Sumario

La presente divulgación proporciona una composición que comprende una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL), que comprende rapamicina, 1,2-(di-miristoil-sn-gIicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1 -miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-fosfocolina (MHPC) y ApoA-1 para su uso en la profilaxis del rechazo de órgano o tejido en un paciente.

La relación en peso de DMPC con respecto a MHPC es preferiblemente de aproximadamente 3:1. La composición farmacéutica comprende preferiblemente a) una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición y b) un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además uno o más agentes inmunosupresores o agentes antiinflamatorios. El agente inmunosupresor es preferiblemente ciclosporina A o FK506. El paciente se ha sometido preferiblemente a un trasplante de órgano o tejido y el tejido trasplantado es tejido pulmonar, tejido cardíaco, tejido renal, tejido hepático, tejido retiniano, tejido corneal, tejido cutáneo, tejido pancreático, tejido intestinal, tejido genital, tejido de ovario, tejido óseo, tejido de tendón, médula ósea, o tejido vascular. La composición se administra preferiblemente por vía intravenosa o intraarterial. La supervivencia de aloinjerto en el paciente preferiblemente se prolonga. El órgano es preferiblemente el corazón.

Descripción detallada

Se ha desarrollado una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) para administrar rapamicina a las células inmunitarias innatas. Una nanopartícula híbrida de HDL, denominada rapamicina-HDL (un mTOR-HDL a modo de ejemplo), que encapsula rapamicina en una corona de fosfolípidos naturales y la apolipoproteína A-I (APOA1) se desarrolló para prolongar la supervivencia de aloinjerto. Las nanopartículas de HDL contienen APOA1, que se unen eficazmente a células de macrófagos a través del receptor carroñero tipo B-1 (del inglés, scavenger receptor type B-1) (sr-b1) y el transportador de casete de unión a adenosina trifosfato A1 (ABCA1)2122. Como resultado, las nanopartículas de mTOR-HDL administran específicamente rapamicina a células inmunitarias innatas in vivo. Nanopartículas de mTOR-HDL, ~15 nm de diámetro, tenían una alta eficiencia de encapsulación de rapamicina de ~65 %. Se observó que mTOR-HDL radiomarcada se acumulaba específicamente en el corazón trasplantado y se asociaba principalmente con células mieloides. Los resultados demuestran una reducción significativa de Ly-6Chi/ Ly-6Clow así como células CD25Y CD25+ en el corazón trasplantado. Este tratamiento también dio como resultado una mejora drástica de la supervivencia de aloinjerto.

Adicionalmente, los inventores desarrollaron un elemento nanobiológico de HDL que incorpora un inhibidor de molécula pequeña (TRAF-STOP) dirigido contra el dominio de unión de CD40 en TRAF6 (denominado en lo sucesivo TRAF6i-HDL). El inhibidor 6877002 se usó para el desarrollo de esta TRAF6i-HDL (el inhibidor 6877002 se describe en Chatzigeorgiou et al. 2014, y también en la patente estadounidense n° 9.408.829, así como otros inhibidores). Las nanopartículas de TRAF6i-HDL tenían un radio hidrodinámico medio de 19,2 ± 3,1 nm y una eficacia de incorporación de fármaco de 84,6 ± 8,6 %. Las nanopartículas de TRAF6i-HDL pueden usarse solas o en combinación con las nanopartículas de mTOR-HDL descritas en el presente documento.

Pueden usarse otros inhibidores de CD40-TRAF6 tales como SMI 6860766 (descritos en Van der Berg et al. 2015) para formar TRAF6i-HDL alternativas. Estos inhibidores pueden usarse solos o en combinación con cualquiera de los otros elementos nanobiológicos como se describe en el presente documento. Compuestos adecuados adicionales para bloquear la interacción CD40-TRAF6 se describen en la patente estadounidense n° 9.408.829.

Usando un modelo experimental de trasplante de corazón en combinación con imágenes moleculares y técnicas inmunológicas, los presentes datos demuestran que mTOR-HDL restringe la potente capacidad estimulante de las células dendríticas, promueve el desarrollo de macrófagos reguladores, y prolonga indefinidamente la supervivencia de aloinjerto de corazón. El régimen comprendía solo tres inyecciones intravenosas en la vena de la cola de 5 mg/kg de rapamicina equivalente durante la primera semana después del trasplante. Usando una combinación de tomografía por emisión de positrones in vivo con obtención de imágenes por tomografía computarizada (PET-TC) y una matriz de ensayos inmunológicos, se evaluó el direccionamiento al aloinjerto de corazón y la especificidad celular. Posteriormente, se estudió extensamente la respuesta inmunitaria innata, la supervivencia de aloinjerto y mecanismos terapéuticos. Nuestros datos demuestran que el tratamiento con nanopartículas de mTOR-HDL promueve la supervivencia de aloinjerto de corazón indefinida. Adicionalmente, los inventores pudieron extender estos resultados en un modelo de trasplante de piel. Estos resultados proporcionan información crítica sobre cómo manipular la respuesta inmunitaria hacia la inducción de no respuesta específica del donante en la clínica e identificar nuevas dianas terapéuticas que puedan prevenir el rechazo de aloinjertos en seres humanos.

Además, los presentes datos demuestran que un tratamiento terapéutico a corto plazo con mTOR-HDL en combinación con una nanoinmunoterapia específica de CD40-TRAF6 inhibidora (TRAF6i-HDL) promueve sinérgicamente la aceptación del trasplante de órganos que conduce a la supervivencia de aloinjerto indefinida.

Juntos, los resultados demuestran que la nanoterapia basada en HDL representa un paradigma de tratamiento eficaz para la inducción de tolerancia al trasplante. Este estudio proporciona la base para desarrollar compuestos y tratamientos de nanomedicamentos terapéuticos novedosos que generan macrófagos inmunorreguladores inductores de tolerancia. Adicionalmente, se ha mostrado que el tratamiento con TRAF6i-HDL resuelve la acumulación de macrófagos en la aterosclerosis y exhibe un perfil de seguridad y eficacia deseable en primates no humanos.

Definiciones y métodos

Composiciones para su uso en la presente invención incluyen una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende rapamicina, 1,2-(di-miristoil-sn-gIicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1 -miristoil-2-hidroxisn-glicero-fosfocolina (m Hp C) y ApoA-1.

En determinadas realizaciones, la composición puede comprender además un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En determinadas realizaciones, la composición de HDL puede administrarse en combinación con uno o más agentes inmunosupresores adicionales tales como ciclosporina A, o FK506.

En una realización, “paciente” o “sujeto” se refiere a mamíferos e incluye sujetos humanos y veterinarios. En una realización, el sujeto es mamífero.

En una realización, el compuesto se administra en una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

El uso de la invención es profilaxis del rechazo de órgano o tejido en un paciente.

Adicionalmente, ya que cualquier trasplante está en riesgo de rechazo, realizaciones incluyen terapia adyuvante usando cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento para prevenir cualquier rechazo de trasplante.

Enfermedades mediadas por el rechazo de aloinjerto incluyen, pero no se limitan a trasplante de corazón, trasplante de piel, trasplante de hígado, trasplante de pulmón, síndrome de bronquiolitis obliterante (BOS), trasplante de riñón, trasplante de páncreas, trasplante de islotes pancreáticos, trasplante intestinal, trasplante de hueso, trasplante de retina, trasplante de médula ósea, trasplante de islotes y trasplante de córnea. Si un centro quiral u otra forma de un centro isomérico está presente en un compuesto de la presente invención, todas las formas de tal isómero o isómeros, incluyendo enantiómeros y diastereómeros, se pretende que estén cubiertos en el presente documento. Pueden usarse compuestos que contienen un centro quiral como una mezcla racémica, una mezcla enantioméricamente enriquecida, o la mezcla racémica puede separarse usando técnicas bien conocidas y puede usarse un enantiómero individual solo. Los compuestos descritos en la presente invención están en forma racémica o como enantiómeros individuales. Los enantiómeros pueden separarse usando técnicas conocidas, tales como los descritos en Pure and Applied Chemistry 69, 1469-1474, (1997) IUPAC. En casos en los que los compuestos tienen dobles enlaces carbonocarbono insaturados, tanto los isómeros cis (Z) como trans (E) están dentro del alcance de esta invención. En los casos en los que los compuestos pueden existir en formas tautoméricas, tales como tautómeros ceto-enol, cada forma tautomérica se contempla como que está incluida dentro de esta invención ya sea que exista en equilibrio o predominantemente en una forma.

Cuando la estructura de los compuestos usados en esta invención incluye un átomo de carbono asimétrico, tal compuesto puede producirse como racematos, mezclas racémicas, y enantiómeros individuales aislados. Todas estas formas isoméricas de estos compuestos están expresamente incluidas en esta invención. Cada carbono estereogénico puede tener la configuración R o S. Por consiguiente, debe entenderse que los isómeros que surgen de tal asimetría (por ejemplo, todos los enantiómeros y diastereómeros) están incluidos dentro del alcance de esta invención, a menos que se indique de otro modo. Tales isómeros pueden obtenerse en forma sustancialmente pura mediante técnicas de separación clásicas y mediante síntesis controlada estereoquímicamente, tales como los descritos en “Anantiomers, Racemates and Resolutions" por J. Jacques, A. Collet y S. Wilen, Pub. John Wiley & Sons, NY, 1981. Por ejemplo, la resolución puede llevarse a cabo mediante cromatografía preparativa en una columna quiral.

La presente invención también se pretende que incluya el uso de todos los isótopos de átomos que se producen en los compuestos dados a conocer en el presente documento. Isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números másicos. A modo de ejemplo general y sin limitación, isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio. Isótopos de carbono incluyen carbono-13 y carbono-14.

Se observará que cualquier notación de un carbono en estructuras a lo largo de esta solicitud, cuando se usa sin notación adicional, están destinados a representar todos los isótopos de carbono, tal como 12C, 13C, o 14C. Además, cualquier compuesto que contenga 13C o 14C puede tener específicamente la estructura de cualquiera de los compuestos dados a conocer en el presente documento.

También se observará que cualquier notación de un hidrógeno en estructuras a lo largo de esta solicitud, cuando se usa sin notación adicional, están destinados a representar todos los isótopos de hidrógeno, tal como 1H, 2H, o 3H. Además, cualquier compuesto que contenga 2H o 3H puede tener específicamente la estructura de cualquiera de los compuestos dados a conocer en el presente documento.

Compuestos marcados isotópicamente generalmente pueden prepararse mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica o mediante procesos análogos a los descritos en los ejemplos dados a conocer en el presente documento usando reactivos marcados isotópicamente apropiados en lugar de los reactivos no marcados empleados.

Los compuestos pueden estar en forma de sal. Como se usa en el presente documento, una “sal” es una sal de los presentes compuestos que se ha modificado haciendo sales, de ácido o base, de los compuestos. En el caso de compuestos usados para el tratamiento del cáncer, la sal es farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácido mineral u orgánico de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como fenoles. Las sales pueden prepararse usando un ácido orgánico o inorgánico. Tales sales de ácido son cloruros, bromuros, sulfatos, nitratos, fosfatos, sulfonatos, formiatos, tartratos, maleatos, malatos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos, y similares. Sales de fenolato son las sales de metales alcalinotérreos, sodio, potasio o litio. El término “sal farmacéuticamente aceptable” a este respecto, se refiere a las sales de adición ácidas o básicas inorgánicas y orgánicas relativamente no tóxicas de compuestos. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos, o tratando por separado un compuesto purificado en su forma de base libre o ácido libre con un ácido o base orgánica o inorgánica adecuada, y aislando la sal formada de ese modo. Sales representativas incluyen sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al. (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66:1-19).

Como se usa en el presente documento, “alquilo” incluye grupos de hidrocarburos alifáticos saturados tanto de cadena ramificada como lineal que tienen el número especificado de átomos de carbono y pueden estar no sustituidos o sustituidos. Los alquilos son alquilos C1-C10, o un subconjunto o individuo de los mismos. En un ejemplo no limitante, donde el alquilo es C1-C5 como en “alquilo C1-C5”, se define para incluir grupos que tienen 1, 2, 3, 4 o 5 carbonos en una disposición lineal o ramificada y específicamente incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, y pentilo. Alquilo puede estar opcionalmente sustituido con fenilo o fenilo sustituido para proporcionar bencilo sustituido o no sustituido.

Heterociclilo significa un radical monocíclico saturado o parcialmente insaturado que contiene de 3 a 8 átomos en el anillo y preferiblemente de 5 a 6 átomos en el anillo seleccionados de carbono o nitrógeno, pero no se limita a pirrolidina.

Como se usa en el presente documento, el término “arilo” se refiere a grupos aromáticos monocíclicos o multicíclicos que contienen de 5 a 15 átomos de carbono. Grupos arilo incluyen, pero no se limitan a grupos tales como fenilo no sustituido o sustituido. Cuando se hace referencia a que dicho arilo está sustituido, dicha sustitución puede estar en cualquier posición en el anillo, distinta del punto de unión al otro sistema de anillo de un compuesto. Por lo tanto, cualquier átomo de hidrógeno en el anillo de arilo puede estar sustituido con un sustituyente. Cuando el arilo es un anillo de fenilo, dicha sustitución puede estar en la posición meta- y/u orto- y/o para- con respecto al punto de unión. El arilo puede estar opcionalmente sustituido con un resto heterociclilo-C(O)- que incluye un resto pirrolidinilo-C(O)-.

El término “heteroarilo”, como se usa en el presente documento, representa un anillo monocíclico, bicíclico o policíclico estable de hasta 10 átomos en cada anillo, en donde al menos un anillo es aromático y contiene desde 1 hasta 4 heteroátomos o particularmente desde 1 hasta 2 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S. Grupos heteroarilo aromáticos bicíclicos incluyen anillos de fenilo, piridina, pirimidina o piridazina que están (a) fusionados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 6 miembros que tiene un átomo de nitrógeno; (b) fusionados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 5 o 6 miembros que tiene dos átomos de nitrógeno; (c) fusionados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 5 miembros que tiene un átomo de nitrógeno junto con un átomo de oxígeno o un átomo de azufre; o (d) fusionados a un anillo heterocíclico aromático (insaturado) de 5 miembros que tiene un heteroátomo seleccionado de O, N o S. Grupos heteroarilo dentro del alcance de esta definición incluyen, pero no se limitan a: benzoimidazolilo, benzofuranilo, benzofurazanilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, carbazolilo, carbolinilo, cinnolinilo, furanilo, indolinilo, indolilo, indolazinilo, indazolilo, isobenzofuranilo, isoindolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, naftpiridinilo, oxadiazolilo, oxazolilo, oxazolina, isoxazolina, oxetanilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridopiridinilo, piridazinilo, piridilo, pirimidilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolilo, quinoxalinilo, tetrazolilo, tetrazolopiridilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo, azetidinilo, aziridinilo, 1,4-dioxanilo, hexahidroazepinilo, dihidrobenzoimidazolilo, dihidrobenzofuranilo, dihidrobenzotiofenilo, dihidrobenzoxazolilo, dihidrofuranilo, dihidroimidazolilo, dihidroindoIilo, dihidroisooxazolilo, dihidroisotiazolilo, dihidrooxadiazolilo, dihidrooxazolilo, dihidropirazinilo, dihidropirazolilo, dihidropiridinilo, dihidropiriinidinilo, dihidropirroIiIo, dihidroquinolinilo, dihidrotetrazolilo, dihidrotiadiazolilo, dihidrotiazolilo, dihidrotienilo, dihidrotriazolilo, dihidroazetidinilo, metilendioxibenzoilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, acridinilo, carbazolilo, cinnolinilo, quinoxalinilo, pirrazolilo, indolilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, furanilo, tienilo, benzotienilo, benzofuranilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isoxazolilo, indolilo, pirazinilo, piridazinilo, piridinilo, pirimidinilo, pirrolilo, tetrahidroquinolina. En los casos en los que el sustituyente heteroarilo es bicíclico y un anillo no es aromático o no contiene heteroátomos, se entiende que la unión es a través del anillo aromático o a través del anillo que contiene heteroátomo, respectivamente. Si el heteroarilo contiene átomos de nitrógeno, se entiende que los N-óxidos correspondientes de los mismos también están abarcados por esta definición.

En los compuestos, los grupos alquilo, arilo, o heteroarilo pueden sustituirse adicionalmente reemplazando uno o más átomos de hidrógeno como grupos alternativos que no son hidrógeno. Estos incluyen, pero no se limitan a, 1-4 grupos seleccionados de alquilo, alcoxilo, halo, hidroxilo, mercapto, amino, carboxilo, ciano y carbamoílo.

El término “sustituido” se refiere a un grupo funcional como se describe anteriormente en el que uno o más enlaces a un átomo de hidrógeno contenido en el mismo se reemplazan por un enlace a átomos que no son hidrógeno o que no son carbono, siempre que se mantengan las valencias normales y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. Grupos sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces a un átomo de carbono(s) o hidrógeno(s) se reemplazan por uno o más enlaces, incluyendo enlaces dobles o triples, a un heteroátomo. Ejemplos de grupos sustituyentes incluyen los grupos funcionales descritos anteriormente, y, en particular, halógenos (es decir, F, Cl, Br y I); grupos alquilo, tales como metilo, etilo, n-propilo, isoproprilo, n-butilo, terc-butilo, y trifluorometilo; hidroxilo; grupos alcoxilo, tales como metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, e isopropoxilo; grupos ariloxilo, tales como fenoxilo; arilalquiloxilo, tales como benciloxilo (fenilmetoxilo) y p-trifluorometilbenciloxilo (4-trifluorometilfenilmetoxilo); grupos heteroariloxilo; grupos sulfonilo, tales como trifluorometanosulfonilo, metanosulfonilo, y p-toluenosulfonilo; nitro, nitrosilo; mercapto; grupos sulfanilo, tales como metilsulfanilo, etilsulfanilo y propilsulfanilo; ciano; resto de heterociclil-C(O); grupos amino, tales como amino, metilamino, dimetilamino, etilamino, y dietilamino; y carboxilo. Cuando se dan a conocer o reivindican múltiples restos sustituyentes, el compuesto sustituido puede estar sustituido independientemente por uno o más de los restos sustituyentes dados a conocer o reivindicados, individual o pluralmente. Por independientemente sustituido, se entiende que los (dos o más) sustituyentes pueden ser iguales o diferentes.

Se entiende que los sustituyentes y los patrones de sustitución en los compuestos pueden ser seleccionados por un experto en la técnica para proporcionar compuestos que sean químicamente estables y que puedan sintetizarse fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica, así como los métodos expuestos a continuación, a partir de materiales de partida fácilmente disponibles. Si un sustituyente está sustituido en sí mismo con más de un grupo, se entiende que estos múltiples grupos pueden estar en el mismo carbono o en diferentes carbonos, siempre que de como resultado una estructura estable.

Al elegir los compuestos, un experto en la técnica reconocerá que los diversos sustituyentes, es decir, R1, R2, etc. deben elegirse de conformidad con principios bien conocidos de conectividad de estructura química. Además, donde los hidrógenos no se muestran en las estructuras a base de carbono en el presente documento, se entiende que los hidrógenos implícitos completan valencias según se requiera.

Los compuestos pueden estar en forma de sal. Como se usa en el presente documento, una “sal” es sal de los presentes compuestos que se ha modificado haciendo sales, de ácido o base, de los compuestos. En el caso de compuestos usados para el tratamiento del cáncer, la sal es farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácido mineral u orgánico de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como fenoles. Las sales pueden prepararse usando un ácido orgánico o inorgánico. Tales sales de ácido son cloruros, bromuros, sulfatos, nitratos, fosfatos, sulfonatos, formiatos, tartratos, maleatos, malatos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos, y similares. Sales de fenolato son las sales de metales alcalinotérreos, sodio, potasio o litio. El término “sal farmacéuticamente aceptable” a este respecto, se refiere a las sales de adición de ácidos o bases inorgánicos y orgánicos relativamente no tóxicas de compuestos. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos, o haciendo reaccionar por separado un compuesto purificado en su forma de base libre o ácido libre con un ácido o base orgánico o inorgánico adecuado, y aislando la sal formada de ese modo. Sales representativas incluyen las sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al. (1977) “Pharmaceutical Salts”, J”. Pharm. Sci. 66:1-19).

Cuando se proporciona un intervalo numérico en el presente documento para cualquier parámetro, se entiende que todos los subconjuntos numéricos de ese intervalo numérico, y se proporcionan todos los valores enteros individuales contenidos en el mismo. Por lo tanto, el alquilo C1-C10 incluye el subconjunto de alquilos que son 1-3 átomos de carbono, el subconjunto de alquilos que son 2-5 átomos de carbono, etc. así como un alquilo que tiene 1 átomo de carbono, un alquilo que tiene 3 átomos de carbono, un alquilo que tiene 10 átomos de carbono, etc.

Las purinas discutidas en el presente documento son una o más de adenosina, inosina, hipoxantina o adenina. “Determinar”, como se usa en el presente documento, significa determinar experimentalmente.

El término “composición”, como en la composición farmacéutica, se pretende que abarque un producto que comprende el/los ingrediente(s) activo(s), y el/los ingrediente(s) inerte(s) (excipientes farmacéuticamente aceptables) que constituyen el portador, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de combinación, complejación o agregación de cualquiera de dos o más de los ingredientes, o de disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición preparada mezclando un compuesto de un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende rapamicina, 1,2-(di-miristoil-sn-gIicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-fosfocolina (MHPC) y ApoA-1, formulado como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), y excipientes farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en el presente documento, el término “opcionalmente” significa que el/los evento(s) descrito(s) posteriormente puede(n) ocurrir o no, e incluye tanto eventos, que se producen, como eventos que no se producen.

