KR20150065881A

KR20150065881A - 암 표적화 치료 및 암 재발 예방을 위한 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20150065881A
Application number: KR1020157012185A
Authority: KR
Inventors: 빙 로우 웡; 노만 펑 맨 와이; 수이 이 쿽; 수이 이 ?; 스제 항 라우
Original assignee: 비전 글로벌 홀딩스 리미티드.
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2015-06-15
Also published as: US20140106004A1; MX367562B; SG10201607846PA; MX2015004512A; MA37994A2; AP2015008315A0; BR112015007475A2; JP2015534946A; PH12015500562A1; IL237763A; US20140303085A1; EA201500301A1; AR093023A1; WO2014059199A8; CA2884521A1; SG11201502133SA; PH12015500562B1; WO2014059199A1; UY35082A; EP2906222A1

Abstract

본 발명은 암을 치료, 암성 종양의 재발 및 전이를 예방하기 위한 헤모글로빈 기반 산소운반체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 단독으로 또는 5FU, 보르테조밉, 독소루비신, 시스플라틴 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 화학요법제와 병용할 수 있다. 조성물 내 헤모글로빈 기반 산소운반체는 암성 세포 상에 발현되는 표면 수용체를 표적화하고, 수용체 매개 메커니즘을 통해 헤모글로빈 기반 산소운반체와 화학요법제 모두의 암성 세포에 의한 흡수를 촉진할 수 있다. 헤모글로빈 기반 산소운반체는 HIF1 a, VEGF, ET1, VHL 등과 같은 저산소 반응 요소의 발현을 억제한다. 본 발명의 약학적 조성물은 암성 종양의 저산소성 적소에 위치하는 암 줄기세포라 불리는 자가 재생 및 종양 개시 유형의 세포의 세포자멸사 또는 세포 사멸을 유도하는 데에도 유용하다.

Description

암 표적화 치료 및 암 재발 예방을 위한 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 약학적 조성물{HEMOGLOBIN-BASED OXYGEN CARRIER-CONTAINING PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR CANCER TARGETING TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER RECURRENCE}

저작권 통지/허락

본 특허 문서의 개시사항의 일부는 저작권 보호의 대상이 되는 내용을 담고 있다. 저작권자는 본 특허 문서 또는 특허 개시사항을 누구든지 특허상표청 특허 포대 또는 기록에 나타난 대로 팩시밀리 복제하는 데에는 이의가 없으나, 그 외에는 어떠한 형태의 모든 저작권 권리를 보유한다. 하기 통지는 후술된 그리고 본 문서에 첨부된 도면에서의 과정, 실험 및 데이터에 적용된다: Copyright ⓒ 2012, 비전 글로벌 홀딩스 리미티드, All Rights Reserved.

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2012년 10월 12일 출원된 미국 가특허출원번호 61/712,853호 및 2012년 12월 13일 출원된 미국 정규특허출원번호 13/731,013호의 우선권을 주장하며, 이의 개시사항은 참조에 의해 본 문서에 편입된다.

본 발명은 인간 및 기타 동물에서 암 표적화 치료 및 종양 재발 예방을 위한, 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 약학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암을 치료, 암성(cancerous) 세포/암 줄기세포/이들 세포 중 임의의 것을 함유하는 조직을 표적화 그리고 종양의 재발을 예방하기 위한, 단독으로 또는 하나 이상의 화학요법제와 병용 투여되는 헤모글로빈 기반 산소운반체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

헤모글로빈은 대부분의 척추동물에서 혈관계와 조직간의 기체 교환을 위한 중요한 역할을 수행한다. 이는 호흡계에서 체세포로 혈액 순환을 통해 산소를 운반하는 데, 그리고 체세포에서 호흡계로 대사 노폐물 이산화탄소를 운반하는 데 관여하고, 이산화탄소는 호흡계로부터 호기된다. 헤모글로빈은 이러한 산소 수송 특징을 갖고 있기 때문에, 생체외(ex vivo)에서 안정화되고 생체내(in vivo)에서 이용될 수 있다면 강력한 산소 공급체로서 이용될 수 있다.

자연발생 헤모글로빈은 적혈구 내에 존재할 때 일반적으로 안정한 4량체(tetramer)이다. 그러나, 자연발생 헤모글로빈은 적혈구로부터 제거되면 혈장에서 불안정하게 되어 2개의 α-β 2량체(dimer)로 쪼개진다. 2량체의 각각은 분자량이 대략 32kDa이다. 이들 2량체는 신장을 통해 여과되어 배설될 때 상당한 신장 손상을 초래할 수 있다. 4량체 연결의 파괴는 또한 순환중인 기능성 헤모글로빈의 지속가능성에 부정적으로 영향을 끼친다.

이 문제점을 해결하기 위해, 헤모글로빈 가공의 최근 발전은 4량체 내에 분자내 결합은 물론 4량체간에 분자간 결합을 생성하여 중합체성 헤모글로빈을 형성하기 위해 다양한 가교 기술을 포함시켜 왔다.

저산소증이 암에서 흔하다. 저산소증은 이온화 방사선 및 화학 요법의 세포 독성 활성에 필수적인 산소를 종양 세포로부터 박탈함으로써 이들에 저항성을 가져올 수 있다. 또한 저산소증은 단백질체적(proteomic) 및 유전체적(genomic) 변화를 포함하는 하나 이상의 간접적 메커니즘을 통해 방사선 요법 및 화학 요법에 대한 종양 민감도를 감소시킬 수 있다. 그러므로, 개선된 암 치료 조성물, 특히 세포 독성 약제의 효능을 향상시키는 개선된 암 치료 조성물에 대한 요구가 있다.

종양 전이가 암 사망의 약 90퍼센트를 초래하지만, 암 세포가 신체의 일부에서 다른 곳으로 퍼지게 하는 정확한 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않고 있다. 따라서, 암 재발을 예방하는 개선된 암 치료 조성물이 중요하다.

최근의 많은 연구들은 암 줄기세포(cancer stem cell, CSC)가 암 및 종양 발달에 중요한 역할을 한다는 점을 보여 주었다. Wang과 Dick(2005)은 종양에서 발견되는 백혈구 줄기세포의 자가 재생 및 종양 세포 증식 잠재력을 이전에 제안되었던 추측통계학적(stochastic) 모델 및 암 줄기세포 모델에 의해 재연구하였다. 추측통계학적 모델에 따르면, 기능적으로 균질한 한 부류의 종양 세포가 일반적으로 존재하고, 유전적 변화는 모든 이들 종양 세포에서 악성 진행으로 이어질 수 있다. 대조적으로, 암 줄기세포 모델은 종양 성장을 지속적으로 개시하는 특징적인 능력을 갖고 또한 기능적으로 불균질한 세포 부류들의 계층을 번식시킬 수 있는 희귀 세포군(population)이 종양 내 세포의 대부분과 비교하여 상이한 종양 유발성 경로를 가질 수 있다고 제안한다. 암 줄기세포 모델에서 제안된 종양 개시 세포는 세포의 잔여부로부터 점진적으로 동정 및 정제될 수 있다. 이 세포를 암 줄기세포(CSC)라 부른다. 백혈병 줄기세포처럼, 유방암과 같은 다른 암들이 종양 개시 세포의 희귀군에 의해 유도되는 것으로 보인다. 세포의 두 표현형이 유방암에서 동정되었는데, 소수인 한 표현형은 유방 종양을 형성할 수 있는 반면 다른 한 표현형은 그렇지 않다. 뇌암에서는 두 유형의 세포가 발견되었다: CD133⁺ 세포는 생체내에서 분화성, 자가 재생 및 종양 개시 능력을 보유하는 반면 CD133^- 세포는 그렇지 않다. 이들 암 줄기세포가 모든 신생물계(neoplastic system)의 정점에 있을 수 있고 따라서 암 치료의 새 표적이 될 수 있다는 점을 뒷받침하는 더 많은 증거들이 발견되어 왔다. 리뷰 논문(Mohyeldin et al., 2010)은 암 줄기세포 적소(niche)가 훨씬 낮은 산소 장력(tension)을 가짐을 시사했다. 종양의 혈관구조(vasculature)로부터 떨어져서 저산소 적소가 위치하는 것이 발견되고, 이는 특징적인 HIF(Hypoxia-inducible factor, 저산소 유도 인자) 유도 패턴, 특히 HIF-2α를 갖고 저산소증에 상이하게 반응하는 암 줄기세포를 함유한다. 이는 암 줄기세포 자가 재생, 증식 및 생존을 조절하는 신호전달 경로에서 새 표적이 되고, 이의 억제는 종양 개시 잠재력을 감쇠시킬 것이다.

따라서, 암 줄기세포에서 높은 산소 장력을 제공할 수 있는 조성물에 대한 요구가 본 기술분야에 있다. 이러한 조성물은 산화적 스트레스 또는 쇼크를 생성하는 데 이용될 수 있고, 이는 암 줄기세포에서 DNA 손상 및 이어지는 DNA 손상 유도 세포자멸사(apoptosis)로 이어진다.

발명의 요약

본 발명은 인간 및 기타 동물에서 표적화 치료 및 암 재발 예방을 위한, 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제1양태는 헤모글로빈 기반 산소운반체 및 병용되는 화학요법제 모두의 효능을 증가시키기 위하여, 인간 또는 동물 체내에서 암성(cancerous) 세포, 암 줄기세포(CSC) 및/또는 암성 전구세포(progenitor cell), 및/또는 이들 세포 중 임의의 것을 함유하는 조직을 표적화하도록 구성되는 헤모글로빈 기반 산소운반체를 제공함으로써, 수용체 매개 메커니즘을 촉발하고 또한 암성 세포, CSC, 및/또는 이들 세포 중 임의의 것을 함유하는 조직의 세포질에 병용되는 화학요법제를 함께 국재화(localize)시키는 것이다. 국재화된 헤모글로빈 기반 산소운반체는 암성 세포와 CSC가 화학요법제에 더 민감하게 되도록 암성 세포와 CSC를 감작화하는 것으로 또한 밝혀진다. 본 발명의 제2양태는 다양한 종양, 암, 또는 종양 또는 암과 연관된 질병을 앓고 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 약학적 조성물을 필요로 하는 개체에 이를 투여함으로써 암을 치료하고 암의 재발을 예방하는 데 상기 조성물을 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 이용되는 헤모글로빈 기반 산소운반체는 열 안정성 가교형 4량체성, 중합체성, 페길화(pegylated) 또는 재조합/변성(modified) 헤모글로빈일 수 있고, 이는 백혈병, 두경부 암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 코인두암, 식도암 및 뇌암과 같은 다양한 암의 치료를 위해 하나 이상의 화학요법제와 병용된다. 또한 헤모글로빈 기반 산소운반체 자체는 저산소 조건에서 종양의 산소화를 개선함으로써 방사선 및 화학요법제에 대한 민감도를 향상시키는 것을 통해 암세포를 파괴하는 능력을 갖는 것으로 밝혀진다.

게다가, 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체는 암성 종양 재발을 감소하고 종양 세포 전이를 최소화하기 위해 단독으로 이용될 수도 있다. 상기 헤모글로빈은 종양 제거 외과술을 위한 허혈 전 그리고 종양 제거시 혈액 공급의 복구(재관류) 동안에 투여된다. 헤모글로빈 기반 산소운반체는 암성 조직의 산소화를 증가시키고 화학요법제와 함께 후속하여 종양의 크기를 감소시키는 데에도 이용될 수 있다. 그 결과, 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 조성물은 암성 종양의 재발을 치료 또는 예방하기 위해 하나 이상의 화학요법제와 병용하여 또는 단독으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 다양한 화학요법 약물 및/또는 방사선요법과 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체의 조합을 이용하여 암 치료 및 종양 재발 예방에 상승 효과(synergistic effect)를 부여하는 것을 포함한다.

