KR20230141306A - 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물 - Google Patents

저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물에 관한 것으로, 고형 종양의 화학-PDT 치료시 저산소증(Hypoxia)을 개선하고 치료효율을 높이며, 종양 표적화에 의하여 부작용을 저감함로써, 본 발명의 항암 화학-광역학 치료에 기여할 것으로 기대된다.

Description

저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물{Composition for anticancer chemo-photodynamic therapy comprising pegylated hemoglobin nanocluster alleviating hypoxia}
본 발명은 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물에 관한 것이다.
고형 종양의 두드러진 특징 중 하나는 저산소증(Hypoxia)이다. 악성 암조직에서는 과잉 세포증식으로 산소농도가 낮은 환경을 형성되는데, 종양 세포는 저산소 미세 환경에서 생존하고 성장할 수 있도록 스스로를 리프로그램하여 적응한다(X. Jing 등, 2019). 종양 세포가 저산소 상태에서 순응할 수 있도록 하는 가장 잘 알려진 전사 인자는 저산소증 유도 인자-1(HIF-1)로, HIF-1은 종양 세포 증식, 혈관 신생 및 전이를 촉진하는 것으로 잘 알려져 있다(A. I. Minchinton 등, 2006). 이러한 종양 저산소증과 HIF-1에 의한 전사 반응은 다양한 암 치료법의 효율성을 낮춘다는 것이 알려지고 있다. 또한, 광역학 요법(PDT) 및 방사선 요법의 주요 치료 메커니즘인 활성산소종(ROS)의 생성은 암조직에서 낮은 산소 수준으로 인해 제한될 수 있다(P. Wang 등, 2017).
특히 PDT 자체는 산소를 소비하여 ROS를 생성할 뿐만 아니라 혈관 차단 효과를 유도하여 저산소증을 더욱 악화시킨다(T. M. Busch 등, 2010). 이러한 저산소증과 PDT의 악순환을 끊기 위한 방법의 하나는 종양 조직의 산소 수준을 높이는 것이고 다른 하나는 PDT의 산소 의존성을 낮추는 것이다(M.-Z. Zou 등, 2020). 종양 조직의 산소 수준을 높이는 방법으로는 산소 나노버블, 과불화탄소 기반 나노물질, 적혈구 기반 마이크로캐리어를 전달하거나, H2O2 기반 나노물질 및 질화탄소 또는 질화텅스텐 기반 물질, H2O 분해 시스템을 통해 산소를 생성시키는 방법 또는 세포 호흡을 줄이는 산소 절약 장치가 연구되고 있다(R. Song 등, 2018). PDT의 산소 의존성을 낮추는 방법으로 PDT 중 스스로 자유 라디칼 또는 치료 가스를 생성하는 재료를 채택하는 방법 등이 있다. 그러나 낮은 종양 특이성과 높은 전신 독성은 여전히 치료 효과를 저감시키는 문제가 있다.
한편, 헤모글로빈(Hb)은 호흡계에서 체세포로 혈액 순환을 통해 산소를 운반하고, 체세포에서 호흡계로 대사 노폐물 이산화탄소를 운반하는 데 중요한 역할을 한다. 이러한 산소 수송 능력으로 헤모글로빈은 적혈구 수혈의 대체물로 오랫동안 연구되어 왔다. 천연 헤모글로빈의 혈류에서의 짧은 반감기(최대 0.5-1.5시간)의 문제는, 가교, 표면 변형, 중합, 캡슐화, 재조합 단백질 생산 등 다양한 변형 전략을 통해 약동학적으로 개선되어 왔으며, 그 중 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-접합 Hb 유도체, Hemospan®(PEG-Hb 인간; Sangart Inc., San Diego, CA, USA) 및 Sanguinate®(PEG-carboxyHb 소; Prolong Pharmaceuticals, South Plainfield, NJ, USA)) 등은 혈액 대용으로 각각 임상 3상 및 2상 시험에 도달하였다.
그러나 헤모글로빈의 이러한 산소전달 기능을 이용하여 화학-PDT 치료효과를 개선하는 시스템은 아직 확립되어 있지 않으며, 특히 단백질 분자의 변성 및 비가역적 접합을 수반하는 화학적 가교제(예: 글루타르알데히드)를 사용하는 기존의 단백질 나노입자의 제조방법으로 헤모글로빈 나노입자를 제조하는 경우, 생성된 입자크기 및 물리화학적 특성이 단핵구에서 표적 이외에 축적되는 등 표적화가 어려운 문제가 있었다. 또한 헤모글로빈은 각 β 사슬(Cys-93)에서 화학적 변형에 접근할 수 있는 단 하나의 시스테인 단위를 포함하는 점에서 정확하게 정의된 구조를 가진 PEG화 헤모글로빈의 암 약물 버전에 대한 연구가 필요하다.
한국공개특허 제10-2015-0065881호, 암 표적화 치료 및 암 재발 예방을 위한 헤모글로빈 기반 산소운반체 함유 약학적 조성물, 2015년06월15일. 공개.
X. Jing, F. Yang, C. Shao, K. Wei, M. Xie, H. Shen, Y. Shu, Mol. Cancer 2019, 18, 157. A. I. Minchinton, I. F. Tannock, Nat. Rev. Cancer 2006, 6, 583 P. Wang, X. Li, C. Yao, W. Wang, M. Zhao, A. M. El-Toni, F. Zhang, Biomaterials 2017, 125, 90 T. M. Busch, H.-W. Wang, E. P. Wileyto, G. Yu, R. M. Bunte, Radiat. Res. 2010, 174, 331. M.-Z. Zou, W.-L. Liu, H.-S. Chen, X.-F. Bai, F. Gao, J.-J. Ye, H. Cheng, X.-Z. Zhang, Natl. Sci. Rev. 2020, 8. R. Song, D. Hu, H. Y. Chung, Z. Sheng, S. Yao, ACS Appl. Mater. Interfaces 2018, 10, 36805. J. E. Schiel, C. M. Ohnmacht, D. S. Hage, Anal. Chem. 2009, 81, 4320.
본 발명의 목적은 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암화학-광역학 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제공한다. 보다 구체적으로는 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)를 위한 광증감제가 접합되며, 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드(PEG-MAL)로 변형된 헤모글로빈(Hb)을 포함하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제공한다.
상기 광증감제(photosensitizer 또는 photosensitizing agent)는 광활성 광에 노출시 활성화되어 특정 파장에 노출이 되면 일항 에너지 상태로 여기되고, 세포독성형으로 전환됨으로써 표적 세포가 사멸되거나 이들의 증식 효능이 소멸되는 화학 화합물을 의미한다. 즉, 광증감제는 직접 또는 간접적으로 각종의 메카니즘에 의해 자체 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명에서 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)를 위한 광증감제는 포르피린, 클로린, 박테리오클로린, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 페오포르바이드(pheophorbides), 푸르푸린(purpurins), m-THPC, 클로린 e6, 박테리오클로린, 프탈로시아닌, 벤조포르피린 유도체 및 아미노레불린 산(ALA)을 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 클로린 e6이다.
본 발명은 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 고형 종양으로 표적화되는 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제공한다. 상기 표적화는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터에 접합되는 표적화 모이어티에 의하여 이루어지며, 본 발명은 페길화 헤모글로빈 나노클러스터에 접합된 비오틴이 일부 고형 암종에서 과발현되는 나트륨 의존성 멀티비타민 수송체(Sodium Dependent Multivitamin Transporter, SMVT)에 선택적으로 부착함으로써 이루어질 수 있다.
상기 나트륨 의존성 멀티비타민 수송체를 과발현하는 암종으로는 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 폐암, 담관암, 신장암, 위암, 간암, 망막아세포종, 융모상피암, 소장암, 대장암 및 직장암 등이 있으며, 이들 암종의 화학-광역학 요법으로 본 발명의 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물을 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 고형 종양의 저산소증(hypoxia)을 완화함으로써 PDT 요법의 효율을 높일 수 있다.
본 발명은 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)을 위한 광증감제가 접합되며, 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 헤모글로빈(Hb)을 포함하며, 헤모글로빈 : 폴리에틸렌 글리콜 : 광증감제가 1 : 4 : 12 의 몰비로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 페길화 헤모글로빈 나노클러스터에 항암제를 추가로 담지한 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제공한다. 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스플라틴(cisplatin), 비노렐빈(vinorelbine) 및 플루오로우라실(5-fluorouracil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 독소루비신(doxorubicin)이다.
본 발명은 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)을 위한 광증감제가 접합되며, 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 헤모글로빈(Hb)을 포함하며, 헤모글로빈 : 폴리에틸렌 글리콜 : 광증감제가 1 : 1~8 : 4~24 의 몰비로 이루어지며, 독소루비신(doxorubicin)을 담지한 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제공한다.
본 발명의 페길화 헤모글로빈 나노클러스터가 항암제로 독소루비신(doxorubicin)을 담지하는 경우, 상기 독소루비신을 담지한 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 다분산 지수 (polydispersity indices) 0.3 미만, 평균 유체역학적 직경 230 nm 미만 및 제타전위가 음수이며, 이에 따라 주사제로 사용이 용이하다.
본 발명은 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물을 제공한다. 상기 항암 화학-광역학 치료용 조성물은 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 폐암, 담관암, 신장암, 위암, 간암, 망막아세포종, 융모상피암, 소장암, 대장암 및 직장암으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 악성 종양에 적용될 수 있다.
상기 항암 화학-광역학 치료용 조성물은 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~99중량%, 또는 0.001~50중량%, 또는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 항암 화학-광역학 치료용 조성물은 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항암 화학-광역학 치료용 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 클로린 e6(Chlorin e6), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 용해혼합물을 제조하는 단계(A);
상기 (A)단계의 용해혼합물을 물에 용해된 헤모글로빈(Hb)에 첨가하여 반응시켜 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)를 수득하는 단계(B);
상기 (B)단계의 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)에 비오틴화 폴리에틸렌글리콜(biotin-PEG)을 추가하여 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 단계(C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 (A)단계의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 클로린 e6(Chlorin e6)과 헤모글로빈이 아미드 결합을 형성하여 (B)단계의 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)를 형성할 수 있도록 돕는 크로스링커 (cross-linker)로 사용된 것일 수 있다. 이때 헤모글로빈과 클로린e6의 몰비는 바람직하게는 1:4~24이다. 헤모글로빈과 클로린e6의 몰비가 1:4보다 클로린e6의 농도가 낮은 경우, 광감작제의 농도가 충분하지 못하여 광역학치료의 효율이 낮아지며, 헤모글로빈과 클로린e6의 몰비가 1:24보다 클로린e6의 농도가 높은 경우, 나노클러스터의 생성이 불안정해 질 수 있다. 헤모글로빈과 클로린e6의 몰비는 더욱 바람직하게는 1:8~20이며, 가장 바람직하게는 1:12이다.
