TW201414489A - 用於癌症標靶治療及預防癌症復發之含有基於血紅素的氧載體之醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於治療癌症、預防癌性腫瘤復發及轉移之含有基於血紅素的氧載體之醫藥組成物。該組成物可單獨或與諸如5FU、硼替佐米、阿黴素、順鉑或其任何組合之至少一種化學治療劑組合使用。該組成物中之該基於血紅素之氧載體能夠靶向在癌細胞上表現之表面受體，且經由受體介導機制促進基於血紅素之氧載體及該化學治療劑由該癌細胞攝取。該基於血紅素之氧載體抑制諸如HIF1 α、VEGF、ET1、VHL等之低氧反應元件之表現。本發明之該醫藥組成物亦適用於誘導稱為癌症幹細胞之一類自我更新及腫瘤引發的細胞之細胞凋亡或細胞死亡，該細胞定位於癌性腫瘤之低氧龕中。

Description

用於癌症標靶治療及預防癌症復發之含有基於血紅素的氧載體之醫藥組成物 【版權聲明/權限】
此專利文獻之本發明之一部分含有受版權保護之材料。版權所有者不反對任何人傳真複製專利與商標局(Patent and Trademark Office)專利檔案或記錄中出現之該專利文件或該專利揭示內容，但在其他任何情況下均保留所有版權。以下聲明適用於如下文及在此所附圖式中所述之該方法、實驗及資料：版權© 2012,Vision Global Holdings有限公司，保留所有權利。
【相關申請案之交叉引用】
本申請案主張2012年10月12日申請之美國臨時專利申請案第61/712,853號及2012年12月13日申請之美國非臨時專利申請案第13/731,013號之優先權，且該專利申請案之揭示內容以引用之方式併入本文中。
本發明係關於一種在人類及其他動物中用於癌症標靶治療及預防腫瘤復發之含有基於血紅素的氧載體之醫藥組成物。詳言之，本發明係關於一種包括基於血紅素的氧載體之組成物，其以單獨或與至少一種化學治療劑組合之形式投予用於治療癌症、靶向癌細胞/癌症幹細胞/含有此等細胞中之 任一者之組織及預防腫瘤之復發。
血紅素在大部分脊椎動物中對於血管系統與組織之間的氣體交換起重要作用。其負責經由血液循環將氧自呼吸系統攜帶至體細胞，以及將代謝廢物二氧化碳攜帶離開體細胞至呼吸系統，在呼吸系統中呼出二氧化碳。因為血紅素具有此氧運輸特性，所以若其可在活體外穩定且在活體內使用，則其可用作有效供氧物。
天然存在之血紅素為四聚體，其當存在於紅血球內時大體上穩定。然而，當天然存在之血紅素自紅血球移出時，其在血漿中變得不穩定且分裂成兩個α-β二聚體。此等二聚體中之每一者之分子量為大約32kDa。此等二聚體當經由腎過濾及排泄時可能會導致實質性腎損傷。四聚體鍵聯之斷裂亦不利地影響循環中功能血紅素之持久性。
為解決該問題，血紅素處理之近期發展已併入各種交聯技術以在四聚體內形成分子內鍵以及在四聚體之間形成分子間鍵，以形成聚合血紅素。
低氧在癌症中為常見的。藉由使腫瘤細胞失去對於此等試劑之細胞毒性活性而言必需之氧，低氧可能會導致電離輻射及化學療法抗性。經由包括蛋白質組及基因組變化之一或多種間接機制，低氧亦可能會降低輻射療法及化學療法之腫瘤敏感度。因此，需要經改良癌症治療組成物，尤其增進細胞毒性劑之功效之經改良癌症治療組成物。
儘管腫瘤轉移造成約90%之癌症死亡，但使癌細胞自身體之一個部分擴散至另一部分之確切機制未得到充分理解。因此，預防癌症復發之經改良癌症治療組成物為重要的。
許多近期研究已顯示癌症幹細胞(cancer stem cell；CSC)在癌症及腫瘤發展中起重要作用。Wang及Dick(2005)藉由隨機模型及較早提出之癌症幹細胞模型回顧見於腫瘤中之白血病幹細胞之自我更新及腫瘤細胞增殖潛力。根據隨機模型，一般存在一類功能上均質之腫瘤細胞，且遺傳變化可能會引起所有此等腫瘤細胞中之惡性進展。相比之下，癌症幹細胞模型提出，與腫瘤中之大多數細胞相比，具有一致地引發腫瘤生長之獨特能力且能夠再生一個層次之功能上異質類別之細胞的罕見細胞群體可能具有不同致瘤途徑。癌症幹細胞模型中所提出之腫瘤引發的細胞可自其餘細胞逐漸地鑑別及純化。此等細胞稱為癌症幹細胞(CSC)。如白血病幹細胞，諸如乳癌之其他癌症似乎由罕見腫瘤引發的細胞群體驅動。細胞之兩種表型已在乳癌中鑑別，其中一種少數表型能夠形成乳房腫瘤，而另一種表型不能。在腦癌中，發現兩種類型之細胞：CD133+細胞具有活體內分化、自我更新及腫瘤引發能力，而CD133-細胞不能。已發現愈來愈多之證據支持，此等癌症幹細胞可能位於所有贅生性系統之尖端，且從而變為癌症治療之新標靶。評論文章(Mohyeldin等人，2010)提出，癌症幹細胞龕之氧張力低得多。發現低氧龕位於離腫瘤之血管結構較遠處，且含有癌症幹細胞，該癌症幹細胞在相異的HIF(低氧誘導性因子；Hypoxia-inducible factor)誘導模式(尤其HIF-2 α)之情況下對低氧有差異地反應。其變為調節癌症幹細胞自我更新、增殖及存活之信號傳導途徑中之新標靶，且其抑制將減弱其腫瘤引發潛力。
因此，在此項技術中需要一種可在癌症幹細胞中提供高氧張力之組成物。該種組成物可用以在癌症幹細胞中產生氧化壓力或休克，其導致DNA 損傷及後續DNA損傷誘導之細胞凋亡。
本發明係關於一種在人類及其他動物中用於癌症標靶治療及預防癌症復發之含有基於血紅素的氧載體之醫藥組成物。本發明之第一態樣為提供一種基於血紅素之氧載體，其經配置以靶向人類或動物體中之癌細胞、癌症幹細胞(CSC)及/或癌祖細胞(progenitor cell)及/或含有此等細胞中的任一者之組織，觸發受體介導機制，且引導組合化學治療劑一起定位於癌細胞、CSC及/或含有此等細胞中的任一者之組織之細胞質中，以便增加基於血紅素之氧載體及化學治療劑兩者之功效。亦發現經定位之基於血紅素之氧載體使癌細胞及CSC敏感，以使得癌細胞及CSC變得對化學治療劑更敏感。本發明之第二態樣為提供一種使用本發明之含有基於血紅素之氧載體的醫藥組成物用於治療癌症及預防癌症復發之方法，其藉由向罹患各種腫瘤、癌症或與腫瘤或癌症相關之疾病的有需要之個體投予該組成物。
本發明中所使用之基於血紅素的氧載體可為熱穩定交聯四聚、聚合、聚乙二醇化或重組/改質血紅素，其與至少一種化學治療劑組合用於治療各種癌症，諸如白血病、頭頸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌、食道癌及腦癌。亦發現，基於血紅素之氧載體自身具有經由在低氧條件下改良腫瘤之氧合來破壞癌細胞之能力，從而增進對輻射及化學治療劑之敏感度。
此外，本發明之基於血紅素之氧載體亦可單獨用於減少癌性腫瘤復發且使腫瘤細胞轉移最小化。該血紅素在腫瘤移除手術之局部缺血之前及在腫瘤移除時之血液供應重建(再灌注)期間投予。基於血紅素之氧載體亦 可用於增加癌性組織之氧合，且與化學治療劑一起隨後接著減小腫瘤之大小。因此，本發明之含有基於血紅素之氧載體的組成物可單獨或與至少一種化學治療劑組合投予用於治療或預防癌性腫瘤之復發。
本發明之方法亦包括使用不同化學治療藥物及/或輻射療法與本發明之基於血紅素之氧載體的組合，以得到對癌症治療及腫瘤復發之預防的協同效應。
本發明之第三態樣係關於向腫瘤提供氧化壓力或休克以便殺死被稱為癌症幹細胞之罕見的自我更新及腫瘤引發的細胞群體之本發明組成物。向腫瘤提供高氧張力之本發明組成物包括基於血紅素之氧載體，其包括四聚交聯血紅素或聚合血紅素，其中四聚交聯血紅素及聚合血紅素兩者均製備成含有不可偵測量之二聚體及低百分比之變性血紅素(met-hemoglobin)。該組成物中之基於血紅素之氧載體經配置用於穿透至腫瘤之癌性組織中，其中癌症幹細胞經發現在腫瘤內選擇性地增殖。該基於血紅素之氧載體可單獨或與至少一種化學治療劑(包括硼替佐米(bortezomib)、5-氟尿嘧啶、阿黴素(doxorubicin)、順鉑(cisplatin)或其任何組合)組合，用於使腫瘤氧合且向該癌症幹細胞提供氧化壓力或休克，以便誘導該癌症幹細胞之細胞凋亡或死亡，其在治療癌症或癌性腫瘤及預防癌症或癌性腫瘤之復發中產生效應。本發明之基於血紅素之氧載體亦經改質以避免分解成二聚體，以使得其變得更穩定且在循環中具有更長之半衰期。不同於天然存在之血紅素，此更長半衰期特性有助於其穿透至包括癌細胞、癌症幹細胞及/或癌症祖細胞之標靶細胞中。類似於對癌細胞之效應，本發明組成物中之基於血紅素之氧載體亦使癌症幹細胞對化學治療劑或輻射療法敏感。換言之，本 發明組成物為一種有效之輔助療法，其可在化學療法及/或輻射療法之前或與化學療法及/或輻射療法組合投予。在本文所述之本發明之任何態樣中，基於血紅素之氧載體可在癌性組織或腫瘤之手術移除之前、在其期間或在其之後向有需要之個體以9.5g/dL至10.5g/dL之濃度投予，用於以下目的：靶向癌性組織或腫瘤中之細胞、觸發受體介導機制、穿透且定位至癌性組織或腫瘤細胞中、誘導癌性組織或腫瘤細胞之細胞凋亡、使細胞對同時或隨後投予之化學治療劑或輻射療法敏感。