Como se usa en el presente documento, el término “sustituido con uno o más grupos” se refiere a la sustitución con el sustituyente o sustituyentes nombrados, múltiples grados de sustitución, hasta reemplazar todos los átomos de hidrógeno con sustituyentes iguales o diferentes, que está permitido a menos que se indique explícitamente el número de sustituyentes. Cuando el número de sustituyentes no se indica explícitamente, se pretende que sea uno o más.

Como se usa en el presente documento, el término “solvato” se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (por ejemplo, un compuesto de fórmula I, o una sal del mismo) y un disolvente. Tales disolventes pueden no interferir con la actividad biológica del soluto. Ejemplos de disolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, acetona, metanol, etanol y ácido acético. Preferiblemente, el disolvente usado es un disolvente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de disolventes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, etanol y ácido acético. Lo más preferiblemente, el disolvente es agua.

El término “derivado fisiológicamente funcional” se refiere a un compuesto (por ejemplo, un precursor de fármaco) que se transforma in vivo para producir un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de m-TOR, en donde el inhibidor de m-TOR es rapamicina o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto. La transformación puede ocurrir mediante diversos mecanismos (por ejemplo, mediante procesos metabólicos o químicos), tales como, por ejemplo, a través de hidrólisis en sangre. Profármacos son tales derivados, y proporciona una discusión del uso de profármacos mediante el documento de T. Higuchi y W. Stella, “Pro-drugs as Novel Delivery Systems”, Vol. 14 del A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. Adicionalmente, el término puede abarcar un compuesto (por ejemplo, un precursor de fármaco) que se transforma in vivo para producir un compuesto de HDL que abarca un inhibidor de CD40-TRAF6, por ejemplo, ^t R^a F6^í-HDL.

También se dan a conocer compuestos que comprenden además una TRAF6i-HDL (también denominado inhibidor de CD40-TRAF6), en donde el inhibidor es 6877002 (descrito en el documento de Zarzycka, T. et al., J. Chem. Inf. Model. 55:294-307 (2015) o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de TRAF6i-HDL (TRAF6i-HDL).El compuesto de nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende rapamicina, formulada como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), son útiles para prevenir (es decir, profilaxis) rechazo de aloinjerto. Además, combinar la composición TRAF6i-HDL con el régimen de tratamiento con mTOR-HDL proporciona efectos sinérgicos en la prevención (es decir, profilaxis) o inhibición del rechazo de aloinjertos.

También se proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica que incluye mezclar un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende rapamicina, formulada como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

También se da a conocer una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de CD40-TRAF6, en donde el inhibidor de CD40-TRAF6 es 6877002, o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de CD40-TRAF6 (TRAF6i-HDL), y sales, solvatos y derivados funcionales fisiológicos de la misma, y uno o más portadores, diluyentes, o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de CD40-TRAF6, en donde el inhibidor de CD40-t Ra F6 es 6877002 o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de CD40-TRAF6 (TRAF6i-HDL), y sales, solvatos y derivados funcionales fisiológicos de la misma, son como se describieron anteriormente. El/los portador(es), diluyente(s) o excipiente(s) deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor del mismo. También se proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica que incluye mezclar un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de CD40-TRAF, en donde el inhibidor de CD40-TRAF6 es 6877002 o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de CD40-TRAF6 (TRAF6i-HDL), o sales, solvatos y derivados funcionales fisiológicos de la misma, con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

También se da a conocer una composición de combinación que comprende tanto el inhibidor de CD40-TRAF6 como el inhibidor de m-TOR formulados como una formulación de nanopartículas de HDL combinada. En una composición de combinación de este tipo, el agente/compuesto activo puede ser como se ha descrito anteriormente, pero cualquier inhibidor de CD40-TRAF6 o inhibidor de m-TOR cargado adecuadamente puede formularse como una formulación de nanopartículas de HDL combinada.

Composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden presentarse en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de ingrediente activo por dosis unitaria. Una unidad de este tipo puede contener, por ejemplo, de 5 |ig a 1 g, preferiblemente de 1 mg a 700 mg, más preferiblemente de 5 mg a 100 mg de un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de m-TOR, en donde el inhibidor de m-TOR es rapamicina o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), dependiendo de la afección que se esté tratando, la vía de administración y la edad, peso y estado del paciente. Por lo tanto, tales dosis unitarias pueden administrarse más de una vez al día. Composiciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o subdosis diaria (para administración más de una vez al día), como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de las mismas, de un principio activo. Además, tales composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. La dosificación a modo de ejemplo incluye 5 mg/kg en ratones.

Composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden adaptarse para la administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral (incluyendo bucal o sublingual), inhalado, nasal, ocular, o parenteral (incluyendo intravenosa e intramuscular). Tales composiciones pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, poniendo en asociación el ingrediente activo con el/los portador(es) o excipiente(s).

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto dependerá de una serie de factores que incluyen, por ejemplo, la edad y el peso del animal, la afección precisa que requiere tratamiento y su gravedad, la naturaleza de la formulación, y la vía de administración, y, en última instancia, estará a discreción del médico o veterinario asistente. Sin embargo, una cantidad eficaz de un compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de m-TOR, en donde el inhibidor de m-TOR es rapamicina o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL) para el tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con el rechazo de aloinjerto, incluyendo trasplante de corazón, trasplante de piel, trasplante de hígado, trasplante de pulmón, síndrome de bronquiolitis obliterante (BOS), trasplante de riñón, trasplante de páncreas, trasplante de islotes pancreáticos, trasplante intestinal, trasplante de hueso, trasplante de retina, y trasplante de córnea estará generalmente en el intervalo de 5 |ig a 100 mg/kg de peso corporal del receptor (mamífero) por día y más normalmente en el intervalo de 5 |ig a 10 mg/kg de peso corporal por día. Esta cantidad puede administrarse en una sola dosis por día o más habitualmente en un número (tal como dos, tres, cuatro, cinco o seis) de subdosis por día de manera que la dosis diaria total es la misma. Una cantidad eficaz de una sal o solvato, de los mismos, puede determinarse como una proporción de la cantidad eficaz del compuesto de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de m-TOR, en donde el inhibidor de m-TOR es rapamicina o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulada como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), en sí misma.

El/los otro(s) agente(s) farmacéuticamente activo(s) puede(n) administrarse juntos o por separado y, cuando se administra por separado, esto puede ocurrir simultánea o secuencialmente en cualquier orden. Las cantidades del/de los compuesto(s) de una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende rapamicina y el/los otro(s) agente(s) farmacéuticamente activo(s) y los tiempos relativos de administración se seleccionarán para lograr el efecto terapéutico combinado deseado.

Se dan a conocer terapias combinadas que comprenden la administración de (i) nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) que comprende un inhibidor de m-TOR, en donde el inhibidor de m-TOR es rapamicina o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de rapamicina (mTOR-HDL), o la composición farmacéutica de los mismos y (ii) nanopartículas de TRAF6i-HDL que comprenden inhibidor de CD40-TRAF6, en donde el inhibidor de CD40-TRAF6 es 6877002, o una sal, solvato, polimorfo, tautómero o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, formulado como nanopartícula de TRAF6i-HDL (también denominada en general CD40-HDL), o la composición farmacéutica de los mismos.

Será evidente para un experto en la técnica que, cuando sea apropiado, el/los otro(s) ingrediente(s) terapéutico(s) puede(n) usarse en forma de sales, por ejemplo, como sales de metales alcalinos o aminas o como sales de adición de ácido, o profármacos, o como ésteres, por ejemplo ésteres de alquilo inferior, o como solvatos, por ejemplo, hidratos, para optimizar la actividad y/o estabilidad y/o características físicas, tal como solubilidad, del ingrediente terapéutico. También quedará claro que, cuando sea apropiado, los ingredientes terapéuticos pueden usarse en forma ópticamente pura.

Las combinaciones mencionadas anteriormente pueden presentarse convenientemente para su uso en forma de una composición farmacéutica y, por lo tanto, composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación como se definió anteriormente junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable representan un aspecto adicional de la invención.

Los compuestos individuales de tales combinaciones pueden administrarse o bien secuencialmente o bien simultáneamente en composiciones farmacéuticas separadas o combinadas. Preferiblemente, los compuestos individuales se administrarán simultáneamente en una composición farmacéutica combinada. Dosis apropiadas de agentes terapéuticos conocidos serán fácilmente apreciadas por los expertos en la técnica.

Los compuestos dados a conocer pueden prepararse mediante una variedad de métodos, incluyendo química estándar. Cualquier variable previamente definida continuará teniendo el significado previamente definido a menos que se indique de otro modo. A continuación se exponen métodos sintéticos generales ilustrativos y luego se preparan compuestos específicos de la invención en los ejemplos de trabajo.

Pueden prepararse compuestos por métodos conocidos en la técnica de síntesis orgánica como se establece en parte por los siguientes esquemas de síntesis. En todos los esquemas descritos a continuación, se entiende bien que los grupos protectores para grupos sensibles o reactivos se emplean cuando sea necesario según los principios generales de la química. Se manipulan grupos protectores según métodos estándar de síntesis orgánica (T. W. Green y P. G. M. Wuts (1991) Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons). Estos grupos se retiran en una etapa conveniente de la síntesis de compuesto usando métodos que son fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. La selección de grupos protectores, así como las condiciones de reacción y el orden de las etapas de reacción, deberán ser consistentes con la preparación de compuestos. Los expertos en la técnica reconocerán si existe un estereocentro en los compuestos. Por consiguiente, la presente divulgación incluye todos los estereoisómeros posibles e incluye no solo mezclas de estereoisómeros (tales como compuestos racémicos) sino también los estereoisómeros individuales. Cuando se desea un compuesto como un enantiómero individual, puede obtenerse por síntesis estereoespecífica o por separación del producto final o cualquier producto intermedio conveniente. La separación del producto final, un producto intermedio, o un material de partida puede efectuarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Stereochemistry of Organic Compounds de E. L. Eliel, S. H. Wilen, y L. N. Mander (Wiley-Interscience, 1994).

Un “injerto trasplantable” se refiere a un material biológico, tales como células, tejidos y órganos (en su totalidad o en parte) que puede administrarse a un sujeto. Injertos trasplantables pueden ser autoinjertos, aloinjertos, o xenoinjertos de, por ejemplo, un material biológico tal como un órgano, tejido, piel, hueso, nervios, tendón, neuronas, vasos sanguíneos, grasa, córnea, células pluripotentes, células diferenciadas (obtenidas o derivadas in vivo o in vitro), etc. Se forma un injerto trasplantable, por ejemplo, a partir de cartílago, hueso, matriz extracelular, o matrices de colágeno. Injertos trasplantables también pueden ser células individuales, suspensiones de células y células en tejidos y órganos que pueden trasplantarse. Células trasplantables típicamente tienen una función terapéutica, por ejemplo, una función de la que se carece o está disminuida en un sujeto receptor. Algunos ejemplos no limitantes de células trasplantables son células de los islotes, células beta, hepatocitos, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales, neuronas, células gliales, o células mielinizantes. Células trasplantables pueden ser células que no están modificadas, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto donante y utilizables en el trasplante sin ninguna modificación genética o epigenética. Células trasplantables pueden ser células modificadas, por ejemplo, células obtenidas de un sujeto que tiene un defecto genético, en las que se ha corregido el defecto genético, o células que se derivan de células reprogramadas, por ejemplo, células diferenciadas derivadas de células obtenidas de un sujeto.

“Trasplante” se refiere al proceso de transferir (mover) un injerto trasplantable a un sujeto receptor (por ejemplo, de un sujeto donante, de una fuente in vitro (por ejemplo, células pluripotentes nativas o inducidas autólogas o heterólogas diferenciadas) y/o de una ubicación corporal a otra ubicación corporal en el mismo sujeto.

“Respuesta inmunitaria no deseada” se refiere a cualquier respuesta inmunitaria no deseada que resulta de la exposición a un antígeno, promueve o exacerba una enfermedad, trastorno o afección proporcionada en el presente documento (o un síntoma de los mismos), o es sintomático de una enfermedad, trastorno o afección proporcionada en el presente documento. Tales respuestas inmunitarias generalmente tienen un impacto negativo en la salud de un sujeto o son sintomáticas de un impacto negativo en la salud de un sujeto.

En una realización, el tejido trasplantado es tejido pulmonar, tejido cardíaco, tejido renal, tejido hepático, tejido retiniano, tejido corneal, tejido cutáneo, tejido pancreático, tejido intestinal, tejido genital, tejido de ovario, tejido óseo, tejido de tendón, o tejido vascular.

En una realización, el tejido trasplantado se trasplanta como un órgano intacto.

Como se usa en el presente documento, un “sujeto receptor” es un sujeto que va a recibir, o que ha recibido, una célula, tejido u órgano trasplantados de otro sujeto.

Como se usa en el presente documento, un “sujeto donante” es un sujeto del que una célula, tejido u órgano a trasplantar se extrae antes del trasplante de esa célula, tejido u órgano a un sujeto receptor.

En una realización, el sujeto donante es un primate. En una realización adicional, el sujeto donante es un ser humano. En una realización, el sujeto receptor es un primate. En una realización, el sujeto receptor es un ser humano. En una realización, tanto los sujetos donantes como los receptores son seres humanos. Por consiguiente, la presente invención incluye la realización de xenotrasplante.

Como se usa en el presente documento, “rechazo por un sistema inmunitario” describe el evento de respuesta hiperaguda, aguda y/o crónica del sistema inmunitario de un sujeto receptor que reconoce una célula, tejido u órgano trasplantados de un donante como respuesta inmunitaria no propia y consecuente.

El término “alogénico” se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término “autólogo” se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se reintroducirá en el mismo individuo.

Como se usa en el presente documento, un “fármaco inmunosupresor” es un fármaco farmacéuticamente aceptable usado para suprimir la respuesta inmunitaria de un sujeto receptor. Ejemplos no limitantes incluyen ciclosporina A, FK506 y rapamicina.

Como se usa en el presente documento, una cantidad “profilácticamente eficaz” es una cantidad de una sustancia eficaz para prevenir o retrasar la aparición de una afección patológica dada en un sujeto al que se va a administrar la sustancia. Una cantidad profilácticamente eficaz se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, ya que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Como se usa en el presente documento, una cantidad “terapéuticamente eficaz” es una cantidad de una sustancia eficaz para tratar, mejorar o disminuir un síntoma o causa de una afección patológica dada en un sujeto que padece la misma al que se va a administrar la sustancia.

En una realización, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es desde aproximadamente 1 mg de agente/kg de sujeto hasta aproximadamente 1 g de agente/kg de sujeto por dosificación. En otra realización, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es desde aproximadamente 10 mg de agente/kg de sujeto hasta 500 mg de agente/sujeto. En una realización adicional, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es desde aproximadamente 50 mg de agente/kg de sujeto hasta 200 mg de agente/kg de sujeto. En una realización adicional, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es de aproximadamente 100 mg de agente/kg de sujeto. En otra realización adicional, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz se selecciona desde 50 mg de agente/kg de sujeto, 100 mg de agente/kg de sujeto, 150 mg de agente/kg de sujeto, 200 mg de agente/kg de sujeto, 250 mg de agente/kg de sujeto, 300 mg de agente/kg de sujeto, 400 mg de agente/kg de sujeto y 500 mg de agente/kg de sujeto.

“Tratar” o “tratamiento” de un estado, trastorno o afección incluye:

(1 ) prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos del estado, trastorno, o afección que se desarrolla en una persona que puede estar afectada por o predispuesta al estado, trastorno o afección, pero aún no experimenta ni muestra síntomas clínicos del estado, trastorno o afección; o

(2 ) inhibir el estado, trastorno o afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de tratamiento de mantenimiento) o al menos un síntoma, signo, o prueba clínicos, de la misma; o

(3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado, trastorno o afección o al menos uno de sus síntomas o signos clínicos o subclínicos.

El beneficio para un sujeto a tratar es o bien estadísticamente significativo o bien al menos perceptible para el paciente o para el médico.

Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, ya que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Excipientes, diluyentes, y portadores aceptables para su uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en el documento Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A. R. Gennaro edit. 2005). La elección de excipiente, diluyente, y portador farmacéuticos puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica convencional.

Como se usa en el presente documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que se “consideran generalmente seguras”, por ejemplo, que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o adversa similar, tal como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano. Preferiblemente, como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas para su uso en animales, y más particularmente, en seres humanos.

“Paciente” o “sujeto” se refiere a mamíferos e incluye sujetos humanos y veterinarios. Determinados sujetos veterinarios pueden incluir especies aviares.

Esta invención se entenderá mejor a partir de los detalles experimentales, que aparecen a continuación. Sin embargo, un experto en la materia apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos discutidos son meramente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen más adelante en el presente documento.

Métodos generales

Métodos estándar en biología molecular se describen en los documentos de Sambrook, Fritsch y Maniatis (1982 & 19892a Edición, 3a edición de 2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). También aparecen métodos estándar en el documento de Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonación en células bacterianas y mutagénesis de ADN (Vol.

1), la clonación en células de mamífero y levadura (Vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3), y bioinformática (Vol. 4).

Se describen métodos para la purificación de proteínas que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación, y cristalización (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc. New York). Se describen el análisis químico, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión, glicosilación de proteínas (véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc. New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; págs. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., págs. 384-391). Se describen la producción, purificación, y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, anteriormente). Están disponibles técnicas estándar para caracterizar interacciones ligando/receptor (véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).

La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus. Derivados adecuados de rapamicina incluyen, por ejemplo, compuestos de fórmula I en donde R.sub.1 es CH.sub.3 o C.sub.3-6alquinilo, R.sub.2 es H o --CH.sub.2--CH.sub.2--OH, y X es .dobleenlace.O, (H,H) o (H,OH) siempre que R.sub.2 sea distinto de H cuando X es .dobleenlace.O y R.sub.1 es CH.sub.3. La estructura de la rapamicina se muestra a continuación:

Compuestos de fórmula I se dan a conocer en el presente documento, por ejemplo, en las patentes estadounidenses de n.os 5.665.772; 6.440.990; 5.985.890; y 6.200.985. Pueden prepararse como se da a conocer o por analogía a los procedimientos descritos en estas referencias.

Compuestos preferidos son 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-iniloxi-32-desoxorapambicina, 16-pent-2-iniloxi- 32(S) dihidro-rapamicina, 16-pent-2-iniloxi-32(S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina y, más preferiblemente, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina (denominada posteriormente compuesto A), dados a conocer como el ejemplo 8 en las patentes estadounidenses n.os 5.665.772 y 6.440.990.

Compuestos de fórmula I tienen, sobre la base de la actividad observada, por ejemplo, unión a macrofilina-12 (también conocida como proteína de unión a FK-506 o FKBP-12), por ejemplo, como se describe en el documento WO 94/09010, WO 95/16691 o WO 96/41807, se ha encontrado que es útil, por ejemplo, como inmunosupresor, por ejemplo, en el tratamiento del rechazo agudo de aloinjerto.

También se dan a conocer nanopartículas que comprenden derivados de rapamicina con hidrofobicidad y/o miscibilidad mejoradas. Por ejemplo, puede conjugarse rapamicina con una cadena de alquilo como se describe en el documento de Zhao et al. Augmenting drug-carrier compatibility improves tumour nanotherapy efficacy , Nature Communications 7, Número de artículo: 11221 (2016) doi:10.1038/ncomms11221.

La adición de colesterol ha estabilizado la formulación, así como una eficacia de atrapamiento mejorada. El porcentaje en peso de colesterol varía desde aproximadamente 0 % hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 1 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 2 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 3 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 4 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 5 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 6 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 7 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 8 % (p/p) hasta aproximadamente 10 % (p/p), desde aproximadamente 1 % (p/p) hasta aproximadamente 9 % (p/p), desde aproximadamente 1 % (p/p) hasta aproximadamente 8 % (p/p), desde aproximadamente 1 % (p/p) hasta aproximadamente 7 % (p/p), o desde aproximadamente 1 % (p/p) hasta aproximadamente 6 % (p/p), de la nanopartícula, de los lípidos, o de la composición.

Vehículos de suministro tales como liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas, y similares, pueden usarse para la introducción de las composiciones que se dirigen al sistema inmunitario innato, por ejemplo, que se dirigen a macrófagos para inducir tolerancia a trasplante. Además de formularse como una nanoterapia como mTOR-HDL, los compuestos que se dirigen a macrófagos pueden formularse para el suministro en una serie de formas y métodos diferentes que incluyen o bien encapsulados en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, o bien una nanopartícula o similar.

La formación y el uso de liposomas se conoce generalmente por los expertos en la técnica. Recientemente, se desarrollaron liposomas con estabilidad en suero y semividas en circulación mejoradas (patente estadounidense n.° 5.741.516). Además, se han descrito diversos métodos de preparaciones similares a liposomas y liposomas como posibles portadores farmacológicos (patente estadounidense n.os 5.567.434; 5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 y 5.795.587).

Se han usado liposomas con éxito con una serie de tipos celulares que normalmente son resistentes a la transfección por otros procedimientos. Además, los liposomas están libres de las restricciones de longitud de ADN que son típicas de los sistemas de suministro basados en virus. Se han usado eficazmente liposomas para introducir genes, fármacos, agentes radioterapéuticos, virus, factores de transcripción y efectores alostéricos en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. Además, se han completado varios ensayos clínicos exitosos que examinan la eficacia de la administración de fármacos mediada por liposomas.

Se forman liposomas a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV). Las MLV generalmente tienen diámetros de desde 25 nm hasta 4 |im. La sonicación de MLV da como resultado la formación de vesículas unilaminares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una disolución acuosa en el núcleo.