본 발명의 제3양태는 암 줄기세포로 알려진 자가 재생 및 종양 개시 세포의 희귀군을 사멸시키기 위해 산화적 스트레스 또는 쇼크를 종양에 제공하기 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다. 높은 산소 장력을 종양에 제공하기 위한 본 발명의 조성물은 4량체성 가교형 헤모글로빈 또는 중합화 헤모글로빈(양자 모두는 검출불가량의 2량체와 낮은 백분율의 메트헤모글로빈(met-hemoglobin)을 함유하도록 제조됨)을 포함하는 헤모글로빈 기반 산소운반체를 포함한다. 상기 조성물 내 헤모글로빈 기반 산소운반체는 암 줄기세포가 종양 내에서 선택적으로 증식하는 것으로 발견된 종양의 암성 조직으로 침투하도록 구성된다. 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 상기 암 줄기세포의 세포자멸사 또는 사멸을 유도하기 위한 목적으로, 종양을 산소화하고 상기 암 줄기세포에 산화적 스트레스 또는 쇼크를 주기 위해 보르테조밉, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 시스플라틴 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 화학요법제와 병용으로 또는 단독으로 이용될 수 있고, 이는 암 또는 암성 종양의 치료 또는 이의 재발을 예방하는 효과를 가져온다. 또한, 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체는 더 안정화되고 순환에서 더 긴 반감기를 갖도록 2량체로의 해리를 회피하도록 변성된다. 자연발생 헤모글로빈과 달리, 이러한 더 긴 반감기 성질은 암성 세포, 암 줄기세포 및/또는 암 전구세포 모두를 포함하는 표적 세포에의 침투를 용이하게 한다. 암세포에 대한 효과와 유사하게, 본 발명의 조성물 내 헤모글로빈 기반 산소운반체는 암 줄기세포를 화학요법제 또는 방사선 요법에 또한 감작화시킨다. 달리 말하면, 본 발명의 조성물은 화학요법 및/또는 방사선 요법 전에 또는 그와 병용하여 투여될 수 있는 효과적인 보조요법(adjunctive therapy)이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 임의의 양태에서, 헤모글로빈 기반 산소운반체는 이를 필요로 하는 개체에 9.5g/dL - 10.5g/dL의 농도로, 암성 조직 또는 종양 내 세포를 표적화하고, 수용체 매개 메커니즘을 촉발하고, 암성 조직 또는 종양 세포에 침투 및 국재화되고, 암성 조직 또는 종양 세포의 세포자멸사를 유도하고, 이 세포를 암성 조직 또는 종양의 외과적 제거 전에, 동안 또는 후에, 동시 또는 후속하여 투여되는 화학요법제 또는 방사선 요법에 감작화시기 위한 목적으로 투여될 수 있다.

정의

"암 줄기세포"라는 용어는 생체 내(in vivo) 종양 성장을 개시 및 지속시킬 수 있는 신생물성 클론 내의 생물학적으로 구별되는(distinct) 세포를 지칭한다(즉, 암 개시세포).

본 명세서에서 "Hb"는 검출불가량의 2량체와 낮은 백분율의 메트헤모글로빈을 갖는 열 안정성 가교형 4량체성 헤모글로빈을 지칭한다. 이 열 안정성 가교형 4량체성 헤모글로빈은 60-70kDa의 분자량을 갖고, 이는 합성 동안에 열처리되고 0.05%-0.4%의 N-아세틸 시스테인이 첨가된다. 얻어지는 열 안정성 가교형 4량체성 헤모글로빈은 검출불가량의 2량체 및 5% 미만의 메트헤모글로빈을 갖는다. 열 안정성 가교형 4량체성 헤모글로빈은 또한 혈관수축성 불순물 및 단백질 불순물이 없고, 비발열성(non-pyrogenic), 무내독소(endotoxin-free), 무인지질(phospholipid-free), 및 무간질(stroma-free)이다. 4량체성 헤모글로빈 분자 내 가교는 알파/알파 소단위체(subunit), 알파/베타 소단위체 또는 알파-베타 소단위체 간일 수 있다.

본 명세서에서 "변성 헤모글로빈" 또는 "재조합 헤모글로빈"은 하나 이상의 화합물로 화학적 접합되거나(chemically conjugated) 표면 변성된(surface modified) 임의의 자연 헤모글로빈 또는 정제 헤모글로빈을 지칭한다. 상기 화합물은 폴리(에틸렌)글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 변성 헤모글로빈의 예들 중 하나는 페길화(pegylated) 헤모글로빈이다.

도 1은 (A) 형광 표지된 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체 및 (B) 형광 표지된 중합화 헤모글로빈의 간암 세포로의 흡수(uptake)를 도시하는 동일 배율의 현미경 영상 세트이다.
도 2는 클라트린(Clathrin) 매개 경로(상부 칸)는 통하지만 카베올린-1(Caveolin-1) 매개 경로(하부 칸)는 통하지 않는, 형광 표지된 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체의 간암 세포로의 흡수를 도시하는 동일 배율의 현미경 영상의 두 세트이다.
도 3은 다양한 농도에서 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포에서 다양한 단백질의 발현을 도시한다.
도 4는 정상 산소(normoxic) 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포(HepG2 및 Huh7)에서 저산소 유도 인자 1(HIF1 α) 유전자의 발현을 도시한다.
도 5는 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포(HepG2 및 Huh7)에서 혈관내피 성장인자(VEGF) 유전자의 발현을 도시한다.
도 6은 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포(HepG2 및 Huh7)에서 엔도텔린-1(ET1) 유전자의 발현을 도시한다.
도 7은 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포(HepG2 및 Huh7)에서 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 유전자의 발현을 도시한다.
도 8은 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포(HepG2 및 Huh7)에서 폰 히펠-린다우(VHL) 유전자의 발현을 도시한다.
도 9는 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포에서 열 쇼크 단백질 90(HSP90) 유전자의 발현을 도시한다.
도 10은 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체의 종양 재발에 대한 억제 효과에 관련된 제안된 메커니즘 및 신호전달 연속단계(cascade)를 도시하는 개념도이다.
도 11은 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포에서 열 쇼크 단백질 7C(HSP7C) 유전자의 발현을 도시한다.
도 12는 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포에서 고이동성 군 박스 3 (high-mobility group box 3(HMGB3)) 유전자의 발현을 도시한다.
도 13은 정상 산소 대 저산소 조건하에서 그리고 다양한 농도의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체로 처리한 뒤 간암 세포에서 복제 인자 1C(RFC1) 유전자의 발현을 도시한다.
도 14는 정상 조직에서 산소화의 개선을 도시한다. 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액의 주사는 (A) 혈장 헤모글로빈 농도 및 (B) 근육으로의 산소 전달의 유의적인 증가를 가져온다.
도 15는 저산소 종양 조직에서 산소화의 개선을 도시한다. 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액의 주사는 두경부 편평세포암종(HNSCC) 이종이식편으로의 산소 전달의 유의적인 증가를 가져온다.
도 16은 (A) 코인두암종(NPC) 및 (B) 간 종양의 설치류 모델에서의 부분적 종양 위축을 도시한다.
도 17은 간 절제 동안 외과적 및 헤모글로빈 생성물 투여 절차를 요약하는 개념도를 도시한다.
도 18은 간 절제술 및 허혈/재관류 절차 후 IR 손상군의 래트(rat)에 유도되는 간내(intra-hepatic) 간암 재발 및 전이 및 원격(distant) 폐 전이 그리고 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 이용한 이의 보호의 대표적 예를 도시한다.
도 19는 간 절제 및 IR 손상 절차 후 4주에서 실험 및 대조군에서의 조직학적 검사를 도시한다.
도 20A는 간 절제술 및 IR 절차 후 IR 손상군의 래트(대조군) 및 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈으로 처리한 래트(Hb 처리군)에서 발견되는 재발 간 종양의 부피(㎤)를 도시한다.
도 20B는 간 절제술 및 IR 절차 후 IR 손상 래트(대조군) 및 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈으로 처리한 래트(Hb 처리군)의 간 재발률(좌측) 및 평균 재발 종양 크기(우측)를 도시한다.
도 21은 간 절제술 및 허혈/재관류 절차 후 IR 손상군의 래트(대조군: C10 & C13) 및 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈으로 처리한 래트(Hb 처리군: Y9, Y10 & Y11)에 유도되는 간내 간암 재발 및 전이 및 원격 폐 전이의 대표적 예를 도시한다.
도 22는 본 발명의 헤모글로빈 생성물 또는 RA 버퍼(대조군)의 최초 1투여로부터 간 외과술 및 재관류를 통한 간 산소 분압(mmHg)의 대표적 예를 도시한다.
도 23은 간 외과술 28일 후 본 발명의 헤모글로빈 생성물의 처리가 있거나 없는 래트의 말초혈 내의 순환성 내피 전구세포(EPC)의 수준 대비를 도시한다.
도 24는 코인두암종 이종이식편 내의 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체의 측두(temporal) 국재화를 도시한다.
도 25는 Hep-2 후두암 모델에서 헤모글로빈 기반 산소운반체 단독 또는 방사선과의 병용시의 종양 성장 억제 효과를 도시한다; 하부 칸은 다양한 처리군으로부터 얻은 종양 이종이식편의 대표적 영상을 도시한다. *p<0.05, **p<0.01 vs. 대조군.
도 26은 C666-1 코인두암 모델에서 방사선과 병용된 헤모글로빈 기반 산소운반체의 종양 성장 억제 효과를 도시한다; 하부 칸은 다양한 처리군으로부터 얻은 종양 이종이식편의 대표적 영상을 도시한다. **p<0.01 vs. 대조군, #p<0.05 vs. 방사선 처리만.
도 27은 뇌암 세포에서 헤모글로빈 기반 산소운반체가 테모졸로마이드(TMZ) 유도 세포독성을 향상시키는 것을 도시한다.
도 28은 암 줄기세포에 의한 맘모스피어(mammosphere) 형성의 형태학적 변화를 도시하는 현미경 영상이다: (A) 0일, (B) 3일, (C) 6일, (D) 9-20일, (E) 대조군(유방 외피세포로부터의 중공(hollow) 맘모스피어).
도 29는 다양한 계대(passage)에서 수집한 미분류 맘모스피어 및 분류된 MCF7 CD44⁺/CD24^- 세포에서 상이한 마커 Oct-4 및 Sox-2의 발현 수준을 도시하는 웨스턴 블롯이다.
도 30은 알데히드 탈수소효소(ALDH) 활성의 관점에서 MCF7 세포의 다양한 계대의 점그래프이다: (A) 대조군(디에틸아미노벤즈알데히드(DEAB)로 항온처리(incubate)한 분류된 MCF7 세포); (B) 0계대에서의 분류된 MCF7 세포; (C) 3계대에서의 분류된 MCF7 세포; (D) 5계대에서의 분류된 MCF7 세포.
도 31은 유세포측정(flow cytometry) 분석에서 CD24(PE-A) 및 CD44(APC-A) 항체로 표지된 저산소 조건하에서의 MCF7 세포의 점그래프이다. 1사분면(Q1은 CD₄₄ ^고 및 CD₂₄ ^저인 세포이다.
도 32는 16시간 및 4일 동안 DMSO(대조군) 및 90nM 탁솔(Taxol) 처리로 항온처리한 후 미분류 및 CD24/CD44 분류된 MCF7 세포의 형태학적 변화를 도시하는 현미경 영상이다.