상기 (B)단계에서 생성된 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)는 6-8kDa의 분자량 컷오프 투석막을 사용하여 투석하거나 및/또는 원심분리 필터(Centrifuge filter)를 사용하여 유기용매를 제거함으로써 세척 및/또는 농축할 수 있다.
상기 (B)단계의 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)에 비오틴화 폴리에틸렌글리콜(biotin-PEG)을 추가하여 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 단계(C)를 통하여 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조할 수 있다. 상기 (B)단계의 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)에 비오틴화 폴리에틸렌글리콜(biotin-PEG)을 Hb : PEG의 몰비가 1:1~8이 되도록 추가하여 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조할 수 있다. 이때 Hb : PEG의 몰비가 1:1보다 PEG가 저농도일 경우, Hb가 충분히 페길화되지 않아 나노클러스터의 생성이 불안정하며, 1:8보다 PEG를 고농도로 반응시키는 경우, PEG 반응농도에 대하여 페길화의 효율이 낮다. 이때 Hb : PEG의 몰비는 바람직하게는 1:1~8이며, 더욱 바람직하게는 1:2~6이며, 가장 바람직하게는 1:4이다.
또한, 상기 단계를 통하여 수득한 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)는 또는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 동결건조하여 -80℃에 보관할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 (C)단계 이후, 상기 (C)단계에서 제조한 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 물에 용해시킨 후, DMSO에 용해된 항암제와 혼합하여 볼 밀링(ball milling)하여 항암제가 담지된 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 단계(F)를 추가로 포함할 수 있다. 이때 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스플라틴(cisplatin), 비노렐빈(vinorelbine) 및 플루오로우라실(5-fluorouracil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 독소루비신(doxorubicin)이다.
본 발명은 저산소증 완화능을 갖는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 항암화학-광역학 치료용 조성물에 관한 것으로, 고형 종양의 화학-PDT 치료시 저산소증(Hypoxia)을 개선하고 치료효율을 높이며, 종양 표적화에 의하여 부작용을 저감할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 DOX@HPBC 구성 및 이를 이용한 화학-PDT 작용 메커니즘의 개략도이다.
도 2는 Ce6 및 비오틴화된 PEG-결합 Hb 유도체의 특성화(A-E)를 나타낸 것이다. (A) Hb 및 그 유도체가 로딩된 전기영동된 아크릴아미드 겔에서 순차적인 요오드화바륨 및 쿠마시 블루 염색 (B) Ce6으로 변형된 Hb 유도체의 MALDI-TOF 스펙트럼. (C) Hb 유도체의 수용액의 제타 전위 및 시각적 외관. Ce6 이미지(침전)는 비교를 위해 표시(점선 테두리). (D) 1O2 생산 효율 및 (E) SOSG 시약의 형광 강도 및 DO 수준에 따라 각각 측정된 산소 방출 특성. (천연 Hb 및 비-Ce6 Hb 유도체와 비교하여 a p < 0.05 ; Ce6와 비교하여 b p < 0.05; PBS와 비교하여 c p < 0.05). (F-H) DOX 로딩 Hb NC의 특성화. (F) DLS 및 TEM 분석에 의해 각각 결정된 크기 분포 및 형태(배경사진). (눈금 막대의 길이는 200 nm) (G) 태아 소 혈청에서 DOX가 로딩된 Hb NC의 콜로이드 안정성 (H) DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 시험관 내 DOX 방출 프로필. pH 7.4, 6.8 및 5.5에서 방출된 DOX의 누적 양(%)은 배양 시간에 대해 표시됨. (pH 7.4와 비교하여 d p < 0.05; pH 6.8와 비교하여 e p < 0.05).
도 3은 DOX@HPBC의 비오틴 수용체 매개 세포 흡수를 나타내는 것이다. (A-D). (A) DOX, Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC와 배양 후 HeLa 세포의 CLSM 이미지. 유리 비오틴은 비오틴 수용체 상호작용에 대한 경쟁적 억제제로 채택됨, 4시간 인큐베이션 후, 세포에 30분 동안 660 nm 레이저(10 mW cm-2)를 조사함, 빨간색, 자홍색 및 파란색 신호는 각각 DOX, Ce6 및 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)의 형광 강도를 나타냄. 눈금 막대의 길이는 20μm. (B) 유세포 분석에 의해 HeLa 세포에서 평가된 DOX 로딩 Hb NC의 세포 흡수. (C) A549, MCF7 및 HCT116에서 유리 비오틴이 DOX@HPBC의 흡수에 미치는 효과. (D) 각 제형의 HeLa 스페로이드 침투 마젠타색과 빨간색은 각각 Ce6 및 DOX의 형광 강도를 나타냄, (Ce6과 비교하여 a p < 0.05; DOX@HPC와 비교하여, b p < 0.05; DOX@HPBC와 비교하여 c p < 0.05). (E-G) PEG화 Hb NC 처리에 의한 시험관 내 저산소증 완화. (E) 아조 절단된 HG 시약의 형광 강도를 측정한 유세포 분석. (F) 정상 산소 및 화학적으로 유도된 저산소 상태에서 배양된 HeLa 세포에서 각 제형과 천연 Hb이 HIF-1α 발현에 미치는 효과, 눈금 막대의 길이는 20μm. (G) 저산소 상태에서 DOX@HPC, DOX@HPBC 및 천연 Hb(DOX 1 μg mL-1 및 Hb 5 μg mL- 1)로 처리된 HeLa 세포에서 HIF-1α 및 MDR1 발현의 웨스턴 블롯 분석 .
도 4는 HeLa 세포에서 DOX@HPBC 매개 복합 화학 PDT의 세포 내 ROS 생성 및 상승적 항암 효과를 나타낸 것이다. (A-D). 세포내 ROS 생성 효율은 CLSM(A) 및 유세포 분석(B)을 사용하여 모니터링. 여기서 DCFH-DA 시약은 ROS 지표로 사용, 녹색 및 파란색 신호는 각각 DCF 및 DAPI의 형광 강도를 나타냄, (a p < 0.05, 각 레이저 무처리 대조군과 비교하여; Ce6 레이저 처리군과 비교하여 b p < 0.05; Ce6 + Hb 레이저 처리군과 비교하여 c p < 0.05; DOX@HPC 레이저 처리군과 비교하여 d p < 0.05). 눈금 막대의 길이는 20μm (C) 단층 배양 HeLa 세포에서 시험관 내 결합된 화학 PDT. 세포 생존율은 세포를 다양한 DOX 및 Ce6 농도(0.1-20 μg mL- 1)에서 72시간 배양한 Cell Counting Kit-8 분석에 의해 660 nm 레이저 처리(10 mW cm- 2)의 유무에 따라 평가, (D) 화학요법(레이저가 없는 약물 로딩된 NC), PDT(레이저가 있는 블랭크 NC) 및 화학-PDT(약물 로딩된 NC가 있는 레이저)의 조합 지수 프로파일. (E-F) HeLa 회전 타원체 모델에서 시험관 내 항종양 효능 평가, (E) 펠렛 배양 스페로이드는 제시된 일정에 따라 화학요법(레이저 없음) 또는 화학 PDT(레이저 포함)의 2주기를 받고, 7일째에 각 그룹의 상대 부피를 비교함. 각 그리드 내부에 위치한 회전 타원체 대표적인 이미지, 스케일 바의 길이는 500 μm. (F) 회전 배양된 HeLa 스페로이드를 화학-PDT 1주기로 처리하고 부피 변화를 7일 동안 모니터링, 눈금 막대의 길이는 200μm. (무처리와 비교하여 e p < 0.05; Ce6와 비교하여 f p < 0.05; DOX와 비교하여 g p < 0.05; DOX + Ce6와 비교하여 h p < 0.05).
도 5는 HeLa-tumor-xenograft 마우스 모델에서 평가된 DOX@HPBC의 생체 분포를 나타낸 것이다. (A) 주사 후 0, 2, 4, 6, 8 및 24시간 전신 스캐닝 (B) 24시간에 해부된 주요 장기 및 종양 조직에 대해 생체외 NIRF 이미징 (C) (B)의 방사 효율 값 (DOX@HPC과 비교하여 * p < 0.05) (D-F) 이소성 HeLa 이종이식 마우스에서 수행된 생체 내 항종양 효능 테스트. (D) DOX, DOX + Ce6(물리적 혼합물), DOX@HPC 또는 DOX@HPBC는 1일(레이저), 3, 5, 7일에 각각 5 및 5 mg kg-1의 DOX 및 Ce6 용량으로 정맥내 투여 후, 종양 부피 및 (E) 체중 (F) 15일째에 해부 후 종양 조직의 무게. (G-H) 종양의 저산소 영역으로의 DOX@HPBC 분포 및 화학-PDT 후 세포자멸사 단백질 확인. (G) 2회 화학 PDT(DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg- 1)를 투여한 HeLa 이종이식편 마우스에서 해부된 종양의 CLSM 관찰. (저산소증 추적을 위해 Pimonidazole을 정맥 주사, 빨간색: DOX, 녹색: 피모니다졸 항체, 파란색: DAPI) 눈금 막대의 길이는 50μm. (H) 무처리 그룹과 비교하여 세포자멸사 관련 단백질의 발현에서 평균 배수 변화를 보여주는 히트맵(Heatmap).
도 6은 동소 자궁경부암 모델에서 DOX@-HPBC 매개 화학-PDT 효과를 나타낸 결과이다. (A) 6회 화학-PDT(DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg-1) 후 25일째 절제한 HeLa 종양 외관 및 무게. (B) 치료 일정 전체에 걸친 체중 모니터링 결과. (C) 3회 화학요법(레이저 제외) 또는 화학-PDT(레이저 포함) 후 동소 HeLa 이종이식 마우스에서 해부된 종양 조직의 HIF-1α 웨스턴 블롯 분석. (D) 절개된 종양 조직에서 HIF-1α 및 MDR1 발현에 대한 IHC 염색. 눈금 막대의 길이는 200μm. (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001).