Alternativamente, pueden usarse formulaciones de nanocápsula de las composiciones que se dirigen al sistema inmunitario innato. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar sustancias de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (tamaño alrededor de 0,1 |im) debe diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Nanopartículas biodegradables de polialquil-cianoacrilato que cumplen estos requisitos se contemplan para su uso.

“Nanoportador(es) sintético(s)” significa un objeto discreto que no se encuentra en la naturaleza, y que posee al menos una dimensión que es menor o igual a 5 micrómetros de tamaño. Un nanoportador sintético puede ser, pero no se limita a, una o una pluralidad de nanopartículas basadas en lípidos (también denominadas en el presente documento nanopartículas lipídicas, es decir, nanopartículas donde la mayoría del material que constituye su estructura son lípidos), nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones a base de tensioactivo, dendrímeros, buckyballs, nanohilos, partículas similares a virus (es decir, partículas que están compuestas principalmente por proteínas estructurales víricas pero que no son infecciosas o tienen baja infectividad), partículas a base de proteínas o péptidos (también denominadas en el presente documento partículas de proteínas, es decir, partículas donde la mayoría del material que constituye su estructura son péptidos o proteínas) (tales como nanopartículas de albúmina) y/o nanopartículas que se desarrollan usando una combinación de nanomateriales tales como nanopartículas de lípidopolímero. Nanoportadores sintéticos pueden tener una variedad de formas diferentes, incluyendo, pero no limitado a, esferoidal, cuboidal, piramidal, oblonga, cilíndrica, toroidal, y similares. Nanoportadores sintéticos comprenden una o más superficies. Nanoportadores sintéticos a modo de ejemplo que pueden adaptarse para su uso en la práctica comprenden: (1) las nanopartículas biodegradables dadas a conocer en la patente estadounidense n.° 5.543.158 de Gref et al., (2) las nanopartículas poliméricas de la solicitud de patente estadounidense publicada 20060002852 de Saltzman et al., (3) las nanopartículas construidas litográficamente de la solicitud de patente estadounidense publicada 20090028910 de DeSimone et al., (4) la divulgación del documento WO 2009/051837 de Von Andrian et al., (5) las nanopartículas dadas a conocer en la solicitud de patente estadounidense publicada 2008/0145441 de Penades et al., (6) las nanopartículas de proteína dadas a conocer en la solicitud de patente estadounidense publicada 20090226525 de los Rios et al., (7) las partículas similares a virus dadas a conocer en la solicitud de patente estadounidense publicada 20060222652 de Sebbel et al., (8) las partículas similares a virus acopladas a ácido nucleico dadas a conocer en la solicitud de patente estadounidense publicada 20060251677 de Bachmann et al., (9) las partículas similares a virus dadas a conocer en los documentos WO2010047839A1 o WO2009106999A2, (10) las nanopartículas nanoprecipitadas dadas a conocer en el documento de P. Paolicelli et al., “Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles” Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010), u (11) células apoptóticas, cuerpos apoptóticos o los miméticos sintéticos o semisintéticos dados a conocer en la publicación estadounidense 2002/0086049. Los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación de aspecto mayor que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, o mayor que 1:10.

Nanoportadores sintéticos pueden tener una dimensión mínima igual o inferior a aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual o inferior a 100 nm, no comprenden una superficie con grupos hidroxilo que activan el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no son grupos hidroxilo que activan el complemento. Nanoportadores sintéticos pueden tener una dimensión mínima igual o inferior a aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual o inferior a 100 nm, no comprenden una superficie que activa sustancialmente el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan sustancialmente el complemento. Nanoportadores sintéticos pueden tener una dimensión mínima igual o inferior a aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual o inferior a 100 nm, no comprenden una superficie que active el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan el complemento. Nanoportadores sintéticos excluyen partículas similares a virus. Nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación de aspecto mayor que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, o mayor que 1 :10.

La presente nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL) comprende 1,2-di-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), y 1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-fosfocolina (MHPC). La relación en peso de DMPC con respecto a MHPC puede variar de desde aproximadamente 1:10 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 4:1, desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 5:1, desde aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 5:1, desde aproximadamente 6:1 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 7:1 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 8:1 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 7:1 hasta aproximadamente 9:1, o desde aproximadamente 8:1 hasta aproximadamente 9:1. La relación en peso de DMPC con respecto a MHPC puede ser de aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:9, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, o aproximadamente 10:1.

Inhibidores de mTor y combinaciones con otros componentes farmacéuticamente activos

Ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen rapamicina y análogos de la misma (por ejemplo, CCL-779, RAD001, AP23573, C20-metalilrapamicina (C20-Marap), C16-(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BSrap), C16-(S)-3-metilindolerapamicina (c16-iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (n Vp-BEZ235), ácido crisofánico (crisofanol), deforolimus (MK-8669), everolimus (RAD0001), Ku -0063794, PI-103, PP242, temsirolimus, y WYE-354 (disponible de Selleck, Houston, Tex. EE.UU.).

Uno o más ingredientes activos adicionales o alternativos que se dirigen a macrófagos PIRb+ y que promueven la supervivencia de aloinjerto pueden utilizarse en combinación. Uno cualquiera o más de estos ingredientes activos pueden formularse en una unidad de dosificación, o en una combinación de formas tales como una nanopartícula de mTOR-HDL podría administrarse en combinación con una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera que comprende un segundo o tercer ingrediente activo. Otros agentes activos adecuados incluyen uno o más agentes inmunosupresores.

Regímenes/opciones de tratamiento

La mTOR-HDL puede usarse en combinación con otras terapias de inducción que se dirigen a la respuesta inmunitaria adaptativa tal como la reducción de células T y B. Por ejemplo, para donantes vivos de riñón, los receptores de trasplante pueden tratarse antes y poco después del trasplante. Los pacientes bajo terapia inmunosupresora actual pueden cambiarse a la terapia de mTOR-HDL, o terapia de combinación de mTOR-HDL/TRAF6i-HDL. En escenarios adicionales, el tratamiento de mTOR-HDL se administra al paciente antes y poco después del trasplante, lo que puede repetirse cada 6 o 12 meses, con el objetivo de eliminar o reducir fuertemente la terapia inmunosupresora. En escenarios adicionales, a los pacientes se les administra la terapia de mTOR-HDL, o terapia de combinación de mTOR-HDL/TRAF6i-HDL sin ninguna terapia inmunosupresora adicional.

Inmunosupresores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, estatinas; inhibidores de mTOR, tal como rapamicina o un análogo de rapamicina; agentes de señalización TGF-.beta.; agonistas del receptor TGF-.beta.; inhibidores de histona desacetilasa (HDAC); corticosteroides; inhibidores de función mitocondrial, tales como rotenona; inhibidores de P38; inhibidores NF-.kappa..beta.; agonistas de receptor de adenosina; agonistas de prostaglandina E2; inhibidores de fosfodiesterasa, tales como inhibidor de fosfodiesterasa 4; inhibidores de proteasoma; inhibidores de quinasa; agonistas de receptor acoplado a proteína G; antagonistas de receptor acoplados a proteína G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citocinas; inhibidores de receptor de citocinas; activadores de receptor de citocinas; antagonistas de receptor activado por proliferador de peroxisomas; agonistas de receptor activado por proliferador de peroxisomas; inhibidores de histona desacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasa y ATP oxidados. Los inmunosupresores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporina A, inhibidores de receptor de hidrocarburos de arilo, resveratrol, azatiopurina, 6-mercaptopurina, aspirina, ácido niflúmico, estriol, tripólido, interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-10), ciclosporina A, ARNip que se dirigen a citocinas o receptores de citocinas y similares. Ejemplos de estatinas incluyen atorvastatina (LIPITOR.RTM., TORVAST.RTM.), cerivastatina, fluvastatina (LESCOL.RTM., LESCOL.RTM. XL), lovastatina (MEVACOR.RTM., ALTOCOR.RTM., ALTOPREV.RTM.), mevastatina (COMPACTIN.RTM.), pitavastatina (LIVALO.RTM., PIAVA.RTM.), rosuvastatina (PRAVACHOL.RTM., SELEKTINE. RTM., LIPOSTAT.RTM.), rosuvastatina (CRESTOR.RTM.), y simvastatina (ZOCOR.RTM., LIPEX.RTM.).

La nanoterapia de mTOR-HDL se sometió a prueba en un modelo de ratón de trasplante de corazón alogénico. El régimen comprendía solo tres inyecciones intravenosas en la vena de la cola de 5 mg/kg de rapamicina equivalente durante la primera semana después del trasplante. Usando una combinación detomografía por emisión de positrones in vivo con obtención de imágenes por tomografía computarizada (PET-TC) y una matriz de ensayos inmunológicos, se evaluaron el direccionamiento al aloinjerto de corazón y la especificidad celular. Posteriormente, la respuesta inmune innata se analizó junto con la supervivencia de aloinjerto y los mecanismos terapéuticos. Estos resultados demuestran que el tratamiento con nanopartículas de mTOR-HDL promueve la supervivencia indefinida del aloinjerto de corazón. Adicionalmente, también se observaron resultados similares para un modelo de trasplante de piel. Estos resultados demuestran cómo manipular la respuesta inmunitaria para inducir la no respuesta específica del donante en la clínica e identificar nuevas dianas terapéuticas que pueden prevenir el rechazo de aloinjertos en seres humanos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Desarrollo de nanopartículas de mTOR-HDL

Nanopartículas de mTOR-HDL (véase la figura 1A) se sintetizaron hidratando una película lipídica, que contenía rapamicina y fosfolípidos, con APOA1 en PBS. Posteriormente, y después de una homogeneización vigorosa, la muestra se sometió a sonicación para generar nanopartículas de mTOR-HDL con 62 ± 11 % de eficiencia de encapsulación de rapamicina y un diámetro hidrodinámico medio de 12,7 ± 4,4 nm, según lo determinado por cromatografía de líquidos de alto rendimiento y dispersión dinámica de luz, respectivamente. El tamaño de las nanopartículas puede variar, pero normalmente será de desde aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 250 nm.

Como se revela por microscopía electrónica de transmisión (figura 4), la mTOR-HDL tenía la estructura discoidal que es típica de las nanopartículas basadas en HDL16. La biodistribución y especificidad celular de mTOR-HDL marcadas con yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (DiR) se evaluaron en ratones C57B1/6 de tipo silvestre usando obtención de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF) ex vivo y citometría de flujo. Se mostró que mTOR-HDL se acumulaba principalmente en el hígado, bazo y riñones (figura 5A) mientras que se muestra una mayor afinidad por monocitos que o bien células dendríticas (DC) o bien neutrófilos en la sangre y el bazo (figura 5B, C) (respectivamente, P < 0,001, P < 0,01 y P < 0,01, P < 0,01).

El tratamiento con mTOR-HDL se utilizó en un modelo de ratón de trasplante de corazón (figura 1B). Se determinaron la biodistribución de mTOR-HDL, direccionamiento a aloinjerto, y especificidad celular usando técnicas de obtención de imágenes de PET-TC in vivo (figura 1B) y ex vivo. Posteriormente, una matriz de lecturas inmunológicas, incluyendo citometría de flujo, se utilizaron ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y reacción de linfocitos mixtos, para evaluar los efectos de un régimen de nanoterapia de mTOR-HDL a corto plazo (figura 1B).

Nanoterapia de mTOR-HDL se dirige al sistema inmunitario innato

Para estudiar cuantitativamente el direccionamiento y la especificidad del tejido, nanopartículas de mTOR-HDL se radiomarcaron con 89Zr (89Zr-mTOR-HDL). Seis días después de haber trasplantado corazones en su abdomen, los ratones recibieron 89Zr-mTOR-HDL por vía intravenosa. Se permitió que las nanopartículas circularan y se distribuyeran durante 24 horas antes de que los ratones se sometieran a obtención de imágenes de PET-TC in vivo. Se observó una presencia de 89Zr-mTOR-HDL marcada en los aloinjertos de corazón (figura 1C). Después de la obtención de imágenes, se sacrificaron los ratones, y los órganos se recogieron para la cuantificación de 89Zr-mTOR-HDL por autorradiografía ex vivo. Se determinó la actividad de corazón de aloinjerto (Tx) (25,2 ± 2,4 x 103 recuentos/área unitaria) era 2,3 veces mayor que en corazones nativos (N) (11,1 ± 1,9 x 103 recuento/área unitaria) (figura 1F). El recuento gamma evaluó la biodistribución completa de 89Zr-mTOR-HDL. La autorradiografía ex vivo indica que 89Zr-mTOR-HDL se dirige a muchos tejidos (figura 1D), lo que sugiere una biodistribución sistémica del fármaco, consistente con el patrón típico de distribución para nanopartículas HDL cargadas de fármaco17.

El patrón de distribución de órganos favorable y la asimilación de aloinjertos de corazón, conducen a los inventores a evaluar el direccionamiento de mTOR-HDL y la especificidad a nivel celular en el aloinjerto de corazón, sangre, bazo y médula ósea. Se marcaron nanopartículas de mTOR-HDL con el colorante fluorescente perclorato de 3,3'-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), administrado por vía intravenosa y se dejó circular durante 24 horas. Usando varios tipos de tejidos, se extrajeron células mieloides, incluyendo neutrófilos; el grupo de monocitos/macrófagos (Mo/MO), incluyendo monocitos Ly-6ClD y Ly-6Chi, DC, y células T para análisis por citometría de flujo.

El direccionamiento de células mieloides se observó en el aloinjerto de corazón, sangre y bazo (figura 1F y 1G). De manera importante, los inventores observaron especificidad celular hacia el grupo de Mo/MO y neutrófilos, con una absorción de mTOR-HDL significativamente mayor por el grupo de Mo/MO que o bien DC o bien neutrófilos en el corazón, sangre y bazo (respectivamente: P < 0,01, P < 0,01, P < 0,05 y P < 0,01, P < 0,01, P < 0,05). Por el contrario, la absorción de mTOR-HDL marcada con DiO por células T estaba prácticamente ausente (figura 1F, 1G), indicativo de la especificidad de células inmunitarias innatas de la nanoterapia. En general, los datos demuestran que mTOR-HDL exhibe una alta especificidad por sitios inflamados, tal como el aloinjerto de corazón, y se capta con avidez por células mieloides incluyendo monocitos, DC y neutrófilos.

mTOR-HDL disminuye significativamente el compartimento de células mieloides

La población de leucocitos se perfiló y, más ampliamente, el compartimento de células mieloides, incluyendo neutrófilos, Mo/MO y DC, en la sangre, bazos y aloinjertos de ratones que recibieron placebo, tratamientos orales con rapamicina (Oral-Ra) y mTOR-HDL, donde el régimen de tratamiento implicó tres inyecciones de mTOR-HDL intravenosas, el día del trasplante, así como dos y cinco días después del trasplante. En línea con los datos de direccionamiento, se observaron leucocitos totales significativamente disminuidos en la sangre, bazos y aloinjertos (figura 2A y figura 8) de receptores tratados con mTOR-HDL en comparación con o bien placebo (P <0,05 y P < 0,01) o bien receptores tratados con Oral-Ra. Adicionalmente, estos datos muestran que el tratamiento con mTOR-HDL redujo los niveles de neutrófilos en la sangre, bazo y aloinjerto, en comparación con receptores tratados tanto con placebo (P < 0,05, P < 0,05 y P < 0,05) como con Oral-Ra (P < 0,05). Además, el tratamiento con mTOR-HDL redujo drásticamente los números de Mo/MO en la circulación, aloinjertos de bazo y corazón, en comparación con receptores tratados con placebo (P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,05) o con Oral-Ra (P < 0,05). Finalmente, el tratamiento con mTOR-HDL disminuyó drásticamente las DC en la circulación, bazo y aloinjerto, en comparación con receptores tratados con placebo (P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,05) o con Oral-Ra (P < 0,05). Todos juntos, estos resultados demuestran que el tratamiento con mTOR-HDL limita la respuesta inmunitaria alorreactiva al interferir con la acumulación de células mieloides en el aloinjerto trasplantado.

Después de estas investigaciones de células mieloides, se evaluaron los efectos de la nanoterapia con mTOR-HDL sobre la distribución de tejido Mo/MO . Mo/MO comprende dos subconjuntos diferentes (Ly-6Chi y Ly-6ClD) con propiedades migratorias regionales23. Seis días después del trasplante, ratones no tratados y tratados con Oral-Ra tenían un mayor número de células mieloides acumuladas en su aloinjertos de corazón, bazo y sangre (figura 2B y figura 9A). Además, las poblaciones elevadas de Mo/MO contenían altos porcentajes de monocitos Ly-6Chi inflamatorios (figuras 9A y 2B). Por el contrario, receptores de mTOR-HDL acumularon significativamente más monocitos Ly-6ClD que los animales tratados con placebo y Oral-Ra en sangre (60 % frente a 12 % y 13 %), bazo (55 % frente a 29 % y 44 %) y aloinjertos de corazón (56 % frente a. 20 % y 18 %) (figura 2B, figura 9A). Por consiguiente, en particular, se identificaron menos monocitos Ly-6Chi en circulación en el grupo tratado con mTOR-HDL que en los receptores tratados o bien con placebo o bien con Oral-Ra (P < 0,05 y P < 0,05, respectivamente). Las proporciones del subconjunto Mo/MO en el bazo y los órganos trasplantados reflejaron los niveles en sangre periférica (figura 1E). Los datos indican que mientras que los monocitos Ly-6Chi dominan la respuesta mieloide en el rechazo del trasplante, los monocitos Ly-6ClD dominan la respuesta mieloide durante la tolerancia. Esto sugiere que el tratamiento con mTOR-HDL promueve la acumulación de MO Ly-6ClD reguladores, y puede reajustar el compartimento mieloide a favor de la homeostasis.

La ruta de mTOR está regulada negativamente por mTOR-HDL

Las rutas moleculares dirigidas por la nanoinmunoterapia con mTOR-HDL se estudiaron usando el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) de ARNm aislado de MO clasificado por flujo de los aloinjertos de receptores tratados o bien con placebo o bien con mTOR-HDL. Los resultados de la matriz génica indicaron que el mTOR (figura 2C) está regulado negativamente por mTOR-HDL.

Tratamiento con mTOR-HDL favorece la inducción de tolerancia al trasplante promoviendo el desarrollo de MO Ly-6ClD reguladores

A continuación, se evaluó in vitro la función supresora de aloinjertos de Mo/MO Ly-6C'° de infiltración de injerto. La función supresora reguladora de MO Ly-6C^ se evaluó por la capacidad de inhibir la proliferación in vitro de células T CD8+ marcadas con diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE). Los resultados de la presente invención indican que los MO Ly-6Cte reguladores obtenidos de los aloinjertos de ratones receptores tratados con mTOR-HDL previenen la proliferación de células T in vitro (figura 3A). Los inventores también observaron que, a diferencia de MO Ly-6Cte obtenidos de los aloinjertos de ratones receptores de placebo, MO Ly-6Cte obtenidos de los aloinjertos de receptores tratados con mTOR-HDL expanden las células T reguladoras (también denominadas Treg) que expresan Foxp3 inmunosupresoras (figura 3A). Según estos datos, los inventores observaron un aumento significativo en el número de células T CD4+CD25+ de aloinjerto (figura 3B; figura 10). Esto sugiere que el tratamiento con mTOR-HDL puede favorecer la inducción de tolerancia al trasplante promoviendo el desarrollo de MO Ly-6Cte reguladores.

Nanoterapia con mTOR-HDL previene la potente estimulación de células T por células dendríticas

Dado que las células dendríticas (DC) captan nanopartículas de mTOR-HDL (figuras 1F-G), se investigaron los efectos de mTOR-HDL sobre la activación de células inmunitarias, la presentación de antígenos y la estimulación de células T mediada por DC. En primer lugar, se utilizaron ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para evaluar la expresión del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Estos datos indican que el tratamiento con mTOR-HDL reduce significativamente los niveles de TNF-a en suero, en comparación con placebo y Oral-Ra (figura 10; P < 0,05 y P < 0,01). A continuación, se examinaron la expresión de moléculas coestimulantes y de adhesión que están reguladas por aumento durante el rechazo agudo2526. La citometría de flujo indica que moléculas tanto c D40 como CD54 se reducen significativamente en leucocitos a partir de receptores tratados con mTOR-HDL en comparación con los receptores tratados con placebo y Oral-Ra (figura 10). Usando el anticuerpo monoclonal Y-Ae (AcM), que reconoce un péptido I-Ed derivado de donante presentado por moléculas receptoras de I-Ab de MHC de clase II, se evaluaron los efectos de mTOR-HDL sobre la presentación del antígeno. Se observaron significativamente menos células Y-Ae+ presentadoras de antígeno en los ganglios linfáticos paraaórticos y bazos de receptores tratados con mTOR-HDL que las de los tratados con o bien placebo o bien Oral-Ra. A continuación, se evaluó la capacidad de DC obtenidas a partir de receptores de mTOR-HDL para estimular células T específicas de antígeno in vitro. Se usaron DC CD11c+MHC-II+ extraídas a partir de los bazos de ratones tratados con placebo y mTOR-HDL como iniciadores para estimular una reacción de linfocitos mixtos (MLR) in vitro. Se aislaron células T CD4+ TEa específicas de antígeno como respondedores, ya que estas células T reconocen el mismo complejo I-Ed-I-Ab de péptido y MHC que el AcM Y-Ae, se marcaron las células con éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE) y se cultivaron con DC esplénicas CD11c+MHC-II+ como se describió previamente27. Las propiedades estimulantes de DC esplénicas CD11c+m HC-II+ se sometieron a prueba midiendo la dilución de CFSE en células T por citometría de flujo. Estos datos indican que las DC de receptores de mTOR-HDL son significativamente menos capaces de estimular la proliferación de células T indiferenciadas in vitro que las DC obtenidas a partir de ratones de control. A continuación, se sometieron a prueba las capacidades proliferativas de células T obtenidas a partir de ratones trasplantados. Estos datos indican que las células T a partir de receptores de mTOR-HDL son capaces de producir respuestas inmunitarias in vitro similares a las células T obtenidas a partir de ratones que rechazan placebo. En general, estos resultados ilustran que el tratamiento con nanopartículas de mTOR-HDL previene respuestas inmunitarias de células T reactivas con injerto mediadas por DC.