圖1為一組在同一放大率下之顯微影像，其展示(A)螢光標記之基於熱穩定血紅素之氧載體及(B)螢光標記之聚合血紅素向肝癌細胞中之攝取。
圖2為兩組在同一放大率下之顯微影像，其展示螢光標記之基於熱穩定血紅素之氧載體經由網格蛋白(Clathrin)介導路徑(上圖)但不經由小窩蛋白-1(Caveolin-1)介導路徑(下圖)向肝癌細胞中之攝取。
圖3展示在以不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後，不同蛋白質在肝癌細胞中之表現。
圖4展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，低氧誘導性因子1(HIF1 α)基因在肝癌細胞(HepG2及Huh7)中之表現。
圖5展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor；VEGF)基因在肝癌細胞(HepG2及Huh7)中之表現。
圖6展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常 氧相較於低氧之條件下，內皮素-1(endothelin-1；ET1)基因在肝癌細胞(HepG2及Huh7)中之表現。
圖7展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，誘導性氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase；iNOS)基因在肝癌細胞(HepG2及Huh7)中之表現。
圖8展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，逢希伯-林道(von Hippel-Lindau；VHL)基因在肝癌細胞(HepG2及Huh7)中之表現。
圖9展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，熱休克蛋白90(heat shock protein 90；HSP90)基因在肝癌細胞中之表現。
圖10為說明涉及基於熱穩定血紅素之氧載體對腫瘤復發之抑制效應的所提出之機制及信號傳導級聯之示意圖。
圖11展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，熱休克蛋白7C(HSP7C)基因在肝癌細胞中之表現。
圖12展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，高遷移率族蛋白3(high-mobility group box 3；HMGB3)基因在肝癌細胞中之表現。
圖13展示在用不同濃度之基於熱穩定血紅素之氧載體處理之後且在常氧相較於低氧之條件下，複製因子1C(replication factor 1C；RFC1)基因在肝癌細胞中之表現。
圖14展示正常組織中氧合之改良。注射0.2g/kg熱穩定四聚血紅素溶液導致(A)血漿血紅素濃度及(B)氧向肌肉之傳遞顯著增加。
圖15展示低氧腫瘤組織中氧合之改良。注射0.2g/kg熱穩定四聚血紅素溶液導致氧向頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma；HNSCC)異種移植物之傳遞顯著增加。
圖16展示在(A)鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma；NPC)及(B)肝腫瘤之嚙齒動物模型中之部分腫瘤收縮。
圖17展示概述在肝切除期間手術及血紅素產物投予程序之示意圖。
圖18展示在肝切除及局部缺血/再灌注程序之後IR損傷組之大鼠中誘導之肝內肝癌復發及轉移及遠距肺轉移及其使用本發明熱穩定四聚血紅素之保護的代表性實例。
圖19展示在肝切除及IR損傷程序之後四週實驗及對照組中之組織學檢驗。
圖20A展示見於肝切除及IR程序之後的IR損傷組之大鼠(對照組)中及已用本發明熱穩定四聚血紅素處理之大鼠(Hb處理組)中之復發肝腫瘤的體積(cm3)。
圖20B展示肝切除及IR程序之後的IR損傷大鼠(對照組)及已用本發明熱穩定四聚血紅素處理之大鼠(Hb組)之肝復發率(左)及復發腫瘤平均大小(右)。
圖21展示在肝切除及局部缺血/再灌注程序之後IR損傷組之大鼠(對照組：C10及C13)及用本發明熱穩定四聚血紅素處理之大鼠(Hb處理組：Y9、Y10及Y11)中誘導之肝內肝癌復發及轉移及遠距肺轉移的代表性實例。
圖22展示來自在整個肝手術及再灌注期間第一投予標的本發明血紅素產物或RA緩衝液(對照物)之肝氧分壓(mmHg)的代表性實例。
圖23展示肝手術後28天經標的血紅素產物處理或未經標的血紅素產物處理的大鼠之外周血液中之循環內皮祖細胞(EPC)水準之間的比較。
圖24展示基於熱穩定血紅素之氧載體在鼻咽癌異種移植物內之時間定位。
圖25展示Hep-2喉癌模型中基於血紅素之氧載體單獨或與輻射組合之腫瘤生長抑制效應；下圖展示獲自不同處理組之腫瘤異種移植物之代表性影像。相較於對照組，*p<0.05，**p<0.01。
圖26展示C666-1鼻咽癌症模型中基於血紅素之氧載體與輻射組合之腫瘤生長抑制效應；下圖展示獲自不同處理組之腫瘤異種移植物之代表性影像。相較於對照組，**p<0.01，相較於僅輻射處理，#p<0.05。
圖27展示基於血紅素之氧載體在腦癌細胞中增進替莫唑胺(temozolomide，TMZ)誘導之細胞毒性。
圖28為展示藉由癌症幹細胞之乳腺球群細胞(mammosphere)形成之形態變化的顯微影像：(A)第0天，(B)第3天，(C)第6天，(D)第9-20天，(E)對照組(來自乳腺上皮細胞之中空乳腺球群細胞)。
圖29為展示自不同繼代收集之未分類乳腺球群細胞及分類MCF7 CD44+/CD24-細胞中之不同標記Oct-4及Sox-2之表現水準的西方墨點(western blot)。
圖30為不同繼代MCF7細胞關於醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性之點圖：(A)對照組(用二乙基胺基苯甲醛 (diethylaminobenzaldehyde；DEAB)培育之分類MCF7細胞)；(B)第0代之分類MCF7細胞；(C)第3代之分類MCF7細胞；(D)第5代之分類MCF7細胞。
圖31為流動式細胞量測術分析中在低氧條件下且用CD24(PE-A)及CD44(APC-A)抗體標記之MCF7細胞的點圖。象限1(Q1)為CD44高及CD24低細胞。
圖32為展示在DMSO(對照物)及90nM紫杉醇(Taxol)處理之情況下培育16小時及4天之後未分類及CD24/CD44-分類MCF7細胞之形態變化的顯微影像。
定義
術語「癌症幹細胞(cancer stem cell)」係指贅生性純系內能夠活體內引發及維持腫瘤生長的生物學上相異之細胞(亦即癌症引發細胞)。
本文中所用之「Hb」係指交聯四聚血紅素，其在不可偵測量之二聚體及低百分比之變性血紅素的情況下具熱穩定性。熱穩定交聯四聚血紅素之分子量為60-70kDa，其經熱處理且在合成期間添加0.05%-0.4%之N-乙醯基半胱胺酸。所得熱穩定交聯四聚血紅素具有不可偵測量之二聚體及少於5%之變性血紅素。熱穩定交聯四聚血紅素亦不含血管收縮雜質及蛋白質雜質、為非致熱的、不含內毒素、不含磷脂且不含基質。四聚血紅素分子內之交聯可在α/α次單元、α/β次單元或α-β次單元之間。
本文中定義之「改質血紅素(Modified hemoglobin)」或「重組血紅素(Recombinant hemoglobin)」係指與至少一種化合物化學共軛或經至少一種化合物表面改質的任何天然血紅素或經純化之血紅素。該化合物可包括聚乙 二醇(poly(ethylene)glycol；PEG)。本發明中所使用之改質血紅素之一個實例為聚乙二醇化血紅素。