도 7은 동소 자궁경부암 모델에서 DOX@-HPBC 매개 화학-PDT 효과를 나타낸 결과이다. (A) 하부 몸통 및 절개된 자궁의 외관. (B) 6회 화학-PDT(DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg-1) 후 동소 이종이식 자궁경부 종양 보유 마우스에서 절제된 주요 기관 및 종양 조직에서 수행된 H&E 염색. (C) 3회 화학-PDT(DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg-1) 후 해부된 종양 조직의 TUNEL 염색. 눈금 막대의 길이는 200 μm.
고형 종양의 PDT 요법에서 저산소증에 의하여 치료효율이 낮아지는 문제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 강력한 산소 수송 능력을 갖는 헤모글로빈 기반의 나노클러스터를 연구하였다. 평균 직경이 6-8 μm인 RBC와 달리, 2개의 α- 및 2개의 β-글로빈 사슬로 구성된 헤모글로빈(Hb)은 성인 Hb 풀의 최대 98%를 차지하는 단일 Hb-A 분자는 직경이 약 5 nm에 불과하다. 본 발명자들은 이 나노크기의 단백질이 종양 조직에 침투하여 축적된 다음 산소 분자를 방출하여 종양 미세 환경의 저산소증을 개선할 수 있다고 가정하였다. 천연 Hb는 혈류에서 최대 0.5-1.5시간의 짧은 반감기를 나타내지만, 가교, 표면 변형, 중합, 캡슐화, 재조합 단백질 제조 등을 통해 이를 개선할 수 있는데, 그 중 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-접합 Hb 유도체를 약물과 흡착시켜 새로운 Hb 기반 화학 PDT 제제를 개발하는 과정에서 본 발명을 완성하였다.
도 1은 본 발명에 따른 DOX@HPBC 구성 및 이를 이용한 화학-PDT 작용 메커니즘의 개략도이다. Chlorin e6(Ce6)은 PDT에 대한 모델 광증감제로서 천연 Hb에 접합되었으며, 이는 안정성 및 종양 표적화를 향상시키기 위해 비오틴화된 PEG-MAL로 추가로 변형되었다. 또한 자궁경부 선암종을 비롯한 다양한 인간 암세포에서 나트륨 의존성 비타민 수송체가 과발현되는 것으로 확인되고 있기 때문에, 나트륨 의존성 비타민 수송체에 결합하는 비오틴을 이용함으로써 다양한 암세포를 표적화할 수 있다. 이렇게 제조된 Hb 유도체인 Hb-PEG-비오틴-Ce6(HPBC)에 단백질 결합을 통해 독소루비신(DOX)이 도핑되도록 하여 자가 조립 기전으로 DOX가 로딩된 HPBC NC(DOX@HPBC)를 제조하였다. 상기 DOX가 로딩된 HPBC NC(DOX@HPBC)은 이소성 자궁경부암 보유 마우스를 포함한 다양한 실험 모델에서 물리화학적 특성, 종양 표적화성, 치료 효능 및 안전성 측면에서 평가되었으며, DOX@HPBC의 산소 운반 능력에 의한 저산소증의 해결을 통해 구조가 화학 PDT에 대한 종양 반응이 개선됨을 입증하였다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 산소 운반 광감작제로서의 헤모글로빈( Hb ) 유도체 제조>
Hb의 저산소증 완화 효과를 가장 잘 활용하기 위해 Hb 분자가 PDT와 산소 공급을 시간적, 공간적으로 공동 국소화하는 광증감제 자체의 역할을 해야 한다. 따라서 Hb를 아미드 결합 형성을 통해 Ce6으로 화학적으로 변형된 Hb-Ce6(HC)을 제조했다.
1.1 Hb 유도체의 제조
Hb 유도체의 제조를 위하여 인간 헤모글로빈(Hb), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 클로린 e6(Chlorin e6, Ce6)는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 입수하였다. 이후 사용되는 바이오틴화 PEG 5000 말레이미드(비오틴-PEG-MAL) 및 메톡시 PEG 5000 말레이미드(mPEG-MAL)는 JenKem Technology USA(미국 텍사스주 플라노)에서 구입했으며, SOSG(Singlet Oxygen Sensor Green) 시약(S36002) 및 유세포 분석용 Hypoxia Green 시약(H20035)은 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였고, 독소루비신(DOX)은 LC Laboratories(Woburn, MA, USA)에서 입수했다. 그 외 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산 및 페니실린/스트렙토마이신 등은 Gibco Life Technologies, Inc.(Carlsbad, CA, USA)에서 구하였다.
Hb-Ce6 (HC)의 제조를 위해, 클로린 e6(Chlorin e6, Ce6) 1 mmol, 1-에틸-3-(3디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC) 3 mmol 및 (N-hydroxysuccinimide, NHS) 4 mmol을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 상기 용해된 혼합물을 이중-탈이온수(DDW)에 용해된 Hb에 Hb : Ce6의 몰비가 1:12가 되도록 첨가하였다. EDC 및 NHS는 Hb에 Ce6이 결합하는 것을 돕는 크로스링커 (zero-length cross-linker)로 사용되었다. 이후, 반응 혼합물을 12시간 동안 교반하고 6-8kDa의 분자량 컷오프(MWCO) 투석막을 사용하여 24시간 동안 DDW에서 투석하여 반응 부산물과 DMSO를 제거하였다. 이후 투석물을 동결 건조하여 HC를 얻었고, 추가 실험을 위해 -80ºC에서 보관하였다.
Hb-PEG-Ce6 (HPC) 및 Hb-PEG-biotin-Ce6 (HPBC)는 mPEG-MAL 및 biotin-PEG-MAL을 각각 HC 반응 혼합물에 Hb : PEG 몰비가 1:4로 추가하는 것을 제외하고는 상기 HC의 제조와 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. Hb-PEG (HP) 및 Hb-PEG-biotin (HPB)는 활성화된 Ce6 용액을 첨가하지 않고 각각 HPC 및 HPBC를 제조하는 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
1.2 Hb 유도체의 특성 확인
12% 겔을 사용하여 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 Ce6 및 PEG 접합을 평가하였다. Hb 및 유도체(HC, HP, HPC, HPB 및 HPBC)를 120V에서 140분 동안 전기영동하고, 5% 염화바륨에 10분 동안 젤을 담군 후, 0.05M 요오드로 5분 동안 염색하였다. 이후, PEG 검출을 위해 물로 탈색하여 BaI2 염색을 수행하였다. 그리고 순차적으로 동일한 겔에 쿠마시 블루 염색을 수행하여 단백질을 검출하고 그 결과를 도 2A에 나타내었다.
도 2A에서 보는 바와 같이, Hb 유도체 HP, HPC, HPB 및 HPBC의 PEG화는 전기영동된 겔 샘플의 PEG 및 단백질 염색에 의해 확인되었다. 쿠마시 블루 염색의 경우 새로운 단백질 밴드가 PEG화된 샘플 레인에서만 20-25kDa 및 35-48kDa위치에서 나타났으며, 이 밴드는 PEG 분자의 존재를 나타내는 바륨 요오드화물 염색 양성이었다. β-글로빈(~16 kDa) 및 PEG 시약(~5 kDa)의 분자량을 고려할 때, 해당 밴드는 각각 β-PEG 단량체 및 α/β-PEG 이량체로 해석할 수 있다. 이러한 결과는 도 2B에 나타낸 바와 같이, 매트릭스 보조 레이저 탈착 및 이온화 시간 비행 질량 분석기(MALDI-TOF MS) 분석으로 확인할 수 있었으며, 여기서 β-PEG 단량체 피크는 PEG화된 Hb 유도체에서만 관찰되는 것을 확인하였다. 약 22,000의 질량 대 전하 비율은 각 β-글로빈 단위가 1:1 몰비로 PEG 분자와 접합되었음을 나타낸다. 또한, Ce6과 PEG의 접합은 Hb 분자의 제타 전위를 변경하였다(도 2C). 모든 Ce6로 변형된 Hb 유도체는 상응하는 대조군보다 더 음전하를 띠었으며, 이는 Ce6 분자의 유리 카르복실레이트 그룹 때문일 가능성이 있다. 또한, PEG화된 것들은 변형되지 않은 것들에 비해 감소된 제타 전위를 나타내었는데, 이는 PEG 분자의 차폐 효과때문일 수 있다.
Hb 유도체의 일중항 산소(1O2) 생산 효율은 SOSG(Singlet Oxygen Sensor Green) 시약(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 평가하여 도 2D에 나타내었다. Ce6, HC, HPC 및 HPBC를 SOSG 용액과 혼합하여 최종 Ce6 농도가 1㎍ mL-1이 되도록 하였으며, 샘플에 17.5 mW cm-2의 강도로 레이저(660 nm)를 조사하였다. SOSG 엔도퍼옥사이드의 형광 강도는 마이크로플레이트 리더(Infinite 200; Tecan Inc., Mnnedorf, Switzerland, 여기 및 방출 파장 각각 510 및 560 nm)를 사용하여 0, 10, 20, 30, 40 및 60분에 측정하였다. 레이저 조사의 음성 대조군으로 Hb, HP 및 HPB도 동일한 프로토콜을 사용하여 측정하였다.
도 2D에서 보는 바와 같이, HPC와 HPBC는 660nm 레이저 조사에서 HC보다 훨씬 더 높은 수준의 1O2를 생성했다(p < 0.001). 이 결과는 HC의 PEG화가 콜로이드 불안정성에 의해 유도된 자가 소광을 완화할 수 있음을 의미한다. 1 μg mL-1에서 유리 Ce6가 10분까지 가장 높은 1O2 생산 효율을 나타내었지만, 20분 내에 포화가 관찰되었으며, 생체 내 투여에 필요한 더 높은 농도에서는 적절한 가용화제 없이 Ce6 자체가 침전되었다(도 2C 삽입도면).