헤모글로빈은 포유류 및 기타 동물의 혈액의 적혈구 내의 철 함유 산소 수송 단백질이다. 헤모글로빈은 단백질의 3차 및 4차 구조 모두의 특성을 나타낸다. 헤모글로빈 내 아미노산의 대부분은 짧은 비나선형 분절로 연결된 알파 나선을 형성한다. 수소결합은 헤모글로빈 내부의 나선형 구획을 안정화시켜 그에 결합한 분자 내에 인력을 유발함으로써 각 폴리펩티드 쇄가 특정 형상으로 접히도록 한다. 헤모글로빈 분자는 4개의 구상 단백질 소단위체로부터 조립된다. 각 소단위체는 삽입된(embedded) 헴 그룹을 갖는 "미오글로빈 접힘" 배열로 연결된 α-나선 구조 분절들의 세트로 배열된 폴리펩티드 쇄로 구성된다.

헴 그룹은 포피린으로 알려진 헤테로사이클 고리 내에 고정된 철 원자로 이루어진다. 철 원자는 한 평면에 놓인 고리 중심의 질소 원자 4개 모두에 동일하게 결합한다. 그러면 산소가 포피린 고리 평면에 수직으로 철 중심에 결합할 수 있다. 따라서, 단일 헤모글로빈 분자는 4개의 산소 분자와 조합하는 능력을 갖는다.

성인에서, 가장 흔한 유형의 헤모글로빈은 헤모글로빈 A라 불리는 4량체로서, α2β2로 지칭되는 2개의 α 및 2개의 β 비공유결합 소단위체로 이루어지고, 각각은 141개 및 146개의 아미노산 잔기로 구성된다. α 및 β 소단위체의 크기 및 구조는 서로 매우 유사하다. 각 소단위체는 약 16kDa의 분자량을 가져 4량체의 전체 분자량은 약 65kDa이다. 4개의 폴리펩티드 쇄는 염다리(salt bridge), 수소결합 및 소수성 상호작용에 의해 서로 결합된다. 소(bovine) 헤모글로빈의 구조는 인간 헤모글로빈과 유사하다(α쇄에서 90.14% 동일성; β쇄에서 84.35% 동일성). 차이점은 소 헤모글로빈에서는 두 설프히드릴 기가 β Cys 93에 위치하는 반면, 인간 헤모글로빈에서는 설프히드릴 기가 α Cys 104, β Cys 93 및 β Cys 112에 각각 위치한다는 점이다.

적혈구 내부의 자연발생 헤모글로빈에서, α쇄와 그에 대응하는 β쇄의 회합(association)은 매우 강하며, 생리학적 조건하에서 해리(disassociate)하지 않는다. 그러나, 하나의 αβ 2량체와 또하나의 αβ 2량체의 회합은 적혈구 외부에서 상당히 약하다. 결합은 각각 대략 32kDa의 2개의 αβ 2량체로 나뉘는 경향을 갖는다. 이들 원치 않는 2량체는 신장에 의해 여과 및 배설되기에 충분히 작고, 그 결과 신장 손상의 가능성 및 상당히 감소된 혈관 내 체류시간으로 이어진다. 그러므로, 안정화된 가교형 4량체성, 중합체성 및/또는 재조합/변성 헤모글로빈은 산소 전달을 위한 약학적 조성물에서 중요한 분자이다. 헤모글로빈 공급원은 인간, 소, 돼지, 말, 및 개 전혈일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 열 안정성 헤모글로빈 기반 산소운반체를 함유하고, 이는 종양 세포 상의 수용체에 부착하여 정상의 비저산소성 건강 조직에 비해 저산소성 종양 세포의 선택적 표적화를 촉진하도록 구성되고 그리고 암세포에 우선적으로 흡수될 수 있으므로 암 치료에 이용될 수 있다. 도 1A에서, 열 안정성 4량체성 헤모글로빈(Hb)이 간암에 대해 효능을 어떻게 갖는지를 보여 주기 위해 생세포 촬영(live cell imaging)을 이용한다. 형광 접합된 Hb는 N₂로 퍼지된(purged) 폐쇄계에서 실온에서 1시간 동안 Hb와 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) (NaHCO₃로 pH 9.3에 완충)간에 접합이 이루어지도록 하여 제조한다. 단백질 정제 컬럼(Millipore)을 이용하여 후속 정제를 수행하여 미접합 Hb와 유리 FITC를 제거한다. 새로 접합된 Hb-FITC 프로브를 생세포 흡수 연구에 즉시 이용한다. 간암 세포 HepG2와 전이성 간암 세포 Huh7을 0.0125g/dL에 15분간 노출시킨 후 생세포 획득을 한다. 15분의 노출 후 두 유형의 간암 세포로의 Hb-FITC의 흡수를 관찰한다(도 1A). Hb-FITC의 흡수는 노출 1시간 후에 최대가 된다(도 1A). 저산소 조건하에서, 단층 간암 세포는 3차원 구조로 말리는 것이 관찰되고, Hb-FITC는 정상 세포보다 이들 암세포가 더 우선적으로 흡수하는 것으로 발견된다. 중합화 헤모글로빈의 간암 세포로의 흡수를 도 1B에 도시한다.

헤모글로빈 분자의 세포흡수 능력은 단백질 피막(protein-coat) 소포성 세포내이입(vesicular endocytosis)를 통해서이다. 내재화될(internalized) 수 있는 두 흔한 단백질 피막은 클라트린 및 카베올린 1이다. 적색 형광 단백질이 태그된(tagged) 클라트린(RFP-클라트린) 및 카베올린 1(mCherry-카베올린1) 플라스미드를 구축하고, 플라스미드를 FITC-접합 Hb가 흡수된 HepG2 또는 Huh7 세포에서 독립적으로 발현시킨다. 시간경과(time lapse) 촬영 연구(도 2)는 Hb-FITC가 RFP-클라트린과는 공동국재(colocalize)하지만, mCherry-카베올린1과는 그렇지 않음을 알려 주며, 이는 헤모글로빈 분자가 클라트린 매개 세포내이입을 통해 간암 세포에 유입됨을 시사한다.

본 발명에서 비전이성 및 전이성 간암 세포에서 헤모글로빈 단독 및 보조요법과의 병용시의 효능은 다양한 약물의 IC₅₀을 두 간암 모델 HepG2 및 Huh7에서 그리고 정상 산소 및 저산소 조건 모두에서 연구하여 입증한다(결과는 표 1에 나타낸다). 정상 산소 조건하에서 HepG2 세포 내 시스플라틴, 독소루비신, 보르테조밉 및 5-플루오로우라실(5FU)의 IC₅₀은 각각 130uM, 10uM, 0.5uM 및 4mM이고, Huh7 세포 내 시스플라틴, 독소루비신, 보르테조밉 및 5FU의 IC₅₀은 각각 70uM, 5uM, 55uM 및 3.5mM이다. 저산소 조건하에서 HepG2 세포 내 시스플라틴, 독소루비신, 보르테조밉 및 5FU의 IC₅₀은 각각 170uM, 30uM, 0.7uM 및 4mM이고, Huh7 세포 내 시스플라틴, 독소루비신, 보르테조밉 및 5FU의 IC₅₀은 각각 100uM, 6uM, 60uM 및 4mM이다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석 결과는 정상 산소 조건하에서 Huh7 세포는 시스플라틴과 독소루비신에 더 민감하지만, 정상 산소 조건하의 HepG2 세포에 비해 보르테조밉에 110배 더 저항성임을 시사한다(프로테아좀 소단위체 PSMB1, 5 및 6에 대한 표적 약물). 저산소 조건하에서, Huh7 세포는 시스플라틴과 독소루비신에 더 민감하게 되지만, 저산소 조건하의 HepG2 세포에 비해 보르테조밉에 또한 고저항성이다(86배). 이 결과는 전이성 간암 세포(Huh7)는 정상 산소 또는 저산소 조건하에 불구하고 비전이성 간암 세포(HepG2)보다 보르테조밉에 일반적으로 더 저항성임을 밝혀 준다.

HepG2 정상 산소		HepG2 저산소
시스플라틴	130uM	시스플라틴	170uM
독소루비신	10uM	독소루비신	30uM
보르테조밉	0.5uM	보르테조밉	0.7uM
5FU	4mM	5FU	4mM
Huh7 정상 산소		Huh7 저산소
시스플라틴	70uM	시스플라틴	100uM
독소루비신	5uM	독소루비신	6uM
보르테조밉	55uM	보르테조밉	60uM
5FU	3.5mM	5FU	4mM

MTT 결과는 Hb 단독은 어떠한 세포 사멸도 유발하지 않을 것임을 또한 밝혀 준다. 그러나, 5FU와 보르테조밉의 유의적인 화학감작화(chemosensitization)가 0.2g/dL의 Hb와 함께 각각의 IC₅₀에서 투여시 관찰된다. 정상 산소 조건하에서, 5FU 및 Hb 처리된 HepG2 세포에서 추가로 33%(총 83%)의 세포 사멸이 검출되는 반면, 보르테조밉 및 Hb 처리된 Huh7 세포에서 추가로 20%(총 50%)의 세포 사멸이 관찰된다. 저산소 조건하에서, 보르테조밉 및 Hb 처리된 HepG2 세포에서 추가로 42%(총 92%)의 세포 사멸이 검출되는 반면, 5FU 및 Hb 처리된 HepG2 세포에서 증가분으로 35%(총 85%)의 세포 사멸이 관찰된다. 같은 저산소 조건하에서, 5FU 및 Hb 처리된 Huh7 세포에서 추가로 20%(총 72%)의 세포 사멸이 관찰된다. 5FU는 티미딜레이트 합성효소를 억제하는 피리미딘 유사체(analog)이다. 보르테조밉은 골수종 환자를 치료하기 위해 처음 사용되는 최초의 치료적 프로테아좀 억제제이다. 이는 생 암세포에서 세포자멸사를 유발하는 것으로 보고된다(Koschny et AL., Hepatology, 2007). 종합하여, 헤모글로빈 분자는 비전이성 및 전이성 암 모두에 대해 5FU 및 보르테조밉과 함께 유의적인 상승 효과를 갖는 것으로 관찰된다.

저산소증은 종양의 흔한 생리학적 특징이다. 종양내 저산소증은 간암에서 또한 흔하다. 저산소증의 조건은 저산소 유도 인자 1(HIF1 α) 전사 인자의 안정화 그리고 저산소증 반응 요소(hypoxia response element(HRE))를 보유하는 HIF1 α 효과체(effector) 유전자(60개 초과의 유전자)의 활성화를 가져오는 신호전달 연속단계를 활성화하는 것으로 알려져 있다. 이 HIF1 α 하류 효과체(downstream effector)는 세포 생존, 적응, 무산소대사, 면역반응, 사이토킨 생산, 혈관화 및 일반적인 조직 항상성에 관여한다.

도 3에서, Hb는 HepG2 및 전이성 Huh7 간암 모델에서 HIF1 α 단백질 발현에 영향을 주는 것으로 나타난다. Hb는 정상 산소 및 저산소 모두에서 HIF1 α를 하향조절(downregulate)하고, 이는 Hb 단독에 의한 HIF1 α의 고갈(미처리 대조군에 비해 40%)이 HIF1 α의 그 하류 효과체에의 결합에 영향을 주고 이 효과체 유전자의 전사 억제를 가져온다는 것을 시사한다. Hb로 처리한 후 HIF1 α(도 4), 열 쇼크 단백질 90(HSP90)(도 9) 및 폰 히펠-린다우(VHL)(도 8)의 상류 조절체에서 유사한 하향조절 양상을 검출할 수 있다.