Nanoterapia con mTOR-HDL promueve el desarrollo de macrófagos supresores

Habiendo determinado que las nanopartículas de mTOR-HDL se dirigen a Mo/MO (figuras 1F y 1G) y afectan a su distribución tisular), se sometieron a prueba las propiedades funcionales de Mo/MO Ly-6Cte que se acumulan en el aloinjerto durante la inducción de tolerancia. Se recogieron aloinjertos de corazón de donantes seis días después del trasplante y se analizó el compartimento mieloide mediante citometría de flujo. Centrándose en células mieloides infiltrantes de injerto receptoras CD45+CD11b+ vivas, discernimos tres poblaciones principales basadas en los patrones de expresión diferencial de Mo/MO Ly-6Chi, Mo/MO Ly-6Cte y neutrófilos Ly-6G (figura 1D). El análisis de citometría de flujo confirmó la presencia de más Mo/MO Ly-6Cte que Ly-6Chi en los aloinjertos de ratones tratados con mTORHDL en comparación con receptores de placebo (figura 1D). No hubo diferencias en la frecuencia de neutrófilos Ly-6G entre los grupos.

La caracterización de matriz génica de macrófagos Ly-6Cte que se acumulan en los aloinjertos de receptores tratados con mTOR-HDL reveló que la ruta mTORC1 está regulada negativamente en estos ratones. Esto confirma que el tratamiento con mTOR-HDL se dirige a macrófagos infiltrantes de injerto.

Un análisis exhaustivo de las moléculas coestimulantes que previenen el trasplante de órganos exitoso reveló que el tratamiento con mTOR-HDL aumentó la expresión de CD40. En línea con esta observación, los inventores encontraron un tratamiento con AcM CD40 agonista para anular la supervivencia prolongada de aloinjerto en receptores tratados con mTOR-HDL (figura 3F). Esto sugiere que células T que expresan CD40L pueden estimular la señalización de CD40 en el receptor MO, dando como resultado una eventual pérdida del injerto. Para suprimir la señalización de CD40 perjudicial, los inventores desarrollaron un segundo tratamiento de nanoinmunoterapia que consiste en una HDL inhibidora de CD40-TRAF6 (denominada CD40-HDL o TRAF6i-HDL; figura 11A-B). El inhibidor de molécula pequeña de CD40-TRAF6 se dirige contra el dominio de unión de CD40 en TRAF6 y bloquea la señalización de CD40, dando como resultado la polarización de macrófagos Ly6Chi inflamatoria hacia un fenotipo antiinflamatorio.

mTOR-HDL prolonga la supervivencia de aloinjerto indefinidamente

Por último, se evaluó la capacidad del tratamiento de nanoinmunoterapia para prevenir el rechazo de órganos y prolongar la supervivencia de aloinjerto. Se trasplantaron aloinjertos cardíacos de donantes Balb/c (H2d) a receptores C57Bl/6 (H2b) completamente alogénicos tratados con: (1) placebo, (2) Oral-Ra, (3) mTOR-HDL, (4) ^t R^a F6^í-H^d L, o (4) mTOR-HDL TRAF6i-HDL. Para evaluar la supervivencia de injerto, los receptores se sometieron a palpación abdominal hasta que las contracciones cardíacas cesaron por completo. Los presentes datos indican que la nanoterapia con mTOR-HDL prolonga drásticamente la supervivencia de injerto con más del 85 % de supervivencia de aloinjerto durante un período de 50 días (figura 3G) Por el contrario, el tratamiento oral con rapamicina solo prolongó la supervivencia de aloinjerto en un 35 % durante el mismo período (P < 0,01, P < 0,01). Este es un resultado notable, especialmente considerando que el régimen implicaba solo tres dosis durante la primera semana después del trasplante.

Como punto final secundario, se evaluó la histología de los aloinjertos 100 días después del tratamiento combinado (figuras 13A-B). La figura 13B muestra inflamación circunferencial leve sin arteritis y sin signos de hiperplasia de la íntima. Segmentos aórticos de ratón no mostraron ninguna alteración histológica sin engrosamiento de la íntima ni signos de vasculopatía de aloinjerto crónica (CAV). Además, los inventores evaluaron un régimen de tratamiento combinado que implica tres inyecciones de tanto mTOR-HDL como TRAF6i-HDL dentro de los primeros cinco días después del trasplante usando el modelo de aloinjerto de corazón. Como se muestra en la figura 3G, el tratamiento combinado con mTOR-HDL/TRAF6i-HDL promueve el trasplante de órganos sinérgicamente, dando como resultado una supervivencia de más del 70 % durante 100 días después del trasplante, que supera significativamente las monoterapias con mTOR-HDL y TRAF6i-HDL.

La programación del tratamiento puede variar y puede comenzar o bien antes del trasplante, o bien de manera concomitante con el trasplante, o bien después del trasplante. El tratamiento con mTOR-HDL o mTOR-HDL/TRAF6i-HDL combinados se inicia 1-2 días antes del trasplante de órganos.

Para someter a prueba si Mo/MO Ly-6ClD supresores in vitro median la supervivencia prolongada del injerto en receptores tratados con mTOR-HDL, los inventores redujeron Mo/MO Ly-6ClD in vivo, como se describió recientemente9. En resumen, se trasplantaron aloinjertos cardíacos de donante Balb/c (H2d) se trasplantaron en ratones receptores (DTR) (H2b) del receptor de la toxina diftérica (DT) CD169 completamente alogénicos el día del trasplante para reducir los macrófagos Ly-6ClD de receptor. Se examinaron leucocitos infiltrantes de injerto por citometría de flujo seis días después del trasplante para confirmar la reducción específica de macrófagos supresores in vitro Ly-6ClD (figura 3B). Experimentos posteriores de supervivencia de injerto mostraron que la reducción de Mo/MO Ly-6ClD dio como resultado el rechazo del injerto en el día 15 (12,3 ± 1,8) a pesar del tratamiento con mTOR-HDL (figura 3D). La transferencia adoptiva de monocitos de tipo silvestre restauró la supervivencia de aloinjerto, demostrando que la nanoinmunoterapia ejerce sus efectos a través de MO regulador. Estos experimentos sugieren que el tratamiento con mTOR-HDL estimula in vivo el desarrollo de macrófagos Ly-6ClD reguladores que previenen respuestas inmunitarias mediadas por células T y, por lo tanto, promueven la supervivencia prolongada de aloinjerto.

Para investigar adicionalmente la aplicabilidad terapéutica general de mTOR-HDL, la nanoterapia con mTOR-HDL descrita en el presente documento se aplicó a un modelo de trasplante de piel completamente alogénico en el que el rechazo se monitorizó macroscópicamente (figuras 12A y 12B). Usando el mismo régimen de tres dosis, el tratamiento con nanomedicina de mTOR-HDL mejoró drásticamente la supervivencia del injerto. El tiempo de supervivencia medio aumentó significativamente en receptores tratados con mTOR-HDL, con más del 75 % de supervivencia en el día 50; el grupo placebo, por otro lado, tenía una tasa de rechazo del 100 % (P < 0,01) (10,5 ± 2,9 días). En general, estos experimentos y resultados muestran que la nanoterapia con mTOR-HDL previene la estimulación de células T mediada por DC, promueve el desarrollo de Mo/MO Ly-6Cloy prolonga drásticamente la supervivencia de aloinjerto.

Las figuras 13A-B son gráficos que muestran la toxicidad asociada con Oral-Ra en comparación con el tratamiento con mTOR-HD. Ratones receptores recibieron el régimen de tratamiento con mTOR-HDL o recibieron un tratamiento con Oral-Ra para el que se aumentó la dosis para lograr el mismo resultado terapéutico (n = 4, gris) o (n = 4, negro). mTOR-HDL no tiene efectos significativos sobre el nitrógeno de urea en sangre (BUN, mostrado en la figura 13A) o creatinina sérica (mostrada en la figura 13B), pero los parámetros de toxicidad renal muestran diferencias estadísticas entre Oral-Ra y mTOR-HDL, mientras que no se observaron diferencias entre los receptores singénicos y mTOR-HDL 30 días después de la infusión (ANOv A *P < 0,05, **P < 0,01).

Secciones histológicas de riñones, teñidas por H&E, PAS y tricromo de Masson y examinadas por un patólogo renal no muestran cambios significativos en los tres compartimentos del parénquima renal (figura 13A). Existen glomérulos de apariencia normal, sin evidencia de glomeruloesclerosis. Los túbulos no muestran atrofia significativa o ninguna evidencia de lesión de células epiteliales, incluyendo la vacuolización, pérdida del borde en cepillo o mitosis. Las arterias y arteriolas no muestran evidencia de fibrosis de la íntima o hialinosis arteriolar, respectivamente. Secciones hepáticas teñidas con H&E, PAS y tricromo de Masson y examinadas por un patólogo del hígado demuestran una arquitectura acinar y lobular normal. No hay evidencia de inflamación o fibrosis en el tracto porta y el parénquima hepático. Los hepatocitos son normales sin evidencia de colestasis, inclusiones o apoptosis (figura 13A). En la figura 13B la sección muestra inflamación circunferencial leve sin arteritis y sin signos de hiperplasia de la íntima. Los segmentos aórticos de ratón no mostraron ninguna alteración histológica sin engrosamiento de la íntima, y sin signos de vasculopatía de aloinjerto crónica (CAV).

Discusión

Pacientes trasplantados se tratan con fármacos inmunosupresores para evitar el rechazo de órgano30. Se dirigen inmunosupresores al sistema inmunitario adaptativo y tienen efectos secundarios graves3132. La actual investigación de inmunología de trasplante busca desarrollar nuevos protocolos tolerogénicos usando diferentes modelos de trasplante experimental. La combinación de la inmunología básica con la nanomedicina innovadora es un nuevo enfoque prometedor para estimular la tolerancia inmunitaria. El uso de modelos animales juega un papel esencial en esta investigación. Desafortunadamente, mientras que algunos protocolos tolerogénicos experimentales pueden inducir la supervivencia indefinida de aloinjerto en ratones y primates3334, las complicaciones tromboembólicas han impedido que estos métodos se trasladen a tratamientos clínicos35. Por consiguiente, existe una necesidad continua de enfoques alternativos para la regulación inmunitaria, tales como el direccionamiento al sistema inmunitario innato, para prevenir el rechazo de trasplante111236.

En el estudio actual, los datos demuestran que la rapamicina encapsulada con HDL dosificada de forma conservadora prolonga la supervivencia del injerto. Esto indica que solo la rapamicina encapsulada, es decir, no la forma libre, puede usarse para inducir tolerancia inmunológica, como se describió recientemente37. Los datos también muestran de manera mecanicista que mTOR-HDL disminuye los leucocitos en la sangre, bazo y aloinjerto. La adhesión y migración reducida de leucocitos está asociada con una mejor supervivencia del injerto, según estudios previos38-41. Más específicamente, se observaron recuentos significativamente menores de Mo/MO y neutrófilos acompañados de menos infiltración de células mieloides en aloinjertos. A diferencia del presente enfoque de nanoterapia con mTOR-HDL que se dirige al compartimento mieloide, el 95 % de la rapamicina oral absorbida se une a eritrocitos42. Por lo tanto, la presente estrategia de administración de nanoterapia presenta una forma innovadora de aumentar drásticamente la biodisponibilidad del fármaco.

En asociación con su capacidad para disminuir la infiltración celular en el órgano trasplantado, la administración de mTOR-HDL in vivo reduce notablemente la producción de moléculas proinflamatorias y disminuye la capacidad de DC para inducir la proliferación de células T. Estos resultados concuerdan con un informe previo que muestra que DC acondicionadas in vitro con rapamicina reducen mediadores proinflamatorios y prolongan la supervivencia de aloinjerto43. Adicionalmente, estos datos indican que la nanoterapia con mTOR-HDL afecta además a DC al inhibir su función estimulante, lo que sugiere que la activación de células T específicas de aloantígeno puede modularse terapéuticamente. Los presentes datos también demuestran que el tratamiento con mTOR-HDL reduce la presentación de aloantígeno a células T CD4+. Estos efectos reguladores inmunitarios son de importancia fundamental durante el trasplante, en el que las células presentadoras de antígeno median la alorreactividad específica contra el órgano trasplantado44.

Los presentes datos ilustran que el tratamiento con mTOR-HDL media la acumulación de macrófagos supresores que inhiben respuestas de células T citotóxicas. Además, macrófagos Ly-6ClD de receptores tratados con ^h D^l expanden Foxp3+Treg in vitro y se correlacionan con la acumulación intrainjerto de Foxp3+Treg in vivo. La acumulación macrófagos Ly-6ClD reguladores en el órgano trasplantado parece ser crítica para la supervivencia prolongada de aloinjerto mediada por TOR-HDL, ya que la reducción de macrófagos Ly-6ClD previene la inducción de tolerancia a pesar del tratamiento con mTOR-HDL. Estos resultados son consistentes con estudios que muestran que los macrófagos Ly-6ClD inhiben la proliferación de células T citotóxicas, median la expansión de Treg y promueven la tolerancia de trasplante9. Los resultados demuestran que las nanopartículas basadas en HDL representan un enfoque terapéutico novedoso para desarrollar sistemas de administración de fármacos que se dirigen a macrófagos in vivo.

Colectivamente, estos datos muestran que la tecnología de nanopartículas HDL administra eficazmente fármacos inmunosupresores al sistema inmunitario innato. mTOR-HDL previene la activación de DC, promueve el desarrollo de macrófagos reguladores e induce la supervivencia indefinida de aloinjerto. La tecnología mTOR-HDL es un enfoque terapéutico potencialmente traduccional, innovador y eficaz que se dirige a células inmunitarias innatas para inducir la supervivencia de aloinjerto a largo plazo. Las pruebas clínicas y la implementación de un protocolo g Mp optimizado confirmarán la seguridad y eficacia a largo plazo. Como mTOR-HDL combina agentes aprobados por la FDA existentes, su desarrollo, o el desarrollo de sistemas de nanopartículas HDL que liberan otros agentes inmunosupresores aprobados por la FDA, puede tener una ruta inmediata de traducción.

Materiales y métodos

Síntesis de nanopartículas

El presente enfoque dirigido suministra el fármaco rapamicina usando una novedosa plataforma de nanopartículas de lipoproteínas de alta densidad sintéticas. Se sintetizaron nanopartículas de mTOR-HDL usando un método de hidratación de película lipídica modificada. En resumen, se disolvieron 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-fosfocolina (MHPC) (ambos adquiridos de Avanti Polar Lipids) y rapamicina (Selleckchem) en una mezcla de cloroformo/metanol (10:1 v/v) en una relación en peso de 3:1:0,5. Después de evaporar los disolventes, se añadió APOA1 humana en PBS para hidratar la película lipídica, en una relación en peso de 5:1 de fosfolípido con respecto a APOA1 y se dejó incubar durante 20 minutos en un baño de hielo. La mezcla resultante se homogeneizó usando un sonicador de sonda en un baño de hielo durante 15 minutos para producir nanopartículas de mTOR-HDL. La mTOR-HDL se lavó y se concentró por filtración centrífuga usando tubos de filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa. Se retiraron agregados usando centrifugación y filtración (0,22 |im). La disolución oral de rapamicina (Oral-Ra) consistió en etanol al 4 %, PEG300 al 5 % y TWEEN80 al 5 % en Pb S, mientras que la disolución intravenosa de rapamicina (i.v.-Ra) incluía etanol al 4 % y TWEEN80 al 5 % en PBS. Los animales recibieron dosis orales o inyecciones en la cola intravenosa (para mTOR-HDL o Ra i.v.) a una dosis de rapamicina de 5 mg/kg el día del trasplante, así como los días dos y cinco después del trasplante.

Se sintetizaron nanopartículas de CD40-HDL según un procedimiento similar al descrito anteriormente. Se disolvieron DMPC, MHPC y el inhibidor de TRAF6 (2E)-1-fenil-3-(2,5-dimetilanilino)-2-propen-1-ona-1 en una mezcla de cloroformo/metanol (10:1 v/v) a una relación en peso de 8,7:1:0,6, y luego se secó al vacío para crear una película lipídica delgada. Se añadió PBS que contenía APOA1 a la película lipídica, en una relación en peso de 9,5:1 de fosfolípido con respecto a APOA1, y se dejó incubar en hielo durante 3 horas hasta que la película se hidrató y se formó una disolución homogénea. La disolución se sometió a sonicación después durante 1 hora para formar nanopartículas de CD40-HDL. Posteriormente, la disolución se purificó mediante múltiples etapas de centrifugación y filtración.

Ratones

Se adquirieron ratones BALB/c (H-2d), C57BL/6J (B6 WT, H-2b) hembra del Taconic Laboratory. Se adquirieron ratones C57BL/6J (Foxp3tm1Flv/J) de 8 semanas de edad del Jackson Laboratory. Los ratones C57BL/6J ^c D169^dtr fueron de Masato Tanaka (Kawaguchi, Japón). Los ratones C57BL/6J CD4+ transgénicos TEa que reconocen un péptido que representa los residuos 52 a 68 de la cadena I-Ea (péptido Ea) unidos a moléculas I-Ab de clase II fueron de Alexander Rudensky (New York, EE.UU.). Los animales se reclutaron a las de 8 a 10 semanas de edad (peso corporal, 20-25 g). Todos los experimentos se realizaron con ratones hembra de 8 a 12 semanas de edad según protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales.

Trasplante de corazón vascularizado

Se trasplantaron corazones BALB/c como injertos heterotópicos completamente vascularizados en ratones C57BL/6 como se describió anteriormente45. Se trasplantaron corazones a las cavidades peritoneales de los receptores estableciendo anastomosis terminolateral entre la aorta del donante y el receptor y anastomosis terminolateral entre el tronco pulmonar del donante y la vena cava inferior del receptor. La supervivencia de aloinjerto cardíaco se evaluó posteriormente a través de la palpación diaria. El rechazo se definió como el cese completo de la contracción cardíaca y se confirmó mediante visualización directa en la laparotomía. La supervivencia de injerto se comparó entre los grupos usando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier.

Estudios biodistribución y obtención de imágenes de micro-PET/TC

Ratones (n = 6; 3 con trasplantes de corazón y 3 con injertos de piel) [peso: 18,8 ± 1,0 g]) se inyectaron con 89ZrmTOR-HDL (0,17 ± 0,01 mCi, ~0,25 mg de Ap Oa 1) en 0,2 ml de disolución de PBS a través de su vena lateral de la cola. A las 24 h, los animales se anestesiaron con mezcla de gas isoflurano(Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EE.UU.)/oxígeno (2 % para inducción, 1 % para mantenimiento), y luego se realizó una exploración usando un escáner PET/TC Inveon (Siemens Healthcare Global, Erlangen, Alemania). Exploraciones estáticas de PET de todo el cuerpo, que registran un mínimo de 30 millones de eventos coincidentes, se realizaron durante 15 min. Las ventanas de tiempo de energía y coincidencia fueron 350-700 keV y 6 ns, respectivamente. Los datos de imagen se normalizaron para corregir la no uniformidad de la respuesta de PET, pérdidas de recuento de tiempo muerto, relación de ramificación de positrones y disminución física con respecto al tiempo de inyección, pero sin atenuación, se aplicó corrección de promedio de volumen parcial o dispersión. Las tasas de recuento en las imágenes reconstruidas se convirtieron en concentraciones de actividad (porcentaje de dosis inyectada [% de ID] por gramo de tejido) usando un factor de calibración de sistema derivado de la obtención de imágenes de un modelo equivalente de agua de tamaño de ratón que contenía 89Zr. Las imágenes se analizaron usando el software ASIPro VMTM (Concorde Microsystems, Knoxville, Tn , EE.UU.). Se realizaron exploraciones de TC de bajo aumento estándar de todo el cuerpo con la configuración de tubo de rayos X a un voltaje de 80 kV y una corriente de 500 |oA. La exploración de TC se adquirió usando 120 etapas de rotación para un total de 220 grados, produciendo un tiempo de exploración estimado de 120 s con una exposición de 145 ms por fotograma. Inmediatamente después de la exploración de PET/TC, se sacrificaron los animales y se recogieron, se pesaron y se contaron tejidos de interés, riñón, corazón, hígado, bazo, sangre, hueso, piel, y músculos, en un contador gamma automático Wizard2 2480 (Perkin Elmer, Waltham, MA) para determinar el contenido de radiactividad. Los valores se corrigieron por disminución y se convirtieron en porcentaje de dosis inyectada por gramo (% de ID/g). Para determinar la distribución de radiactividad dentro de los corazones trasplantados, las muestras nativas e injertadas se colocaron en un casete de película contra una placa de fosforo para obtención de imágenes (BASMS-2325, Fujifilm, Valhalla, NY) durante 4 horas a -20 °C. La placa se leyó a una resolución de píxeles de 25 |im con un lector de placas Typhoon 7000IP (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Las imágenes se analizaron usando el software ImageJ.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de injerto

Los corazones de ratón se enjuagaron in situ con HBSS con heparina al 1 %. Los corazones explantados se cortaron en trozos pequeños y se digirieron durante 40 minutos a 37 °C con 400 U/ml de colagenasa IV (Sigma-Aldrich), HEPES 10 mM (Cellgro) y ADNasa I al 0,01 % (MP Biomedicals) en HBSS (Cellgro). Las suspensiones digeridas se pasaron a través de una malla de nailon y se centrifugaron, y el sedimento celular se resuspendió en HBSS completo, se tiñó y se analizó por citometría de flujo (BD LSR-II; BD Biosciences).