血紅素為一種在哺乳動物及其他動物之血液之紅血球中的含鐵氧運輸蛋白。血紅素展現蛋白質之三級及四級結構之特徵。血紅素中之大部分胺基酸形成由短非螺旋片段連接之α螺旋。氫鍵使血紅素內之螺旋部分穩定，在分子內產生吸引，從而將各多肽鏈摺疊成特定形狀。血紅素分子係自四個球狀蛋白質次單元組合。各次單元由排列成一組α-螺旋結構片段之多肽鏈組成，該α-螺旋結構片段以「肌紅素摺疊」排列之形式連接、包埋有原血紅素基(heme group)。
原血紅素基由固定在稱為卟啉之雜環中的鐵原子組成。鐵原子同等地結合至環中心中位於一個平面中之所有四個氮原子。則氧能夠結合至垂直於卟啉環平面之鐵中心。因此，單個血紅素分子具有與四個氧分子結合之能力。
在成人中，最常見類型之血紅素為稱為血紅素A之四聚體，其由指定為α 2 β 2之兩個α及兩個β非共價結合次單元組成，各次單元分別由141及146個胺基酸殘基製成。α及β次單元之大小及結構彼此極類似。就四聚體之總分子量為約65kDa而言，各次單元之分子量為約16kDa。四條多肽鏈藉由鹽橋、氫鍵及疏水相互作用彼此結合。牛血紅素之結構類似於人血紅素(α鏈中之一致性為90.14%；β鏈中之一致性為84.35%)。不同之處為牛血紅素中之兩個硫氫基安置在β Cys 93處，而人血紅素中之硫氫基分別安置在α Cys 104、β Cys 93及β Cys 112處。
在紅血球內之天然存在之血紅素中，α鏈與其相應β鏈之締合極強且在生理條件下不會分裂。然而，在紅血球外，一個α β二聚體與另一α β二聚體之締合極其微弱。該結合具有分裂成兩個α β二聚體之傾向，各二聚體為大約32kDa。此等非所需之二聚體小得足以由腎過濾且被排泄，結果為潛在的腎損傷及實質上減少之血管內滯留時間。因此，就氧傳遞而言，穩定交聯四聚、聚合及/或重組/改質血紅素為醫藥組成物中之重要分子。血紅素之來源可來自(但不限於)人、牛、豬、馬及犬全血。
本發明之醫藥組成物含有基於熱穩定血紅素之氧載體，其經配置以附著至腫瘤細胞上之受體，以促進選擇性靶向低氧腫瘤細胞優於正常非低氧健康組織，且由於其可優先地吸收至癌細胞中，因此其可用於癌症治療。在圖1A中，活細胞成像用於展示熱穩定四聚血紅素(Hb)具有針對肝癌之功效的程度。螢光共軛Hb藉由在室溫下於用N2沖洗之封閉系統中使Hb與異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate；FITC)之間進行共軛(用pH 9.3下之NaHCO3緩衝)1小時來製備。使用蛋白質純化管柱(Millipore)進行後續純化以移除非共軛Hb及自由FITC。立即將新共軛Hb-FITC探針用於活細胞攝取研究。在活細胞採集之前，將肝癌細胞HepG2及轉移性肝癌細胞Huh7暴露於0.0125g/dL 15min。在暴露15min之後，觀測Hb-FITC向兩種類型之肝癌細胞中之攝取(圖1A)。Hb-FITC之攝取在暴露1小時之後達至最大程度(圖1A)。在低氧條件下，觀測到單層肝癌細胞捲曲成三維結構，且偵測到與正常細胞相比，Hb-FITC更優先由此等癌細胞吸收。聚合血紅素向肝癌細胞中之攝取顯示於圖1B中。
細胞攝取血紅素分子之能力為經由蛋白質外殼囊泡胞吞作用。可經內 在化之兩種常見蛋白質外殼為網格蛋白及小窩蛋白1。構建紅螢光蛋白質標記之網格蛋白(RFP-網格蛋白)及小窩蛋白1(mCherry-小窩蛋白1)質體，且質體在吸收有FITC共軛Hb之HepG2或Huh7細胞中獨立地表現。時移成像研究(圖2)揭示Hb-FITC與RFP-網格蛋白共定位(colocalize)，但不與mCherry-小窩蛋白1共定位，表明血紅素分子經由網格蛋白介導之胞吞作用進入肝癌細胞中。
本發明中藉由研究兩種肝癌模型(HepG2及Huh7)中且在常氧及低氧條件下不同藥物之IC50來展示血紅素在非轉移性及轉移性肝癌細胞中單獨及在輔助療法之情況下的功效(結果顯示於表1中)。在常氧條件下，在HepG2細胞中順鉑、阿黴素、硼替佐米及5-氟尿嘧啶(5FU)之IC50分別為130uM、10uM、0.5uM及4mM，且在Huh7細胞中順鉑、阿黴素、硼替佐米及5FU之IC50分別為70uM、5uM、55uM及3.5mM。在低氧條件下，在HepG2細胞中順鉑、阿黴素、硼替佐米及5FU之IC50分別為170uM、30uM、0.7uM及4mM，且在Huh7細胞中順鉑、阿黴素、硼替佐米及5FU之IC50分別為100uM、6uM、60uM及4mM。3-(4,5-二甲基噻唑(cimethylthiazol)-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)分析結果表明，在常氧條件下，Huh7細胞對順鉑及阿黴素更敏感，但與常氧條件下之HepG2細胞相比，對硼替佐米之抗性大110倍(針對蛋白酶體次單元PSMB1、5及6之標靶藥物)。在低氧條件下，Huh7細胞變得對順鉑及阿黴素更敏感，且與低氧條件下之HepG2細胞相比，亦對硼替佐米具有高抗性(86倍)。結果揭示，不管在常氧抑或低氧條件下，轉移性肝癌細胞(Huh7)大體上比非轉移性肝癌細胞(HepG2)對硼替佐米具有更大抗性。
MTT結果亦揭示，單獨Hb將不造成任何細胞死亡。然而，當以5FU及硼替佐米之相應IC50連同0.2g/dL Hb投予時，觀測到其顯著化學致敏作用。在常氧條件下，於5FU及Hb處理之HepG2細胞中偵測到另外33%(總計83%)細胞死亡，而於硼替佐米及Hb處理之Huh7細胞中觀測到另外20%(總計50%)細胞死亡。在低氧條件下，於硼替佐米及Hb處理之HepG2細胞中偵測到另外42%(總計92%)細胞死亡，而於5FU及Hb處理之HepG2細胞中觀測到35%增量(總計85%)細胞死亡。在相同低氧條件下，觀測到5FU及Hb處理之Huh7細胞中之另外20%(總計72%)細胞死亡。5FU為一種抑制胸苷酸合成酶之嘧啶類似物。硼替佐米為最初用於治療骨髓瘤患者之第一治療性蛋白酶體抑制劑。據報導，其造成肝癌細胞中之細胞凋亡(Koschny等人，Hepatology,2007)。綜合而言，觀測到血紅素分子在5FU及硼替佐米之情況下對非轉移性及轉移性癌症均具有顯著協同效應。
低氧為腫瘤之一種常見生理特性。腫瘤內低氧亦常見於肝癌中。已知低氧之條件活化促使低氧誘導性因子1(HIF1 α)轉錄因子之穩定化及具有低氧反應元件(hypoxia response element；HRE)之HIF1 α效應基因(超過60個基因)之活化的信號傳導級聯。此等HIF1 α下游效應子參與細胞存活、適應、厭氧代謝、免疫反應、細胞活素生產、血管形成及一般組織恆定。
在圖3中，展示Hb影響HIF1 α蛋白質在HepG2及轉移性Huh7肝癌模型中之表現。Hb在常氧及低氧下均下調HIF1 α，表明藉由單獨Hb耗竭HIF1 α(40%相比於未處理之對照組)影響HIF1 α結合至其下游效應子且導致此等效應基因之轉錄抑制。在用Hb處理後，類似下調模式可在HIF1 α(圖4)、熱休克蛋白90(HSP90)(圖9)及逢希伯-林道(VHL)(圖8)之上游調節因子中偵測到。
當肝癌細胞用Hb及5FU(95%抑制)或Hb及硼替佐米(80%抑制)處理時，偵測到HIF1 α之實質性減少，轉錄物及蛋白質水準藉由對應定量qPCR及西方墨點研究來例示。此等資料表明，Hb單獨、Hb與5FU或硼替佐米處理組合可消除低氧誘導HIF1 α mRNA及蛋白質穩定。因此，觀測到在Huh7細胞中血管內皮生長因子(VEGF)(圖5)及內皮素-1(ET1)(圖6)表現之下調，表明Hb與5FU或Hb與硼替佐米之組合可抑制肝轉移性模型中之血管生成及血管緊張，其中血管生成之抑制固有地與轉移之發展相關。觀測到組合處理減少Huh7中之誘導性氧化氮合成酶(iNOS)(圖7)表現，表明血管分佈及血管生成之程度亦可在肝轉移性模型中受到損害。總之，吾等發現表明，Hb與5FU或硼替佐米之組合投予可藉由抑制HIF1 α 而協同抑制VEGF、ET1及iNOS表現之低氧誘導。所提出之機制涉及Hb對腫瘤復發之抑制效應，且其信號傳導級聯說明在圖10中。氧供應、含有脯胺醯基羥化酶域之蛋白質(PDH)、HIF及內皮祖細胞(EPC)之關係經清楚地展示。
亦發現經配置以靶向DNA損傷感測細胞調節器的包括基於血紅素之氧載體之醫藥組成物通過新穎調節途徑。在本發明中，為DNA損傷感測器、複製因子1C(RFC1)(圖13)及HSP7C(熱休克蛋白7C)(圖11)之固有部分之兩種蛋白質在Hb處理肝癌細胞中上調，且在與硼替佐米之組合處理中大幅度上調(就RFC1而言為3-10倍上調，且就HSP7C而言為25-45倍上調)。此等新穎Hb標靶蛋白質表明，Hb為一種潛在活性氧物質(Reactive Oxygen Species；ROS)誘導物，且其就轉移性肝癌細胞Huh7而言，對於感測及響應ROS介導DNA損傷而言明顯至關重要。在與Hb及硼替佐米之反應中，DNA損傷反應蛋白質之急劇上調可能導致後續氧化壓力誘導之細胞凋亡。