또한, Hb 유도체의 산소 방출 특성은 산소 충전 후 수성 매체에 투여할 때 용존 산소(DO) 수준의 변화를 모니터링하여 확인하였다. 인산염 완충 식염수(PBS; 25mL)를 질소 가스로 10분 동안 퍼지하고 탈산소화를 위해 밀봉하고, PBS, Ce6, Hb, HC, HPC 및 HPBC(5 mg Hb mL-1)를 1분 동안 산소 가스로 버블링한 다음, 주사기를 사용하여 탈산소화된 PBS에 주입했다. 이후, 용존 산소 측정기(YK-2001-PHA; Lutron, Coopersburg, PA, USA)를 사용하여 용존 산소 수준을 모니터링했다(도 2E). 종양의 핵심 영역에 있는 산소 부분압이 약 0.52mmHg(즉, 0.89mg L-1)이므로 배지의 초기 DO 수준은 종양 저산소증을 시뮬레이션하기 위해 <0.9mg L-1로 설정하였다. 도 2E에서 보는 바와 같이, 모든 Hb 유도체는 250초 내에 DO 수준을 2 mg L-1 이상으로 증가시켰으며, 이는 변형되지 않은 Hb에 필적할만한 산소 방출 프로파일을 보여주는 것이다. 따라서 상기 제조된 광증감성 Hb 유도체는 전체적으로, 천연 Hb의 산소 운반 능력을 손상시키지 않으면서 성공적으로 제조된 것을 확인하였다.
< 실시예 2. DOX 흡착된 안정적인 헤모글로빈 나노클러스터( Hb NCs )의 제조>
2.1 DOX 흡착 Hb NCs의 제조
DOX가 로딩된 Hb NC는 최소량의 유기 용매를 사용하여 제조되었다. DMSO에 용해된 DOX(기본 형태; 3mg) 및 DDW에 있는 Hb 또는 Hb 유도체(5mg)를 5분 동안 볼 밀링하였으며, 생성된 혼합물을 DDW로 10배 희석하고 동결건조한 다음 DDW로 재구성하고 주사기 필터(공극 크기 0.45μm)로 여과하여 DOX가 로딩된 Hb NC인 DOX@Hb, DOX@HC, DOX @HPC 및 DOX@HPBC를 제조하였다.
2.2 DOX 흡착 Hb NCs의 특성 확인
NC의 평균 직경 및 제타 전위 값은 Zetasizer Ultra(Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여 평가되었다. DOX 흡착 효율은 NC 현탁액을 DMSO로 20배 희석한 UV-Vis 분광광도계(Multiskan Go; Thermo Scientific)를 사용하여 평가했으며 흡광도 값은 485 nm에서 측정되었다. NC의 형태는 투과 전자 현미경(TEM; Talos L120C; FEI, Hillsboro, OR, USA)을 사용하여 관찰되었다. 샘플을 200 메쉬 탄소 코팅된 구리 그리드에 놓고 우라닐 아세테이트로 음성 염색했다. NC의 평균 직경 및 제타 전위 값은 Zetasizer Ultra(Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여 평가하여 표 1 및 도 2F에 나타내었다.
Composition Mean diameter
[nm] 		Polydispersity index Zeta potential
[mV] 		DOX adsorption efficiency [ % ] a)
DOX@Hb 167.4 ± 2.1 0.17 ± 0.03 -52.03 ± 1.12 40.58 ± 0.29
DOX@HC 210.8 ± 2.1 0.26 ± 0.01 -46.63 ± 5.50 45.96 ± 0.09
DOX@HPC 222.3 ± 2.9 0.27 ± 0.01 -43.03 ± 0.61 53.32 ± 0.20
DOX@HPBC 217.1 ± 2.6 0.28 ± 0.02 -40.93 ± 1.47 59.95 ± 5.78
결과는 평균 ± 표준편차(n = 3)로 표시. a) DOX 흡수 효율 (%) = (NCs 내의 DOX 실제 포함량) × 100 / (NCs 내의 DOX의 이론적 포함량)
표 1 및 도 2F에서 보는 바와 같이, 소수성 모델 약물인 독소루비신(DOX)은 새로운 단백질 결합 방법인 볼 밀링 기술을 사용하여 소수성 상호 작용을 통해 Hb 유도체에 흡착되어 효율적인 약물 로딩 메커니즘 역할을 할 뿐만 아니라 단백질 분자의 자가 조립을 유도하여 수성 환경에서 안정적인 형태의 Hb NC를 형성하는 것을 확인하였다. DOX@Hb, DOX@HC, DOX@HPC 및 DOX@HPBC를 포함한 DOX가 로딩된 Hb NC는 다분산 지수 (polydispersity indices) 0.3 미만의 좁은 사이즈 분포를 가지며 230 nm 미만의 평균 유체역학적 직경을 나타냈다. 또한 동적 광산란(DLS) 분석을 통해 NC가 음수의 제타전위를 갖고 있어, NC가 정맥내 투여에 적합할 수 있음을 보여주었다. 그러나 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰한 결과 도 2F(배경사진)에서 보는 바와 같이, PEG화된 DOX@HPC 및 DOX@HPBC만이 균일한 구형 형태를 나타내어, 단백질 백본의 PEG화가 안정적인 Hb NC 형성에 필수적임을 암시하였다.
또한, DOX@HPC 및 DOX@HPBC는 모두 초기 입자 크기를 최대 12시간까지 유지한 반면, DOX@Hb 또는 DOX@HC는 각각 혈청 또는 약산성 인산완충식염수(PBS)와 혼합 시 거의 즉각적인 입자 크기 상승을 나타내었다(도 2G). 혈청 및 높은 이온 강도 조건에서 수행된 안정성 테스트에서 유사한 경향이 발견되었다. 따라서, 표 1에서와 같이, 4가지 유도체 모두 >40%의 높은 DOX 흡착 효율을 나타내었으나, PEG화되지 않은 Hb NC는 안정성 문제의 확인이 더 이루어질 필요가 있다.
2.3 DOX 흡착 Hb NCs의 DOX 방출 특성 확인
DOX가 로딩된 Hb NC의 콜로이드 안정성은 생리학적으로 관련된 조건에서 평가되었다. FBS 또는 PBS(pH 5.5, 6.8 및 7.4)에 분산된 NC를 진탕 수조(50rpm; 37℃)에서 Zetasizer Ultra(Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여 배양하였다. 평균 직경을 0, 1, 4, 8 및 12시간에 모니터링했다.
DOX@HC, DOX@HPC 및 DOX@HPBC로부터의 DOX 방출은 투석 방법을 사용하여 평가되었다. NP 현탁액의 분취량(150 μL)을 미니-GeBAflex 튜브(MWCO: 6-8 kDa; Gene Bio-Application Ltd., Yavne, Israel)에 로딩하고 이형 매체(2 mL, pH 5.5의 PBS, 6.8 및 7.4)에서 이머징하였다. 인큐베이션은 진탕 수조(50 rpm; 37 °C)에서 수행되었고 NC가 채워진 튜브는 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 및 120시간에 새로운 배지로 채운 새 용기에 옮겨졌다. 배지에서 방출된 DOX의 양은 Kinetex C18 컬럼(4.6 mm × 250 mm, 5 μm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)으로 결정하였다. 이때, 이동상은 인산칼륨 완충액(5mM; pH 2.5) 및 0.1%(v/v) 트리에틸아민(70:30, v/v)이 포함된 아세토니트릴로 구성되었다. DOX의 검출 파장과 유속은 각각 486 nm와 1.0 mL min-1이었으며, 컬럼 온도와 주입 부피는 각각 35ºC 및 20μL이었다.. 머무름 시간과 총 실행 시간은 각각 4.6분과 8.0분이었다. 누적 방출(F; %)과 배양 시간(t) 사이의 관계는 0차, 1차, Higuchi, Korsmeyer-Peppas 및 Peppas-Sahlin 모델을 사용하여 피팅되었으며, 방정식은 다음과 같습니다. :
영차 모델: F=k0·t
1차 모델: F=Fmax·(1-e-k·t)
히구치 모델: F=kH·t0.5
Korsmeyer-Peppas 모델: F=kKP·tn
페파스-살린 모델: F=k1·tm+k2·t2m
여기서 Fmax는 최대누적방출량, k0, k, kH, kKP, k1, k2, m은 해당 모델의 상수이다.
PEG화 Hb NC의 DOX 방출 패턴은 다양한 pH 조건에서 평가하여 도 2H에 나타내었다. 도 2H에서 보는 바와 같이, DOX@HPC와 DOX@HPBC는 모두 최대 120시간까지 pH 의존적인 방식으로 DOX를 방출했다. DOX 방출은 pH 7.4(p < 0.05)와 비교하여 pH 5.5 및 6.8에서 촉진되었으며, 이는 산성 pH에서 DOX의 용해도가 증가하여 약물과 Hb NC 사이의 소수성 상호작용이 감소했기 때문일 수 있다. 5.5, 6.8 및 7.4의 pH 값은 각각 엔도리소좀, 종양 미세 환경 및 혈액 구획(또는 정상 조직)을 나타내므로 산성 조건에서 더 높은 약물 방출은 정상보다 종양 조직에서 DOX 노출을 증가시킬 가능성이 있다. PEG화된 Hb NC의 약물 방출 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 표 2와 같이 수학적 모델 피팅을 수행했다. 특히, 두 제형 모두에서 1차 동역학은 모든 테스트된 조건(R2 > 0.995)에서 가장 높은 결정 계수를 보여 이전에 J. E. Schiel등(2009)이 보고한 단백질 결합 약물의 해리 모델과도 잘 일치하였다.