Citometría de flujo y clasificación celular

Para la tinción de células mieloides, se adquirieron AcM conjugados con fluorocromo específicos para CD45 de ratón (clon 30-F11), CD11b (clon M1/70), CD11c (clon N418), F4/80 (clon CI:A3.1), Ly-6C (clon HK1.4) y los controles de isotipo correspondientes de eBioscience. Se adquirió AcM Ly-6G (clon 1A8) de Biolegend. Se adquirió F4/80 (clon CI:A3.1) de AbD Serotec. Para la tinción de células T, se adquirieron anticuerpos contra CD45 (clon 30-F11), CD3 (clon 2C11), CD4 (clon GK1.5), CD8 (clon 53-6.7), CD25 (clon PC61.5), CD40 (clon 1C10) y CD54 (clon YN1/1.7.4) de eBioscience. El recuento absoluto de células se realizó usando perlas Countbright (Invitrogen). Para detectar la presentación de antígenos, se adquirió el AcM Y-Ae de eBioscience. El análisis de citometría de flujo se realizó en LSR II (BD Biosciences) y se analizó con el software FlowJo (Tree Star, Inc.). Los resultados se expresan como porcentaje de tinción de células o recuento de células (células por mililitro) por encima de los niveles de base. Los AcM se sometieron a título a intervalos regulares durante el transcurso de estos estudios para garantizar el uso de concentraciones de saturación. Para purificar células mieloides infiltrantes de injerto, las suspensiones de células individuales de corazón de donante se clasificaron con un clasificador de células InFlux (BD) para lograr > 96 % de pureza en las Instalaciones de Recursos Compartidos de Citometría de Flujo (del inglés, Flow Cytometry Shared Resource Facility) en la Facutlad de Medicina de Icahn en Mount Sinai.

Reacción de linfocitos mixtos

Los bazos de ratones TEa específicos de antígeno (H-2b) se disociaron suavemente en suspensiones de células individuales, y los glóbulos rojos se retiraron usando tampón de lisis ACK hipotónico. Los esplenocitos se marcaron con marcador de proliferación celular CFSE a una concentración de 5 |iM (sondas moleculares de Invitrogen) seguido de tinción con AcM anti-CD4 durante 30 minutos en hielo. Se clasificaron células T CD4+ CFSE+ respondedoras usando el clasificador FACS Aria II (BD Biosciences) con una pureza de >98 %. Los esplenocitos de los receptores tratados con mTOR-HDL y placebo se enriquecieron para células CD11c+ usando el kit de selección positiva EasySep Mouse CD11c (StemCell). Los esplenocitos CD11c+ enriquecidos se tiñeron con AcM CD11c anti-ratón durante 30 minutos en hielo. Se clasificaron células CD11c+ usando el clasificador FACS Aria II (BD Biosciences) y luego se usaron para estimular células T CD4+ CFSE+ respondedoras. Las células se cultivaron durante 4 días a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %, y se midió la proliferación de células T CD4+ CFSE+ mediante análisis de citometría de flujo de dilución de CFSE en células T CD4+.

Ensayo de supresión in vitro

Los bazos de ratones C57BL/6 (H-2b) se disociaron suavemente en suspensiones de células individuales, y los glóbulos rojos se retiraron usando tampón de lisis ACK hipotónico. Los esplenocitos se marcaron con CFSE a una concentración de 5 |iM (sondas moleculares de Invitrogen) seguido de tinción con AcM anti-CD8 durante 30 minutos en hielo. Se clasificaron células T CD8+ CFSE+ respondedoras usando FACS Aria II (BD Biosciences) con >98 % de pureza. Se usaron células T CD8+ CFSE+ junto con microperlas anti-CD3/CD28 como estimulantes. Se cultivaron células T CD8+ CFSE+ estimuladas con macrófagos Ly-6ClD infiltrantes de injerto, mTOR-HDL o placebo durante 72 horas a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. La proliferación de células T se midió mediante análisis de citometría de flujo de dilución de CFSE en células T CD8+.

Ensayo de expansión de Treg

Los bazos de ratones C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J (H-2b) se disociaron suavemente en suspensiones de células individuales, y los glóbulos rojos se retiraron usando tampón de lisis ACK hipotónico. Los esplenocitos se tiñeron con AcM anti-CD4 durante 30 minutos en hielo. Se clasificaron CD4+ respondedoras usando FACS Aria II (BD Biosciences) con una pureza de >98 %. Se usaron células T CD4+junto con microperlas anti-CD3/CD28 como estimulantes. Las células T CD4+ estimuladas se cultivaron con macrófagos Ly-6ClD infiltrantes de injerto, mTOR-HDL o placebo durante 72 horas a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. La expansión de Treg se midió mediante análisis de citometría de flujo de Foxp3-RFP en células T CD4+.

Micromatriz.

Se clasificaron macrófagos Ly-6ClD de receptor infiltrante de injerto a partir de receptores tratados con mTOR-HDL y que rechazan placebo el día 6 después del trasplante. Las células se clasificaron dos veces con un clasificador FACS Aria II (BD Biosciences) para lograr >98 % de pureza. El análisis de micromatriz de células clasificadas se realizó con un total de 6 matrices Affymetrix Mouse Exon GeneChip 2.0 que se ejecutaron por triplicado con las muestras de interés. Los datos sin procesar del archivo CEL de la consola de expresión de Affymetrix se corrigieron con respecto a los niveles de base, se normalizaron, y se resumieron usando RMA. Las puntuaciones de expresión de resumen se calcularon al nivel de metasonda de transcripción usando archivos de anotación suministrados por el fabricante. La expresión génica se filtró basándose en IQR (0,25) usando un paquete de filtro de genes. Se usaron datos filtrados y normalizados por log2 (P ajustado <0,05) para su posterior análisis. Se realizaron comparaciones de firma génica entre los macrófagos Ly6ClD intrainjerto a partir de receptores tratados con mTORHDL y placebo. GSEA se realizó usando GSEA versión 17 de Genepattern versión 3.9.6. Los parámetros utilizados para el análisis fueron los siguientes. Conjuntos de genes c2.cp.biocarta.v5.1.symbols.gmt; c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt; c2.cp.reactome.v5.1.symbols.gmt; c6.all.v5.1.symbols.gmt (Oncogenic Signatures), c7.all.v5.1.symbols.gmt (Immunologic signatures); y h.all.v5.1.symbols.gmt (Hallmarks) para realizar GSEA y se usaron 1000 permutaciones para calcular el valor de p y el tipo de permutación se estableció en el conjunto de genes. Cada conjunto de genes se ejecutó por separado. Todos los campos básicos y avanzados se establecieron por defecto. Para seleccionar las rutas significativas de cada resultado del conjunto de genes, el valor de q de fdr de 0,25 se estableció como límite. Solo se consideraron los genes que contribuyen al enriquecimiento del núcleo.

Reducción de macrófagos in vivo

Para reducir los macrófagos Ly-6ClD que expresan CD169, se inyectó a receptores CD169-DTR heterocigotos por vía intraperitoneal con 10 ng/g de peso corporal de DT (Sigma-Aldrich) 24, 48 y 72 horas después del trasplante46.

Análisis estadísticos

Los resultados se expresan como media ± SEM. Las comparaciones estadísticas entre 2 grupos se evaluaron usando las pruebas de Mann Whitney. Se realizaron gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier, y una comparación de rango logarítmico de los valores de P calculados de grupos. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Las estadísticas de IBM SPSS 22 se utilizaron para el análisis estadístico.

Obtención de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano

Los ratones C57/B6 de tipo silvestre recibieron una única inyección intravenosa de 5 mg/kg de mTOR-HDL marcada con colorante DiR o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de 24 horas, los ratones se sacrificaron y se perfundieron con PBS. Se recogieron tejidos de hígado, bazo, pulmón, riñón, corazón y músculo para la obtención de imágenes de NIRF. Se adquirieron imágenes fluorescentes con el sistema IVIS 200 (Xenogen) con un tiempo de exposición de 2 segundos usando un filtro de excitación de 745 nm y un filtro de emisión de 820 nm. Se han cuantificado tanto la eficiencia radiante promedio dentro de cada tejido como la relación con respecto al control.

Radiomarcado de nanopartículas de mTOR-HDL

Se preparó 89Zr-mTOR-HDL según los procedimientos descritos anteriormente [15]. En resumen, se obtuvo mTOR-HDL lista para marcar añadiendo 1 % en moles del quelante de fosfolípidos 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-1,8-diazafluoren-9-ona (DSPE-DFO) [44] a costa de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) en la formulación inicial. El radiomarcado con 89Zr se logró haciendo reaccionar las nanopartículas que portaban DFO con 89Zr-oxalato en PBS (pH = 7,1) a 37 °C durante 1 h.89Zr-mTOR-HDL se aisló por filtración centrífuga usando tubos de corte de peso molecular de 10 kDa. El rendimiento radioquímico fue del 75 ± 2 % (n = 2).

Biodistribución de 89Zr-mTOR-HDL

Inmediatamente después de la exploración de PET/TC, se sacrificaron los ratones y se recogieron tejidos de interés (sangre, corazón, riñones, pulmones, hígado, bazo, hueso, piel, músculo e injerto), se transfirieron y se pesaron antes del recuento de radioactividad en un contador gamma automático Wizard22480 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.). Después, el contenido de radiactividad se convirtió en concentración de radiactividad y se expresó como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID/g).

Ensayo inmunoabsorción enzimática (ELISA)

Se recogió sangre el día 6 después del trasplante, y los sueros se purificaron usando Microtubos Z-Gel de 1,1 ml (Sarstedt) después de la incubación a temperatura ambiente y una breve centrifugación. La secreción de TNF-a en sueros se evaluó mediante ELISA (eBiosciences) según el protocolo del fabricante (n = 4 en cada grupo). La producción de citocinas de aloinjerto se determinó en sobrenadantes usando kits comerciales de ELISA para IL-6 y TNFa según las directrices del fabricante (R&D systems).

Obtención de imágenes por ultrasonidos

Se monitorización de tasa de trasplante de aloinjerto de corazón (latidos por minuto, BPM) usando una imagen de modo B (B-Mode) en sección transversal de eje corto del corazón trasplantado, con la línea de cursor de modo M (M-Mode) a través de su dimensión más grande y el trazado de la pared ventricular izquierda.

Trasplante de piel

Los aloinjertos de piel de tronco de grosor completo se colocaron como se describió anteriormente [42]. La piel se recogió de BALB/C, se cortó en trozos de 0,5 cm y se colocó en recipientes C57BL/6. El aloinjerto de piel se colocó en un lecho de injerto ligeramente más grande preparado sobre el tórax del receptor y asegurado usando vaselina, gasa y un vendaje. Los injertos se puntuaron visualmente diariamente por evidencia de rechazo. El rechazo del aloinjerto de piel se monitorizó mediante fotografía de microscopio digital y se consideró completamente rechazado cuando era >90 % necrótico. La supervivencia del injerto se comparó entre los grupos usando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier.

Referencias

1. Demirkiran, A., et al. Conversion from calcineurin inhibitor to mycophenolate mofetil-based immunosuppression changes the frequency and phenotype of CD4+FOXP3+ regulatory T cells. Trasplantaron 87, 1062-1068 (2009).

2. Gardiner, K.M., Tett, S.E. & Staatz, C.E. Multinational Evaluation of Mycophenolic Acid, Tacrolimus, Cyclosporin, Sirolimus, and Everolimus Utilization. Annals of trasplantaron 21, 1-11 (2016).

3. Lien, Y.H. Top 10 things primary care physicians should know about maintenance immunosuppression for trasplant recipients. The American journal of medicine (2015).

4. Naesens, M., Kuypers, D.R. & Sarwal, M. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity. Clin J Am Soc Nephrol 4 , 481-508 (2009).

5. Wells, A.D., et al. Requirement for T-cell apoptosis in the induction of peripheral trasplantation tolerance. Nature medicine 5 , 1303-1307 (1999).

6. Wu, Z., et al. Homeostatic proliferation is a barrier to trasplantation tolerance. Nature medicine 10, 87-92 (2004).

7. Auchincloss, H. No tolerance for depletion. Nature medicine 10, 21-23 (2004).

8. LaRosa, D.F., Rahman, A.H. & Turka, L.A. The innate immune system in allograft rejection and tolerance. J Immunol 178, 7503-7509 (2007).

9. Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Trasplantation Tolerance. Immunity 42, 1143­ 1158 (2015).

10. Zecher, D., van Rooijen, N., Rothstein, D.M., Shlomchik, W.D. & Lakkis, F.G. An innate response to allogeneic nonself mediated by monocytes. J Immunol 183, 7810-7816 (2009).

11. Oberbarnscheidt, M.H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. The Journal of clinical investigation 124, 3579-3589 (2011).

12. Oberbarnscheidt, M.H. & Lakkis, F.G. Innate allorecognition. Immunol Rev 258, 145-149 (2014).

13. Liu, W., Xiao, X., Demirci, G., Madsen, J. & Li, X.C. Innate NK cells and macrophages recognize and reject allogeneic nonself in vivo via different mechanisms. J Immunol 188, 2703-2711 (2012).

14. Sporri, R. & Reis e Sousa, C. Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+ T cell populations lacking helper function. Nature immunology 6 , 163-170 (2005).

15. Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med 56, 1272-1277 (2015).

16. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nat Commun 5, 3065 (2014).

17. Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Sci Adv 1(2015).

18. Fantus, D. & Thomson, A.W. The Ups and Downs of TORKinibs in Trasplantation. Trasplantaron 99, e117-118 (2015).

19. Pritchard, D.I. Sourcing a chemical succession for cyclosporin from parasites and human pathogens. Drug Discov Today 10, 688-691 (2005).

20. Shuchman, M. Trading restenosis for thrombosis? New questions about drug-eluting stents. N Engl J Med 355, 1949-1952 (2006).

21. Chambenoit, O., et al. Specific docking of apolipoprotein A-I at the cell surface requires a functional ABCA1 transporten The Journal of biological chemistry 276, 9955-9960 (2001).

22. Yang, X.P., et al. Scavenger receptor-BI is a receptor for lipoprotein(a). Journal of lipid research 54, 2450-2457 (2013).

23. Geissmann, F., Jung, S. & Littman, D.R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity 19, 71-82 (2003).

24. Maury, C.P. & Teppo, A.M. Raised serum levels of cachectin/tumor necrosis factor alpha in renal allograft rejection.

The Journal of experimental medicine 166, 1132-1137 (1987).

25. Shimizu, K., Schonbeck, U., Mach, F., Libby, P. & Mitchell, R.N. Host CD40 ligand deficiency induces long-term allograft survival and donor-specific tolerance in mouse cardiac trasplantation but does not prevent graft arteriosclerosis. J Immunol 165, 3506-3518 (2000).

26. Haug, C.E., et al. A phase I trial of immunosuppression with anti-ICAM-1 (CD54) mAb in renal allograft recipients.

Trasplantation 55, 766-772; discusión 772-763 (1993).

27. Ochando, J.C., et al. Alloantigen-presenting plasmacytoid dendritic cells mediate tolerance to vascularized grafts.

Nature immunology 7, 652-662 (2006).

28. Endo, S., Sakamoto, Y., Kobayashi, E., Nakamura, A. & Takai, T. Regulation of cytotoxic T lymphocyte triggering by PIR-B on dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 14515-14520 (2008).

29. Liu, J., et al. Rat CD8+ FOXP3+ T suppressor cells mediate tolerance to allogeneic heart trasplants, inducing PIR-B in APC and rendering the graft invulnerable to rejection. Trasplant immunology 13, 239-247 (2004).

30. Thomson, A.W., Turnquist, H.R. & Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews 9, 324-337 (2009).

31. Demir, T., et al. Cancer Screening of Renal Trasplant Patients Undergoing Long-Term Immunosuppressive Therapy. Trasplantation proceedings 47, 1413-1417 (2015).

32. Kupeli, E., et al. Long-term risk of pulmonary embolism in solid-organ trasplant recipients. Exp Clin Trasplant 13 Supl 1, 223-227 (2015).

33. Hancock, W.W., et al. Costimulatory function and expression of CD40 ligand, CD80, and CD86 in vascularized murine cardiac allograft rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 13967-13972 (1996).

34. Kirk, A.D., et al. Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates. Nature medicine 5, 686-693 (1999).

35. Kawai, T., Andrews, D., Colvin, R.B., Sachs, D.H. & Cosimi, A.B. Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand. Nature medicine 6, 114 (2000).

36. Nakamura, T., Nakao, T., Yoshimura, N. & Ashihara, E. Rapamycin Prolongs Cardiac Allograft Survival in a Mouse Model by Inducing Myeloid-Derived Suppressor Cells. Am J Trasplant 15, 2364-2377 (2015).

37. Maldonado, R.A., et al. Polymeric synthetic nanoparticles for the induction of antigen-specific immunological tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, E156-165 (2015).

38. Swirski, F.K., et al. Myeloperoxidase-rich Ly-6C+ myeloid cells infíltrate aMografts and contribute to an imaging signature of organ rejection in mice. The Journal of clinical investigation 120, 2627-2634 (2010).

39. Garcia, M.R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular trasplantation tolerance in mice. The Journal of clinical investigation 120, 2486-2496 (2010).

40. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. The Journal of experimental medicine 204, 3037-3047 (2007).

41. Shi, C. & Pamer, E.G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature reviews 11, 762-774 (2011).

42. Garrod, K. R. & Cahalan, M. D. Murine skin trasplantation. J Vis Exp, doi:10.3791/634 (2008).

43. Hackstein, H., et al. Rapamycin inhibits IL-4--induced dendritic cell maturation in vitro and dendritic cell mobilization and function in vivo. Blood 101, 4457-4463 (2003).

44. Herrera, O.B., et al. A novel pathway of alloantigen presentation by dendritic cells. J Immunol 173, 4828-4837 (2004).

45. Corry, R.J., Winn, H.J. & Russell, P.S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H- 2K, and non-H-2 antigens in rejection. Trasplantation 16, 343-350 (1973).

46. Miyake, Y., et al. Critical role of macrophages in the marginal zone in the suppression of immune responses to apoptotic cell-associated antigens. The Journal of clinical investigation 117, 2268-2278 (2007).

47. Zarzycka, T. et al. Discovery of small moleculce CD40-TRAF6 inhibitors. J. Chem. Inf Model. 55:294-307 (2015).

48. Chatzigeorgiou et al. 2014; Blocking CD40-TRAF6 signaling is a therapeutic target in obesity associated insulin resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb. 18;111(7):2686-91.

49. Van der Berg et al. 2015; Blocking CD40-TRAF6 interactions by small-molecule inhibitor 6860766 ameliorates the complications of diet-induced obesity in mice. Int J Obes (Lond). 2015 Mayo;39(5):782-90.

Ejemplo 2

Inhibición de CD40-TRAF6 dirigida resuelve acumulación de macrófagos en aterosclerosis.

En la aterosclerosis, la acumulación de macrófagos está directamente relacionada con la desestabilización y la ruptura de placa, provocando eventos aterotrombóticos agudos. Monocitos circulantes entran en la placa y se diferencian para dar macrófagos, donde se activan por los linfocitos T CD4+ a través de la señalización del ligando CD40-CD40. Aquí se muestra que la interrupción de esta ruta de señalización en monocitos/macrófagos ejerce efectos antiinflamatorios rápidos en un modelo de ratón ApoE'/_ de aterosclerosis. Para este propósito, se desarrolla una nanopartícula de lipoproteína de alta densidad reconstituida infundible que porta un inhibidor de molécula pequeña de la interacción de CD40 y factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral. Se muestra el direccionamiento específico a monocitos/macrófagos de nuestra nanoinmunoterapia, lo que deteriora su capacidad migratoria. La reducción rápida de la inflamación de placa por esta terapia representa una estrategia novedosa en el tratamiento de aterosclerosis, con alto potencial para la traducción clínica, como se ilustra por el perfil de toxicidad favorable en primates no humanos. El reclutamiento de monocitos circulantes que se diferencian en macrófagos es un proceso clave que contribuye a agravar la inflamación de la placa aterosclerótica [1]. Esta acumulación dinámica de macrófagos en placa está directamente relacionada con el desarrollo de eventos aterotrombóticos [1 ].

Ya en la década de 1990, se reconoció que la activación de macrófagos en placa por los linfocitos T CD4+ a través de la señalización de ligando CD40-CD40 (CD40-CD40L) juega un papel central en la atenuación de la inflamación de placa [2]. La desactivación genética de CD40L en ratones con apolipoproteína e inactivada (Apoe'/_) disminuye drásticamente el desarrollo de lesiones ateroscleróticas y disminuye el contenido de linfocitos T y macrófagos en placa [3]. El tratamiento de ratones inactivados (LDLr/_) de receptor de lipoproteínas de baja densidad y Apoe_/' con un anticuerpo CD40L anti-ratón tuvo efectos ateroprotectores similares [4-6]. Estudios adicionales revelaron que el factor 6 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF6) es de importancia específica en la impulsión de la cascada de señalización de CD40 dentro de los macrófagos [7]. Las TRAf son proteínas adaptadoras que pueden unirse al dominio citoplasmático de CD40 y acoplar el complejo receptor a varias rutas de transducción de señales diferentes [8]. De hecho, se ha mostrado que la deficiencia de las interacciones CD40-TRAF6 en células mieloides disminuye el reclutamiento de monocitos a placas y elimina la formación de placa aterosclerótica en ratones Apoe_/'

[7]. Aunque la interacción CD40-TRAF6 proporciona una diana terapéutica prometedora, las limitaciones principales están asociadas con su inhibición. Además del papel de la interacción CD40-TRAF6 en las células mieloides, controla parcialmente la maduración de linfocitos B y la generación de células plasmáticas de vida larga [9]. Por lo tanto, la inhibición a largo plazo de la interacción CD40-TRAF6 probablemente causará deficiencias inmunitarias, convirtiéndose en un enfoque terapéutico inviable para la aterosclerosis.