就在癌症治療中之用途而言，本發明之含有氧載體之醫藥組成物用作組織氧合劑以改良腫瘤組織中之氧合，從而增進化學敏感度及輻射敏感度。
另外，在本發明中展示熱穩定四聚血紅素改良正常組織(圖14)及極其低氧腫瘤(圖15)之氧合的能力。腫瘤塊內之氧分壓(pO2)藉由與微定位系統(DTI有限公司)耦合之光纖氧感測器(Oxford Optronix有限公司)直接監測。在經靜脈內注射0.2g/kg熱穩定四聚血紅素之後，中值pO2值在15分鐘內自基線上升至約兩倍氧分壓相對平均值，且延長至6小時。此外，在輸注之後，氧平均水準仍維持在基線值25%至30%以上之水準24至48 小時。當與本發明中所製備之含有氧載體之醫藥組成物相比時，市售產品或現有技術未展示如此高之功效。
就腫瘤組織氧合而言，人頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物(FaDu)之代表性氧特徵顯示於圖15中。在經靜脈內注射0.2g/kg熱穩定四聚血紅素之後，分別在3及6小時觀測到超過6.5倍及5倍之平均pO2之顯著增加(圖15)。
就在癌症治療中之應用而言，本發明之含有氧載體之醫藥組成物用作組織氧合劑，以改良腫瘤組織中之氧合，從而增進化學及輻射敏感度。結合X射線照射及熱穩定四聚血紅素，腫瘤生長延遲。在圖16A中，代表性曲線展示鼻咽癌之嚙齒動物模型中之顯著腫瘤收縮。帶有CNE2異種移植物之裸小鼠用X射線單獨(2Gy)或與熱穩定四聚血紅素組合(2Gy+Hb)處理。在X射線照射之前大約3至6個小時，1.2g/kg熱穩定四聚血紅素經靜脈內注射至小鼠中，且導致鼻咽癌異種移植物部分收縮。
在一個具體實例中，在結合化學治療劑注射組成物之後，觀測到顯著肝腫瘤收縮。在圖16B中，代表性圖表展示大鼠正位肝癌模型中之顯著腫瘤收縮。帶有肝腫瘤正位移植物(CRL1601細胞系)之布法羅大鼠(buffalo rat)用3mg/kg順鉑單獨或與0.4g/kg熱穩定四聚血紅素組合(順鉑+Hb)處理。在順鉑注射之前投予熱穩定四聚血紅素導致肝腫瘤之部分收縮。
實施例
藉助於描述本發明之特定具體實例提供以下實施例而不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
實施例1
肝癌細胞系之培養及試劑
使用HepG2及Huh7細胞系。在37℃下在具有10%胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素之DMEM(Invitrogen)中培養此等細胞。就常氧條件而言，在環境O2濃度及5% CO2下培育細胞；就低氧條件而言，在0.1-0.5% O2(Quorum FC-7自動CO2/O2/N2氣體混合器)及5% CO2下培育細胞。
實施例2
活細胞時移顯微術
將HepG2或Huh7細胞接種至玻璃底微孔皿(MatTek公司)上。使用配備有大氣/溫度控制室及用於多位置採集之電動平台的Zeiss Observer.Z1廣視野顯微鏡在限定縮放(63×，20×)下採集活細胞。在用0.1% O2及5% CO2(預混合)沖洗之封閉活細胞成像系統中進行培育。將用pcDNA3、pRFP-小窩蛋白1或pRFP-網格蛋白轉染之細胞暴露於HB-FITC 15min，隨後每3min採集影像持續2小時之時段。使用MetaMorph軟體(Molecular Device)將影像去捲積且壓縮成時移影片。
實施例3
細胞毒性分析
細胞生存力使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)增殖分析來量測。簡言之，將HepG2或Huh7細胞接種於96孔平底微板(6000個細胞/孔)中，且在37℃及5% CO2下在100μL生長培養基中培養24h。各孔中之細胞培養基隨後經100μL不含有其IC50濃度之藥物、單獨Hb或伴以另一化學治療劑之Hb的細胞生長培養基替換。培育Hb 24h，在37℃下 向各孔中添加20μL MTT標記試劑(5mg/mL於PBS溶液中)再持續4h。輕緩地移除生長培養基，且隨後向各孔中添加200μL DMSO作為溶解試劑，以完全溶解甲月朁晶體。藉由Multiskan EX(Thermo Electron公司)量測570nm波長下之吸光度，且各資料點表示來自一式三份孔之平均值±SD。
實施例4
RNA分離及定量即時PCR
使用Trizol試劑(Invitrogen)分離總RNA，且將5μg總RNA用寡dT引子及Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen)逆轉錄。在特定引子(展示如下)之情況下藉由SYBR Green PCR Master Mix套組(Applied Biosystems)，將第一股cDNA之十分之一用於HIF1 α、VHL、HSP90、VEGF、iNOS、ET1、HSP7c、RFC1、HMGB3及GAPDH轉錄物水準之定量量測。螢光信號在延長步驟期間藉由7900HT快速即時PCR系統(7900HT Fast Real Time PCR System)(Applied Biosystems)即時量測。閾值循環數(threshold cycle；Ct)定義為螢光信號達至基線之10倍標準差時之部分循環數(2至10個循環)。標靶基因相對於GAPDH對照基因之比率變化藉由2-△△Ct方法測定。
HIF1 α：
SEQ NO.1：正向引子：5-GGCGCGAACGACAAGAAAAAG-3(420-440)
SEQ NO.2：反向引子：5-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3(21-44)
SEQ NO.3：正向引子：CAGAGCAGGAAAAGGAGTCA(2414-2433)
SEQ NO.4：反向引子：AGTAGCTGCATGATCGTCTG(2645-2625)
SEQ NO.5：正向引子：5′-AATGGAATGGAGCAAAAGACAATT-3′(2694-2720)
SEQ NO.6：反向引子：5′-ATTGATTGCCCCAGCAGTCTAC-3′(2764-2743)
VEGF：
SEQ NO.7：正向引子：GCTACTGCCATCCAATCGAG(1187-1206)
SEQ NO.8：反向引子：CTCTCCTATGTGCTGGCCTT(1395-1376)
SEQ NO.9：正向引子：5′-CTCTCTCCCTCATCGGTGACA-3′(3146-3167)
SEQ NO.10：反向引子：5′-GGAGGGCAGAGCTGAGTGTTAG-3′(3202-3223)
SEQ NO.11：正向引子：ACTGCCATCCAATCGAGACC(1190-1209)
SEQ NO.12：反向引子：GATGGCTGAAGATGTACTCGATCT(1265-1241)
INOS：
SEQ NO.13：正向引子：5'-ACAACAAATTCAGGTACGCTGTG-3'(2111-2137)
SEQ NO.14：反向引子：5'-TCTGATCAATGTCATGAGCAAAGG-3(2194-2171)
SEQ NO.15：正向引子：GTTCTCAAGGCACAGGTCTC(121-140)
SEQ NO.16：反向引子：GCAGGTCACTTATGTCACTTATC(225-247)
ET1：
SEQ NO.17：正向引子：TGCCAAGCAGGAAAAGAACT(701-720)
SEQ NO.18：反向引子：TTTGACGCTGTTTCTCATGG(895-876)
HSP90：
SEQ NO.19：正向引子：TTCAGACAGAGCCAAGGTGC(640-659)
SEQ NO.20：反向引子：CAATGACATCAACTGGGCAAT(807-787)
SEQ NO.21：正向引子：GGCAGTCAAGCACTTTTCTGTAG(1032-1054)
SEQ NO.22：反向引子：GTCAACCACACCACGGATAAA(1230-1210)
VHL：
SEQ NO.23：正向引子：ATTAGCATGGCGGCACACAT(2806-2825)