간암 세포를 Hb 및 5FU로 처리시(95% 억제) 또는 Hb 및 보르테조밉으로 처리시(80% 억제), 각각의 정량적 qPCR 및 웨스턴 블롯팅 연구로 예시화되는 전사 및 단백질 수준 모두에서 HIF1 α의 상당한 감소가 검출된다. 이 데이터는 Hb 단독, 5FU나 보르테조밉과 병용한 Hb 처리가 저산소 유도 HIF1 α mRNA 및 단백질 안정화를 없앨 수 있음을 시사한다. 결과적으로, Huh7 세포 내 혈관내피 성장인자(VEGF)(도 5) 및 엔도텔린-1(ET1)(도 6) 발현의 하향조절이 관찰되고, 이는 Hb와 5FU 또는 Hb와 보르테조밉의 조합이 간 전이 모델에서 혈관신생 및 혈관긴장(vascular tone)을 억제할 수 있음을 시사하고, 여기에서 혈관신생의 억제는 전이의 발달에 내재적으로 연결되어 있다. 병용 처리는 Huh7 내 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)(도 7) 발현을 감소시키는 것으로 관찰되고, 이는 혈관구조 및 혈관신생의 정도가 간 전이 모델에서 또한 저하될 수 있음을 시사한다. 전체적으로, 우리의 발견은 Hb와 5FU 또는 보르테조밉의 병용 투여가 HIF1 α를 억제함으로써 VEGF, ET1 및 iNOS 발현의 저산소성 유도를 상승적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 종양 재발에 대한 Hb의 억제 효과에 관여하는 제안된 메커니즘 및 그 신호전달 연속단계를 도 10에 나타낸다. 산소 공급, 프롤릴 히드록실라제 영역 함유 단백질(PDH), HIF 및 내피 전구세포(EPC)의 관계가 명확하게 도시되어 있다.

DNA 손상을 감지하는 세포 조절 기관을 표적화하도록 구성된 헤모글로빈 기반 산소운반체를 포함하는 약학적 조성물은 신규한 조절 경로를 통하는 것으로 또한 밝혀진다. 본 발명에서, DNA 손상을 감지하는 기관의 내재적 부분인 단백질 중 2개, 복제 인자 1C(RFC1)(도 13) 및 HSP7C(열 쇼크 단백질 7C)(도 11)는 Hb 처리된 간암 세포에서 상향조절되고, 보르테조밉과의 병용 처리에서 급격히 상향조절된다(RFC1의 경우 3-10배 상향조절, 및 HSP7C의 경우 25-45배 상향조절). 이들 새로운 Hb 표적 단백질은 Hb가 잠재적인 활성산소종(Reactive Oxygen Species(ROS)) 유도제임을 시사하고, 전이성 간암 세포 Huh7이 ROS 매개 DNA 손상을 감지하고 이에 반응하는 것이 분명히 중요하다. Hb 및 보르테조밉과의 반응에서 DNA 손상 응답 단백질의 급격한 상향조절은 후속하는 산화적 스트레스 유도 세포자멸사를 가져올 수 있다.

암 치료에서의 이용을 위해, 본 발명의 산소운반체 함유 약학적 조성물은 종양 조직에서 산소화를 개선하기 위한 조직 산소화제로서 작용하여, 화학민감도 및 방사선 민감도를 향상시킨다.

또한, 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 정상 조직에서(도 14) 및 극저산소성 종양에서(도 15) 산소화를 개선하는 능력을 본 발명에서 입증한다. 종양 덩어리 내의 산소 분압(pO₂)를 마이크로 위치선정 시스템(DTI Limited)이 결합된 광섬유 산소 센서(Oxford Optronix Limited)에 의해 직접 모니터링한다. 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 정맥 주사한 뒤, pO₂ 중간값(median)은 15분 내에 기저선에서 상대적 평균 산소 분압의 약 2배로 상승하고 6시간까지 이어진다. 나아가, 산소 수준은 평균적으로 주입 후 24 내지 48시간 후에 기저선값보다 25% 내지 30% 위의 수준을 여전히 유지한다. 본 발명에서 제조한 산소운반체 함유 약학적 조성물만큼의 높은 효능을 보이는 상업적 제품이나 기존 기술은 없다.

종양 조직 산소화를 위해, 인간 두경부 편평세포암종(HNSCC) 이종이식편(FaDu)의 대표적 산소 프로파일을 도 15에 도시한다. 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 정맥 주사한 뒤, 3시간 및 6시간에서 평균 pO₂의 각각 6.5배 및 5배 초과의 유의적 증가가 관찰된다(도 15).

암 치료에서의 응용을 위해, 본 발명의 산소운반체 함유 약학적 조성물은 종양 조직에서 산소화를 개선하기 위한 조직 산소화제로서 작용하여, 화학 및 방사선 민감도를 향상시킨다. X선 조사 및 열 안정성 4량체성 헤모글로빈과 함께, 종양 성장이 지연된다. 도 16A에서, 대표적 곡선은 코인두암종의 설치류 모델에서 유의적인 종양 위축을 도시한다. CNE2 이종이식편을 보유하는 누드 마우스를 X선 단독(2Gy) 또는 열 안정성 4량체성 헤모글로빈과 병용으로(2Gy+Hb) 처리한다. 1.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 X선 조사 대략 3 내지 6시간 전에 마우스에 정맥 주사하면, 코인두암종 이종이식편의 부분적 위축이 일어난다.

한 구체예에서, 조성물 주사 후에 화학요법제와 함께 유의적인 간 종양 위축이 관찰된다. 도 16B에서, 대표적 그래프는 래트 동소이식(orthotopic) 간암 모델에서 유의적인 종양 위축을 도시한다. 간 종양 동소이식편(orthograft)(CRL1601 세포주)을 보유하는 버팔로 래트를 3mg/kg의 시스플라틴 단독으로 또는 0.4g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈과 병용으로(시스플라틴+Hb) 처리한다. 시스플라틴 주사 전의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 투여는 간 종양의 부분적 위축을 가져온다.

실시예

다음 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하고자 함이 없이 본 발명의 구체적인 구체예들을 기술함으로써 제공한다.

실시예 1

간암 세포주를 위한 배양 및 시약

HepG2 및 Huh7 세포주를 이용한다. 이들 세포를 37℃에서 10% 우태아혈청(FBS), 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신과 함께 DMEM(Invitrogen)에서 배양(culture)한다. 정상 산소 조건을 위해, 세포를 주위(ambient) O₂ 농도 및 5% CO₂로 항온처리(incubate)한다; 저산소 조건을 위해, 세포를 0.1-0.5% O₂ (Quorum FC-7 자동 CO₂/O₂/N₂ 가스 혼합기) 및 5% CO₂로 항온처리한다.

실시예 2

생세포 시간경과(time-lapse) 현미경검사

HepG2 또는 Huh7 세포를 유리 바닥 마이크로웰 접시(MatTek Corporation) 상에 파종한다. 소정 줌(63x, 20x)에서의 생세포를 분위기/온도 조절 챔버 및 다중위치 획득을 위한 모터화 스테이지를 구비한 Zeiss Observer.Z1 광시야(widefield) 현미경을 이용하여 획득한다. 0.1% O₂ 및 5% CO₂ (사전혼합)로 퍼지된 폐쇄형 생세포 촬영 시스템에서 항온처리를 수행한다. pcDNA3, pRFP-카베올린1, 또는 pRFP-클라트린으로 형질감염된 세포를 15분간 HB-FITC에 노출한 뒤 2시간의 기간 동안 3분마다 영상을 획득한다. MetaMorph 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 영상을 디컨볼루션(deconvolve) 및 컴팩트(compact)시켜 시간경과 동영상을 만든다.

실시예 3

세포독성 분석

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 증식 분석을 이용하여 세포 생육성을 측정한다. 약술하면, HepG2 또는 Huh7 세포를 96웰 편평 바닥 마이크로플레이트(6000세포/웰)에 파종하고 100μL 성장 배지에서 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양한다. 다음, 각 웰 내 세포 배양 배지를 각각의 IC₅₀ 농도에서 약물 무함유, Hb 단독 함유 또는 Hb와 또하나의 화학요법제 함유의 100μL 세포 성장 배지로 교체한다. 24시간 동안 Hb의 항온처리, 20μL의 MTT 표지 시약(5mg/mL PBS 용액)을 37℃에서 추가로 4시간 동안을 위해 각 웰에 첨가한다. 성장 배지를 조용히 제거하고, 포르마잔(formazan) 결정을 완전히 용해하기 위해 용해제로서 200μL의 DMSO를 각 웰에 첨가한다. 파장 570nm에서의 흡광도를 Multiskan EX(Thermo Electron Corporation)으로 측정하고, 각 데이터 점은 3개의 웰로부터의 평균±SD를 나타낸다.

실시예 4

RNA 단리 및 정량적 실시간 PCR

트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 단리하고 전체 RNA의 5μg을 올리고-dT 프라이머 및 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)로 역전사한다. 제1가닥 cDNA의 10분의 1을 이용하여, HIF1알파, VHL, HSP90, VEGF, iNOS, ET1, HSP7c, RFC1, HMGB3, 및 GAPDH 전사 수준을 구체적 프라이머를 이용한(하기 도시) SYBR Green PCR Master Mix 키트(Applied Biosystems)에 의해 정량 측정한다. 형광 신호를 7900HT Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems)에 의해 연장 단계 동안 실시간으로 측정한다. 형광 신호가 기저선의 표준편차의 10배에 도달할 때의 부분 주기수를 문턱 주기(threshold cycle, Ct)로 정의한다(주기 2 내지 10까지). GAPDH 대조군 유전자에 상대적인 표적 유전자의 비율 변화를 2^-ΔΔCt 방법으로 결정한다.

HIFlα:

서열번호 1: 정방향 프라이머: 5-GGCGCGAACGACAAGAAAAAG-3 (420-440)

서열번호 2: 역방향 프라이머: 5-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3 (21-44)

서열번호 3: 정방향 프라이머: CAGAGCAGGAAAAGGAGTCA (2414-2433)

서열번호 4: 역방향 프라이머: AGTAGCTGCATGATCGTCTG (2645-2625)

서열번호 5: 정방향 프라이머: 5'-AATGGAATGGAGCAAAAGACAATT-3' (2694-2720)

서열번호 6: 역방향 프라이머: 5'-ATTGATTGCCCCAGCAGTCTAC-3' (2764-2743)

VEGF:

서열번호 7: 정방향 프라이머: GCTACTGCCATCCAATCGAG (1187-1206)

서열번호 8: 역방향 프라이머: CTCTCCTATGTGCTGGCCTT (1395-1376)

서열번호 9: 정방향 프라이머: 5'-CTCTCTCCCTCATCGGTGACA-3' (3146-3167)

서열번호 10: 역방향 프라이머: 5'-GGAGGGCAGAGCTGAGTGTTAG-3' (3202-3223)

서열번호 11: 정방향 프라이머: ACTGCCATCCAATCGAGACC (1190-1209)

서열번호 12: 역방향 프라이머: GATGGCTGAAGATGTACTCGATCT (1265-1241)

INOS:

서열번호 13: 정방향 프라이머: 5'-ACAACAAATTCAGGTACGCTGTG-3' (2111-2137)

서열번호 14: 역방향 프라이머: 5'-TCTGATCAATGTCATGAGCAAAGG-3 (2194-2171)

서열번호 15: 정방향 프라이머: GTTCTCAAGGCACAGGTCTC (121-140)

서열번호 16: 역방향 프라이머: GCAGGTCACTTATGTCACTTATC (225-247)

ET1:

서열번호 17: 정방향 프라이머: TGCCAAGCAGGAAAAGAACT (701-720)

서열번호 18: 역방향 프라이머: TTTGACGCTGTTTCTCATGG (895-876)

HSP90:

서열번호 19: 정방향 프라이머: TTCAGACAGAGCCAAGGTGC (640-659)

서열번호 20: 역방향 프라이머: CAATGACATCAACTGGGCAAT (807-787)

서열번호 21: 정방향 프라이머: GGCAGTCAAGCACTTTTCTGTAG (1032-1054)

서열번호 22: 역방향 프라이머: GTCAACCACACCACGGATAAA (1230-1210)

VHL:

서열번호 23: 정방향 프라이머: ATTAGCATGGCGGCACACAT (2806-2825)

서열번호 24: 역방향 프라이머: TGGAGTGCAGTGGCATACTCAT (2921-2900)

실시예 5

웨스턴 블롯팅 분석

셀을 수확하고 단백질 농도를 결정한다. 단백질(30μg)을 10% SDS-PAGE 상에서 분리(resolve)하고, 니트로셀룰로오스 막(PVDF, BioRad) 상으로 옮긴다. 액틴을 로딩 대조군으로서 이용한다. 상대적 단백질 발현 수준을 겔 기록 시스템(gel documentation system)(Ultra-Violet Product Ltd)으로 정량화한다.