Model Zero-order First-order with F max Higuchi Korsmeyer - Peppas Peppas - Sahlin
pH R 2 k 0 R 2 k F max R 2 k H R 2 k KP n R 2 k 1 k 2 m
DOX@HPC
5.5 0.851 0.525 0.996 0.061 46.23 0.946 5.135 0.960 8.387 0.384 0.987 4.944 -0.127 0.663
6.8 0.893 0.354 0.998 0.044 32.35 0.968 3.406 0.972 4.236 0.448 0.992 2.310 -0.041 0.734
7.4 0.914 0.280 0.997 0.039 25.94 0.979 2.671 0.981 3.038 0.470 0.994 1.743 -0.029 0.729
DOX@HPBC
5.5 0.861 0.443 0.995 0.053 39.52 0.949 4.299 0.958 6.164 0.415 0.985 3.452 -0.073 0.705
6.8 0.937 0.270 0.999 0.029 26.73 0.985 2.540 0.984 2.129 0.542 0.997 1.051 -0.011 0.833
7.4 0.932 0.218 0.998 0.033 20.85 0.985 2.061 0.985 2.003 0.507 0.996 1.146 -0.016 0.757
< 실시예 3. DOX@HPBC의 비오틴 수용체 매개 세포 흡수>
DOX@HPBC의 세포 흡수 메커니즘은 비오틴 수용체 양성 인간 자궁 경부 선암종 세포주인 HeLa에서 평가되었다. Hb NC의 세포 흡수는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 HeLa 및 HCT116에서 평가되었다. HeLa 및 HCT116 세포(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 각각 FBS(10%, v/v), penicillin(100 units mL-1) 및 streptomycin(100 μg mL-1)을 함유한 DMEM 및 RPMI로 37°C에서 5% CO2 대기 및 95% 상대 습도에서 배양하였다. 세포를 각각 50μg mL-1 및 10μg mL-1의 DOX 및 Ce6 농도에서 DOX, Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC와 함께 배양했다. 세포에 660 nm 레이저(10 mW cm- 2)를 30분 동안 조사하였고, 총 배양 시간은 5시간이었다. DOX@HPBC의 세포 흡수에서 비오틴 수용체의 관련성은 경쟁적 억제제로서 유리 비오틴(2mM)의 전처리 및 공동 처리를 적용하여 평가되었다. CLSM 관찰을 위해 세포를 4%(v/v) 포름알데히드 용액으로 고정하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 포함하는 변색 방지 마운팅 배지로 염색했다. DOX, Ce6 및 DAPI의 형광 신호는 LSM 5 LIVE(Carl-Zeiss, Thornwood, NY, USA)를 사용하여 관찰되었다.
Hb NC의 세포 흡수 효율은 유세포 분석을 사용하여 정량적으로 분석되었다. HeLa 세포는 37°C에서 1시간 또는 4시간 동안 10μg mL-1의 Ce6 농도에서 Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC와 함께 (웰당 6.0 × 105 세포) 배양되었다. 상기 CLSM 연구에서 관찰된 경쟁 억제를 확인하기 위해 유리 비오틴(2mM)의 전처리 및 동시 처리도 수행했다. Ce6의 형광 강도는 유세포 분석기(FACS Canto™ II; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 흡수 억제 연구는 동일한 처리 일정으로 A549(비오틴 수용체 양성), MCF7(양성) 및 HCT116(음성)을 포함한 다른 세포주에서도 수행되었다. A549 및 MCF7 세포(한국 세포주 은행)는 5% CO2 대기 및 95℃에서 FBS(10%, v/v), 페니실린(100units mL-1) 및 스트렙토마이신(100μg mL- 1)을 함유하는 RPMI로 37℃에서 상대 습도 %에서 배양하였다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 통하여 DOX@HPBC가 DOX보다 세포에 더 효율적으로 흡수되는 것을 확인하였다.
도 3A에서 보는 바와 같이, DOX@HPBC은 DOX@HPC 또는 약물을 포함하지 않은 용액보다 세포로 더욱 잘 흡수되었다. 흥미롭게도 DOX@HPBC의 세포 흡수는 동족 수용체에 대한 경쟁적 억제제인 유리 비오틴의 공동 처리에 의해 억제되었다. 이를 유세포 분석을 통해 정량적으로 확인한 결과(도 3B), DOX@HPBC의 세포 흡수 효율이 유리 Ce6 및 DOX@HPC보다 각각 1.37배 및 1.14배 높았다. 그러나 유리 비오틴으로 처리한 경우, 30.3% 유의하게 감소하였다(p < 0.05). 이러한 결과는 A549(인간 폐 선암종) 및 MCF7(인간 유방 선암종)을 포함한 다른 비오틴 수용체 양성 세포주에서도 유사하게 나타났으나, 비오틴 수용체 음성인 인간 결장직장암 세포주인 HCT116에서는 DOX@HPBC의 개선된 흡수 효율이나 유리 비오틴에 의한 경쟁적 억제가 관찰되지 않았다(도 3C).
DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 침투 효율은 HeLa 스페로이드에서 평가되었다. 도 3D에서 보는 바와 같이, DOX@HPC 및 DOX@HPBC는 DOX 및 Ce6 용액보다 실질적으로 개선된 회전 타원체 침투를 나타냈고, 유리 비오틴은 DOX@HPBC 침투를 방해했는데, 이는 위의 세포 흡수 결과와 잘 일치한다.
< 실시예 4. PEG화 Hb NC 처리에 의한 시험관내 저산소증 완화>
종양 내 저산소증은 산소 가용성을 낮추어 PDT 효능을 감소시킬 뿐만 아니라 MDR1의 과발현을 통해 HIF-1α 매개 화학 저항성을 유발한다. 이러한 관점에서 본 발명자들은 저산소 상태에서 배양된 HeLa 세포에서 저산소 수준을 감지하는 저산소증 프로브인 Hypoxia Green(HG) 시약(Thermo Fisher Scientific)을 추적하고 HIF-1α 및 MDR1를 포함한 저산소증 관련 단백질의 발현 수준을 측정하여 PEG화 Hb NC의 저산소증 완화 효과를 평가했다.
HeLa 세포를 6웰 플레이트에 웰당 5.0 × 105개의 세포로 시딩하고 37°C에서 24시간 동안 배양했다. 세포를 두 그룹으로 나누고 각각 정상산소(21% O2) 및 저산소증(1% O2) 조건에서 추가로 24시간 동안 배양했다. 저산소 분위기는 저산소 챔버(Billups-Rothenberg, Inc., Del Mar, CA, USA)를 사용하여 유지되었으며, 1% O2 및 5% CO2 함유 질소 가스 혼합물이 공기 압력 및 4분 동안 각각 20L min-1 20psi의 유속으로 도입되고 저산소 상태의 세포는 300 μg mL-1의 Hb 농도에서 HPC 또는 HPBC로 처리되었다. 세포를 4시간 동안 추가로 인큐베이션하고 Hypoxia Green 시약으로 처리했다. 시약의 형광 강도는 유세포 분석기(FACS Canto™ II; BD Biosciences)를 사용하여 인큐베이션 2시간 후에 측정되었다.
HIF-1α의 면역형광 염색은 화학적으로 유도된 저산소증 모델에서 수행되었으며, 여기서 HeLa 세포는 정상산소 조건에서 염화코발트(CoCl2) 또는 데스페리옥사민(DFO)으로 24시간 처리되었다. Hb, HPC, HPBC, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC(DOX로 50μg mL-1 및 Hb로 200μg mL- 1)를 세포와 함께 4시간 동안 배양한 다음 메탄올로 5분 및 밤새 고정했다. Alexa Fluor® 488 항-HIF-1α 항체(ab190197; Abcam, Cambridge, MA, USA)와 함께 4℃에서 배양. 세포 핵은 CLSM 이미징 전에 DAPI로 염색되었다(LSM 5 LIVE, Carl-Zeiss).
HeLa 세포의 CoCl2 유도 저산소증 모델에서 HIF-1α, MDR1 및 β-액틴 발현의 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 유리 Hb, DOX@HPC 및 DOX@HPBC(Hb로서 5μg mL- 1)를 4시간 동안 세포에 투여했다. 세포 용해물은 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 포함된 RIPA 완충액을 사용하여 제조하고 SDS-PAGE를 통해 전기영동했다. 겔 이동 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인은 1차 항체(항-HIF-1α: ab82832, Abcam; 항-MDR1: sc-55510, Santa Cruz Biotechnology; 및 항-β 액틴: ab8226, Abcam) 및 염소와 함께 배양되었다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-토끼 이차 항체(1662408EDU; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Image J 소프트웨어(US National Institutes of Health; Bethesda, MD, USA)를 사용하여 Densitometric analysis를 수행하였고, 각 단백질의 상대적 발현은 β-actin으로 normalized하였다.
도 3E에서 보는 바와 같이, 저산소증 처리에서 아조 절단(즉, 감소된) HG 시약의 상대 형광 강도는 HPC 및 HPBC 처리에 의하여 처리되지 않은 세포와 비교하여 각각 61.0 ± 1.2% 및 52.7 ± 0.6%(p < 0.001)(cf. 정상 산소 상태에서 배양된 세포의 경우 27.0 ± 0.5%)저로 감소하였다. 즉, 산소증(1% O2) 하에서 HPC 및 HPBC 처리가 암세포의 저산소증을 효과적으로 개선한다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 도 2E에서 확인한 바와 같이, 천연 Hb에 필적하는 HPC 및 HPBC의 산소 방출 능력에 기인할 수 있다.
HIF-1α 발현 수준은 PEG화 Hb NC를 처리한 후 면역조직화학(IHC)에 의해 염화코발트 및 데스페리옥사민(DFO)에 의해 유도된 화학적 저산소증 모델에서 모니터링되었다. 도 3F에서 보는 바와 같이, 핵 영역의 HIF-1α 수준이 정상 Hb 모델과 비교하여 CoCl2 유도 및 DFO 유도 저산소증 모델에서 각각 현저하게 증가되었으며, 이는 PEG화 Hb NC 및 천연 Hb의 처리에 의해 완전히 역전되었다. Western blot 분석은 HIF-1α/MDR1 발현이 정상산소 상태에 비해 저산소 상태에서 각각 2.9/1.8배 증가했음을 확인하였다(도 3G). 이때, DOX@HPC 및 DOX@HPBC를 처리하는 경우 HIF-1α/MDR1의 발현이 각각 1.9/1.3배 및 1.2/1.0배로 감소했다. 상기와 같은 결과는 PEG화 Hb NC가 산소 분자를 전달하여 종양 저산소증을 개선할 수 있다는 우리의 가설을 강력히 뒷받침한다.