SEQ NO.24：反向引子：TGGAGTGCAGTGGCATACTCAT(2921-2900)
實施例5
西方墨點分析
收集細胞，且測定蛋白質濃度。將蛋白質(30μg)在10% SDS-PAGE上解析，轉移至硝化纖維素膜(PVDF，BioRad)上。肌動蛋白用作內參考物。相對蛋白質表現水準藉由照膠系統(gel documentation system)(Ultra-Violet Product有限公司)定量。
實施例6
氧合之改良
(6a)正常組織中氧合之改良
進行藉由熱穩定四聚血紅素之正常組織氧合之一些研究(顯示於圖14中)。比較藥物動力學及藥力學研究在布法羅大鼠中進行。向雄性近親布法羅大鼠個別地投予0.2g/kg熱穩定四聚血紅素溶液或林格氏乙酸鹽緩衝液(ringer's acetate buffer)(對照物)。將血漿血紅素之濃度-時間特徵藉由HemocueTM光度計在1、6、24、48小時測定，且與基線讀數相比。該方法係基於血紅素之光度量測，其中血紅素之濃度直接以g/dL之形式讀出。氧分 壓(oxygen partial pressure；pO2)藉由OxylabTM組織氧合及溫度監測器(Oxford Optronix有限公司)在布法羅大鼠之後腿肌肉中直接量測。藉由腹膜內注射30-50mg/kg戊巴比妥(pentobarbitone)溶液使大鼠麻醉，繼而將氧感測器插入肌肉中。所有pO2讀數均藉由Datatrax2資料採集系統(World Precision Instrument)以即時方式記錄。結果顯示，在經靜脈內注射0.2g/kg熱穩定四聚血紅素之後，平均pO2值在15分鐘內自基線上升至約兩倍氧分壓相對平均值，且延長至6小時。此外，在注射後24至48小時，平均氧水準仍維持在超過基線值25%至30%(圖14B)。
(6b)極其低氧腫瘤區域中氧合之顯著改良
極其低氧腫瘤區域中之氧合之改良藉由人頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物模型評估。下嚥鱗狀細胞癌(FaDu細胞系)獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。向四至六週大之近親BALB/c AnN-nu(裸)小鼠中皮下注射大約1×106個癌細胞。當腫瘤異種移植物之直徑達至8-10mm時，腫瘤塊內之氧分壓(pO2)藉由OxylabTM組織氧合及溫度監測器(Oxford Optronix有限公司)直接監測。所有pO2讀數均藉由Datatrax2資料採集系統(World Precision Instrument)以即時方式記錄。當pO2讀數穩定時，經由小鼠之尾靜脈經靜脈內注射0.2g/kg熱穩定四聚血紅素溶液，且量測組織氧合。結果顯示，在經靜脈內注射0.2g/kg該熱穩定四聚血紅素之後，在3及6小時中分別觀測到超過6.5倍及5倍的平均pO2之顯著增加(圖15)。
實施例7
癌症治療研究：鼻咽癌中之顯著腫瘤收縮
在與X射線照射組合投予熱穩定四聚血紅素溶液之後觀測到顯著腫瘤 收縮(圖16A)。採用人鼻咽癌異種移植物模型。向四至六週大之近親BALB/c AnN-nu(裸)小鼠中皮下注射大約1×106個癌細胞(CNE2細胞系)。當腫瘤異種移植物之直徑達至8-10mm時，使帶有腫瘤之小鼠隨機化成如下三組：
組1：林格氏乙酸鹽緩衝液(對照組)
組2：林格氏乙酸鹽緩衝液+X射線照射(2Gy)
組3：熱穩定四聚血紅素+X射線照射(2Gy+Hb)
將帶有CNE2異種移植物之裸小鼠用X照射單獨(組2)或與熱穩定四聚血紅素組合(組3)照射。就X射線照射(組2及3)而言，藉由腹膜內注射50mg/kg戊巴比妥溶液使小鼠麻醉。2戈雷(Gray)X射線藉由直線加速器系統(Varian Medical Systems)向帶有腫瘤異種移植物之小鼠傳遞。就組3而言，經由尾靜脈向小鼠中經靜脈內注射1.2g/kg熱穩定四聚血紅素，隨後進行X射線處理。自處理第一天開始，每隔一天記錄腫瘤尺寸及體重。腫瘤重量使用方程式½×LW2計算，其中L及W表示腫瘤塊藉由數位測徑規(Mitutoyo株式會社，Tokyo,Japan)在各量測下量測之長度及寬度。組1為非處理對照組。結果(顯示於圖16中)顯示，在結合X照射用熱穩定四聚血紅素溶液處理之小鼠中觀測到CNE2異種移植物之顯著收縮(組3，圖16A)。
實施例8
癌症治療研究：肝腫瘤之顯著收縮
另外，在與順鉑組合投予熱穩定四聚血紅素溶液之後，觀測到顯著腫瘤收縮(圖16B)。採用大鼠正位肝癌模型。向布法羅大鼠中肝之左葉中注射大約2×106個標記有螢光素酶基因(CRL1601-Luc)之大鼠肝腫瘤細胞。 腫瘤生長藉由Xenogen活體內成像系統監測。在注射之後兩至三週，收集腫瘤組織，切割成小片且正位地植入第二組大鼠之左肝葉中。將帶有肝腫瘤之大鼠隨機化成如下三組：
組1：林格氏乙酸鹽緩衝液(對照組)
組2：林格氏乙酸鹽緩衝液+順鉑(順鉑)
組3：熱穩定四聚血紅素+順鉑(順鉑+Hb)
將植入有肝腫瘤組織之大鼠用3mg/kg順鉑單獨(組2)或結合熱穩定四聚血紅素(組3)處理。就組2及3而言，藉由腹膜內注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液使大鼠麻醉，且經由左門靜脈投予順鉑。就組3而言，經靜脈內注射0.4g/kg熱穩定四聚血紅素，隨後進行順鉑處理。組1為非處理對照組。重要的為，在處理之後3週觀測到肝腫瘤之顯著收縮(圖16B)。
實施例9
預防術後肝腫瘤復發及轉移之方法
手術切除肝腫瘤為肝癌之一線治療。然而，癌症之術後復發及轉移仍為此等患者中不利預後之主要屬性。舉例而言，先前研究報導，肝切除與50%之5年存活率但亦與70%復發率相關。對肝細胞癌(hepatocellular carcinoma；HCC)患者之跟蹤研究亦展現，在大約15% HCC患者中偵測到自原發性HCC之肝外轉移，其中肺為肝外轉移之最頻繁部位。已提出，手術壓力，尤其在肝手術期間引入之局部缺血/再灌注(IR)損傷為腫瘤進展之主要原因。常規地，外科醫師通常使用肝血管控制以防止在肝切除期間大出血。舉例而言，藉由夾緊肝門三體(普林格操作(Pringle maneuver))之入口閉塞已用於使失血最小化且減少圍手術期輸血之需要。近期日本研 究顯示，25%外科醫師按常規應用普林格操作。然而，普林格操作誘導剩餘肝中各種程度之局部缺血損傷，且與癌症復發及轉移相關。
IR損傷與腫瘤進展之關聯亦由先前動物研究支持。首先，IR損傷及肝切除對肝癌復發及轉移之效應展示於對正位肝癌模型之近期研究中。肝IR損傷及肝切除導致肝腫瘤之顯著復發及轉移。在結腸直腸肝轉移小鼠模型中獲得類似結果，其中IR損傷之引入加速結腸直腸肝轉移之發展。
先前，若干保護策略已經研究用以在切除期間減少IR損傷。舉例而言，在延長夾緊之前施加短時期之局部缺血(被稱為局部缺血預處理(ischemic preconditioning；IP))經提出以觸發肝細胞防衛機制，且已用於在肝切除期間減少IR損傷。其他應用間歇夾緊(intermittent clamping；IC)程序，其允許相繼為入口閉塞及再灌注之循環。兩種方法均經表明在經歷重大肝手術之非肝硬化患者中針對手術後肝損傷之保護中具有效性。然而，在腫瘤環境下，動物研究亦展示，IP無法保護肝免於由IR損傷誘導之加速腫瘤生長。另外，一些群組試圖使用諸如α-生育酚及抗壞血酸之抗氧化劑來保護肝免於IR損傷，從而預防肝轉移。然而，兩種抗氧化劑均無法限制由IR刺激之肝內腫瘤生長。
在機制上，不同跡象表明，低氧由於多種原因而與腫瘤復發及轉移相關：(1)研究展示，低氧腫瘤對輻射及化學療法抗性更大，經受住處理之腫瘤細胞易於復發；臨床跡象亦表明，具有更多低氧腫瘤區域之患者之轉移率更高；(2)在低氧條件下，經由活化低氧誘導性因子-1(HIF-1)途徑，癌細胞變得具更大攻擊性。此轉而觸發涉及促血管生成因子血管內皮生長因子(VEGF)及諸如c-Met及CXCR4之受體的互補反應，其增強細胞運動 性及復位至特定遠距器官；(3)近期研究亦展示，循環癌細胞(circulating cancer cells；CTC)在低氧條件下變得具更大攻擊性。癌症患者之外周血液中所偵測之循環腫瘤細胞經展示在遠距轉移情況下之患者中之疾病攻擊指數，同時低氧使得彼等細胞能夠成為具更大攻擊性之表型且降低細胞凋亡潛力。詳言之，具更大抗輻射性之癌症幹細胞群體在降低之氧水準下富集於腦腫瘤中。
