JP6489517B2 - ガン幹細胞に対する分化促進薬及び脳腫瘍治療薬 - Google Patents
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Description
特許文献1、2においては、それぞれ所定のポリエーテル化合物、アセトアミノフェン誘導体が、所定の培地において乳ガンや肺ガン等のガン幹細胞を減少させたことが記載されている。また、特許文献3においては、抗ガン剤であるドキソルビシンに対して経口血糖低下剤であるメトホルミンを併用することにより、培養された乳ガン由来のガン幹細胞及び非ガン幹細胞を死滅させることが記載されている。
本発明は、このような新しい知見に基づいて達成されたものである。
本発明は以下のとおりである。
[1] メトホルミン又はその薬理学的に許容される塩の少なくとも1種を有効成分として含有し、脳腫瘍に含まれるガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化促進作用を示す分化促進薬。
[2] 前記ガン幹細胞がムサシ(musashi)、ネスチン(nestin)、bmi1及びsox2からなる群より選ばれる少なくとも1種の分子マーカーを発現するものである[1]に記載の分化促進薬。
[3] メトホルミン又はその薬理学的に許容される塩の少なくとも1種を有効成分として含有する脳腫瘍の治療薬。
[4] 前記脳腫瘍は、ムサシ(musashi)、ネスチン(nestin)、bmi1及びsox2からなる群より選ばれる少なくとも1種の分子マーカーを発現するガン幹細胞が含まれる[3]に記載の脳腫瘍の治療薬。
[5] 有効成分の投与量が500mg/日〜3000mg/日である[3]又は[4]に記載の脳腫瘍の治療薬。
[6] さらに、血中グルコース濃度を4.44mmol/L〜6.06mmol/Lに制御可能な成分を含む[3]〜[5]のいずれか1つに記載の脳腫瘍の治療薬。
[7] さらに、グルコース代謝拮抗薬を有効成分として含有する[3]〜[6]のいずれか1つに記載の脳腫瘍の治療薬。
[8] 前記グルコース代謝拮抗薬として、2−deoxyglucose、3−bromopyruvate及び3−bromo−2−oxopropionate−1−propyl esterからなる群より選ばれる少なくとも1種を含有する[7]に記載の脳腫瘍の治療薬。
[9] さらに、脳腫瘍に対する化学療法薬剤を有効成分として含有する[3]〜[6]のいずれか1つに記載の脳腫瘍の治療薬。
[10] 前記化学療法薬剤として、テモゾロミド、ニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ラニムスチン、プロカルバジン、ベバシズマブ、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、インターフェロン、メソトレキセート、シタラビンからなる群より選ばれる少なくとも1種を含有する[9]に記載の脳腫瘍の治療薬。
[11] メトホルミン又はその薬理学的に許容される塩の少なくとも1種を有効成分として用いる脳腫瘍の治療方法。
[12] 前記脳腫瘍は、ムサシ(musashi)、ネスチン(nestin)、bmi1及びsox2からなる群より選ばれる少なくとも1種の分子マーカーを発現するガン幹細胞が含まれる[11]に記載の脳腫瘍の治療方法。
[13] 有効成分の投与量が500mg/日〜3000mg/日である[11]又は[12]に記載の脳腫瘍の治療方法。
[14] さらに、血中グルコース濃度を4.44mmol/L〜6.06mmol/Lに制御可能な成分を含む[11]〜[13]のいずれか1つに記載の脳腫瘍の治療方法。
[15] さらに、グルコース代謝拮抗薬を有効成分として用いる[11]〜[14]のいずれか1つに記載の脳腫瘍の治療方法。
[16] 前記グルコース代謝拮抗薬として、2−deoxyglucose、3−bromopyruvate及び3−bromo−2−oxopropionate−1−propyl esterからなる群より選ばれる少なくとも1種を用いる[15]に記載の脳腫瘍の治療方法。
[17] さらに、脳腫瘍に対する化学療法薬剤を有効成分として用いる[11]〜[14]のいずれか1つに記載の脳腫瘍の治療方法。
[18] 前記化学療法薬剤として、テモゾロミド、ニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ラニムスチン、プロカルバジン、ベバシズマブ、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、インターフェロン、メソトレキセート、シタラビンからなる群より選ばれる少なくとも1種を用いる[17]に記載の脳腫瘍の治療方法。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