Para abordar este problema, se desarrolla una inmunoterapia dirigida con la capacidad de bloquear la interacción CD40-TRAF6 específicamente en monocitos/macrófagos. Para este propósito, los inventores incorporaron un inhibidor de molécula pequeña recientemente desarrollado de la interacción CD40-TRAF6 en lipoproteína de alta densidad reconstituida (TRAF6i-HDL) [10, 11]. Se muestra en un modelo de ratón Apoe-/" de aterosclerosis que TRAF6i-HDL se dirige a monocitos/macrófagos, mientras que los linfocitos no captan nanopartículas. Después de una única semana de inmunoterapia con TRAF6i-HDL, se observó una disminución rápida de la inflamación de placa y una disminución del reclutamiento de monocitos. En línea con estos hallazgos, el análisis del transcriptoma completo indicó que la migración celular estaba entre los procesos celulares afectados. Finalmente, para evaluar su potencial de traducción, se evaluó la farmacocinética de TRAF6i-HDL, biodistribución y seguridad en primates no humanos (NHP).

Resultados

Características de TRAF6Í-HDL.

El objetivo del estudio fue disminuir la inflamación de placa inhibiendo específicamente la interacción CD40-TRAF6 en monocitos/macrófagos a través de nanoinmunoterapia dirigida (TRAF6i-HDL). La nanopartícula TRAF6i-HDL se construyó a partir de apolipoproteína humana A-I (apoA-I), y los fosfolípidos 1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-fosfocolina (MHPC) y 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), en la que se encapsuló un inhibidor de molécula pequeña lipofílica de la interacción CD40-TRAF6 (SMI 6877002) [8, 11]. Debido a que apoA-I puede tener efectos moduladores por sí misma, la nanoinmunoterapia se diseñó con una baja relación de apoA-I con respecto a fármaco. La nanopartícula TRAF6i-HDL resultante, mostrado esquemáticamente en la figura 14A, medía 22,6 /- 12 nm de diámetro (PDI = 0,3), determinado por dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Variantes de TRAF6i-HDL, que incorporan tintes fluorescentes (DiO o DiR) o fosfolípidos radiomarcados con circonio-89 (89Zr), se sintetizaron para permitir la detección mediante técnicas de fluorescencia, tomografía por emisión de positrones (PET), recuento gamma y autorradiografía.

Visión general esquemática

En la figura 14B se muestra una visión general esquemática del diseño del estudio. La primera parte del estudio se realizó en ratones con aterosclerosis (ratones Apoe_/' con una dieta alta en colesterol). En estos ratones, primero se estudió la toxicidad de TRAF6i-HDL, farmacocinética, biodistribución, y eficacia de direccionamiento a monocitos/macrófagos en placa aterosclerótica. Posteriormente, se evaluó la eficacia de regresión de placa de un régimen de TRAF6i-HDL de una semana que implica cuatro infusiones intravenosas. A continuación, se investigó el mecanismo mediante el cual TRAF6i-HDL afecta a monocitos/macrófagos en placa usando análisis de transcriptoma completo. La segunda parte del estudio se centró en la traducibilidad de la nanoinmunoterapia con TRAF6i-HDL. Para este propósito, se investigó la toxicidad y farmacocinética de TRAF6i-HDL, mientras que se realizó una tomografía de emisión de positrones in vivo con resonancia magnética (PET/MRI) para estudiar longitudinalmente la biodistribución y el direccionamiento a la pared del vaso en primates no humanos.

Estudios de biodistribución, farmacocinética y toxicidad en ratones Apoe-/-.

Una semana de tratamiento con TRAF6i-HDL no tuvo efecto sobre los niveles de eritrocitos, plaquetas o leucocitos (figura 20). El número de reticulocitos y linfocitos aumentó en cierta medida en comparación con el placebo. El número de células T y células B en la sangre de médula ósea y el bazo no se vio afectado por la terapia con TRAF6i-HDL. No se observaron efectos tóxicos sobre el riñón y la función hepática, aunque la fosfatasa alcalina aumentó en cierta medida (la figura 21). Lípidos, glucosa, proteínas y electrolitos no se vieron afectados.

Para investigar su farmacocinética y biodistribución, ratones Apoe_/' recibieron una única infusión de TRAF6i-HDL radiomarcada con 89Zr. El aclaramiento de radiactividad sanguínea de 89Zr-TRAF6i-HDL se midió durante 24 horas y los datos se ajustaron usando una regresión no lineal de disminución bifásica. La semivida en sangre ponderada (t1/2) finalmente se calculó que era 124,4 min basándose en una t1/2 rápida de 13,7 min y una t1/2 lenta de 195 min (figura 14C). La biodistribución se evaluó mediante obtención de imágenes de PET/TC in vivo (figura 14C) y validó por recuento gamma ex vivo, este último se expresa como un porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% de ID/g; figura 14D). Como se esperaba, la obtención de imágenes de PET/TC mostró que TRAF6i-HDL se acumulaba principalmente en el hígado, bazo y riñón, órganos conocidos por captar y metabolizar HDL. Los datos de recuento gamma confirmaron estos resultados, que muestran la absorción de nanopartículas de 12,8 % de ID/g en el hígado, 8,9 % de ID/g en el bazo, y 7,9 % de ID/g en los riñones. En comparación, el corazón, un órgano de tamaño similar, solo contenía 1,1 % de ID/g (figura 14D). Obtención de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF) ex vivo, 24 horas después de la infusión, corroboró las observaciones de recuento gamma y PET/TC, que muestra que TRAF6i-HDL se acumula principalmente en el hígado, bazo y riñones.

El análisis de citometría de flujo reveló que los macrófagos y monocitos Ly6Chi en sangre, médula ósea, y bazo captó DiO marcado con TRAF6i-HDL. Neutrófilos, monocitos Ly6ClD y células dendríticas también captaron DiO-TRAF6i-HDL, mientras que las células negativas para CD11b positivas para el linaje (todas las células no mieloides) no lo hicieron (figura 14G), indicativo de especificidad de células mieloides.

Acumulación de TRAF6Í-HDL en lesiones ateroscleróticas.

El recuento gamma ex vivo de la totalidad de las aortas mostró que 1,3 % de ID/g de 89Zr-TRAF6i-HDL se había acumulado 24 horas después de la infusión (figura 14D). Observando específicamente la distribución de nanopartículas de TRAF6i-HDL en toda la aorta, la absorción fue la más alta en el área del seno aórtico, que es el sitio preferencial de desarrollo de placa en este modelo de ratón. Mientras que solo se tiene en cuenta el 6,4 % del área total, el área del seno aórtico generó aproximadamente un 29 % de la señal, correspondiente al 5,9 % de ID/g (figura 1d). La obtención de imágenes por NIR^f mostró una acumulación preferencial similar de TRAF6i-HDL marcadas con DiR en el área del seno aórtico (figura 14E). La especificidad celular de la absorción de TRAF6i-HDL marcadas con DiO en la placa aórtica se evaluó mediante citometría de flujo. Se encontró que el 86 % de macrófagos y el 81 % de monocitos Ly6Chi habían captado DiO-TRAF6i-HDL, mientras que las células positivas para el linaje (todas las células no mieloides) no habían captado prácticamente ninguno (figura 14F). Además, se encontró que la mayoría de los neutrófilos (64 %) y células dendríticas (61 %) en la placa aórtica contenían nanopartículas marcadas (figura 14G). Estos resultados reflejan nuestros hallazgos en la sangre, médula ósea y bazo, que muestra que las células del linaje mieloide, y en particular el subconjunto de monocitos Ly6Chi y macrófagos, se dirigen preferiblemente por nanopartículas TRAF6i-HDL.

Efectos in vivo de TRAF6Í-HDL sobre inflamación de placa

Para evaluar la eficacia terapéutica de TRAF6i-HDL, se usaron ratones Apoe-/" de 20 semanas de edad que habían estado con una dieta alta en colesterol durante 12 semanas para desarrollar lesiones ateroscleróticas. Mientras que todos los ratones permanecieron con una dieta alta en colesterol, recibieron cuatro infusiones intravenosas de placebo, nanopartículas de HDL de control sin carga útil, o TRAF6i-HDL durante un período de 7 días. La dosis de inhibidor de CD40-TRAF6 administrada por infusión fue de 5 mg/kg. Para limitar un efecto terapéutico dominante de la propia apoA-I, se usó una dosis baja de apoA-I de 9 mg/kg. Todos los ratones se sacrificaron 24 horas después de la infusión final.

Para el primer experimento, se realizó un análisis histológico cuantitativo de placas en el área del seno aórtico en ratones tratados con placebo, HDL o TRAF6i-HDL (n=10 por grupo). Las secciones transversales se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y Sirio Rojo (colágeno), e inmunotinción para Mac3 (macrófagos) y Ki67 (células proliferantes). No se observaron diferencias significativas en el tamaño de placa o el contenido de colágeno en todos los grupos (figura 15A). Sin embargo, el porcentaje de área positiva para Mac3 disminuyó notablemente en un 36 % (p = 0,001) y un 37 % (p < 0,001) en comparación con los grupos de placebo y HDL, respectivamente (figura 15B). Como resultado, también la relación de Mac3 con respecto a colágeno en la placa se vio afectada favorablemente hacia un fenotipo de placa más estable en el grupo de TRAF6i-HDL, ya que la relación disminuyó en un 31 % (p <0,001) y un 36 % (p = 0,004) en comparación con los grupos de placebo y HDL (figura 15B). El número de macrófagos proliferantes fue similar en todos los grupos (figura 15A), lo que indica que la disminución observada en los macrófagos en placa no fue provocada por una disminución en la proliferación local de macrófagos. Estudios previos mostraron que, además del reclutamiento de monocitos, la proliferación local de macrófagos juega un papel fundamental en la estimulación de la inflamación de placa [12 ].

Posteriormente, se realizó una tomografía molecular de fluorescencia fusionada con obtención de imágenes de tomografía computarizada (FMT/TC) para visualizar la actividad proteasa en el área del seno aórtico. Ratones Apoe-/" tratados con placebo (n=8) y TRAF6i-HDL (n=7) recibieron todos una inyección de un sensor de proteasa pancatepsina activable 24 horas antes de la obtención de imágenes. El sensor de proteasa se capta por macrófagos activados, seguido de la escisión del sensor de proteasa dentro del endolisosoma, produciendo fluorescencia en función de la actividad enzimática. La terapia con TRAF6i-HDL disminuyó la actividad proteasa en un 60 % (p = 0,002, figura 16A). A continuación, nos centramos en la cuantificación del contenido de macrófagos de aorta mediante citometría de flujo de aortas completas. De nuevo, Apoe-/' de 20 semanas de edad con una dieta alta en colesterol se trataron con placebo (n=27), ^h D^l (n=27) o TRAF6i-HDL (n=27). El contenido de macrófagos de aorta disminuyó notablemente en el grupo tratado con TRAF6i-HDL, en un 66 % y un 67 % (p < 0,001 para ambas comparaciones), en comparación con los grupos de placebo y HDL (figura 16B). Estos resultados corroboran las observaciones realizadas por análisis histológico y FMT-TC. Además, en el grupo tratado con TRAF6i-HDL, el contenido de linfocitos T de aorta disminuyó en un 65 % y 49 % en comparación con placebo y HDL, respectivamente. En conjunto, estos datos indican un potente efecto antiinflamatorio de TRAF6i-HDL en placas ateroscleróticas después de una sola semana de terapia.

Dado que ya hemos observado que el número de macrófagos Ki67+ proliferantes no se vio afectado por la terapia, se planteó la hipótesis de que la disminución en el contenido de macrófagos en placa y la inflamación podrían estar provocadas por un reclutamiento disminuido de monocitos en su lugar [13,14]. Para investigar adicionalmente esto, en primer lugar se cuantificaron monocitos Ly6Chi aórticos en el mismo experimento de citometría de flujo que el que medimos el contenido de macrófagos. Se observó que la disminución en macrófagos fue paralela en un 49 % y un 52 % (p < 0,001 para ambas comparaciones) de disminución de monocitos Ly6Chi en la aorta, en comparación con los grupos de placebo y HDL respectivamente (figura 16B). Curiosamente, la reducción en el contenido de monocitos Ly6Chi aórticos no pudo explicarse por una disminución sistémica en monocitos Ly6Chi (figura 16C).

En segundo lugar, se realizó un experimento en el que el análogo de timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) se inyectó por vía intraperitoneal 2 horas antes de sacrificar a los ratones. BrdU se incorpora en el ADN recién sintetizado, y por lo tanto puede usarse como un marcador para la proliferación. La figura 16d muestra que el porcentaje de macrófagos en placa que habían incorporado BrdU no disminuyó por la terapia con TRAF6i-HDL. Este resultado está en línea con la observación histológica sobre la expresión de Ki67. En un experimento in vitro con línea celular RAW 264.7 de macrófagos murinos, caracterizado por una alta tasa de proliferación [15], la incubación con el compuesto inhibidor de CD40-TRAF6 o TRAF6i-HDL no afectó la tasa de proliferación (figura 16E).

Tomados en conjunto, estos datos indican que el contenido de macrófagos en placa, así como la actividad proteasa, disminuyó por la terapia con TRAF6i-HDL. El mecanismo de acción por el cual TRAF6i-HDL disminuye la inflamación de placa está probablemente mediado por la disminución del reclutamiento de monocitos, mientras que la proliferación local de macrófagos no se ve afectada.

Análisis comparativo de transcriptoma completo de monocitos/macrófagos en placa

Para obtener información sobre los efectos de TRAF6i-HDL sobre la expresión génica de monocitos/macrófagos en placa, se aislaron células positivas para CD68 de placas de seno aórtico mediante microdisección de captura con láser de ratones tratados o bien con placebo o bien con TRAF6i-HDL. Se aisló el ARN completo de estas células para secuenciación.

Se identificaron genes que se expresaban diferencialmente (DE) entre ratones tratados con placebo y TRAF6i-HDL. La corrección para múltiples pruebas se realizó con una tasa de falso descubrimiento (FDR) < 0,2 (figura 17A). Se identificó un total de 416 genes DE, de los cuales 209 genes estaban regulados por disminución y 207 regulados por aumento (figura 17B). La función de ontología génica (GO) se usó para anotar los genes d E, y para encontrar componentes celulares que estén significativamente enriquecidos con genes DE (figura 17C). En los 15 términos de GO enriquecidos que se enriquecieron significativamente con genes DE, la “adhesión focal” es de mayor interés. Otros términos de GO enriquecidos, tales como “unión adherente de célula-sustrato”, “unión célula-sustrato”, “unión de adherencia”, y la “unión de anclaje” están estrechamente relacionados con la “adhesión focal” y los genes en estos términos de Go se superponen en un alto grado (figura 22). La adhesión focal es un proceso dinámico en el que los complejos proteicos se conectan a la matriz extracelular, y desempeña un papel central en la migración de monocitos/macrófagos [16]. En un análisis posterior, los mismos 416 genes DE se mapearon con la herramienta de la ruta de la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG), por lo que identificamos dos rutas significativamente alteradas, concretamente “adhesión focal” y “endocitosis” (figura 17D, figura 23).

Los genes DE más significativos, todos con FDR < 0,05 (figura 17D, figura 24) fueron Adcy3, Lgals3bp, Pltp y Stab1 (regulados por aumento) e Impad1, Sept2, Slc4a7 y Spcs2 (regulados por disminución). Entre estos genes, se sabe que el PLTP derivado de macrófagos ejerce efectos antiateroscleróticos [17], y Stab1 (codifica para estabilina-1) tiene funciones en el tropismo de migración dirigida de linfocitos y adhesión celular y está asociado con un fenotipo de macrófago ateroprotector [18, 19]. Se sabe que Sept2 (que codifica para septina2) se expresa abundantemente en los macrófagos y se requiere para la formación de fagosomas [20]. Juntos, los análisis de datos del transcriptoma indican que entre varios procesos afectados, la adhesión focal se ve afectada significativamente por la terapia con TRAF6i-HDL. El hecho de que la adhesión focal, un proceso implicado en la migración celular, se vea afectada de manera importante es consistente con nuestra observación mencionada anteriormente de la disminución del reclutamiento de monocitos Ly6Chi en ratones tratados con TRAF6i-HDL. No se observó un efecto sobre la expresión génica relacionada con la proliferación de macrófagos, apoptosis o salida migratoria (figura 25).

Estudios de biodistribución, farmacocinética y toxicidad de TRAF6i-HDL en primates no humanos.

Para evaluar la capacidad de traducción de la terapia con TRAF6i-HDL, se realizaron pruebas de sangre exhaustivos, análisis histológico, y estudios avanzados de farmacocinética y biodistribución en primates no humanos tratados con TRAF6i-HDL (NHP). Se usaron seis NHP para análisis hematológicos completos y análisis histológico post mortem y otros seis para obtención de imágenes de biodistribución (PET/MRI) y análisis de química sanguínea. Los NHP se inyectaron con placebo o una dosis única de TRAF6i-HDL (1,25 mg/kg) y o bien se sacrificaron después de 72 horas o bien se tomaron imágenes en múltiples puntos de tiempo y después se sacrificaron.

Los datos de hemograma completo de 7 puntos de tiempo dentro de las 72 horas posteriores a la inyección no mostraron diferencias entre los animales tratados con placebo y TRAF6i-HDL en glóbulos blancos, monocitos, neutrófilos, linfocitos, glóbulos rojos, plaquetas o cualquiera de los otros índices. (Figura 18A). Adicionalmente, el análisis de química sanguínea no mostró signos de toxicidad de células hepáticas, renales, pancreáticas o musculares en el grupo tratado con TRAF6i-HDL en comparación con el grupo placebo (figura 18B). Además, niveles de lípidos, glucosa, y proteínas (albúmina y globulina) fueron iguales en ambos grupos (figura 18B). Los electrolitos tampoco se vieron afectados. Se cortaron en sección y se tiñeron (H&E) muestras de hígado, riñones y bazo para histología y se evaluaron por un patólogo. No se encontraron signos de daño tisular o alteraciones en la arquitectura tisular (figura 18C).

Para evaluar la biodistribución, seis NHP se sometieron a obtención de imágenes de PET/MR de cuerpo completo después de la administración intravenosa de TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr. Se tomaron imágenes dinámicamente de los animales durante el transcurso de la primera hora después de la administración, mientras que las exploraciones estáticas posteriores se realizaron en 1,24, 48 y 72 horas. La obtención de imágenes de PET dinámica mostraron una rápida acumulación de radiactividad en el hígado, bazo y riñones, seguido de una absorción significativa en la médula ósea (figura 19A). Una hora después de la inyección, las imágenes de PET estaban dominadas por la fuerte señal de los riñones, seguido por el hígado y el bazo en el punto de tiempo de 1 hora (figura 19A). En 24, 48 y 72 horas, la radiactividad se acumuló principalmente en el hígado y el bazo (figura 19B). Después de sacrificar a los animales en el punto de tiempo de 72 horas, el recuento gamma tisular mostró que la mayor cantidad de la dosis inyectada (% de ID/g) podría rastrearse de vuelta al hígado y al bazo, seguido de los riñones, lo que corrobora los hallazgos de la obtención de imágenes de PET/MRI (figura 19C). Se recogió sangre en diferentes puntos de tiempo y los datos se ajustaron usando una regresión no lineal de disminución bifásica. La t1/2 rápida fue de 14,2 min y la t1/2 lenta fue de 513 min, dando como resultado una semivida en sangre ponderada (t1/2) de 272 min (figura 19D).

Discusión

En el estudio actual se describe el desarrollo de una nanoinmunoterapia basada en HDL dirigida contra la interacción CD40-TRAF6 en monocitos/macrófagos. Nuestros datos muestran que TRAF6i-HDL se acumula en lesiones ateroscleróticas, y tiene una fuerte afinidad por monocitos/macrófagos. Una sola semana de terapia reduce rápidamente el contenido de macrófagos en placa, lo que puede atribuirse en parte a la inhibición del reclutamiento de monocitos. El hecho de que TRAF6i-HDL demostró ser segura en primates no humanos ilustra el potencial de traducción de esta terapia.

El eje de señalización CD40-CD40L ha sido reconocido durante mucho tiempo por desempeñar un papel indispensable en la obtención de respuestas inmunitarias en la aterosclerosis [2-5]. Si bien su identificación dio lugar a una gran anticipación, el direccionamiento terapéutico de este par coestimulante receptor-ligando demostró ser engorroso. Un anticuerpo anti-CD40L fue eficaz para disminuir el desarrollo de aterosclerosis en ratones [3-5], pero las complicaciones tromboembólicas debidas al CD40 expresado en plaquetas impidieron su aplicación en seres humanos [21, 22]. Además, se expresa CD40 en linfocitos B, y el bloqueo prolongado perjudicaría su maduración causando inmunodeficiencia [9]. En el estudio actual, se abordaron estos problemas al dirigirse a la interacción de TRAF6 con el dominio citoplasmático de CD40 específicamente en monocitos/macrófagos. Esto se logró usando HDL como portador de nanopartículas cargado con un inhibidor de molécula pequeña de la interacción CD40-TRAF6. Estos datos muestran que nuestras nanopartículas basadas en HDL expusieron más del 80 % de monocitos y macrófagos a su carga, mientras que los linfocitos no captaron ninguna nanopartícula.