< 실시예 5. Chemo -PDT 병합에 의한 효율적인 세포내 ROS 생성 및 시너지 효과>
먼저, HeLa 세포에서 PEG화 Hb NC의 ROS 생성 효율을 측정했으며, 여기서 디클로로다이하이드로프루오레세인 디아세테이트(dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)는 세포 내 ROS 지표로 사용되었다. ROS 생성은 CLSM을 사용하여 저산소 상태에서 배양된 HeLa 세포에서 평가되었다. 세포(웰당 1.5 × 105개 세포)를 유리 Ce6, Ce6과 Hb의 물리적 혼합물(Ce6 + Hb), HPC 또는 HPBC(Ce6로 10μg mL-1 및 Hb로 200μg mL- 1)로 처리했다. 24시간 동안 디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 660 nm 레이저 조사(10 mW cm-2) 1분 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, LSM 5 LIVE(Carl-Zeiss)를 사용하여 관찰하였다. 세포내 ROS 생성량은 유세포분석기(FACS Canto™ II; BD Biosciences)를 이용하여 정량하였으며, 실험 조건은 HeLa세포가 각 웰당 5.0 × 105개, Ce6의 농도 1μg mL-1, Hb 유도체/DCFH-DA의 배양 시간 4h, 1h을 제외하고는 상기와 동일하였다.
도 4A에서 보는 바와 같이, CLSM 관찰 결과, HPC와 HPBC 모두 660 nm 레이저 조사 시 Ce6 용액에 비해 더 높은 디클로로플루오레세인(DCF) 형광을 나타냈다. 도 4B의 유세포 분석에 의한 정량화 결과는 DCF 형광 강도가 Ce6 용액 그룹(p < 0.05)에 비해 HPC(11.2배) 및 HPBC(16.1배) 그룹에서 유의하게 높아 상기 결과를 뒷받침한다. Ce6 및 Hb 물리적 혼합물(Ce6 + Hb) 그룹은 CLSM 분석에서 형광 신호의 눈에 띄는 향상 없이 Ce6 용액 그룹보다 2.9배만 증가(도 4B)했다. 이러한 결과는 주로 Hb 백본의 산소 공급 능력보다 PEG화된 Hb NC의 개선된 세포 흡수 효율에 기인한 것으로 사료되며(도 3A), 대체로 HPC와 HPBC 모두 ROS를 보다 효율적으로 생성하여 Ce6 자체보다 향상된 PDT 효능을 나타낼 것을 예상할 수 있다.
시험관 내 화학 PDT 효능을 추가로 조사하기 위해 개발된 각각의 제형을 HeLa 세포에 처리하고 레이저 조사의 유무에 따라 세포 생존율을 평가하였다. 도 4C에서 보는 바와 같이, Hb 및 PEG의 생체 적합성 특성에서 예상되듯, 약물을 담지하지 않은 PEG화된 Hb NC는 생리학적으로 적절한 농도에서 레이저 처리 없이 무시할 수 있는 세포독성을 나타냈다. 레이저 처리로 약물을 담지하지 않은 HPC 및 HPBC NC는 배양 72시간에서 유리 Ce6와 비교하여 절반인 3.74 ± 0.03 및 4.30 ± 0.53 μg mL-1의 최대 억제 농도(IC50)를 각각 나타내었다(표 3).
Laser irradiation Intervention Formulation IC50 values (unit: μg mL -1 )
24 h 48 h 72 h
Without laser Chemotherapy DOX + Ce6 131.02 ± 16.35 18.65 ± 1.77 10.47 ± 1.25
DOX@HPC 17.14 ± 1.74 6.59 ± 0.54 3.89 ± 0.49
DOX@HPBC 32.83 ± 7.48 12.94 ± 5.31 4.09 ± 0.52
With laser PDT Ce6 3.11 ± 0.45 3.32 ± 0.39 5.30 ± 0.18
HPC 1.94 ± 0.59 1.83 ± 0.39 3.74 ± 0.03
HPBC 1.74 ± 0.09 2.42 ± 0.27 4.30 ± 0.53
Chemo-PDT DOX + Ce6 3.46 ± 0.11 2.94 ± 0.41 2.10 ± 0.02
DOX@HPC 0.56 ± 0.03 0.63 ± 0.02 0.52 ± 0.01
DOX@HPBC 0.52 ± 0.03 0.58 ± 0.07 0.55 ± 0.03
약물 로딩 후, DOX@HPC 및 DOX@HPBC는 레이저 노출 없이 각각 3.89 ± 0.49 및 4.09 ± 0.52 μg mL-1의 IC50 값을 나타내었으며, 이 값은 DOX 및 Ce6 물리적인 혼합물(DOX + Ce6; 10.47 ± 1.25μg mL-1)(p < 0.05)값보다 2.5배 이상 낮았다. 주목할 만한 점은 DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 치료 효능이 레이저 치료의 존재하에 현저하게 향상되어 IC50 값(각각 0.52 ± 0.01 및 0.55 ± 0.03 μg mL- 1)에서 레이저 조사(2.10 ± 0.02 μg mL- 1)를 사용한 DOX + Ce6 혼합물 요법과 비교(p < 0.05)하여 약 4배 감소를 나타냈다는 것이다. 실제로, 두 제형은 72시간의 배양 후 모든 효과 수준(즉, 부분 세포 성장 억제) 내에서 조합 지수 값이 0.7 미만으로 유지되면서 화학요법과 PDT 사이에 중간 내지 강한 상승작용을 나타냈다(그림 4D). 배양 24시간 및 48시간 후 세포 생존율 프로파일에서 유사한 패턴이 관찰되었지만, DOX@HPBC만이 모든 테스트 조건에서 상승 효과를 보이는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 세포 흡수 효율 향상 등의 효과에 의한 것으로 사료된다.
< 실시예 6. HeLa 스페로이드의 시험관 내 항종양 효능>
본 발명의 PEG화 Hb NC의 시험관 내 항종양 효능은 단층 배양 모델보다 병태생리학적으로 더 관련된 HeLa 스페로이드 모델에서 조사되었다. HeLa 세포(접시당 2.5 × 106 세포)를 3D 세포 배양 접시(LabToLab, 대전, 한국)(펠렛 배양)에서 배양하였고, 여기서 HeLa 스페로이드는 24시간 내에 자발적으로 형성되었다. 2일과 4일에 유리 DOX, 유리 Ce6, DOX + Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC(DOX 2μg mL-1 및 Ce6 2μg mL-1에 해당)를 처리하고 24시간 동안 인큐베이션했다. 세포에 660 nm 레이저(10 mW cm- 2)를 3일과 5일에 1시간 동안 조사했다. HeLa 스페로이드의 형태를 Axiovert 25 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 1일과 7일에 관찰했다. 회전 타원체 부피(V, mm3)는 다음 공식으로 계산되었다. V = 0.5 × 가장 긴 직경 × (최단 직경)2.
세포 흡수 연구에 사용된 다른 HeLa 회전 타원체 모델(방적 배양)에서 항암 효과가 확인되었다. 회전 타원체의 직경이 약 65-70 μm에 도달한 후 유리 DOX, 유리 Ce6, DOX + Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC(DOX의 1 μg mL-1 및 Ce6의 1 μg mL-1에 해당)가 투여하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포에 660nm 레이저(10mW cm-2)를 1시간 동안 조사했습니다. HeLa 회전 타원체의 형태는 Axiovert 25 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 일주일 동안 매일 관찰되었다. 회전 타원체 부피는 위의 동일한 공식으로 계산되었다.
먼저 펠릿 배양 모델에서 스페로이드 성장에 대한 화학 PDT 효과를 평가했다. 도 4E에서 보는 바와 같이, 단층 모델에서 얻은 세포독성 프로파일에서 예상한 대로, DOX@HPC 및 DOX@HPBC 모두 레이저 조사의 유무에 관계없이 DOX 또는 Ce6 단독 요법과 비교하여 회전 타원체 성장을 효과적으로 억제했다(p < 0.05). 흥미롭게도 DOX@HPBC만이 DOX + Ce6(물리적 혼합물; 결합 화학 PDT)(p < 0.05)보다 현저히 높은 치료 효능을 나타냈으며, 이는 더 높은 세포 흡수 및 세포내 ROS 생성 효율 때문인 것으로 사료된다. 그러나 도 4F에서 보는 바와 같이, 펠릿 배양 모델보다 더 큰 크기(~500μm)의 스페로이드를 제공할 수 있는 회전 배양 모델을 사용하여 수행된 유사한 실험에서 Ce6 단독처리를 제외한 DOX, DOX + Ce6, DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 모든 그룹에서 실질적인 회전 타원체 성장 억제 효과를 나타냈다(p < 0.05). 이는 큰 회전 타원체에서 유리 Ce6의 조직 침투가 제한되기 때문으로 사료되며, 광증감제의 조직 침투가 성공적인 PDT에 필수적임을 시사한다. DOX 단독 요법의 경우, 시험관 내에서 회전 타원체 부피를 유의하게 감소시켰지만, DOX는 약동학적 특성이 좋지 않은 것 알려져 있어 생체 내에서 추가 평가가 필요했다.
< 실시예 7. DOX@HPBC의 생체내 생체분포 및 항종양 효능>
본 발명에 따른 PEG화 Hb NC의 생체 분포는 근적외선 형광(NIRF) 이미징을 통해 평가되었다. 이때 NC는 Cy5.5 태그된 HPC 및 HPBC(Cy5.5로, 단백질 mg당 각각 1.29 ± 0.04 및 1.29 ± 0.02 μg)로 제작되었으며, 이소성(우측 상부 옆구리) HeLa-이종이식 마우스에 정맥내 투여되었다. DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 생체 분포는 HeLa 종양의 종속 이식이 있는 마우스 모델에서 평가되었다. HeLa 세포(5.0 × 105 세포)를 마우스의 오른쪽 위 옆구리 부위에 피하 주사했다. 종양 부피(V, mm3)는 다음 공식으로 계산되었습니다. V = 0.5 × 가장 긴 직경 × (가장 짧은 직경)2. 평균 종양 부피가 약 150 mm3에 도달했을 때, Cy5.5-tagged DOX@HPC 또는 DOX@HPBC를 35 μg kg-1의 Cy5.5 용량으로 마우스의 꼬리 정맥에 주사했다. Cy5.5 태그된 제형은 30μg의 Cy5.5-N-hydroxysuccinimide ester와 15mg의 Hb 유도체를 접합하여 합성된 Cy5.5-tagged HPC 및 HPBC가 사용된 것을 제외하고는 동일한 DOX 로딩 방법을 사용하여 제조되었다. 전신 형광 이미징은 VISQUE® InVivo Smart(Vieworks, 안양, 한국)를 사용하여 주사 후 2, 4, 6, 8 및 24시간에 수행되었다. 간, 비장, 신장, 심장, 폐 및 종양을 주사 후 24시간째에 절개하고, 각 장기 또는 조직의 복사 효율을 측정하였다.