メトホルミンは、N,N−dimethylimidodicarbonimidic diamide(IUPAC命名法による物質名)(CAS登録番号;657−24−9)の別称であり、1,1−dimethylbiguanideとも呼ばれ、化学式C4H11N5(分子量129.164 g/mol)で表される。
また、メトホルミンの薬理学的に許容される塩としては、例えば、メトホルミン塩酸塩が挙げられる。下記構造で示されるメトホルミン塩酸塩は、商品名 メトグルコ(登録商標)として、大日本住友製薬株式会社等から販売されている。
なお、本明細書では、メトホルミン及びその薬理学的に許容される塩を、以下「メトホルミン」と総称することもある。
また、ガン幹細胞は、胚性幹細胞をはじめとする種々の幹細胞の維持に関与するタンパク質であり、分子マーカーの一種として使用されるbmi1(B lymphoma Mo−MLV insertion region 1 homolog)や、胚性幹細胞をはじめとする種々の幹細胞の維持に関与する転写因子であり、同様に分子マーカーの一種として使用されるsox2を発現することによっても特徴づけられる。
また、ガン幹細胞の基本概念として、ガン幹細胞から非ガン幹細胞への変化(分化)は不可逆的であることが前提とされている(Medema,Nat Cell Biol 2013;15:338−344)
つまり、ガン幹細胞をメトホルミンの存在下で培養することにより、メトホルミンを使用せずに培養した場合と比較して、A)その後の培養における浮遊細胞塊(sphere)形成能が低下、B)各種のガン幹細胞マーカーの発現が減少及び/又は消失、C)各種の分化マーカーの発現が上昇することが確認された。また、同様にメトホルミンの存在下と非存在下において一定期間培養した細胞をヌードマウスの脳内に移植したところ、メトホルミンの存在下で培養した細胞を移植した群において、有意に長い生存期間が観察された。
上記の結果は、いずれもメトホルミンの存在下で培養された細胞群においてガン幹細胞の割合(量)が低いことを示しており、メトホルミンがガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化を促進した結果であると理解することができる。このことから、メトホルミンはガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化を促進させる分化促進薬として機能することが把握される。
つまり、メトホルミンは原発性脳腫瘍の内の神経膠腫に相当するグリオブラストーマの組織に含まれるガン幹細胞に限定されることなく、bmi1、sox2、musashi、nestin等の分子マーカーが発現する脳腫瘍であれば、転移性脳腫瘍等の脳腫瘍においてもガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化を促進させる分化促進薬として機能することが把握される。
本発明は、メトホルミンが脳腫瘍の中でも悪性度の高いグリオブラストーマ等に由来するガン幹細胞に対しても分化促進作用を有意に示すことを見出しものであり、神経膠腫等の原発性脳腫瘍の治療に貢献することが期待される。
メトホルミンの投与により、ガン幹細胞を移植したヌードマウスが延命する理由は必ずしも明らかでないが、上記で説明したように、メトホルミンがガン幹細胞の分化促進効果を示すことが明らかであることから、ヌードマウスの体内においてもガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化が促進され、この結果として腫瘍形成能力を喪失させ、腫瘍の増大が抑制された結果であると推察される。
メトホルミンがガン幹細胞に作用してその腫瘍形成能力を喪失させ、脳腫瘍の動物モデルにおいてその全身投与が治療的効果をもたらすことはこれまで全く知られておらず、今回の知見はメトホルミンを利用したガン幹細胞を標的とする新規脳腫瘍治療の開発につながるものである。また、単にガン幹細胞を殺傷するのではなく、ガン幹細胞を非ガン幹細胞へと変容させることで不可逆的に腫瘍形成能力を喪失させる機構が機能する点も本発明に特徴的である。尚、本発明ではメトホルミンが単独でもガン幹細胞を標的とした治療効果をもつことが示された。
固体担体の例としては通常のゼラチンタイプのカプセルが用いられる。
これらのカプセル、錠剤、粉末は一般的に、製剤全質量に対して、5質量%〜95質量%、好ましくは5質量%〜90質量%の有効成分を含む。
液状担体としては、水、石油、ピーナツ油、大豆油、ミネラル油、ゴマ油、生理食塩水、デキストロール、類似のショ糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。