Además de restringir la administración del inhibidor de CD40-TRAF6 a la población de monocitos/macrófagos, también se pretende minimizar los efectos inmunosupresores sistémicos mediante el uso de una corta duración de la terapia de una sola semana. Estudios terapéuticos previos que se dirigen al eje de señalización de CD40-CD40L usaron tiempos de tratamiento prolongados [3-5]. El hecho de que se encontró una disminución de un 49 % y un 66 % en el contenido de macrófagos y monocitos Ly6Chi en placa en una semana indica la alta potencia de la terapia con TRAF6i-HDL. Cabe destacar que se demostró que la contribución de apoA-I al efecto terapéutico de TRAF6i-HDL era menor. Se usaron 4 infusiones de 9 mg/kg de apoA-I, que es relativamente bajo en comparación con estudios publicados previamente [24], y no se encontraron efectos de HDL vacía sobre el contenido de monocitos/macrófagos en placa en comparación con el placebo.

El mecanismo por el cual TRAF6i-HDL disminuyó la inflamación de placa en una escala de tiempo tan corta puede explicarse en parte por la disminución del reclutamiento de monocitos. En general, el contenido de macrófagos en placa está determinado por un equilibrio de reclutamiento de monocitos, así como la proliferación de macrófagos, apoptosis y salida migratoria. Los dos primeros procesos se consideran los determinantes más importantes [25-28]. Nuestros datos no revelaron un efecto sobre la proliferación de macrófagos, apoptosis o salida migratoria, mientras que se observó una disminución en el contenido de monocitos Ly6Chi en placa, lo que sugiere una disminución del reclutamiento de monocitos. Además, no se encontró una disminución en los monocitos sanguíneos que pudiera explicar la disminución del número de monocitos en la placa. Estudios previos mostraron una alta cinética de monocitos [13, 14, 26-28], y se mostró que la disminución del reclutamiento provoca más del 70 % de reducción en el contenido de macrófagos en placa en 4 semanas [26]. Por el contrario, un aumento repentino en el reclutamiento de monocitos, inducido por infarto de miocardio, causó un marcado aumento en el contenido de macrófagos en placa en 1-3 semanas [27]. Estas observaciones están en línea con nuestros hallazgos de disminución del reclutamiento de monocitos causando una disminución de un 66 % del contenido de macrófagos en placa en una semana.

Nuestros datos de análisis del transcriptoma respaldan que el reclutamiento de monocitos se ve afectado. Los análisis no mostraron un papel claro para los ligandos o receptores de quimiocinas. Sin embargo, el análisis de función de GO mostró que la “adhesión focal”, un proceso fundamental en la migración celular, se enriqueció significativamente con genes DE. El análisis de ruta de KEGG también mostró enriquecimiento para la “adhesión focal”. Los genes en la ruta de “adhesión focal” de interés específico son Rhoa, Rap1b y Rap1b, que desempeñan un papel central en la regulación de la migración de monocitos activando integrinas [16]. Todos estaban significativamente regulados por disminución. Esto está en línea con observaciones previas en un modelo de ratón inactivado con señalización defectuosa de CD40-TRAF6, en el que la adhesión luminal de monocitos circulantes a las arterias carótidas se alteró in vivo según lo evaluado por microscopía intravital [7]. Además, la capacidad migratoria de los macrófagos se vio notablemente afectada [7].

Los efectos de TRAF6i-HDL no se limitan a “adhesión focal”, según lo sometido a prueba por varias otras expresiones génicas que mostraron verse afectadas. Juntos, los presentes datos indican que TRAF6i-HDL afecta a diversos procesos biológicos en monocitos/macrófagos en placa, incluyendo el deterioro de la migración de monocitos/macrófagos. Los experimentos extensos sobre farmacocinética, biodistribución y seguridad en primates no humanos (NHP) ilustran la capacidad de traducción de este tratamiento. El uso de HDL reconstituida ha demostrado previamente ser seguro en seres humanos con dosis de apoA-I de 40 mg/kg [24]. Dado que se usaron 9 mg/kg de apoA-I, esto no plantea problemas de seguridad. El inhibidor de molécula pequeña de la interacción CD40-TRAF6 que se desarrolló recientemente, no se ha evaluado en seres humanos hasta la fecha. La biodistribución de TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr fue similar a las observaciones previas con HDL marcada con 89Zr en modelos de aterosclerosis murina, de conejo y porcina [29]. Se observó la mayor acumulación en el hígado, bazo y riñones. El hígado y los riñones son los sitios principales del catabolismo de apoAI y HDL, y el bazo es el principal órgano linfoide secundario que contiene muchas células mieloides que eliminan las nanopartículas de la circulación. No hubo signos de efectos tóxicos en el hígado, riñón o bazo y todos los tejidos mostraron una arquitectura tisular normal en el análisis histológico. Además, el hemograma completo no mostró ningún efecto sobre el número de plaquetas, linfocitos, monocitos, neutrófilos o glóbulos rojos. Los datos de seguridad se evaluaron hasta 72 después de la administración. La seguridad a largo plazo no se evaluó en el estudio actual.

Actualmente no hay terapias específicas disponibles que aborden la inflamación de la placa, aunque la terapia crónica con un anticuerpo anti-interleucina-1p y metotrexato a dosis bajas se está investigando actualmente en ensayos clínicos de fase III grandes [30-32]. El desafío con la inmunosupresión en una enfermedad crónica tal como la aterosclerosis está equilibrar el riesgo frente al beneficio. A diferencia de la estrategia mencionada anteriormente de inmunosupresión crónica, se concibió que puede usarse una nanoterapia de inducción a corto plazo con propiedades inmunomoduladoras para suprimir rápidamente la inflamación de la placa en pacientes con alto riesgo de eventos cardiovasculares. Si bien la administración dirigida mejora la eficacia local del fármaco, su aplicación a corto plazo minimiza los riesgos asociados con la inmunosupresión prolongada. Los pacientes admitidos por un síndrome coronario agudo pueden ser una población apropiada para tal terapia de inducción de inflamación, ya que tienen un riesgo notablemente mayor de infarto de miocardio recurrente de hasta un 17,4 % en el primer año [33]. Estudios recientes han propuesto que es el propio infarto de miocardio inicial el que evoca el reclutamiento de monocitos a placas ateroscleróticas, lo que hace que se inflamen y sean vulnerables a la ruptura de placa [27]. En este contexto fisiopatológico, se espera que nuestro concepto de supresión rápida de reclutamiento de monocitos en la fase vulnerable sea relevante. Este estudio proporciona un enfoque terapéutico innovador de una terapia de inducción rápida para tratar la inflamación en la aterosclerosis, mediante direccionamiento a la señalización de CD40-TRAF6 en monocitos/macrófagos. La nanoinmunoterapia con TRAF6i-HDL infundible tiene un potencial prometedor para la traducción según lo probado por los datos de seguridad favorables en primates no humanos.

En vista de estos resultados, se espera que las nanopartículas TRAF6i-HDL también sean útiles en condiciones asociadas o relacionadas con la obesidad y la resistencia a la insulina. Tales afecciones y complicaciones incluyen: resistencia a la insulina, diabetes mellitus tipo 2 y enfermedad cardiovascular. Se espera que el bloqueo de la ruta CD40-TRAF conduzca a una falta de resistencia a la insulina y una reducción tanto en la inflamación del tejido adiposo (AT) como en la hepatoesteatosis en la obesidad inducida por la dieta, y condiciones similares. Se esperará además que las nanopartículas TRAF6i-HDL puedan proteger contra la inflamación de AT y las complicaciones metabólicas asociadas con la obesidad. Por lo tanto, administrar las nanopartículas TRAF6i-HDL, solo o en combinación con otros tratamientos de cuidados de referencia, puede mejorar los resultados del paciente y prevenir o revertir el daño asociado con estas afecciones.

Métodos

Síntesis de nanopartículas basadas en rHDL.

La síntesis de TRAF6i-HDL se basó en un método previamente publicado [34, 23]. En resumen, el inhibidor de CD40-TRAF66877002 [10] se combinó con 1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-fosfocolina (MHPC) y 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC) (Avanti Polar Lipids) en una mezcla de cloroformo/metanol (9:1 en volumen) y después se secó al vacío, produciendo una película lipídica delgada. Se añadió una disolución de PBS de apolipoproteína humana A1 (apoA-I) a la película lipídica. La mezcla se incubó en hielo durante 1 hora o hasta que la película se hidrató y se formó una disolución homogénea. La disolución se sometió a sonicación después durante 20 minutos para formar nanopartículas de TRAF6i-HDL. Posteriormente, la disolución se purificó mediante múltiples etapas de filtración centrífuga. Para el direccionamiento, experimentos de obtención de imágenes y biodistribución, se prepararon análogos de TRAF6i-HDL mediante la incorporación de los colorantes fluorescentes DiR o DiO (Invitrogen), o el quelante de fosfolípidos DSPE-DFO (1 % en moles a costa de DMPC), que permite el radiomarcado con 89Zr [35].

Animales y dieta para los estudios de ratón.

Se usaron ratones Apoe-/" hembra (B6.129P2-Apoetm1Unc, n=103) para este estudio. Todos los cuidados y procedimientos de animales se basaron en un protocolo institucional aprobado por la Facultad de Medicina de Icahn en Mount Sinai. Se adquirieron ratones Apoe-/" de ocho semanas de edad del Jackson Laboratory. Todos los ratones se alimentaron con una dieta alta en colesterol (HCD) (0,2 % en peso de colesterol; 15,2 % en kcal de proteína, 42,7 % en kcal de hidratos de carbono, 42,0 % en kcal de grasa; Harlan TD. 88137) durante 12 semanas.

El protocolo de tratamiento en cada experimento fue idéntico: ratones Apoe-/" de veinte semanas de edad se asignaron aleatoriamente a grupos o bien de placebo (solución salina), o bien de rHDL vacías o bien de TRAF6i-HDL (5 mg/kg). Los ratones se trataron con 4 inyecciones intravenosas durante 7 días, mientras se mantiene en un HCD durante el tratamiento. Los animales se sacrificaron 24 horas después de la última inyección.

Citometría de flujo.

Los ratones Apoe-/" se sacrificaron y se perfundieron con PBS, después de lo cual la aorta desde la raíz aórtica hasta la bifurcación ilíaca se limpió suavemente de la grasa y se recogió. Se colocaron aortas completas en una disolución de digestión enzimática que contenía liberasa TH (4 U/ml) (Roche), desoxirribonucleasa (ADNasa) I (40 U/ml) (Sigma-Aldrich) e hialuronidasa (60 U/ml) (Sigma-Aldrich), se trituraron y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 60 min. Las células se pasaron a través de un filtro de 70 |im, y se centrifugaron dos veces y se resuspendieron en medios que contenían suero. Los bazos se pesaron y se empujaron a través de un filtro de células de 70 |im, se centrifugaron, se resuspendieron en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 4 minutos, y después se inactivaron usando medios que contenían suero, se centrifugaron y se resuspendieron en 1000 |il de medios que contenían suero por 100 mg de tejido del bazo. La sangre tratada con EDTA se centrifugó, se resuspendió en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 4 minutos, y después se inactivó usando medios que contenían suero, se centrifugó y se resuspendió en 100 |il de medios que contenían suero. La médula ósea se obtuvo de un solo fémur. Los fémures intactos se enjuagaron con etanol al 70 % seguido de tres lavados posteriores en PBS estéril enfriado con hielo. Las epífisis se cortaron y la médula ósea se lavó con PBS. Las células se pasaron a través de un filtro de 70 |im, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 30 segundos, y después se inactivaron usando medios que contenían suero, se centrifugaron y se resuspendieron en 1000 |il de medios que contenían suero. Se usaron los siguientes anticuerpos: F4/80-PE-Cy7 (clon BM8, BioLegend); CD11b-PerCP/Cy5.5 (clon M1/70, BioLegend); CD11c-APC (clon N418, BioLegend); CD45-brillant violet 510 (clon 30-F11, BioLegend); Ly-6C-PE (clon AL-21, BD Biosciences); Ly6CFITC (clon AL-21), BD Biosciences); CD90.2-eFluor 450 (clon 53-2.1, eBioscience); CD90.2-PE (clon 53-2.1, BD Biosciences); Ter119-eFluor 450 (clon TER-119, eBioscience); NK1.1-eFluor 450 (clon PK136, eBioscience); NK1.1-PE (clon PK136, BD Biosciences); CD49b-eFluor 450 (clon DX5, eBioscience); CD45R-eFluor450 (clon RA3-6B2, eBioscience); Ly-6G-Pacific Blue (clon 1A8, BioLegend); Ly-6G-PE (clon 1A8, BD Biosciences); CD3-PE (clon 17A2; Biolegend); CD19-PE (clon 1 D3, BD Bioscience).

Las diluciones de anticuerpos variaron desde 1:200 hasta 1:100. La contribución de células recién preparadas a diferentes poblaciones se determinó mediante marcado in vivo con bromodesoxiuridina (BrdU). La incorporación se midió usando anticuerpos anti-BrdU conjugados con APC según el protocolo del fabricante (BD APC-BrdU Kit, 552598). Se identificaron monocitos y macrófagos usando un método similar al descrito anteriormente [28]. Específicamente, se identificaron monocitos Ly6Chi como CD11bhi, CD11clow, Lin-/low (con Lin definido como CD90.2+, CD45R+, CD49b+, NK1.1+, Ly-6G+, Ter119+ o CD90.2+, NK1.1+, Ly-6G+, CD19+, CD3+) F4/80lowque también eran Ly-6Chi. Se identificaron macrófagos como CD11bhi, CD11dlow, Lin-/low, F4/80hi, CD11'/low. Se adquirieron datos en un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) y se analizaron con FlowJo v10.0.7 (Tree Star, Inc.).

Histología e inmunohistoquímica.

Se recogieron tejidos para análisis histológico y se fijaron durante la noche en formalina y se embebieron en parafina. Las raíces aórticas se cortaron en sección en cortes de 4 |im, generando un total de 90 - 100 secciones transversales por raíz. Ocho secciones transversales se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y se usaron para la medición del tamaño de placa aterosclerótica. Otras secciones se desparafinaron, se bloquearon, se incubaron en una disolución de recuperación de antígeno (DAKO) a 95 °C, y se inmunomarcaron o bien con anticuerpo monoclonal de rata MAC-3 (1:30; BD Biosciences) o bien con anticuerpo policlonal de conejo anti-Ki67 (1:200, Abcam). Se usó tinción con Sirius Red (Sirio Rojo) para el análisis del contenido de colágeno. La tinción de anticuerpos se visualizó mediante o bien rojo AMEC Immpact (Vectorlabs) o bien diaminobencidina (DAB). Las secciones se analizaron usando un microscopio Leica DM6000 (Leica Microsystems) o el escáner de portaobjetos VENTANA iScan HT (Ventana).

Microdisección por captura láser y secuenciación de ARN.

La LCM se realizó en 24 secciones de raíz aórtica (6 |im) como se describió anteriormente (20). En resumen, las secciones congeladas se deshidrataron en disoluciones de etanol escalonadas (70 % dos veces, 95 % dos veces, 100 % una vez), se lavaron con agua tratada con DEPC, se tiñeron con hematoxilina de Mayer, eosina y se aclararon en xileno. Por cada 8 secciones, se usó 1 sección para la tinción de CD68 (Abdserotec, dilución 1:250) que se usó para guiar la LCM. Se identificaron áreas ricas en c D68 dentro de las placas y se cortaron usando el sistema ArcturusXT LCM. Las células positivas para CD68 recogidas se usaron para el aislamiento de ARN (kit de aislamiento de ARN PicoPure, Arcturus) y posterior amplificación de ARN y preparación de ADNc según los protocolos del fabricante (Ovation Pico WTA System, NuGEN). La calidad y concentración de las muestras recogidas se midieron con el bioanalizador Agilent 2100.

Secuenciación de ARN. Se prepararon y validaron bibliotecas de extremos emparejados. Se determinaron la pureza, tamaño del fragmento, rendimiento y la concentración. Durante la generación de agrupaciones, las moléculas de la biblioteca se hibridaron en una celda de flujo Illumina. Posteriormente, las moléculas hibridadas se amplificaron usando amplificación de puente, dando como resultado una población heterogénea de agrupaciones. El conjunto de datos se obtuvo usando un secuenciador HiSeq 2500 de Illumina.

Análisis de anotación de función y expresión diferencial.

Las lecturas de secuenciación de extremos emparejados se alinearon con el genoma humano hg19 usando el alineador Tophat (bowtie2) [36]. Después de la alineación de lecturas, se usó HTSeq [37] para cuantificar la expresión génica a nivel génico basándose en la versión 22 del modelo génico GENCODE [38]. Los recuentos de lectura sin procesar de expresión génica se normalizaron como recuentos por millón usando la media recortada del método de normalización de valores de M para ajustar la diferencia de tamaño de biblioteca de secuenciación entre las muestras [39]. Los genes expresados diferencialmente entre los tratamientos con fármaco y el placebo se identificaron usando el paquete limma de Bioconductor [40]. Con el fin de corregir el problema de múltiples pruebas, se usó limma para calcular estadísticas y valores de p en muestras aleatorias después de una permutación de marcas. Este procedimiento se repitió 1,000 veces para obtener una distribución de valor de p y estadística de t nula para estimar la tasa de falso descubrimiento (FDR) de todos los genes. Los genes expresados diferencialmente (DE) se identificaron por un valor de corte de valor de p corregido menor que 0,2. La función de GO [41] se usó para anotar los genes DE, y para encontrar componentes celulares que estén significativamente enriquecidos con los genes DE. Los genes DE también se mapearon en la ruta de la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG) con KEGG Mapper [42].

Tomografía molecular de fluorescencia con TC.

Ratones Apoe-/- hembra alimentados con una dieta rica en grasas durante 12 semanas, se trataron o bien con cuatro infusiones de TRAF6i-HDL (5 mg/kg, n = 7) o bien con solución salina (n = 8) durante 7 días. Cinco nanomoles de sensor de proteasa pan-catepsina (ProSense 680, PerkinElmer, n.° de Cat. NEV10003) se administraron por vía intravenosa 24 horas antes de la obtención de imágenes. Para la obtención de imágenes FMT/TC, los animales se colocaron en un cartucho de obtención de imágenes personalizado, que estaba equipado para la administración de isoflurano durante la obtención de imágenes. Los animales se exploraron primero con tomografía computarizada de alta resolución (TC; Inveon PET-CT, Siemens), con una infusión continua de agente de contraste de TC (isovue-370, Bracco Diagnostics) a una velocidad de 55 |il/min a través de un catéter en la vena de la cola. Los animales se exploraron posteriormente con un escáner FMT (PerkinElmer) en el mismo cartucho. La fuente de rayos X de TC con un tiempo de exposición de 370-400 ms se hizo funcionar a 80 kVp y 500 mA. Se usaron imágenes de TC de alta resolución mejoradas en contraste para localizar la raíz aórtica, que se usó para guiar la colocación del volumen de interés para el mapa cuantitativo de actividad proteasa FMT. La fusión de imágenes se basó en marcadores fiduciales. La fusión de imágenes y el análisis se realizó con OsiriX v.6.5.2 (The Osirix Foundation, Geneva).

Radiomarcado de nanopartículas HDL.

Las nanopartículas de HDL listas para marcar se prepararon incluyendo 1 % en moles de fosfolipidquelato o DSPE-DFO (35) en la mezcla de formulación a costa de DMPC. Las nanopartículas que contenían DFO se marcaron luego con circonio-89 (89Zr) como se describió previamente (35). En resumen, las nanopartículas se hicieron reaccionar con 89Zr-oxalato en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,1) a 37 °C durante 1 hora. La purificación se llevó a cabo por filtración centrífuga usando tubos de filtro de corte de peso molecular de 10 kDa, y lavando dos veces con PBS estéril fresco. El rendimiento radioquímico fue del 90 ± 4 % (n = 3) y la pureza radioquímica > 97 %, según lo determinado por cromatografía de exclusión por tamaño.

Estudios de farmacocinética, biodistribución y obtención de imágenes de PET/TC en ratones.

Ratones Apoe_/' hembra alimentados con una dieta rica en grasas durante 12 semanas (n = 4, 25,5 ± 2,6 g de peso corporal) se inyectaron con nanopartículas de 89Zr-TRAF6i-HDL (183 ± 16 |iC¡, 5 mg de TRAF6i-HDL/kg). En puntos de tiempo predeterminados (2, 15 y 30 min, y 1, 4, 8 y 24 horas) se tomaron muestras de sangre, se pesaron y se midieron para determinar el contenido de radiactividad usando un contador gamma automático 2470 Wizard (Perkin Elmer). Los datos se convirtieron en porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido [% de ID/g], se representaron gráficamente en una curva de actividad con respecto al tiempo y se ajustaron usando una regresión no lineal de disminución bifásica en Prism GraphPad (GraphPad Software inc, EE.UU.). Finalmente se calculó la semivida de radiactividad sanguínea ponderada (t1/2).