전신 스캐닝 결과, 도 5A에서 보는 바와 같이, HPC 및 HPBC는 24시간 내에 종양과 혈장 Hb의 주요 배설 기관인 신장에 우선적으로 축적되었다. 이러한 경향은 종양과 신장이 다른 장기보다 현저히 높은 방사 효율 값을 나타내는 생체외 영상화에 의하여도 확인되었다(도 5B). 간 및 폐 축적이 매우 적은 것은 클러스터링된 PEG화 Hb 입자가 혈액 순환 중에 단일 단백질 분자로 분해될 수 있음을 시사한다. 특히, 도 5B에서 보는 바와 같이, 종양 표적화 능력을 갖는 비오틴 부분을 포함하고 있는 DOX@HPBC는 DOX@HPC보다 1.55배 더 높은 종양 축적을 나타냈다(p < 0.05).
성공적인 생체 분포 프로파일을 바탕으로, DOX@HPBC 기반 화학-PDT의 치료 효능 및 안전성을 HeLa 종양 이종이식 마우스 모델에서 평가하였다. 이종성 HeLa 종양-이종이식 모델은 위에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 의해 준비되었다. 종양 부피가 약 30-50 mm3에 도달한 후 마우스를 무작위로 5개 그룹으로 나누었다(무처리, DOX 용액(DOX), DOX 및 Ce6 용액(DOX + Ce6), DOX@HPC 및 DOX@HPBC 그룹). 종양 크기와 체중을 15일 동안 매일 모니터링했다. 약물 투여는 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일에 꼬리 정맥 주사를 통해 수행되었으며 용량은 DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg-1이었다. DOX + Ce6, DOX@HPC 및 DOX@HPBC 그룹은 1일째에 주사 후 4시간에 660nm 레이저 처리(5분 동안 250mW cm-2)를 받았다. 15일째에 마우스를 isoflurane 마취 후, 종양을 해부하여 무게를 측정하였다. 혈액 샘플(0.5mL)을 좌심실에서 수집하고 Scil Vet abc Plus(HORIBA, Kyoto, Japan)를 사용하여 전체 혈구 수(CBC) 테스트를 수행했다. 혈청 샘플은 혈액 샘플을 13000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 얻었다. 혈청 알부민(ALB), 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST), 알라닌 트랜스아미나제(ALT), 혈청 크레아티닌(SCr) 및 혈액 요소 질소(BUN)의 수준은 Fuji Dri-Chem 3500s(Fujifilm Holdings Corp., Tokyo, 일본)로 측정하였다.
도 5D에서 보는 바와 같이, DOX@HPC와 DOX@HPBC는 종양 성장을 거의 완전히 억제하여 치료하지 않은 그룹과 비교하여 15일째에 각각 97.3% 및 96.6%의 종양 부피 감소를 나타냈다(p < 0.0001). DOX(단일 요법) 및 DOX + Ce6(물리적 혼합물, 화학-PDT)도 동일한 용량(DOX 및 Ce6에 대해 격일로 5mg kg- 1)에서 종양 성장을 효과적으로 억제했지만, 도 5E에서 보는 바와 같이, 체중의 심각한 감소( 28.3% 및 26.3%)가 15일째에 무처리 그룹과 비교하여 관찰되었다(p < 0.005). 또한 표 4에서 보는 바와 같이, DOX 또는 DOX + Ce6 처리군은 백혈구 수가 0.53배 또는 0.40배 감소한 반면(p < 0.05), DOX@HPC 또는 DOX@HPBC 처리군은 유의한 감소를 나타내지 않았다.
Parameters [unit] a) No treatment DOX DOX + Ce6 DOX@HPC DOX@HPBC
Complete blood counts
WBC [10 3 μL -1 ] 1.96 ± 0.70 1.04 ± 0.35* 0.78 ± 0.22* 1.28 ± 0.13 1.38 ± 0.15
NEU [ % ] 28.19 ± 8.96 32.18 ± 8.05 22.18 ± 12.34 41.13 ± 15.60 39.28 ± 7.04
LYM [ % ] 56.10 ± 13.04 46.28 ± 21.85 63.18 ± 9.34 42.44 ± 12.04 44.52 ± 7.03
MON [ % ] 11.09 ± 7.51 13.25 ± 6.03 9.60 ± 3.73 8.40 ± 4.62 9.60 ± 2.38
EOS [ % ] 4.10 ± 1.99 8.03 ± 9.09 4.50 ± 4.98 7.04 ± 5.08 6.16 ± 2.26
RBC [10 6 μL -1 ] 5.20 ± 1.63 4.48 ± 3.00 5.41 ± 1.23 5.90 ± 1.61 5.98 ± 1.32
HCT [ % ] 24.27 ± 8.17 21.25 ± 14.29 25.28 ± 6.02 28.74 ± 8.81 30.18 ± 7.25
MCV [2c] 46.30 ± 1.43 47.33 ± 0.79 46.68 ± 0.83 48.41 ± 2.83 50.34 ± 1.88
PLT [10 3 μL -1 ] 512.1 ± 222.3 424.8 ± 282.4 439.8 ± 416.3 565.0 ± 171.8 562.8 ± 236.1
MPV [2c] 4.99 ± 0.27 4.95 ± 0.37 5.08 ± 0.43 5.39 ± 0.34 5.38 ± 0.31
PCT [ % ] 0.26 ± 0.11 0.22 ± 0.15 0.23 ± 0.23 0.35 ± 0.14 0.32 ± 0.13
Blood biochemistry
ALB [g dL -1 ] 3.47 ± 0.06 3.33 ± 0.31 3.23 ± 0.55 3.63 ± 0.15 3.77 ± 0.06
AST [U L -1 ] 300.7 ± 56.5 299.0 ± 69.5 267.0 ± 33.2 318.7 ± 155.3 333.7 ± 9.5
ALT [U L -1 ] 121.7 ± 9.5 134.7 ± 30.6 132.3 ± 28.4 126.0 ± 21.2 155.7 ± 25.6
SCr [mg dL -1 ] 0.10 ± 0.04 0.09 ± 0.03 0.10 ± 0.02 0.19 ± 0.10 0.13 ± 0.03
BUN [mg dL -1 ] 19.50 ± 5.21 21.90 ± 3.06 17.30 ± 2.35 19.47 ± 3.65 15.53 ± 2.20
또한 도 5F에서 보는 바와 같이, 해부된 종양 무게도 DOX@HPC 및 DOX@HPBC 그룹은 다른 그룹보다 유의하게 감소를 나타냈습니다(p < 0.05). 상기의 결과와 같이 본 발명에 따른 DOX@HPC 및 DOX@HPBC개선된 생체 분포뿐만 아니라 위의 시험관 내 평가에서 입증된 기타 유리한 물리화학적 특성에 의해 향상된 효능 및 안전성을 나타내었다.
< 실시예 8. 종양의 저산소 영역으로의 DOX@HPBC 분포 및 세포자멸사 단백질의 상향조절>
본 발명에 따른 PEG화 Hb NC의 저산소증 완화 효과와 DOX 전달 효율을 조직 수준에서 평가했다. 이종성 HeLa 종양-이종이식 모델은 위에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 의해 준비되었습니다. 12일째에 DOX + Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC(DOX와 Ce6 모두 5 mg kg- 1)를 꼬리 정맥에 주입하고 660 nm 레이저(250 mW cm-2)를 5분 동안 조사했다. 14일째에, 상기 동일한 제형의 주사 후 4시간째에 피모니다졸 염산염(60 mg/kg-1)을 마우스에 정맥내 주사하였다. 피모니다졸 염색은 절개된 종양에서 수행되었으며, 여기서 종양 섹션은 마우스 항-피모니다졸 1차 항체(희석률 1:200; Hypoxyprobe, Burlington, MA, USA)와 함께 배양된 다음 Alexa 488-접합된 염소 항-마우스 이차 항체(희석 1:200, Seracare, Milford, MA, USA). 세포핵은 DAPI로 염색하였고, 영상은 LSM 5 LIVE(Carl-Zeiss)로 수행하였다.
DOX + Ce6(물리적 혼합물), DOX@HPC 또는 DOX@HPBC(DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg- 1)를 격일로 레이저 조사와 함께 HeLa 종양 보유 마우스에 정맥내 투여한 후 다음 기간 동안 피모니다졸을 투여하여 저산소증을 추적했다. 도 5G에서 보는 바와 같이, 절개된 종양에 대해 수행된 저산소증 염색은 DOX@HPC 및 DOX@HPBC가 무처리 및 DOX + Ce6 처리와 비교하여 종양 저산소증을 개선한 것으로 나타났으며, 이는 시험관내 관찰과 일치한다. 특히, DOX@HPC 및 DOX@HPBC 모두에서 DOX 형광은 피모니다졸 염색 영역을 포함한 전체 종양 조직에서 관찰된 반면, DOX + Ce6 그룹에서는 제한된 신호가 검출되었다. 이러한 결과는 DOX@HPC 및 DOX@HPBC가 종양 저산소증을 완화할 수 있을 뿐만 아니라 생체내 종양의 저산소증 영역에 DOX를 효율적으로 전달할 수 있음을 뒷받침한다.
세포 사멸 관련 단백질의 상대적인 발현 패턴은 위의 화학 PDT 요법 후 항체 마이크로어레이를 사용하여 종양 조직에서 분석되었다. 종양이 100-120 mm3에 도달한 후 DOX + Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC(DOX 및 Ce6 모두에 대해 5 mg kg- 1)를 격일로 정맥내 투여한 후 주사 후 4시간에서 5분 동안 660 nm 레이저 조사(250 mW cm-2)하였다. 12일과 14일에 2주기의 처리 후, 16일에 마우스를 희생시키고 종양을 해부했다. 종양 조직의 용해 후, 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)로 정량화되었다. 세포사멸 신호전달 경로 관련 단백질의 발현 수준은 제조사의 프로토콜에 따라 Human Apoptosis Antibody Array(ab134001; Abcam)에 의해 평가되었다.