실시예 6

산소화의 개선

(6a) 정상 조직에서의 산소화의 개선

열 안정성 4량체성 헤모글로빈에 의한 정상 조직 산소화에 대한 몇몇 연구를 수행하였다(도 14). 약물동력학 및 약물역학적 비교 연구를 버팔로 래트에서 수행한다. 수컷 근교계(inbred) 버팔로 래트에 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액 또는 링거(ringer)의 아세테이트 완충액(대조군)을 개별적으로 투여한다. 혈장 헤모글로빈의 농도-시간 프로파일을 1, 6, 24 및 48시간에서 Hemocue™ 광도계로 결정하고 기저선 값과 비교한다. 이 방법은 헤모글로빈의 광도계적 측정에 기반하고, 이때 헤모글로빈의 농도를 g/dL로서 직접적으로 읽는다. 버팔로 래트의 뒷다리 근육에서 산소 분압(pO₂)을 Oxylab™ 조직 산소화 및 온도 모니터(Oxford Optronix Limited)로 직접 측정한다. 래트를 30-50mg/kg의 펜토바비톤 용액의 복강내 주사로 마취시킨 뒤 산소 센서를 근육에 삽입한다. 모든 pO₂ 값은 Datatrax2 데이터 획득 시스템(World Precision Instrument)으로 실시간 방식으로 기록한다. 결과는 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 정맥 주사 후, 평균 pO₂ 값이 15분 내에 기저선에서 상대적 평균 산소 분압의 약 2배로 상승하고 6시간까지 이어짐을 보여 준다. 나아가, 산소 수준은 평균적으로 주입 후 24 내지 48시간 후에 기저선값보다 25% 내지 30% 위의 수준을 여전히 유지한다(도 14B).

(6b) 극저산소성 종양 영역에서의 산소화의 유의적 개선

극저산소성 종양 영역에서의 산소화의 유의적 개선을 인간 두경부 편평세포암종(HNSCC) 이종이식편 모델로 평가한다. 하인두 편평세포암종(FaDu 세포주)을 American Type Culture Collection으로부터 얻는다. 대략 1×10⁶ 개의 암세포를 4 내지 6주령 근교계 BALB/c AnN-nu(누드) 마우스에 피하 주사한다. 종양 이종이식편이 직경 8-10mm에 도달하면, 종양 덩어리 내의 산소 분압(pO₂)을 Oxylab™ 조직 산소화 및 온도 모니터(Oxford Optronix Limited)로 직접 측정한다. 모든 pO₂ 값은 Datatrax2 데이터 획득 시스템(World Precision Instrument)으로 실시간 방식으로 기록한다. pO₂ 값이 안정화되면, 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하고 조직 산소화를 측정한다. 결과는 0.2g/kg의 상기 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 정맥 주사 후, 3시간 및 6시간에서 평균 pO₂의 각각 6.5배 및 5배 초과의 유의적 증가가 관찰됨을 보여 준다(도 15).

실시예 7

암 치료 연구: 코인두암종에서 유의적인 종양 위축

X선 조사와 병용되는 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액의 투여 후 유의적인 종양 위축이 관찰된다(도 16A). 인간 코인두암종 이종이식편 모델을 이용한다. 대략 1×10⁶ 개의 암세포(CNE2 세포주)를 4 내지 6주령 근교계 BALB/c AnN-nu(누드) 마우스에 피하 주사한다. 종양 이종이식편이 직경 8-10mm에 도달하면, 종양 보유 마우스를 아래와 같이 세 군으로 무작위로 나눈다:

제1군: 링거의 아세테이트 완충액(대조군)

제2군: 링거의 아세테이트 완충액 + X선 조사(2Gy)

제3군: 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 + X선 조사(2Gy+Hb)

CNE2 이종이식편을 보유하는 누드 마우스를 X선 조사 단독(제2군) 또는 열 안정성 4량체성 헤모글로빈과 병용(제3군)으로 조사한다. X선 조사를 위해(제2 및 3군), 50mg/kg의 펜토바비톤 용액의 복강내 주사로 마우스를 마취한다. 2그레이(Gray)의 X선을 선형 가속기 시스템(Varian Medical Systems)에 의해 종양 보유 마우스의 이종이식편에 전달한다. 제3군의 경우, X선 처리 전에 1.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 정맥 주사한다. 처리 1일째부터 격일로 종양 치수 및 체중을 기록한다. 종양 중량은 1/2×LW²의 식을 이용하여 계산하고, 여기에서 L 및 W는 디지털 캘리퍼(일본 도쿄의 Mitutoyo Co)로 측정한 각 측정시의 종양 덩어리의 길이 및 폭을 의미한다. 제1군은 비처리 대조군이다. 결과(도 16에 도시)는 X선 조사와 함께 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액으로 처리한 마우스에서 CNE2 이종이식편의 유의적 위축이 관찰됨을 보여 준다(제3군, 도 16A).

실시예 8

암 치료 연구: 간 종양의 유의적인 위축

또한, 시스플라틴과 병용되는 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 용액의 투여 후 유의적인 종양 위축이 관찰된다(도 16B). 래트 동소이식 간암 모델을 이용한다. 대략 2×10⁶ 개의 루시퍼라제 유전자로 표지된 래트 간 종양세포(CRL1601-Luc)를 버팔로 래트의 좌간엽에 주사한다. 종양 성장은 Xenogen 생체내 촬영 시스템으로 모니터링한다. 주사 후 2 내지 3주에서 종양 조직을 수확하고 작은 조각으로 절제하고, 두번째 래트 군의 좌간엽에 동소이식한다. 간 종양 보유 래트를 아래와 같이 세 군으로 무작위로 나눈다:

제1군: 링거의 아세테이트 완충액(대조군)

제2군: 링거의 아세테이트 완충액 + 시스플라틴(시스플라틴)

제3군: 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 + 시스플라틴(시스플라틴+Hb)

간 종양 조직을 이식한 래트를 3mg/kg의 시스플라틴 단독(제2군) 또는 열 안정성 4량체성 헤모글로빈과 함께(제3군)로 처리한다. 제2 및 3군의 경우, 30-50mg/kg의 펜토바비톤 용액의 복강내 주사로 래트를 마취하고 시스플라틴을 좌문맥을 통해 투여한다. 제3군의 경우, 시스플라틴 처리 전에 0.4g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 정맥 주사한다. 제1군은 비처리 대조군이다. 중요하게도, 처리 3주 후에 간 종양의 유의적 위축이 관찰된다(도 16B).

실시예 9

수술후 간 종양 재발 및 전이를 방지하는 방법

간 종양의 외과적 절제는 간암의 최전선 치료이다. 그러나, 암의 수술후 재발 및 전이는 이들 환자에서 바람직하지 못한 예후의 주요 속성으로 남아 있다. 예를 들어, 기존의 연구들은 간 절제가 50%의 5년 생존률뿐 아니라 70%의 재발률과도 연관되어 있음을 보고하였다. 간세포암종(HCC) 환자들에 대한 추적 연구는 일차 HCC로부터 간외 전이가 HCC 환자의 대략 15%에서 발견되었고 폐가 가장 흔한 간외 전이 부위임을 또한 밝혀 준다. 외과적 스트레스, 특히 간 외과술 동안 도입되는 허혈/재관류(IR) 손상이 종양 진행의 주원인이라고 제시되어 왔다. 통상적으로, 간절제술 동안 대량 출혈을 방지하기 위해 간혈관 조절이 외과의에 의해 흔히 이용된다. 예컨대, 간세동이(portal triad)의 폐쇄에 의한 유입 폐색(프링글 방법(Pringle maneuver))이 혈액 손실을 최소화하고 수술 전후의 수혈의 필요성을 감소하는 데 이용되어 왔다. 최근의 일본 연구는 25%의 외과의가 프링글 방법을 정례적으로 적용함을 보여 준다. 그러나, 프링글 방법은 잔존하는 간에 다양한 정도의 허혈 손상을 유도하고 암 재발 및 전이와 연관된다.

IR 손상과 종양 진행의 연관성은 기존의 동물 연구에 의해서 또한 지지된다. 먼저, IR 손상과 간 절제가 간암 재발과 전이에 주는 효과가 동소이식 간암 모델에 의한 최근 연구에서 입증되었다. 간 IR 손상과 간 절제술은 간 종양의 현저한 재발 및 전이를 가져왔다. 유사한 결과가 결장직장성 간 전이 마우스 모델에서 얻어졌는데, 여기에서 IR 손상의 도입은 결장직장성 간 전이의 증생(outgrowth)을 가속시킨다.

기존에, 절제 동안의 IR 손상을 감소하기 위한 용도로 몇몇 보호 전략이 연구되어 왔다. 예컨대, 허혈성 전처치(ischemic preconditioning, IP)로 알려진 장시간의 폐쇄 전의 단기 허혈의 적용이 간세포 방어 메커니즘을 촉발하는 것으로 제안되었고 간 절제 동안의 IR 손상을 감소하는 데 이용되어 왔다. 다른 사람들은 유입 폐색에 이은 재관류의 주기를 가능케 하는 간헐적 폐쇄(intermittent clamping, IC) 절차를 적용한다. 두 방법 모두 간의 대수술을 받는 비경화성 환자에서 수술후 간 손상을 보호하는 데 효과적인 것으로 제안되었다. 그러나, 종양 수립에서, 동물 연구는 IP가 IR 손상이 유도하는 가속화된 종양 성장으로부터 간을 보호하는 데 실패하였음을 또한 보여 준다. 또한, 어떤 그룹들은 α-토코페롤 및 아스코르브산과 같은 항산화제를 이용하여 IR 손상으로부터 간을 보호함으로써, 간 전이를 방지하고자 한다. 그러나, 두 산화제는 모두 IR이 자극하는 간내 종양 성장을 제한하는 데 실패했다.

메커니즘적으로, 다양한 종류의 증거들은 저산소증이 종양 재발 및 전이에 여러 이유로 연관되어 있음을 시사한다: (1) 저산소성 종양이 방사선 및 화학요법에 더 저항성이고, 이 처리에 살아남는 종양 세포가 재발하는 경향이 있음을 연구는 보여 준다; 임상적 증거는 또한 더 저산소성인 종양 영역을 갖는 환자가 더 높은 전이율을 가짐을 시사한다; (2) 저산소 조건하에서, 암세포는 저산소 유도 인자-1(HIF-1) 경로의 활성화를 통해 더 공격적으로 된다. 이는 다시 혈관신생 촉진(pro-angiogenic) 인자 혈관내피 성장인자(VEGF)와 c-Met 및 CXCR4와 같은 수용체와 관련된 보충반응(complementary response)을 촉발하고, 이는 구체적인 원격 장기에 대한 세포 운동성(motility) 및 귀소(homing)를 향상시켰다; (3) 최근의 연구는 또한 순환성 암세포(CTC)가 저산소 조건하에서 더 공격적으로 됨을 입증하였다. 암 환자의 말초혈에서 발견되는 순환성 종양 세포는 원격 전이를 갖는 환자에서 질병 공격성의 지표로 알려진 가운데, 저산소증은 이들 세포에 더 공격적인 표현형을 가능케 하고 세포자멸사 잠재력을 감소시켰다. 특히, 더 방사선 저항성인 암 줄기세포군이 뇌종양에서 감소된 산소 수준하에서 증강(enrich)되었다.