Veinticuatro horas después de la inyección, los animales se exploraron en un escáner PET/TC Inveon (Siemens Healthcare Global) bajo anestesia con mezcla de gases de isoflurano/oxígeno (2 % para inducción, 1 % para mantenimiento). La exploración estática de PET registró un mínimo de 25 millones de eventos coincidentes y duró 10 minutos. Las ventanas de tiempo de energía y coincidencia fueron 350-700 keV y 6 ns, respectivamente. Los datos de imagen se normalizaron para corregir la falta de uniformidad de la respuesta de la PET, pérdidas de recuento de tiempo muerto, relación de ramificación de positrones, y disminución física hasta el momento de la inyección, pero no se aplicó corrección de promedio de volumen parcial, atenuación o dispersión. Las tasas de recuento en las imágenes reconstruidas se convirtieron en concentraciones de actividad (% de ID/g) mediante el uso de un factor de calibración del sistema derivado de la obtención de imágenes de un modelo equivalente al agua de tamaño de ratón que contenía 89Zr. Las imágenes se analizaron usando ASIPro VMTM (Concorde Microsystems) y el software Inveon Research (Siemens Healthcare Global). La cuantificación de concentración de actividad se realizó promediando los valores máximos en al menos 5 ROI extraídas en cortes adyacentes del tejido de interés. Se realizaron exploraciones TC de bajo aumento estándar en el cuerpo completo con la configuración de tubo de rayos X a un voltaje de 80 kV y una corriente de 500 |oA. La exploración de TC se adquirió usando 120 etapas de rotación para un total de 220 grados, produciendo un tiempo de exploración estimado de 120 s con una exposición de 145 ms por fotograma. Inmediatamente después de la exploración de PET/TC, los animales se sacrificaron y se perfundieron con PBS. Tejidos de interés (hígado, riñones, bazo, pulmones, músculo, corazón, aorta, hueso y cerebro) se recogieron, se transfirieron y se pesaron. La radiactividad se midió mediante recuento gamma y la concentración de radiactividad se expresó como porcentaje de la dosis inyectada por gramo [% de ID/g].

Autorradiografía.

Después del recuento de radiactividad, las aortas se colocaron en un casete de película contra una placa de fósforo para obtención de imágenes (BASMS-2325, Fujifilm, Valhalla, NY) durante 24 horas a -20 °C para determinar la distribución de radiactividad. Las placas se leyeron a una resolución de píxeles de 25 |im con un lector de placas Typhoon 7000IP (GE Healthcare, Pittsburgh, PA).

Obtención de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIRF) ex vivo.

Ratones Apoe_/' hembra alimentados con una dieta rica en grasas durante 12 semanas, recibieron una única inyección IV con DiR (0,5 mg/kg) marcada con TRAF6i-HDL (5 mg/kg, n = 2) o solución salina (n = 1). Los ratones se sacrificaron 24 horas después de la inyección y se perfundieron con 60 ml de PBS. Se recogió tejido de hígado, bazo, pulmón, riñones, corazón y músculo para la obtención de imágenes de NIRF. Las imágenes fluorescentes se adquirieron con el sistema IVIS 200 (Xenogen), con un tiempo de exposición de 2 segundos, usando un filtro de excitación de 745 nm y un filtro de emisión de 820 nm. Las ROI se extrajeron en cada tejido con el software proporcionado por el vendedor, después de lo cual se realizó un análisis cuantitativo con la eficiencia radiante promedio dentro de estas ROI.

Análisis de sangre.

En ratones, se recogió sangre mediante punción cardíaca en el momento del sacrificio. El suero se envió a laboratorios IDEXX (Totowa, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizó con un analizador químico Olympus AU400. Se recogió sangre completa en tubos que contenían EDTA y se analizó con un analizador de hematología procyte DX de IDEXX para análisis de hemograma completo. En primates no humanos se recogió sangre a los 0 y 15 minutos y 6, 12, 24, 28, 48 y 72 horas después de la infusión. El suero se analizó con un analizador químico Olympus AU400. También se analizaron muestras de sangre completa con un analizador de hematología procyte DX de IDEXX.

Estudios de primates no humanos

Se usaron monos cynomolgus macho adultos (Macaca fascicularis) para los estudios de primates no humanos realizados en la Universidad de Kentucky y la Facultad de Medicina de Icahn en Mount Sinai. Los animales tenían en promedio 7,3 años de edad, y su peso fue de 7,3 ± 1,98 kg (media ± DE). Todos los cuidados, los procedimientos y experimentos animales se basaron en protocolos institucionales aprobados de Facultad de Medicina de Icahn en Mount Sinai y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky. Los monos se alojaron por parejas cuando fue posible en condiciones de clima controlado con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. A los monos se les proporcionó agua ad libitum y se les alimentó con dieta de primates con 20 % de proteínas de Teklad Global. Para el experimento en la Universidad de Kentucky se usaron los seis monos macho. Después de un ayuno nocturno, los monos se anestesiaron con ketamina (5 mg/kg) y dexmedetomidina (0,0075-0,015 mg/kg), y se recogió sangre de la vena femoral. A continuación, se inyectó IV a los monos a través de la vena safena con o bien vehículo (PBS, grado USP) o bien TRAF6i-HDL de modo que la dosis de inhibidor de CD40-TRAF66877002 fue de 1,25 mg/kg. Se recogió sangre 15 minutos, 6, 12, 24, y 48 horas después de la inyección. Después de la extracción de sangre, la anestesia se revirtió con atipamezol (0,075-0,15 mg/kg). 72 horas después de la inyección, los monos en ayunas se anestesiaron con ketamina (25 mg/kg), se les extrajo sangre una última vez, y se sacrificaron por exanguinación con perfusión salina de cuerpo completo mientras se anestesiaron con isoflurano (3-5 % de inducción, 1-2 % de mantenimiento). Los tejidos se retiraron inmediatamente y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. La sangre se sometió a una prueba de hemograma completo (CBC) (ANTECH Diagnostics).

Para el experimento en la Facultad de Medicina de Icahn en Mount Sinai se usaron seis monos hembra. Para la obtención de imágenes de 89Zr-PET/MRI, a los animales se les infundió 58,9 ± 17,9 MBq de TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr (1,25 mg/kg) y se obtuvieron imágenes por PET/MRI en diferentes puntos de tiempo. La obtención de imágenes de PET dinámica se realizó durante los primeros 60 minutos después de la infusión. Se realizaron exploraciones adicionales de PET/MRI a las 24, 48 y 72 horas. Las imágenes de PET y MR se adquirieron en un sistema combinado de PET/MRI 3T (Biograph mMR, Siemens Healthineers, Erlangen, Alemania). El día 1, la obtención de imágenes de PET dinámica se realizó durante 60 minutos usando una posición de lecho que cubre el pecho y el abdomen, directamente después de la inyección con TRAF6i-HDL marcadas con 89Zr. Simultáneamente, las imágenes de MR de pared de vaso anatómico se adquirieron usando una perfección de muestreo ponderada de densidad de protones (PD) con contrastes optimizados por aplicación usando diferente secuencia de evolución de ángulo de volteo (SPACE). Los parámetros de obtención de imágenes de MR fueron: plano de adquisición, coronal; tiempo de repetición (TR), 1000 ms; tiempo de eco (TE), 79 ms; campo de visión (FOV), 300 x 187 mm2; número de cortes, 144; número de promedios, 4; ancho de banda, 601 Hz/píxel; factor turbo (TF), 51; haces de ecos por corte, 4; longitud del haz de ecos, 192 ms; espaciado de eco, 3,7 ms; duración de adquisición, 33 minutos y 36 segundos. Después de la adquisición de PET dinámica, se obtuvieron imágenes de PET estática de cuerpo completo desde el cráneo hasta la pelvis, usando 3 posiciones de lecho consecutivas, de 10 minutos cada una. Simultáneamente con cada lecho, las imágenes de MR se adquirieron como se describió anteriormente, excepto poque se usó solo promedio de señal 1,4 (duración de adquisición, 11 min 44 segundos por lecho). La obtención de imágenes de PET y MR de todo el cuerpo también se realizó en 24, 48 y 72 horas después de la inyección, usando 3 posiciones de lecho (duración de PET por lecho, 30 min; duración de MR por lecho, 33 min y 36 s). Las imágenes de MR de todo el cuerpo de cada lecho se recogieron automáticamente juntas por el escáner. Después de la adquisición, los datos sin procesar de PET de cada lecho se reconstruyeron y se recogieron juntos fuera de línea usando las herramientas e7 patentadas Siemens con un algoritmo de maximización de expectativa de subconjuntos ordenados (OSEM) con corrección de función de dispersión de puntos (PSF). Se usó un mapa de atenuación de doble compartimento (tejido blando y aire) para la corrección de atenuación.

Análisis estadístico.

Las variables continuas se expresan como medias ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. La significación de diferencias se calculó mediante el uso de la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica y la prueba de Kruskal-Wallis. Valores de probabilidad de P < 0,05 se consideraron significativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico para las ciencias sociales (SPSS) versión 22.0.0.0.

Referencias

1. F. K. Swirski, M. Nahrendorf, Leukocyte behavior in atherosclerosis, myocardial infarction, and heart failure. Science 339, 161-166 (2013).

2. U. Schonbeck, P. Libby, CD40 signaling and plaque instability. Circ Res. 89, 1092-1103 (2001).

3. E. Lutgens, L. Gorelik, M. J. Daemen, E. D. de Muinck, I. S. Grewal, V. E. Koteliansky, R. A. Flavell, Requirement for CD154 in the progression of atherosclerosis. Nat. Med. 5 , 1313-1316 (1999).

4. F. Mach, U. Schonbeck, G. K. Sukhova, E. Atkinson, P. Libby, Reduction of atherosclerosis in mice by inhibition of CD40 signalling. Nature 394, 200-203 (1998).

5. U. Schonbeck, G. K. Sukhova, K. Shimizu, F. Mach, P. Libby, Inhibition of CD40 signaling limits evolution of established atherosclerosis in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 7458-7463 (2000).

6. E. Lutgens, K.B. Cleutjens, S. Heeneman, V.E. Koteliansky, L.C. Burkly, M.J. Daemen. Both early and delayed anti-CD40L antibody treatment induces a stable plaque phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 7464-7469 (2000).

7. E. Lutgens, D. Lievens, L. Beckers, E. Wijnands, O. Soehnlein, A. Zernecke, T. Seijkens, D. Engel, J. Cleutjens, A. M. Keller, S. H. Naik, L. Boon, H. A. Oufella, Z. Mallat, C. L. Ahonen, R. J. Noelle, M. P. de Winther, M. J. Daemen, E. A. Biessen, C. Weber, Deficient CD40-TRAF6 signaling in leukocytes prevents atherosclerosis by skewing the immune response toward an antiinflammatory profile. J. Exp. Med. 207, 391-404 (2010).

8. S. S. Pullen, H. G. Miller, D. S. Everdeen, T. T. Dang, J. J. Crute, M. R. Kehry, CD40-tumor necrosis factor receptorassociated factor (TRAF) interactions: regulation of CD40 signaling through multiple TRAF binding sites and TRAF hetero-oligomerization. Biochemistry 37, 11836-11845 (1998).

9. C. Ahonen, E. Manning, L. D. Erickson, B. O'Connor, E. F. Lind, S. S. Pullen, M. R. Kehry, R. J. Noelle, The CD40-TRAF6 axis controls affinity maturation and the generation of long-lived plasma cells. Nat. Immunol. 3, 451-456 (2002).

10. B. Zarzycka, T. Seijkens, S. B. Nabuurs, T. Ritschel, J. Grommes, O. Soehnlein, R. Schrijver, C. M. van Tiel, T. M.

Hackeng, C. Weber, F. Giehler, A. Kieser, E. Lutgens, G. Vriend, G. A. Nicolaes, Discovery of small molecule CD40-TRAF6 inhibitors. J. Chem. Inf. Model. 55, 294-307 (2015).

11. A. Chatzigeorgiou, T. Seijkens, B. Zarzycka, D. Engel, M. Poggi, S. van den Berg, S. van den Berg, O. Soehnlein, H. Winkels, L. Beckers, D. Lievens, A. Driessen, P. Kusters, E. Biessen, R. Garcia-Martin, A. Klotzsche-von Ameln, M. Gijbels, R. Noelle, L. Boon, T. Hackeng, K.M. Schulte, A. Xu, G. Vriend, S. Nabuurs, K.J. Chung, K. Willems van Dijk, P.C. Rensen, N. Gerdes, M. de Winther, N.L. Block, A.V. Schally, C. Weber, S.R. Bornstein, G. Nicolaes, T. Chavakis, E. Lutgens. Blocking CD40-TRAF6 signaling is a therapeutic target in obesity-associated insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 2686-2691 (2014).

12. C. S. Robbins, I. Hilgendorf, G. F. Weber, I. Theurl, Y. Iwamoto, J. L. Figueiredo, R. Gorbatov, G. K. Sukhova, L. M. Gerhardt, D. Smyth, C. C. Zavitz, E. A. Shikatani, M. Parsons, N. van Rooijen, H. Y. Lin, M. Husain, P. Libby, M. Nahrendorf, R. Weissleder, F. K. Swirski, Local proliferation dominates lesional macrophage accumulation in atherosclerosis. Nat. Med. 19, 1166-1172 (2013).

13. F. K. Swirski, P. Libby, E. Aikawa, P. Alcaide, F. W. Luscinskas, R. Weissleder, M. J. Pittet. Ly-6Chi monocytes dominate hypercholesterolemia-associated monocytosis and give rise to macrophages in atheromata. J Clin Invest.

117, 195-205 (2007).

14. F. KS. wirski, M. J. Pittet, M. F. Kircher, E. Aikawa, F. A. Jaffer, P. Libby, R. Weissleder. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 10340-10345 (2006).

15. S. B. Iloki Assanga, A A. Gil-Salido, L. M. Lewis Luján, A. Rosas-Durazo, A. L.. Acosta-Silva, E. G. Rivera-Castaneda, J. L. Rubio-Pino, Cell growth curves for different cell lines and their relationship with biological activities. Int. J. Biotechnol. Mol. Biol. Res. 4, 60-70 (2013).

16. B. A. Imhof, M. Aurrand-Lions, Adhesion mechanisms regulating the migration of monocytes. Nat. Rev. Immunol.

4 , 432-444 (2004).

17. D. T. Valenta, J. J. Bulgrien, D. J. Bonnet, L. K. Curtiss, Macrophage PLTP is atheroprotective in LDLr-deficient mice with systemic PLTP deficiency. J. Lipid. Res. 49, 24-32 (2008).

18. G. D. Wenger, M. S. O'Dorisio, Induction of cAMP-dependent protein kinase I during human monocyte differentiation. J. Immunol. 134, 1836-1843 (1985).

19. G. Chinetti-Gbaguidi, S. Colin, B. Staels, Macrophage subsets in atherosclerosis. Nat. Rev. Cardiol. 12, 10-17 (2015).

20. Y. W. Huang, M. Yan, R. F. Collins, J. E. Diciccio, S. Grinstein, W. S. Trimble, Mammalian septins are required for phagosome formation. Mol. Biol. Cell. 19, 1717-1726 (2008).

21. T. Kawai, D. Andrews, R. B. Colvin, D. H. Sachs, A. B. Cosimi, Thromboembolic complications after treatment with monoclonal anti- body against CD40 ligand. Nat. Med. 6, 114 (2000).

22. P. André, K. S. Prasad, C. V. Denis, M. He, J. M. Papalia, R. O. Hynes, D. R. Phillips, D. D. Wagner, CD40L stabilizes arterial thrombibyabeta3 integrin-dependent mechanism. Nat. Med. 8, 247-252 (2002).

23. R. Duivenvoorden, J. Tang, D. P. Cormode, A. J. Mieszawska, D. Izquierdo-Garcia, C. Ozcan, M. J. Otten, N. Zaidi, M. E. Lobatto, S. M. van Rijs, B. Priem, E. L. Kuan, C. Martel, B. Hewing, H. Sager, M. Nahrendorf, G. J. Randolph, E.

5. Stroes, V. Fuster, E. A. Fisher, Z. A. Fayad, W. J. Mulder, A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nat. Commun. 5 , 3065 (2014).

24. P. K. Shah, J. Nilsson, S. Kaul, M. C. Fishbein, H. Ageland, A. Hamsten, J. Johansson, F. Karpe, B. Cercek, Effects of recombinant apolipoprotein A-I(Milano) on aortic atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 97, 780-785 (1998).

25. K. J. Moore, F. J. Sheedy, E. A. Fisher, Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat. Rev. Immunol.

13, 709-721 (2013).

26. S. Potteaux, E. L. Gautier, S. B. Hutchison, N. van Rooijen, D. J. Rader, M. J. Thomas, M. G. Sorci-Thomas, G. J. Randolph, Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe_/' mice during disease regression. J. Clin. Invest. 121, 2025- 2036 (2011).

27. P. Dutta, G. Courties, Y. Wei, F. Leuschner, R. Gorbatov, C. S. Robbins, Y. Iwamoto, B. Thompson, A. L. Carlson, T. Heidt, M. D. Majmudar, F. Lasitschka, M. Etzrodt, P. Waterman, M. T. Waring, A. T. Chicoine, A. M. van der Laan, H. W. Niessen, J. J. Piek, B. B. Rubin, J. Butany, J. R. Stone, H. A. Katus, S. A. Murphy, D. A. Morrow, M. S. Sabatine, C. Vinegoni, M. A. Moskowitz, M. J. Pittet, P. Libby, C. P. Lin, F. K. Swirski, R. Weissleder, M. Nahrendorf, Myocardial infarction accelerates atherosclerosis. Nature 487, 325-329 (2012).

28. C. S. Robbins, I. Hilgendorf, G. F. Weber, I. Theurl, Y. Iwamoto, J. L. Figueiredo, R. Gorbatov, G. K. Sukhova, L. M. Gerhardt, D. Smyth, C. C. Zavitz, E. A. Shikatani, M. Parsons, N. van Rooijen, H. Y. Lin, M. Husain, P. Libby, M. Nahrendorf, R. Weissleder, F. K. Swirski, Local proliferation dominates lesional macrophage accumulation in atherosclerosis. Nat Med. 19, 1166-1172 (2013).

29. C. Pérez-Medina, T. Binderup, M. E. Lobatto, J. Tang, C. Calcagno, L. Giesen, C. H. Wessel, J. Witjes, S. Ishino, S. Baxter, Y. Zhao, S. Ramachandran, M. Eldib, B. L. Sánchez-Gaytán, P. M. Robson, J. Bini, J. F. Granada, K. M. Fish, E. S. Stroes, R. Duivenvoorden, S. Tsimikas, J. S. Lewis, T. Reiner, V. Fuster, A. K j^r, E. A. Fisher, Z. A. Fayad, W. J. Mulder, In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC. Cardiovasc. Imaging. 9 , 950-961 (2016).

30. P. M. Ridker, T. Thuren, A. Zalewski, P. Libby, Interleukin-1 p inhibition and the prevention of recurrent cardiovascular events: rationale and design of the Canakinumab Anti-inflammatory Thrombosis Outcomes Study (CANTOS). Am. Heart. J. 162, 597-605 (2011).

31. B. M. Everett, A. D. Pradhan, D. H. Solomon, N. Paynter, J. Macfadyen, E. Zaharris, M. Gupta, M. Clearfield, P. Libby, A. A. Hasan, R. J. Glynn, P. M. Ridker, Rationale and design of the Cardiovascular Inflammation Reduction Trial: a test of the inflammatory hypothesis of atherothrombosis. Am Heart J. 166, 199-207 (2013).

32. M. Back, G. K. Hansson, Anti-inflammatory therapies for atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 12, 199-211 (2015).

33. G. W. Stone, A. Maehara, A. J. Lansky, B. de Bruyne, E. Cristea, G. S. Mintz, R. Mehran, J. McPherson, N. Farhat, S. P. Marso, H. Parise, B. Templin, R. White, Z. Zhang, P. W. Serruys, A prospective natural-history study of coronary atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 364, 226-235 (2011).

34. Jonas A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods Enzymol 128, 553-582 (1986).

35. C. Perez-Medina, J. Tang, D. Abdel-Atti, B. Hogstad, M. Merad, E. A. Fisher, Z. A. Fayad, J. S. Lewis, W. J. Mulder, T. Reiner, PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J. Nucl. Med. 56, 1272-1277 (2015).

36. B. Langmead, S. L. Salzberg. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods 9 , 357-359 (2012).

37. S. Anders, P.T. Pyl, W. Huber. HTSeq - a Python framework to work with highthroughput sequencing data. Bioinformatics 31, 166-169 (2015).

38. J. M. Mudge, J. Harrow. Creating reference gene annotation for the mouse C57BL6/J genome assembly. Mamm Genome. 26, 366-378 (2015).

39. M. E. Ritchie, B. Phipson, D. Wu, Y. Hu, C. W. Law, SW. Shi, G. K. Smyth. Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic. Acids. Res. 43, e47 (2015).

40. J. Wang, X. Zhou, J. Zhu, Y. Gu, W. Zhao, J. Zou, Z. Guo. GO-function: deriving biologically relevant functions from statistically significant functions. Brief Bioinform 13, 216-227 (2012).

41. M. Kanehisa, S. Goto, Y. Sato, M. Furumichi, M. Tanabe. KEGG for integration and interpretation of large-scale molecular data sets. Nucleic Acids Res. 40, D109-114 (2012).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   i . Una composición que comprende una nanopartícula derivada de lipoproteína de alta densidad (HDL), que comprende rapamicina, 1,2-(dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), 1 -miristoil-2-hidroxi-sn-glicerofosfocolina (MHPC) y ApoA-1 para su uso en la profilaxis del rechazo de órgano o tejido en un paciente. 2. La composición según la reivindicación 1, en la que la relación en peso de DMPC con respecto a MHPC es aproximadamente 3:1.

   3. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, que comprende a) una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición y b) un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

   4. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, que comprende además uno o más agentes inmunosupresores o agentes antiinflamatorios.

   5. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 4, en la que el agente inmunosupresor es ciclosporina A o FK506.

   6. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el paciente se ha sometido a un trasplante de órgano o tejido y el tejido trasplantado es tejido pulmonar, tejido cardíaco, tejido renal, tejido hepático, tejido retiniano, tejido corneal, tejido cutáneo, tejido pancreático, tejido intestinal, tejido genital, tejido de ovario, tejido óseo, tejido de tendón, médula ósea, o tejido vascular.

   7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que la composición se administra por vía intravenosa o intraarterial.

   8. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que se prolonga la supervivencia de aloinjerto en el paciente.

   9. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que el órgano es el corazón.