因此，鑒於以上觀測及研究，本發明之交聯四聚血紅素用於預防肝切除之後的術後肝腫瘤復發及轉移。建立大鼠正位肝癌模型。肝細胞癌細胞系(McA-RH7777細胞)用於建立布法羅大鼠(雄性，300-350g)中之正位肝癌模型。圖17展示概述手術及血紅素產物投予程序之示意圖。向布法羅大鼠之肝囊中注射McA-RH7777細胞(大約1×106個細胞/100μL)以誘導實體腫瘤生長。兩週之後(當腫瘤體積達至約10×10mm時)，收集腫瘤組織且切割成1-2mm3立方體，且植入一組新的布法羅大鼠之左肝葉中。正位肝腫瘤植入之後兩週，大鼠經歷肝切除(帶有肝腫瘤之左葉)及部分肝IR損傷(在右葉上局部缺血30分鐘)。
兩組具有植入腫瘤組織之大鼠用於比較腫瘤復發及轉移。在組1中，用戊巴比妥使大鼠麻醉，且在局部缺血之前1小時經靜脈內投予0.2g/kg濃度為10g/dL之本發明之熱穩定四聚血紅素。藉由用動脈夾夾緊肝門靜脈及肝動脈之右支，於肝之右葉中引入局部缺血。隨後，於左肝葉中進行結紮，繼而切除帶有肝腫瘤之左肝葉。在局部缺血之後30分鐘，經由下腔靜脈注射另外0.2g/kg熱穩定四聚血紅素，繼而再灌注。在組2中，用相同程序注射林格氏乙酸鹽緩衝液作為媒劑對照物。在肝切除程序之後4週，殺死所 有大鼠。
為了檢驗腫瘤生長及轉移，在局部缺血/再灌注及肝切除程序之後4週對布法羅大鼠之肝及肺取樣用於形態檢驗。組織經收集、封口膜包埋及切片，繼而進行蘇木素及伊紅(Hematoxylin and Eosin；H&E)染色。局部復發/轉移(肝內)及遠距轉移(肺)藉由組織學檢驗確認。表2概述大鼠正位肝癌模型中在肝切除與IR損傷之後四週腫瘤復發/轉移之比較。
為了檢驗非聚合性熱穩定四聚血紅素對肝腫瘤復發及轉移之保護效應，在肝切除及IR程序之後4週殺死所有大鼠。收集肺及肝組織；比較兩組中肝腫瘤復發/轉移及肺中遠距轉移。結果展示，血紅素處理減少兩種器官中之復發及轉移之出現。
圖18展示在肝切除及局部缺血/再灌注程序之後IR損傷組之大鼠中誘導之肝內肝癌復發及轉移及遠距肺轉移及其使用本發明熱穩定四聚血紅素之保護的代表性實例。在圖18A中，在IR損傷組中觀測到廣泛肝內肝癌復發/轉移。遠距肺轉移亦出現在同一大鼠中(由實心箭頭指示)。在圖18B中，在IR損傷組中之另一情況中，觀測到肝內肝癌復發/轉移(由虛線箭頭指示)。在同一情況下觀測到廣泛肺轉移(由實心箭頭指示)。相比之下，圖18C展示在本發明熱穩定四聚血紅素處理之大鼠中對肝內肝癌復發/轉移及遠距肺轉移之保護的代表性實例。
圖19展示在肝切除及IR損傷程序之後四週在兩組中之組織學檢驗。在IR損傷及血紅素處理組中進行肝及肺組織之組織學檢驗(H&E染色)以確認腫瘤結節之標識。展示IR損傷組中肝內復發(T1及T2)及肺轉移(M)之代表性區域經展示(上)。展示處理組中之正常肝結構(N1)及血紅素處理之後肝中偵測到之腫瘤結節(T3)之組織學檢驗包括在內用於比較(下)。另外，未轉移之肺組織顯示於處理組(N2)中用於比較。
為了進一步確認熱穩定四聚血紅素對腫瘤復發及轉移之保護效應，研究局部缺血/再灌注及肝切除程序之後腫瘤之復發率及復發腫瘤之大小。再次，如圖17中所描述，在肝切除時之局部缺血之前及再灌注時，將具有藉由如上所述注射McA-RH7777細胞製備之植入腫瘤組織之大鼠用大約0.2-0.4g/kg本發明之熱穩定四聚血紅素或作為陰性對照物之林格氏乙酸鹽(Ringer's acetate；RA)緩衝液來經靜脈內處理。總共測試26隻大鼠，其中13隻大鼠用標的血紅素處理，且13隻為僅用RA緩衝液處理之陰性對照大鼠。在肝切除及IR程序之後4週殺死所有大鼠，檢驗測試大鼠之肝及肺的腫瘤復發/轉移，且量測復發腫瘤之相對大小。
圖20A展示測試大鼠中之肝腫瘤復發及個別復發腫瘤之體積。13隻未處理之對照大鼠中有9隻經歷肝腫瘤復發/轉移，而13隻經處理之大鼠中僅有4隻經歷腫瘤復發/轉移。亦顯而易見，在見到腫瘤復發時，已用標的血紅素處理之大鼠之復發腫瘤的大小顯著小於未處理之大鼠之復發腫瘤的大小。結果展示，如圖20B中所概述，在本發明之處理之情況下，腫瘤復發率極大地降低，且復發腫瘤大小顯著減小。
圖21說明已用標的本發明熱穩定四聚血紅素處理之大鼠及IR損傷(陰 性對照)組在肝切除及IR程序之後4週收集之肝及肺組織的代表性實例。如未處理之陰性對照組(大鼠C10及13)之代表性實例中所見，觀測到廣泛肝內肝癌復發/轉移及遠距肺轉移(圈出)。另一方面，如大鼠Y9、Y10及Y11中所見，藉由標的本發明血紅素之處理預防肝內肝癌復發/轉移及遠距肺轉移。
實施例10
用熱穩定四聚血紅素處理減少局部缺血
如實施例6中所展示，向低氧腫瘤經靜脈內注射標的熱穩定四聚血紅素顯著改良其中之氧合。因此，研究在腫瘤切除及IR程序期間標的血紅素產物之氧合效應。使用具有藉由注射McA-RH7777細胞製備之植入肝腫瘤組織之大鼠，且如圖17中所概述，其經歷手術及0.2-0.4g/kg標的血紅素產物或RA緩衝液投予程序。自標的血紅素產物/RA緩衝液第一次投予至肝腫瘤之時起且在整個IR程序、肝腫瘤切除期間及在再灌注之後量測肝之氧分壓。結果(圖22)展示，在引入局部缺血之後，觀測到氧合在標的血紅素處理之情況下增加。另外，如圖22中所見，在再灌注之後，已經標的血紅素處理之肝之氧分壓比未處理之肝之氧分壓高大約3倍。已經證實，在腫瘤切除時在局部缺血之前及在再灌注時，標的血紅素之處理相比於非處理顯著改良肝組織之氧合。鑒於在此項技術中提出之低氧腫瘤與腫瘤復發/轉移之增加可能性之間的強相關性、如此實施例中所展示的本發明血紅素產物在腫瘤切除程序期間之深遠氧合效應及其用途，明顯證實本發明血紅素產物對減少腫瘤復發及轉移之適用性。
實施例11
用熱穩定四聚血紅素處理降低循環內皮祖細胞水準
不同線路之研究已展示癌症幹細胞(CSC)及/或祖細胞群體在肝癌之進展中的重要性。重要的為，先前研究展示，在包括經歷肝切除患者之HCC患者中發現顯著較高水準之循環內皮祖細胞(EPC)。
因此，循環EPC之水準藉由諸如CD133、CD34及VEGFR2之表面分子之表現來評估。研究在用標的血紅素產物處理或不處理之情況下肝切除手術及IR程序後之循環內皮祖細胞水準。如圖17中所示，分別在肝切除時在局部缺血之前及再灌注時，使兩組具有植入肝腫瘤之大鼠經歷標的血紅素或RA緩衝液(對照物)之處理。隨後在肝切除及IR程序之後的0、3、7、14、21及28天量測兩組大鼠之循環EPC數目。結果(圖23)展示，儘管在手術後第0天-第3天期間處理組與非處理組之EPC水準相當，但血紅素處理組之EPC水準極大地低於RA緩衝液處理組之EPC水準。結果展示，標的血紅素之保護效應可減少腫瘤復發/轉移且使其最小化。
實施例12
熱穩定四聚血紅素在腫瘤塊內之定位
為了使熱穩定四聚血紅素在腫瘤塊內之定位可見，本發明血紅素用Alexa Fluor® 750 SAIVITM抗體標記系統根據製造商之指示標記。簡言之，將螢光標記之本發明血紅素(fl-Hb)以大約1：80之比率與未標記對應物混合。將混合物經靜脈內注射至帶有鼻咽癌異種移植物(C666-1)之裸小鼠中。就各裸小鼠而言，fl-Hb之量為大約0.2mg以確保足夠的螢光信號由Maestro2成像系統捕捉。為了分析，在不同時間點使裸小鼠麻醉，隨後暴露於Maestro2螢光成像系統。圖24展示集中在腫瘤異種移植物內之Hb的代表性影像(由 箭頭指示)。
實施例13
熱穩定四聚血紅素在喉癌中之輻射敏感效應
為了評估熱穩定四聚血紅素在頭頸癌中之輻射敏感效應，投予本發明之基於血紅素之氧載體一次，隨後進行輻射，且結果展示Hep-2喉癌模型中之腫瘤生長抑制效應。在實驗結束時，與輻射組合之高劑量Hb(2.2g/kg)之腫瘤體積為90.0mm3，其顯著小於對照組(336.1mm3)(P<0.01)。單獨輻射之腫瘤體積為143.1mm3，且投予高劑量Hb之組合q值為1.17，表明此組合之協同效應(q>1.15，協同效應)。圖25展示本發明之基於血紅素之氧載體繼之以輻射的腫瘤生長抑制效應。
實施例14
熱穩定四聚血紅素在鼻咽癌中之輻射敏感效應
為了評估熱穩定四聚血紅素在鼻咽癌中之輻射敏感效應，投予本發明之基於血紅素之氧載體一次，隨後進行輻射，且結果展示C666-1鼻咽癌模型中之腫瘤生長抑制效應。在實驗結束時，與輻射組合之高劑量Hb(2.2g/kg)之腫瘤體積為110.3mm3，相比於對照組(481.1mm3)顯著更小(P<0.01)，且相比於單獨輻射組(160mm3)亦顯著更小(P<0.05)。高劑量Hb之組合q值為1.24，表明此組合之協同效應(q>1.15，協同效應)。圖26展示本發明之基於血紅素之氧載體繼之以輻射的腫瘤生長抑制效應。