그러므로, 상기 관찰 및 연구들을 고려할 때, 본 발명의 가교형 4량체성 헤모글로빈은 간 절제 후의 수술후 간 종양 재발 및 전이를 예방하는 데 이용된다. 래트 동소이식 간암 모델을 수립한다. 간세포암종 세포주(McA-RH7777 세포)를 이용하여 버팔로 래트(수컷, 300-350g)에 동소이식 간암 모델을 수립한다. 도 17은 외과적 및 헤모글로빈 생성물 투여 절차를 요약하는 개념도를 도시한다. McA-RH7777 세포(대략 1×10⁶ 개의 세포/100μL)를 버팔로 래트의 간낭에 주사하여 고형 종양 성장을 유도한다. 2주 후(종양 부피가 약 10×10mm에 도달시), 종양 조직을 수집하여 1-2mm³ 정육면체로 절단하고 새로운 버팔로 래트 군의 좌간엽에 이식한다. 동소이식성 간 종양 이식 2주 후에, 래트에 간 절제(간 종양을 보유하는 좌엽) 및 부분적 간 IR 손상(우엽에 30분간의 허혈)을 실시한다.

이식된 종양 조직을 갖는 두 군의 래트를 종양 재발 및 전이의 비교를 위해 이용한다. 제1군에서, 래트를 펜토바비탈로 마취하고, 허혈 1시간 전에 10g/dL 농도의 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 0.2g/kg으로 정맥내 투여한다. 간문정맥 및 간동맥의 오른가지를 불독 클램프(bulldog clamp)로 폐쇄하여 간의 우엽에 허혈을 도입한다. 후속하여, 좌간엽에 결찰(ligation)을 실시한 뒤 간 종양을 보유하는 좌간엽을 절제한다. 허혈 30분 후에, 추가로 0.2g/kg의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 하대정맥을 통해 주사한 뒤 재관류한다. 제2군에서, 운반체 대조군으로서 링거의 아세테이트 완충액을 같은 절차로 주사한다. 모든 래트는 간 절제술 절차 후 4주째에 희생시킨다.

종양 성장 및 전이를 검사하기 위해, 버팔로 래트의 간과 폐의 표본을 허혈/재관류 및 간 절제술 절차 후 4주째에 얻어 형태학적 검사를 한다. 조직을 수확하고 파라필름에 삽입하고 구획화한 뒤 헤마톡실린 및 에오진(H&E) 염색을 행한다. 국소 재발/전이(간내) 및 원격 전이(폐)를 조직학적 검사에 의해 확인한다. 표 2는 래트 동소이식적 간암 모델에서 간 절제 및 IR 손상 후 4주째의 종양 재발/전이 비교 결과를 요약한 것이다.

	대조군 (n=13)	처리 (n=13)
간내 전이/재발	9 (69.2%)	4 (30.8%)
폐 전이	7 (53.9%)	4 (30.8%)

간 종양 재발 및 전이에 대한 비중합체성 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 보호 효과를 검사하기 위해, 모든 래트는 간 절제술 및 IR 절차 후 4주째에 희생시킨다. 폐 및 간 조직을 수확한다; 간 종양 재발/전이 및 폐에서의 원격 전이를 두 군 모두에서 비교한다. 결과는 헤모글로빈 처리가 장기 모두에서 재발 및 전이의 발생을 감소시킴을 보여 준다.

도 18은 간 절제술 및 허혈/재관류 절차 후 IR 손상군의 래트에 유도되는 간내 간암 재발 및 전이 및 원격 폐 전이 그리고 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 이용한 이의 보호의 대표적 예를 도시한다. 도 18A에서, 광범위한 간내 간암 재발/전이가 IR 손상군에서 관찰된다. 원격 폐 전이도 같은 래트에서 발생한다(실선 화살표로 표시). 도 18B에서, 간내 간암 재발/전이가 IR 손상군 내 또하나의 경우에서 관찰된다(점선 화살표로 표시). 광범위한 폐 전이가 같은 경우에서 관찰된다(실선 화살표로 표시). 대조적으로, 도 18C는 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 처리된 래트에서 간내 간암 재발/전이 및 원격 폐 전이로부터의 보호의 대표적 예를 도시한다.

도 19는 간 절제 및 IR 손상 절차 후 4주에서 두 군 모두에서의 조직학적 검사를 도시한다. IR 손상 및 헤모글로빈 처리군 모두에서의 간 및 폐 조직의 조직학적 검사(H&E 염색)를 수행하여 종양 결절의 실체를 확인한다. IR 손상군에서 간내 재발(T1 및 T2)과 폐 전이(M)를 보여 주는 대표적 시야를 도시한다(윗쪽). 처리군에서의 정상 간 구조(N1) 및 헤모글로빈 처리 후 간에서 발견되는 종양 결절(T3)을 비교를 위해 포함시킨다(아래쪽). 또한, 처리군에서 전이가 없는 폐 조직을 비교를 위해 도시한다(N2).

종양 재발 및 전이에 대한 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 보호 효과를 더 확인하기 위해, 허혈/재관류 및 간 절제술 절차 후 재발 종양의 크기 및 종양 재발률을 조사한다. 다시, 상기 기술한 바와 같이 McA-RH7777 세포의 주사에 의해 제조한 이식된 종양 조직을 갖는 래트를 대략 0.2-0.4g/kg의 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈 또는 음성 대조군으로서 링거의 아세테이트(RA) 완충액으로 도 17에 기술한 바와 같이 간 절제 절차시 허혈 전 그리고 재관류에서 정맥내 처리한다. 총 26마리의 래트를 시험하고, 이때 13마리의 래트는 본원의 헤모글로빈으로 그리고 13마리의 래트는 RA 완충액으로만 처리되는 음성 대조군 래트이다. 모든 래트는 간 절제술 및 IR 절차 후 4주째에 희생시키고, 시험 래트의 간과 폐의 종양 재발/전이를 검사하고, 재발 종양의 상대 크기를 측정한다.

도 20A는 시험 래트에서 간 종양 재발 및 개별 재발 종양의 부피를 도시한다. 13마리의 비처리 대조군 래트 가운데 9마리에서 간 종양 재발/전이가 있는 반면, 13마리의 처리 래트 가운데 4마리만이 종양 재발/전이를 나타냈다. 종양 재발이 나타나는 경우, 본원의 헤모글로빈으로 처리된 래트의 재발 종양의 크기가 비처리 래트에 비해 유의적으로 작은 점도 명백하다. 이 결과는 본 발명의 처리에 의해 종양 재발률이 크게 감소하고 재발 종양 크기가 유의적으로 감소함을 보여 주고, 이는 도 20B에 요약되어 있다.

도 21은 간 절제술 및 IR 절차 후 4주째에 수확한 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈으로 처리한 래트 및 IR 손상군(음성 대조군)의 간 및 폐 조직의 대표적 예를 도시한다. 비처리 음성 대조군 래트 C10 및 13의 대표적 예에서 나타나듯이, 광범위한 간내 간암 재발/전이 및 원격 폐 전이가 관찰된다(원으로 표시). 한편, 래트 Y9, Y10 및 Y11에서 나타나듯이, 본 발명의 헤모글로빈 처리에 의해 간내 간암 재발/전이 및 원격 폐 전이가 방지된다.

실시예 10

열 안정성 4량체성 헤모글로빈에 의한 처리는 허혈을 감소시킴

실시예 6에서 입증한 바와 같이, 본원의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈을 저산소성 종양에 정맥내 주사하면 그곳에서의 산소화를 유의적으로 개선한다. 따라서, 종양 절제 및 IR 절차 동안 본원의 헤모글로빈 생성물의 산소화 효과를 조사한다. McA-RH7777 세포의 주사로 제조한 이식된 간 종양 조직을 갖는 래트를 이용하고, 도 17에 개략적으로 나타낸 바와 같이 외과술 및 0.2-0.4g/kg의 본원의 헤모글로빈 생성물 또는 RA 완충액 투여 절차를 실시한다. 간의 산소 분압을 본원의 헤모글로빈 생성물/RA 완충액이 간 종양에 처음 투여될 때부터 IR 절차, 간 종양 절제 동안 그리고 재관류 후에 측정한다. 결과(도 22)는 본원의 헤모글로빈 처리에 의한 증가된 산소화가 허혈 도입 후에 관찰됨을 보여 준다. 또한, 도 22에서 알 수 있듯이, 본원의 헤모글로빈으로 처리된 간은 재관류 후 처리가 없는 경우에 비해 대략 3배 높은 산소 분압을 갖는다. 종양 절제시 허혈 전 그리고 재관류시에 본원의 헤모글로빈 처리는 비처리와 비교하여 간 조직의 산소화를 유의적으로 개선함이 확인된다. 저산소성 종양과 종양 재발/전이의 증가된 가능성간의 강한 상관관계가 문헌에서 제시된 점을 고려하면, 본원의 헤모글로빈 생성물의 강한 산소화 효과 및 본 실시예에서 입증된 바와 같은 종양 절제 절차 동안의 그 용도, 종양 재발 및 전이를 감소하기 위한 본원의 헤모글로빈 생성물의 유용성이 명백하게 확인된다.

실시예 11

열 안정성 4량체성 헤모글로빈에 의한 처리는 순환성 내피 전구세포 수준을 감소시킴

다양한 종류의 연구들이 간암의 진행에서 암 줄기세포(CSC) 및/또는 전구세포군의 중요성을 입증해 왔다. 중요한 점은, 기존의 연구들은 간 절제술을 받는 자들을 포함하여 HCC 환자에서 유의적으로 높은 수준의 순환성 내피 전구세포(EPC)가 발견됨을 보여 준다는 점이다.

따라서, 순환성 EPC의 수준을 CD133, CD34 및 VEGFR2와 같은 표면 분자의 발현으로 평가한다. 본원의 헤모글로빈 생성물 처리의 존재 또는 부재시 간 절제 외과술 및 IR 절차 후 순환성 내피 전구세포 수준을 조사한다. 이식된 간 종양을 갖는 두 군의 래트를 본원의 헤모글로빈 또는 RA 완충액(대조군)으로 도 17에 도시된 바와 같이 간 절제시 허혈 전 그리고 재관류시에 각각 처리한다. 두 군의 래트의 순환성 EPC의 개수를 간 절제 및 IR 절차 후 0, 3, 7, 14, 21 및 28일째에 측정한다. 결과(도 23)는 처리 및 비처리군의 EPC 수준이 외과술 후 0 내지 3일 동안은 비슷하지만, 헤모글로빈 처리군의 EPC 수준이 RA 완충액 처리군보다 크게 낮음을 보여 준다. 이 결과는 본원의 헤모글로빈의 보호 효과가 종양 재발/전이를 감소 및 최소화할 수 있음을 보여 준다.