도 5H에서 보는 바와 같이, DOX@HPBC 처리는 무처리에 비해 p27(배수 변화: 1.72 ± 0.03), FasL(1.67 ± 0.09), DR6(1.55 ± 0.02), BID(1.55 ± 0.05) 및 TNF-α(1.53 ± 0.02)를 포함하여 모니터링되는 대부분의 세포자멸사 촉진 단백질의 상향조절을 유발하였으며, 항-세포자멸사 단백질은 혼합 양상을 보였다. DOX + Ce6 및 DOX@HPC 처리도 유사한 패턴을 나타내었지만 배수 변화는 DOX@HPBC보다 대부분 작았으며, 이러한 결과는 도 5C에서 보이는 DOX@HPBC에 의한 향상된 DOX 축적 및 DOX에 의해 가해지는 후속 pro-apoptotic 효과에 의해 설명될 수 있다.
< 실시예 9. 동소 자궁경부암 모델의 화학-PDT>
본 발명에 따른 DOX@HPC 및 DOX@HPBC의 치료 효능은 최종적으로 동소(자궁경부 자궁) HeLa-이종이식 마우스에서 평가되었다. HeLa 세포(5 × 106 세포)를 암컷 BALB/c 누드 마우스의 자궁경부에 주사했다. 비히클, DOX + Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC를 각각 5/5 mg kg-1의 DOX/Ce6 용량으로 7, 10, 13, 16, 19 및 22일에 꼬리 정맥에 주사한 후, 주입 후 4시간에 자궁경부에 660nm 레이저 노출(2분 동안 250mW cm-2)시키고 체중을 매일 모니터링하였다. 25일째에 쥐를 희생시키고 종양이 있는 자궁경부와 폐, 심장, 간, 신장, 비장을 포함한 다른 장기를 해부했다. 종양 샘플의 무게를 측정하고, 4%(v/v) 포름알데히드로 고정한 후, 파라핀에 포매하고, 10μm 두께로 슬라이스했다. 항원 검색은 97°C에서 15분 동안 tris-EDTA 완충액(pH 9.0)에서 수행되었다. HIF-1α(ab51608; Abcam) 및 MDR1(ab235954; Abcam)에 대한 1차 항체를 1:100의 희석율로 4°C에서 밤새 배양하고 DAB Kit( D39-18, GBI Labs, 보셀, 워싱턴, 미국) 및 DeadEnd™(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 염색을 수행했다. 모든 조직 및 기관 샘플도 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행했다.
HIF-1α 및 β-액틴 발현의 웨스턴 블롯 분석은 상기 동소 이종이식 모델에서 수행되었으며, 여기서 마우스는 7, 14 및 21일에 동일한 DOX 및 Ce6 용량으로 꼬리 정맥을 통해 비히클, DOX + Ce6, DOX@HPC 또는 DOX@HPBC를 투여받았다. 레이저 치료군은 위와 동일한 프로토콜로 레이저 치료를 수행하였지만, 비레이저 그룹에는 레이저 치료를 하지 않았다. 22일째에 마우스를 안락사시키고 자궁경부 종양을 분리한 후, 종양 조직을 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 포함된 RIPA 완충액으로 용해하고 실시예 4와 동일한 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시했다. Image J 소프트웨어(US National Institutes of Health)를 이용하여 Densitometric analysis를 수행하였고, HIF-1α의 상대적 발현은 β-actin으로 표준화하고 상기 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6A 및 도 7A에서 보는 바와 같이, DOX@HPC 및 DOX@HPBC 모두 6회 치료 후 DOX + Ce6(p < 0.05)보다 종양 성장을 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며, DOX@HPBC는 정상과 거의 동일한 평균 자궁(종양 포함) 무게(52.8 ± 15.2 mg)를 유지하는 것으로 나타났다(암세포 접종 없는 경우 54.9 ± 10.7 mg). DOX@HPC 처리군도 무치료 그룹과 비교하여, 체중 및 조직학적 유해한 변화 없이 자궁경부 종양 성장을 실질적으로 억제했다(p < 0.005)(도 6B 및 도 7B). 해부된 종양에서 수행된 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP nick-end labeling(TUNEL) 염색도 유사한 경향을 나타냈으며(도 7C), 여기서 DOX@HPBC는 다른 처리군에 비해 가장 높은 정도의 세포자멸사를 유도했다.
또한, 동소형 HeLa-이종이식 모델에서 생체 내 저산소증 완화 테스트를 수행했다. HIF-1α 발현 수준은 상기에서 설명한 바와 같이 동일한 용량에서 3회 화학요법(레이저 제외) 또는 화학 PDT(레이저 포함) 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 절개된 자궁경부 종양에서 평가되었다. 도 6C에서 보는 바와 같이, 레이저 치료없이 화학요법을 수행한 모든 그룹은 무처리 그룹과 비교하여 60% 미만으로 HIF-1α 발현이 크게 감소했으며, 이는 부분적으로 종양 프라이밍 효과와 산소 전달 효과에 기인할 수 있다. 레이저 조사한 경우, HIF-1α 발현은 PDT에 의한 산소 고갈로 인해 모든 그룹에서 증가했다(무처리 그룹의 최대 90%). 그럼에도 불구하고, DOX@HPBC 치료는 여전히 다른 처리군보다 HIF-1α 수준(60.3 ± 10.5%)을 유의하게 감소시켰다(p < 0.005). HIF-1α 발현의 감소와 MDR1의 후속 하향 조절을 확인하기 위해 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 염색은 수행한 결과, 도 6D에서 보는 바와 같이, DOX@HPBC는 HIF-1α 및 MDR1 발현을 현저히 감소시켰으며, 이는 산소화된 HPBC의 향상된 종양 분포 및 PDT 유도 저산소증의 후속 개선으로 설명될 수 있다. 이러한 감소된 MDR1 발현은 또한 화학요법 측면에서 DOX@HPBC의 효능에 의한 것으로 사료된다.
상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따른 페길화 헤모글로빈 나노 클러스터는 자궁 경부암에서 종양 저산소증을 효과적으로 완화시키는 새로운 Hb 기반 화학 PDT 제제이다. 비오틴 부착 PEG가 Ce6으로 변형된 Hb에 도입되어 안정성과 표적화가 개선되었으며, 이는 비 PEGylated에 비해 ROS 생성 효율도 크게 증가시켰다. 또한, 볼 밀링 기술을 통해 PEG화 Hb 유도체에 DOX을 로딩함으로써 단백질 분자의 자가 조립을 유도하여 안정적인 NC를 생성할 수 있었다. DOX@HPBC NC는 비오틴 수용체 상호작용을 통해 개선된 세포 흡수 및 회전 타원체 침투를 나타냈으며, 시험관 내에서 검증된 향상된 항암 효과 및 저산소증 개선 가능성은 생체 내 개선된 치료 결과로 확인되어 자궁경부 종양의 크기와 저산소증 마커의 상당한 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 DOX@HPBC가 자궁경부암 치료를 위한 유망한 화학 PDT 방식이 될 수 있음을 시사한다.

Claims (16)

  1. 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)을 위한 광증감제가 접합되며, 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 헤모글로빈(Hb)을 포함하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 헤모글로빈 : 폴리에틸렌 글리콜 : 광증감제가 1 : 1~8 : 4~24 의 몰비로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 광증감제는, 포르피린, 클로린, 박테리오클로린, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 페오포르바이드(pheophorbides), 푸르푸린(purpurins), m-THPC, 클로린 e6, 박테리오클로린, 프탈로시아닌, 벤조포르피린 유도체 및 아미노레불린 산(ALA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 고형 종양으로 표적화되는 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 고형 종양은 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 폐암, 담관암, 신장암, 위암, 간암, 망막아세포종, 융모상피암, 소장암, 대장암 및 직장암으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 악성 종양인 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 고형 종양의 저산소증(hypoxia)을 완화하는 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 페길화 헤모글로빈 나노클러스터에 항암제를 추가로 담지한 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스플라틴(cisplatin), 비노렐빈(vinorelbine) 및 플루오로우라실(5-fluorouracil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin)이며, 독소루비신을 담지한 페길화 헤모글로빈 나노클러스터는 다분산 지수 (polydispersity indices) 0.3 미만, 평균 유체역학적 직경 230 nm 미만 및 제타전위가 음수인 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  10. 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)을 위한 광증감제가 접합되며, 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 헤모글로빈(Hb)을 포함하며, 헤모글로빈 : 폴리에틸렌 글리콜 : 광증감제가 1 : 4 : 12 의 몰비로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  11. 광역학치료(Photo Dynamic Therapy)을 위한 광증감제가 접합되며, 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 헤모글로빈(Hb)을 포함하며, 헤모글로빈 : 폴리에틸렌 글리콜 : 광증감제가 1 : 1~8 : 4~24 의 몰비로 이루어지며, 독소루비신(doxorubicin)을 담지한 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 항암 화학-광역학 치료용 조성물은 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 폐암, 담관암, 신장암, 위암, 간암, 망막아세포종, 융모상피암, 소장암, 대장암 및 직장암으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 악성 종양에 적용되는 것을 특징으로 하는 항암 화학-광역학 치료용 조성물.
  14. 클로린 e6(Chlorin e6), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 용해혼합물을 제조하는 단계(A);
    상기 (A)단계의 용해혼합물을 물에 용해된 헤모글로빈(Hb)에 첨가하여 반응시켜 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)를 수득하는 단계(B);
    상기 (B)단계의 헤모글로빈-클로린e6 복합체(Hb-Ce6, HC)에 비오틴화 폴리에틸렌글리콜(biotin-PEG)을 Hb : PEG의 몰비가 1:4가 되도록 추가하여 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 단계(C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (C)단계 이후, 상기 (C)단계에서 제조한 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 물에 용해시킨 후, DMSO에 용해된 항암제와 혼합하여 볼 밀링(ball milling)을 통하여 항암제가 담지된 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 단계(D);를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스플라틴(cisplatin), 비노렐빈(vinorelbine) 및 플루오로우라실(5-fluorouracil)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 페길화 헤모글로빈 나노클러스터를 제조하는 방법.
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