實施例15
熱穩定四聚血紅素在腦癌中之化學致敏效應
多形性膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme；GBM)為成人中原發性 腦腫瘤之最普遍類型，且為人類中攻擊性及致死性最大之惡性腫瘤之一，其特徵為生長迅速、具侵襲性且復發早。GBM患者之預後為極其不利的，中值存活為大約1年。儘管烷化劑替莫唑胺(TMZ)可顯著延長存活，但大部分患者由於原發(de novo)或後天TMZ抗性而出現腫瘤復發。
因此，研究Hb對多形性膠質母細胞瘤中之替莫唑胺誘導細胞毒性的致敏效應。在低氧(1%氧)條件下，將對替莫唑胺具敏感性(D54-S)及抗性(D54-R)之GBM細胞用各種濃度(0.015至0.03g/dL)之單獨Hb、單獨TMZ或以組合形式處理72小時，隨後進行細胞生存力分析。
結果展示，Hb活體外促進D54-S及D54-R GBM細胞中之TMZ誘導細胞毒性。圖27A展示不同處理條件之後D54-S及D54-R細胞之代表性96孔板。圖27B展示藉由Hb之TMZ誘導細胞毒性之劑量依賴性增強。
實施例16
藉由流動式細胞量測術分離癌症幹細胞
將乳癌細胞系(MCF7細胞)用CD24及CD44抗體標記，且藉由流動式細胞量測術使用PE及APC同型分析，其分別由488nm(藍色雷射)及633nm(紅色雷射)激發，且相應發射藉由585nm及660nm帶通濾波器量測。流動式細胞量測術結果展示，在總群體中高度表現CD44而非CD24之市售MCF7細胞之百分比僅為約0.5%。
為了獲得所需癌症幹細胞，在MammoCultTM中在未塗佈之皮氏培養皿(petri dish)上於懸浮液中培養MCF7細胞至少7至9天，隨後球體形成。培養基含有用於人乳腺球群細胞之MammoCult基本培養基及MammoCult增殖補充物。培養基亦經0.48μg/mL新溶解氫皮質酮(hydrocortisone)及4 μg/mL肝素(heparin)補充，隨後使用。每1-2天更換皮氏培養皿中之培養基，且可根據培養基之顏色來確定頻率。在顯微鏡下觀測細胞之形態。圖28展示在光學顯微鏡下在相差場中觀測到之細胞形態。相比於得自乳腺上皮細胞之中空乳腺球群細胞(E，對照物)，在向皮氏培養皿上傾注流動式分類MCF7細胞之後在生長之第9天至第20天觀測到實心乳腺球群細胞。 自我更新能力藉由使癌症幹細胞繼代約9代來進一步確認，且第0代之後的各後續繼代可能耗時約9-14天來發展成實心乳腺球群細胞。自一個繼代至另一繼代，實心乳腺球群細胞藉由化學(例如胰蛋白酶消化)或機械方法在無菌環境中分離成單一細胞(例如使用細胞刮刀自皮氏培養皿分離細胞結塊，隨後向上及向下進行移液操作)。自各繼代之單一細胞經收集用於進一步蛋白質分析以確認癌症幹細胞之標識及自我更新能力。圖29展示在不同繼代中收集之溶解細胞之西方墨點。在圖29A中，樣品1為來自乳腺球群細胞之未分類細胞，且樣品2為在第1代來自乳腺球群細胞之CD44+/CD24-分類細胞。在圖29B中，樣品1為來自乳腺球群細胞之未分類細胞，且樣品2、3及4分別為在第1、2及3代來自乳腺球群細胞之CD44+/CD22-分類細胞。根據西方墨點，來自乳腺球群細胞之未分類及分類細胞均經展示為表現幹細胞標記Oct-4(39kDa)及Sox-2(40kDa)。然而，此等標記在未分類與分類細胞之間的表現水準不同。明顯地，在同一代中CD44+/CD24-分類細胞比未分類細胞具有更高Oct-4表現水準。由於在各繼代中應用細胞分類以選擇CD44+/CD24-細胞，因此就自一個繼代至另一繼代之此等幹細胞標記之表現水準而言，癌症幹細胞之自我更新能力變得較高。
為了進一步檢驗癌症幹細胞之腫瘤引發能力，藉由用醛脫氫酶(ALDH) 抗體標記處於不同繼代之自乳腺球群細胞收集之細胞且用流動式細胞量測術分析標記細胞來研究ALDH活性。圖30A為對照組(用二乙基胺基苯甲醛(DEAB)(ALDH之抑制劑)培育之細胞)之分析結果；圖30B為在第0代收集之細胞的結果，其中其展示1%細胞群體具有ALDH活性；圖30C為在第3代收集之細胞的結果，其中其展示約8.7%細胞群體具有ALDH活性；在第5代收集之細胞具有約10-13%具有ALDH活性之群(圖30D)。在此分析中表明，自乳腺球群細胞分離之細胞具有腫瘤引發及自我更新能力，而自繼代至繼代在選擇壓力下其在癌細胞之細胞群體中具更大顯性。其亦與對癌症幹細胞之先前研究一致。
實施例17
基於血紅素之氧載體對癌症幹細胞之效應
為了測試基於血紅素之氧載體對腫瘤中之癌症幹細胞之效應，在低氧條件(5% CO2及1.1% O2)下培育MCF7細胞9-20天，隨後繼代至細胞分類器，其中使用兩種過濾器：PE-A用於CD24標記而APC-A用於CD44標記。細胞對CD44為陽性且對CD24為陰性之象限1(圖31)經分類用於進一步分析。
為了測試癌症幹細胞對單獨化學治療劑或對基於血紅素之氧載體與化學治療劑之組合療法的敏感度，向在例如第7及8代之隨後繼代獲得之自乳腺球群細胞分離之MCF7細胞投予不同組化學治療劑及/或本發明之基於血紅素之氧載體。在測試癌症幹細胞之敏感度之前，CD44+/CD24-對化學治療劑之抗藥性顯示於圖32中。將未分類MCF7細胞及CD44+/CD24-分類細胞用DMSO(作為對照物)及90nM紫杉醇培育16小時及4天。各組樣品 之相差影像(圖32)在各時間間隔(16小時及4天)取得，且在紫杉醇處理4天之後的分類細胞藉由MTT分析進一步測試(如實施例3中所描述)以確認此等細胞對化學治療劑之抗藥性。根據細胞形態，未分類及CD44+/CD24-分類細胞之乳腺球群細胞形成似乎均受90nM紫杉醇抑制。然而，用紫杉醇處理4天之後，分類細胞之MTT分析展示約96%存活，其意謂CD44+/CD24-分類細胞對單獨紫杉醇具有高抗性。
在乳腺球群細胞用不同化學品組合處理至少24小時之後，在乳腺球群細胞之胰蛋白酶消化之前，CSC對化學治療劑之高抗性藉由對自兩個繼代(P7及P8)之單一細胞之MTT分析結果進一步確認。乳腺球群細胞在低氧條件(5% CO2，1.1% O2)下生長以模擬腫瘤之生理環境。MTT分析中使用之不同化學品組合包括單獨Hb(0.2g/dL)、單獨硼替佐米(「Bort」，0.5μM)、單獨5-氟尿嘧啶(「5FU」，5μM)或以上各者之任何組合。在組合藥物(亦即Hb+至少一種化學治療劑)之情況下，將經胰蛋白酶消化之細胞用0.2g/dL Hb培育24小時，繼而添加預定化學治療劑，且再培育24小時。藉由光譜儀量測吸光度，且下表3中給出吸光度之正規化值。在正規化值中，「1」表示100%存活率；0.75表示75%存活率等。
在僅投予0.2g/dL Hb之組中，自兩個繼代之細胞存活率為約61-65%存活率。在單獨投予0.5μM硼替佐米之組中，自兩個繼代之細胞具有約78%-91%存活率。在單獨投予5μM 5FU之組中，自兩個繼代之細胞具有約72%-87%存活率。在投予0.2g/dL Hb+0.5μM硼替佐米之組中，自兩個繼代之細胞存活率為約38%-49%。在投予0.2g/dL Hb+5μM 5FU之組中，自兩個繼代之細胞存活率為約52%-72%。在投予0.5μM硼替佐米及5μM 5FU之組中，自兩個繼代之細胞存活率為約60%-64%。在投予0.2g/dL Hb+0.5μM硼替佐米及5μM 5FU之組中，自兩個繼代之細胞存活率為約33%-39%。藉由比較單獨投予一種化學治療劑之組及投予基於血紅素之氧載體與同一藥劑之組合之組，存活率在硼替佐米之情況下降低幾乎一半；存活率在5FU之情況下降低約17%至20%。儘管以硼替佐米與5FU之組合的細胞存活率為約60%-64%，但其仍相對高於經基於血紅素之氧載體及硼替佐米處理之細胞存活率。有趣的為注意到，單獨基於血紅素之氧載體可以與使用硼替佐米與5FU之組合幾乎相同之百分比殺死CSC。最後，在此測試中殺死CSC之最有效組合為基於血紅素之氧載體加硼替佐米及5FU，因為存活率僅為約33%-39%，其遠低於如本文所述之其他組合中之任一者。 然而應注意，與本發明之基於血紅素之氧載體組合投予之化學治療劑不限於硼替佐米或5FU。已經證實在治療癌症/腫瘤或諸如輻射療法之任何其他療法中不太有效的任何其他習知化學治療劑亦可與本發明之基於血紅素之氧載體組合使用，殺死CSC之功效得到改良。
必要時，本文中論述之不同功能可以不同順序及/或彼此同時進行。此外，必要時，上述功能中之一或多者可視情況存在或可經組合。