실시예 12

열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 종양 덩어리 내 국재화

열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 종양 덩어리 내 국재화를 시각화하기 위해, 본 발명의 헤모글로빈을 Alexa Fluor® 750 SAIVI™ Antibody Labeling System으로 제조사의 설명서에 따라 표지한다. 약술하면, 형광 표지된 본 발명의 헤모글로빈(fl-Hb)을 미표지 대응물과 대략 1:80의 비율로 혼합한다. 혼합물을 코인두암종 이종이식편(C666-1)을 보유하는 누드 마우스에 정맥내 주사한다. 각 누드 마우스에 대해, fl-Hb의 양은 Maestro2 촬영 시스템이 포착할 수 있는 충분한 형광 신호를 보장하기 위해 0.2mg 가량이다. 누드 마우스를 다양한 시점에서 마취시킨 뒤, 분석을 위해 Maestro2 형광 촬영 시스템에 노출시킨다. 도 24는 종양 이종이식편 내에 농축된 Hb의 대표적 영상이다(화살표로 표시).

실시예 13

후두암에서 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 방사선 감작화 효과

두경부암에서 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 방사선 감작화 효과를 평가하기 위해, 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체를 방사선 전에 한 번 투여하고, 그 결과는 Hep-2 후두암 모델에서 종양 성장 억제 효과를 보여 준다. 실험의 종료시에 방사선과 병용된 고용량의 Hb(2.2g/kg)의 종양 부피는 90.0㎣이고, 이는 대조군(336.1㎣)(P<0.01)보다 유의적으로 작다. 방사선 단독의 종양 부피는 143.1㎣이고, 고용량의 Hb 투여의 조합 q 값은 1.17로서, 이 조합의 상승 효과를 나타낸다(q>1.15, 상승 효과). 도 25는 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체 후 방사선의 종양 성장 억제 효과를 도시한다.

실시예 14

코인두암에서 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 방사선 감작화 효과

코인두암에서 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 방사선 감작화 효과를 평가하기 위해, 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체를 방사선 전에 한 번 투여하고, 그 결과는 C666-1 코인두암 모델에서 종양 성장 억제 효과를 보여 준다. 실험의 종료시에 방사선과 병용된 고용량의 Hb(2.2g/kg)의 종양 부피는 110.3㎣이고, 이는 대조군(481.1㎣)(P<0.01)보다 유의적으로 작고, 방사선 단독군(160㎣)(P<0.05)보다도 유의적으로 작다. Hb 고용량의 조합 q 값은 1.24로서, 이 조합의 상승 효과를 나타낸다(q>1.15, 상승 효과). 도 26은 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체 후 방사선의 종양 성장 억제 효과를 도시한다.

실시예 15

뇌암에서 열 안정성 4량체성 헤모글로빈의 화학감작화 효과

다형교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)은 성인에서 1차 뇌종양의 가장 흔한 유형이며 인간에서 가장 공격적이고 치명적인 악성종양 중 하나로서, 빠른 성장, 침입성 및 조기 재발의 특성이 있다. GBM 환자의 예후는 극히 바람직하지 못하여 생존 중간값이 대략 1년이다. 알킬화제 테모졸로마이드(TMZ)가 생존을 유의적으로 늘릴 수 있지만, 대부분의 환자는 신규(de novo) 또는 획득의 TMZ 저항성 때문에 종양 재발을 경험한다.

따라서, 다형교모세포종에서 테모졸로마이드 유도 세포독성에 대한 Hb의 감작화 효과를 연구한다. 테모졸로마이드에 민감성(D54-S) 및 저항성(D54-R)인 GBM 세포를 다양한 농도(0.015 내지 0.03g/dL)의 Hb 단독, TMZ 단독 또는 병용으로 72시간 동안 저산소(1% 산소)하에서 처리한 뒤 세포 생육성 검사를 실시한다.

결과는 Hb가 시험관 내 D54-S 및 D54-R GMB 세포 모두에서 TMZ 유도 세포독성을 향상시킴을 보여 준다. 도 27A는 다양한 처리 조건 후에 D54-S 및 D54-R 세포의 대표적 96웰 플레이트를 도시한다. 도 27B는 Hb에 의한 TMZ 유도 세포독성의 용량 의존적 향상을 보여 준다.

실시예 16

유세포측정에 의한 암 줄기세포의 단리

유방암 세포주 MCF7 세포를 CD24 및 CD44 항체로 표지하고, 각각 488nm(청색 레이저) 및 633nm(적색 레이저)로 여기되는 PE 및 APC 동종형(isotype)을 이용한 유세포측정으로 분석하고, 각각의 발광을 585nm 및 660nm 대역 통과 필터로 측정한다. 유세포측정 결과는 CD44는 고발현하지만 CD24는 그렇지 않은 상업적으로 입수가능한 MCF7 세포의 백분율이 전체 군의 약 0.5%에 불과함을 보여 준다.

원하는 암 줄기세포를 얻기 위해, MCF7 세포를 코팅되지 않은 페트리 접시 상에 현탁액에서 적어도 7-9일간 배양하여 구상체를 형성한다. 배양 배지는 인간 맘모스피어(mammosphere)를 위해 MammoCult Basal Medium 및 MammoCult Proliferation Supplement 모두를 함유한다. 배양 배지는 사용 전에 0.48μg/mL의 갓 용해한 히드로코르티손 및 4μg/mL의 헤파린으로 또한 보충된다. 페트리 접시의 배양 배지는 1-2일마다 갈아 주고 배지의 색상으로부터 빈도를 결정할 수 있다. 세포의 형태학을 현미경으로 관찰한다. 도 28은 광학 현미경으로 위상차 시야(phase contrast field)에서 관찰한 세포 형태학을 도시한다. 유방 상피세포에서 유도된 중공(hollow) 맘모스피어(E, 대조군)와 비교하여, 유동 분류된(flow-sorted) MCF7 세포를 페트리 접시 상에 부은 후 약 9 내지 20일의 성장에서 중실(solid) 맘모스피어가 관찰된다. 자가 재생 능력은 암 줄기세포를 약 9계대 동안 경과시킴으로써 추가로 확인되고, 0계대 이후의 각 후속 계대는 중실 맘모스피어로 발달하는 데 약 9-14일이 걸릴 수 있다. 한 계대에서 다른 계대까지, 중실 맘모스피어를 화학적(예: 트립신화) 또는 기계적 수단에 의해(예: 페트리 접시에서 세포괴(cell clump)를 떼어내기 위해 세포 긁개(cell scraper)를 이용한 뒤, 위아래로 피펫팅(pipetting)) 무균 환경에서 단일 세포로 분리한다. 각 계대의 단일 세포를 수집하여, 암 줄기세포의 실체 및 자가 재생 능력을 확인하기 위한 추가 단백질 분석을 실시한다. 도 29는 다양한 계대에서 수집한 용해된(lysed) 세포의 웨스턴 블롯이다. 도 29A에서, 표본 1은 맘모스피어로부터의 미분류 세포에 대한 것이고 표본 2는 1계대에서 맘모스피어로부터의 CD44+/CD24- 분류된 세포에 대한 것이다. 도 29B에서, 표본 1은 맘모스피어로부터의 미분류 세포에 대한 것이고 표본 2, 3 및 4는 각각 1, 2 및 3계대에서 맘모스피어로부터의 CD44+/CD22- 분류된 세포에 대한 것이다. 웨스턴 블롯으로부터, 맘모스피어로부터의 미분류 및 분류된 세포 모두는 줄기세포 표지자(marker) Oct-4(39kDa) 및 Sox-2(40kDa)를 발현하는 것으로 나타난다. 그러나, 미분류 및 분류된 세포간 이들 표지자의 발현 수준은 상이하다. 명백하게, CD44+/CD24- 분류된 세포는 동일 계대에서 미분류 세포에 비해 높은 Oct-4 발현 수준을 갖는다. CD44+/CD24- 세포를 선택하기 위한 각 계대에서의 세포 분류의 적용 때문에 암 줄기세포의 자가 재생 능력은 한 계대에서 다른 계대까지 이들 줄기세포 표지자의 발현 수준의 관점에서 더 높아진다.

암 줄기세포의 종양 개시 능력을 더 조사하기 위해, 다양한 계대에서의 맘모스피어로부터 수집한 세포를 알데히드 탈수소효소(ALDH)-항체로 표지하고 표지된 세포를 유세포측정으로 분석함으로써 ALDH 활성을 연구한다. 도 30A는 대조군에 대한 분석의 결과이다(ALDH의 억제제인 디에틸아미노벤즈알데히드(DEAB)로 항온처리한 세포); 도 30B는 0계대에서 수집한 세포의 결과로서, ALDH 활성을 갖는 1%의 세포군을 보여 준다; 도 30C는 3계대에서 수집한 세포의 결과로서, ALDH 활성을 갖는 약 8.7%의 세포군을 보여 주고, 5계대에서 수집한 세포는 ALDH 활성을 갖는 약 10-13%의 군을 갖는다(도 30D). 이 분석에서, 맘모스피어에서 단리한 세포는 종양 개시 및 자가 재생 능력을 갖는 반면, 계대를 거치면서 선택적 압력하에서 암세포의 세포군에서 더 지배적이 됨이 입증된다. 이는 암 줄기세포에 대한 기존의 연구들과도 일치한다.

실시예 17

암 줄기세포에 대한 헤모글로빈 기반 산소운반체의 효과

종양 내 암 줄기세포에 대한 헤모글로빈 기반 산소운반체의 효과를 시험하기 위해, MCF7 세포를 저산소 조건하에서(5% CO₂ 및 1.1% O₂) 9-20일간 항온처리한 뒤, 두 필터를 이용하는 세포 분류기에 통과시킨다: CD24 표지자를 위해 PE-A, CD44 표지자를 위해 APC-A. 세포가 CD44에 양성이고 CD24에 음성인 1사분면(도 31)을 추가 분석을 위해 분류한다.

암 줄기세포의 화학요법제 단독 또는 헤모글로빈 기반 산소운반체와 화학요법제의 병용요법에의 민감도를 시험하기 위해, 다양한 세트의 화학요법제 및/또는 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체를 늦은 계대, 예컨대 7 및 8계대에서 얻은 맘모스피어로부터 단리한 MCF7 세포에 투여한다. 암 줄기세포의 민감도를 시험하기 전에, CD44+/CD24-의 화학요법제에 대한 약물 저항성을 도 32에 도시한다. 미분류 MCF7 세포 및 CD44+/CD24- 분류된 세포를 DMSO(대조군으로서) 및 90nM의 탁솔로 16시간 및 4일 동안 항온처리한다. 각 표본 세트의 위상차 영상(도 32)을 각 시간 간격(16시간 및 4일)으로 얻고, 4일 동안 탁솔 처리 후의 분류된 세포를 MTT 분석으로 추가 시험하여(실시예 3에 기술한 바와 같이) 이들 세포의 화학요법제에 대한 약물 저항성을 확인한다. 세포 형태학으로부터, 미분류 및 CD44+/CD24- 분류된 세포 모두의 맘모스피어 형성은 90nM에서 탁솔에 의해 억제되는 것으로 보인다. 그러나, 4일 동안 탁솔 처리 후의 분류된 세포의 MTT 분석은 약 96% 생존을 보이고, 이는 CD44+/CD24- 분류된 세포가 탁솔 단독에 대해 높은 저항성을 보유함을 의미한다.

화학요법제에 대한 CSC의 높은 저항성은 맘모스피어를 다양한 조합의 화합물(들)로 24시간 이상 처리한 뒤 맘모스피어를 트립신화하한 후 두 계대(P7 및 P8)로부터의 단일 세포에 대한 MTT 분석 결과에 의해 추가로 확인된다. 맘모스피어는 종양의 생리학적 환경을 모방하기 위해 저산소 조건하(5% CO₂, 1.1% O₂)에서 성장한다. MTT 분석에 이용되는 다양한 조합의 화합물(들)은 Hb 단독(0.2g/dL), 보르테조밉("Bort", 0.5μM) 단독, 5-플루오로우라실("5FU", 5μM) 단독, 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 병용 약물(즉, Hb + 하나 이상의 화학요법제)의 경우, 트립신화 세포는 0.2g/dL의 Hb로 24시간 동안 항온처리한 뒤 목적하는 화학요법제(들)을 첨가하고 24시간 동안 추가로 항온처리한다. 흡광도를 분광계로 측정하고 정규화된(normalized) 흡광도 값을 하기 표 3에 나타낸다. 정규화된 값에서, "1"은 100%의 생존률을 나타내고; 0.75는 75%의 생존률을 나타내는 등이다.

0.2g/dL의 Hb만을 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포의 생존률은 약 61-65%의 생존률이다. 0.5μM의 보르테조밉 단독을 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포는 약 78%-91%의 생존률을 갖는다. 5μM의 5FU 단독을 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포는 약 72%-87%의 생존률을 갖는다. 0.2g/dL의 Hb + 0.5μM의 보르테조밉을 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포의 생존률은 약 38%-49%이다. 0.2g/dL의 Hb + 5μM의 5FU를 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포의 생존률은 약 52%-72%이다. 0.5μM의 보르테조밉과 5μM의 5FU를 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포의 생존률은 약 60%-64%이다. 0.2g/dL의 Hb + 0.5μM의 보르테조밉 및 5μM의 5FU를 투여하는 세트에서, 두 계대로부터의 세포의 생존률은 약 33%-39%이다. 하나의 화학요법제 단독 그리고 헤모글로빈 기반 산소운반체와 동일 약제의 병용을 투여하는 세트를 비교하면, 생존률은 보르테조밉의 경우 거의 절반만큼 줄어들고; 생존률은 5FU의 경우 약 17% 내지 20%만큼 줄어든다. 보르테조밉과 5FU의 병용에서 세포의 생존률은 약 60%-64%이지만, 이는 헤모글로빈 기반 산소운반체 및 보르테조밉으로 처리한 세포의 경우보다 여전히 상대적으로 높다. 헤모글로빈 기반 산소운반체 단독이 보르테조밉과 5FU의 병용을 이용하는 경우와 거의 같은 백분률만큼 CSC를 사멸시킬 수 있다는 점은 흥미로운 일이다. 마지막으로, 이 시험에서 CSC를 사멸시키는 가장 효과적인 병용은 헤모글로빈 기반 산소운반체 + 보르테조밉 및 5FU로서, 그 생존률은 약 33%-39%에 불과하고 이는 본 명세서에서 기술한 임의의 다른 어떤 병용보다도 훨씬 낮다. 그러나, 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체와 병용으로 투여되는 화학요법제는 보르테조밉 또는 5FU에 제한되지 않음을 주목하여야 한다. 암/종양을 치료하는 데 덜 효과적인 것으로 알려져 온 임의의 다른 종래의 화학요법제 또는 방사선 요법과 같은 임의의 다른 요법도 CSC 사멸에 개선된 효능을 갖는 본 발명의 헤모글로빈 기반 산소운반체와 병용으로 이용될 수 있다.

원하는 경우, 본 명세서에서 논의한 다양한 작용들을 상이한 순서 및/또는 동시에 수행할 수 있다. 더욱이, 원하는 경우, 상기 기술한 작용들 중 하나 이상은 선택적이거나 조합될 수 있다.

상기 조사의 결과, 본 발명의 열 안정성 4량체성 헤모글로빈에 의한 처리는 간 종양의 재발 및 다른 장기에의 전이 모두에 예방적 효과를 가진다는 결론을 얻는다.

전술한 발명을 다양한 구체예와 관련하여 기술하였지만, 그러한 구체예는 제한적인 것은 아니다. 많은 변경과 변형을 본 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 그러한 변경과 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.

본 발명의 다양한 양태를 독립항에 제시하였지만, 본 발명의 다른 양태들은 기술한 구체예 및/또는 종속항의 특징과 독립항의 특징의 다른 조합을 포함하며, 청구범위에 명시적으로 제시한 조합만을 포함하는 것은 아니다.

상기는 본 발명의 예시적 구체예를 기술하지만, 이 기술이 제한적 의미로 해석되어서는 아니된다는 점을 또한 주목하여야 한다. 오히려, 첨부 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있는 다양한 변경과 변형이 존재한다.

<110> Vision Global Holdings Ltd. et al. <120> HEMOGLOBIN-BASED OXYGEN CARRIER-CONTAINING PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR CANCER TARGETING TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER RECURRENCE <130> P6560PC00 <140> PCT/US13/064418 <141> 2013-10-11 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 1 ggcgcgaacg acaagaaaaa g 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 2 ccttatcaag atgcgaactc aca 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 3 cagagcagga aaaggagtca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 4 agtagctgca tgatcgtctg 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 5 aatggaatgg agcaaaagac aatt 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 6 attgattgcc ccagcagtct ac 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 7 gctactgcca tccaatcgag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 8 ctctcctatg tgctggcctt 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 9 ctctctccct catcggtgac a 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 10 ggagggcaga gctgagtgtt ag 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 11 actgccatcc aatcgagacc 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 12 gatggctgaa gatgtactcg atct 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 13 acaacaaatt caggtacgct gtg 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 14 tctgatcaat gtcatgagca aagg 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 15 gttctcaagg cacaggtctc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 16 gcaggtcact tatgtcactt atc 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 17 tgccaagcag gaaaagaact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 18 tttgacgctg tttctcatgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 19 ttcagacaga gccaaggtgc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 20 caatgacatc aactgggcaa t 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 21 ggcagtcaag cacttttctg tag 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 22 gtcaaccaca ccacggataa a 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 23 attagcatgg cggcacacat 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 24 tggagtgcag tggcatactc at 22

Claims

암성(cancerous) 조직 또는 종양의 덩어리 내에서 암세포의 표면 상에 발현되는 수용체를 표적화하도록 구성되는 헤모글로빈 기반 산소운반체 약학적 조성물로서, 자가 재생 및 종양 개시 세포를 포함하는 상기 암성 조직 또는 종양의 세포 내에 세포자멸사(apoptosis)를 유도하여 암 재발을 예방하고, 상기 암성 조직 또는 종양에 산화적 스트레스 또는 쇼크를 제공하고, 그리고 동시 또는 후속하여 투여되는 화학요법제 또는 방사선 요법에 상기 암성 조직 또는 종양을 감작화하기 위하여, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체 약학적 조성물이 수용체 매개 메커니즘을 촉발하여 상기 암성 조직 또는 종양의 덩어리 내에서 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체의 암세포로의 흡수 및 국재화(localization)를 촉진하도록 하는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암성 조직 또는 종양 및 자가 재생 및 종양 개시 세포를 포함하는 상기 암성 종양 세포를 상승적으로(synergistically) 표적화하기 위하여 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체와 화학적 접합된 화학요법제를 더 포함하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학요법제는 5-플루오로우라실, 보르테조밉, 독소루비신, 시스플라틴 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 검출불가량의 2량체 농도 및 낮은 농도의 메트헤모글로빈을 갖는 열 안정성 가교형 4량체성 헤모글로빈, 중합화 헤모글로빈, 또는 변성(modified) 헤모글로빈 분자로부터 선택되는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 수용체 매개 메커니즘은 클라트린(Clathrin) 매개 세포내이입(endocytosis)인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 개체로부터의 종양의 외과적 제거에서 혈액 공급의 중단 전 및/또는 혈액 공급의 복구 동안에 이를 필요로 하는 개체에 투여되는 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 대략 0.2-1.2g/상기 개체의 체중 kg의 범위로 투여되는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암성 조직 또는 종양은 간, 유방, 뇌, 결장, 폐, 두경부, 코인두 및 백혈병을 포함하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암성 조직 또는 종양은 저산소성인 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 가교형 4량체성 헤모글로빈은 60-70kDa의 분자량을 갖고, 0.05-0.4%의 농도로 N-아세틸 시스테인의 첨가와 함께 열처리되는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 혈관수축성 불순물 및 단백질 불순물이 없고, 비발열성(non-pyrogenic), 무내독소(endotoxin-free), 무인지질(phospholipid-free), 무간질(stroma-free)이고 메트헤모글로빈 수준이 5% 미만인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자가 재생 및 종양 개시 세포를 포함하는 상기 암성 조직 또는 종양의 세포 내에 세포자멸사가 유도되도록, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 상기 암성 조직 또는 종양의 덩어리에 침투하고 상기 암성 조직 또는 종양에 산화적 스트레스 또는 쇼크를 제공하기 위해 더 긴 반감기를 갖게 변성되는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자가 재생 및 종양 개시 세포는 암 줄기세포 및/또는 전구세포인 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 단독으로 또는 하나 이상의 화학요법제 및/또는 방사선 요법과 병용으로 투여되고, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 보조요법(adjunctive therapy)으로서 투여되는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 변성 헤모글로빈 분자는 페길화(pegylated) 헤모글로빈 분자인 약학적 조성물.
암성 조직을 치료하고 암성 종양의 재발을 예방하기 위한 약학적 조성물의 제조에서의 헤모글로빈 기반 산소운반체의 용도로서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 단독으로 또는 하나 이상의 화학요법제와 병용으로 투여되는 용도.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 암성 조직 또는 종양의 제거 동안 또는 후에 상기 개체에 투여되는 용도.
제16항에 있어서, 상기 조직 또는 종양은 간, 코인두, 뇌, 결장, 폐, 두경부, 유방 및 백혈병인 용도.
제16항에 있어서, 상기 암성 조직 또는 종양은 저산소성인 용도.
제16항에 있어서, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 60-70kDa의 분자량을 갖는 가교형 4량체성 헤모글로빈이고, 0.05-0.4%의 농도로 N-아세틸 시스테인의 첨가 및 열처리 후에 열 안정성인 용도.
제20항에 있어서, 상기 조성물은 상기 열처리 및 첨가된 N-아세틸 시스테인과의 반응 후에 혈관수축성 불순물 및 단백질 불순물이 없고, 비발열성, 무내독소, 무인지질, 무간질이고 메트헤모글로빈 수준이 5% 미만인 용도.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 대략 0.2-1.2g/체중 kg의 범위로 그리고 10mL/시간/체중 kg 미만의 속도로 주입에 의해 투여되는 용도.
제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학요법제는 5-플루오로우라실, 보르테조밉, 독소루비신, 시스플라틴 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 용도.
제16항에 있어서, 더 많은 헤모글로빈 기반 산소운반체와 화학요법제가 세포에 의해 선택적으로 흡수되고 세포의 세포질에 국재화되는 한편 상기 세포는 상기 화학요법제에 더 민감하게 되도록, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체와 하나 이상의 화학요법제의 병용이 상기 암성 조직 또는 종양 내 수용체의 발현을 갖는 세포를 상승적으로 표적화하여 수용체 매개 메커니즘을 촉발함으로써 상기 암성 조직 또는 종양 내 세포를 감작화하도록 구성되는 용도.
제16항에 있어서, 자가 재생 및 종양 개시 세포를 포함하는 상기 암성 조직 또는 종양 내 세포의 세포자멸사가 유도되도록, 상기 헤모글로빈 기반 산소운반체는 상기 암성 조직 또는 종양의 덩어리에 산화적 스트레스 또는 쇼크를 제공하기 위해 그리고 상기 암성 조직 또는 종양을 상기 화학요법제에 감작화하기 위해 상기 하나 이상의 화학요법제와 보조요법으로서 투여되는 용도.
제25항에 있어서, 상기 자가 재생 및 종양 개시 세포는 암 줄기세포 및/또는 암성 전구세포인 용도.
제16항에 있어서, 상기 암성 조직 또는 종양은 간, 유방, 뇌, 결장, 폐, 두경부, 코인두 및 백혈병을 포함하는 용도.
제24항에 있어서, 상기 수용체 매개 메커니즘은 클라트린 매개 세포내이입인 용도.