作為以上研究之結果，推斷在本發明之熱穩定四聚血紅素之情況下的治療對肝腫瘤之復發及在其他器官中之轉移均具有預防性效應。
儘管已針對各種具體實例描述前述發明，但該具體實例不具限制性。大量變化及修改將為一般技術者所理解。認為該變化及修改包括在以下申請專利範圍之範疇內。
儘管本發明之各種態樣陳述於獨立申請專利範圍中，但本發明之其他態樣包含來自所描述之具體實例及/或具有獨立申請專利範圍特徵之附屬申請專利範圍的特徵之其他組合，且不僅為明確陳述於該申請專利範圍中之組合。
本文中亦應注意，儘管以上描述本發明之例示性具體實例，但此等描述不應以限制意義來看待。確切地說，可在不背離如所附申請專利範圍中所定義之本發明範疇的情況下進行若干變化及修改。
<110> 黃炳鏐
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<223> DNA引子
<400> 24

Claims (28)

  1. 一種基於血紅素之氧載體醫藥組成物，其經配置以靶向於癌性組織或腫瘤之團塊內之癌細胞表面上表現的受體，以使得該基於血紅素之氧載體醫藥組成物觸發受體介導機制，以促進攝取及定位該基於血紅素之氧載體至該癌性組織或腫瘤之團塊內之癌細胞中，用於在包括自我更新及腫瘤引發的細胞之該癌性組織或腫瘤之細胞中誘導細胞凋亡以預防癌症復發，向該癌性組織或腫瘤提供氧化壓力或休克，且使該癌性組織或腫瘤對同時或隨後投予之化學治療劑或輻射療法敏感。
  2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其進一步包含與該基於血紅素之氧載體化學共軛之用於協同靶向該癌性組織或腫瘤及包括自我更新及腫瘤引發的細胞之癌性腫瘤細胞的化學治療劑。
  3. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該化學治療劑係選自5-氟尿嘧啶、硼替佐米(Bortezomib)、阿黴素(doxorubicin)、順鉑(cisplatin)或其任何組合。
  4. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該基於血紅素之氧載體係選自熱穩定交聯四聚血紅素、聚合血紅素或具有不可偵測量之二聚體濃度及低濃度變性血紅素(met-hemoglobin)之改質血紅素分子。
  5. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該受體介導機制為網格蛋白(Clathrin)介導之胞吞作用。
  6. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其在自有需要之個體手術移除腫瘤中之血液供應之破壞之前及/或血液供應之再建立期間向該個體投予。
  7. 如申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其在每kg該個體之體重大約0.2 g-1.2g的範圍內投予。
  8. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該癌性組織或腫瘤包含肝、乳腺、腦、結腸、肺、頭頸部、鼻咽及白血病。
  9. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該癌性組織或腫瘤為低氧的。
  10. 如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該交聯四聚血紅素之分子量為60-70kDa，且在添加有0.05-0.4%濃度之N-乙醯基半胱胺酸下經熱處理。
  11. 如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其不含血管收縮雜質及蛋白質雜質、為非致熱的、不含內毒素、不含磷脂、不含基質且變性血紅素水準小於5%。
  12. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該基於血紅素之氧載體經改質成具有更長半衰期以穿透至該癌性組織或腫瘤之團塊中，且向該癌性組織或腫瘤提供氧化壓力或休克，以使得在包括該自我更新及腫瘤引發的細胞之該癌性組織或腫瘤之細胞中誘導細胞凋亡。
  13. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該自我更新及腫瘤引發的細胞為癌症幹細胞及/或祖細胞(progenitor cell)。
  14. 如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中該基於血紅素之氧載體單獨或與至少一種化學治療劑及/或輻射療法組合投予，且其中該基於血紅素之氧載體作為輔助療法投予。
  15. 如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中該改質血紅素分子為聚乙二醇化血紅素分子。
  16. 一種藉由使用含有基於血紅素之氧載體之組成物來治療癌性組織及預防 癌性腫瘤之復發的方法，其中該組成物單獨或與至少一種化學治療劑組合向有需要之個體投予。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該組成物在癌性組織或腫瘤之移除期間或在此之後向該個體投予。
  18. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該癌性組織或腫瘤為肝、鼻咽、腦、結腸、肺、頭頸部、乳腺及白血病。
  19. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該癌性組織或腫瘤為低氧的。
  20. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該基於血紅素之氧載體為分子量為60-70kDa之交聯四聚血紅素，且在熱處理且添加0.05-0.4%濃度下之N-乙醯基半胱胺酸之後具熱穩定性。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該組成物在該熱處理及與該添加之N-乙醯基半胱胺酸反應之後，不含血管收縮雜質及蛋白質雜質、為非致熱的、不含內毒素、不含磷脂、不含基質且變性血紅素水準小於5%。
  22. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該組成物藉由在每kg體重大約0.2-1.2g之範圍內且以每kg體重每小時小於10ml之速率輸注來投予。
  23. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該至少一種化學治療劑係選自5-氟尿嘧啶、硼替佐米、阿黴素、順鉑或其任何組合。
  24. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該基於血紅素之氧載體與至少一種化學治療劑之組合經配置以協同靶向具有該癌性組織或腫瘤中之受體的表現之細胞，觸發受體介導機制，從而使該癌性組織或腫瘤中之細胞敏感，以使得更多基於血紅素之氧載體及化學治療劑由該細胞選擇性吸收，且定位於該細胞之細胞質中，而該細胞變得對該化學治療劑更敏感。
  25. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該基於血紅素之氧載體作為與該至少一種化學治療劑之輔助療法投予，用於向癌性組織或腫瘤之團塊提供氧化壓力或休克，及用於使該癌性組織或腫瘤對該化學治療劑敏感，以使得包括自我更新及腫瘤引發的細胞之該癌性組織或腫瘤中之細胞的細胞凋亡被誘導。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該自我更新及腫瘤引發的細胞為癌症幹細胞及/或癌性祖細胞。
  27. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該癌性組織或腫瘤包含肝、乳腺、腦、結腸、肺、頭頸部、鼻咽及白血病。
  28. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該受體介導機制為網格蛋白介導之胞吞作用。
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