先に検討したように、メトホルミンの腫瘍の治療薬としての作用は、メトホルミンがガン幹細胞の分化促進効果を示すことに由来するものと推察され、腫瘍組織内で腫瘍形成能力を減退・喪失させる結果であると推察される。一方、実施例の結果に示されるように、メトホルミンはガン細胞に対する積極的な殺傷効果は有していないと考えられる。このため、メトホルミンを用いた治療方法としては、外科的処置により腫瘍を除去した後であって、残存腫瘍をわずかにした状態でメトホルミン投与を行い、残存腫瘍によるマクロ的な腫瘍組織の再発や転移の防止を主目的とした用法を採ることが好ましいと考えられる。
ガンを含め種々の疾患に付随する様々なストレスが高血糖状態を将来することはよく知られたところであり(Nomikos,J Clin Med Res. 2012 Aug;4(4):237−41)、こういった高血糖状態がメトホルミンのガン幹細胞への治療効果を阻害する可能性は十分に推察される。メトホルミン自体も糖尿病治療薬であることから血糖降下作用が期待されるが、本発明による結果に示されるとおり、他の血糖降下作用をもつ薬剤の併用や、あるいはグルコース代謝拮抗物質により細胞へのグルコース取り込みを阻害し血糖降下疑似状態を作り出すことで、メトホルミンのガン幹細胞に対する治療効果を増強することが可能である。本発明はこのようなグルコース代謝を標的とする治療薬とメトホルミンとを組み合わせた、ガン幹細胞に対する新規治療法をその一部として含む。
また、特に血中グルコース濃度は、4.44mmol/L〜5.22mmol/L(80mg/dL〜94mg/dL)に制御することがより好ましい。
ここで、本明細書において、血中グルコース濃度とは、空腹時血中グルコース濃度を意味する。なお、血中グルコース濃度は、採血後、通常の方法に従い、測定すればよい。
また、メトホルミンに、グルコース代謝拮抗薬を併用することがより好ましい。これにより、ガン幹細胞を標的とする腫瘍治療薬の治療効果を相乗的に向上できると期待される。
グルコース代謝拮抗薬としては、体内でのグルコース代謝を抑制する成分であれば特に制限はされない。グルコース代謝拮抗薬としては、具体的には、2−deoxyglucose、3−bromopyruvate及び3−bromo−2−oxopropionate−1−propyl ester等を挙げることができる。
これにより、本発明ではメトホルミンが単独でもガン幹細胞を標的とした治療効果をもつことが示された他、化学療法薬剤等の他の抗がん剤との併用療法が有効であることを示され、本発明はメトホルミンの単独使用と共に、他の抗がん剤との併用による神経膠腫等の脳腫瘍の治療をその一部として含んでいる。
メトホルミンと併用される化学療法薬剤は、治療の対象とされる腫瘍の治療効果が見込まれるものであれば特に制限はされない。メトホルミンと併用される化学療法薬剤としては、具体的には、神経膠腫に対する場合にはテモゾロミドの他、一般に脳腫瘍等に対して使用されるニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ラニムスチン、プロカルバジンなどのアルキル化剤、ベバシズマブなどの分子標的薬、シスプラチン、カルボプラチンなどの白金製剤、ブレオマイシン、インターフェロン及びメソトレキセート・シタラビン、ビンクリスチン等が挙げられる。
メトホルミンと併用される化学療法薬剤の投与量は、使用する化学療法薬剤の種類に応じて適宜設定することができるが、メトホルミンとの併用により生じる作用を考慮して、適宜調整されることが望ましい。
また、メトホルミンがガン幹細胞の非がん幹細胞への分化を促進していると考えられることから、上記化学療法薬剤の併用投与以外にも、放射線療法のような特に非がん幹細胞の殺傷を目的とする従来のガン治療法との併用も効果的であると考えられる。更に、メトホルミンをガン幹細胞の非がん幹細胞への分化を促進する他の分化促進薬と併用することも有効と考えられる。
また、メトホルミンがガン幹細胞の非がん幹細胞への分化を促進すること、及び、顕著な副作用を有しないことを利用して、特に、脳腫瘍等の外科的な処置のみによっては根治が困難な腫瘍に対して外科的処置、放射線治療、化学療法、その他従来一般的に施行されているガン治療法のみによっては根治が困難な脳腫瘍に対して、これらの治療を行った後の再発を防止するために、適宜の量を投与することも有効である。
[実施例1]
脳腫瘍のガン幹細胞の分化促進に対するメトホルミンの効果を調べるため、特に、原発性脳腫瘍を代表する神経膠腫、その中でも最も悪性度の高いグリオブラストーマの手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞培養細胞株(Matsuda, Sci Rep. 2012;2:516)を用いて以下の検討を行った。
脳腫瘍由来のガン幹細胞の重要な特徴の一つに通常の幹細胞培養条件下では培養皿に接着することなく浮遊細胞塊(sphere)を形成することが挙げられる(Dirks, Mol Oncol. 2010 Oct;4(5):420−30)。そこで、以下の検討では、この性質を指標にメトホルミンのガン幹細胞の分化促進効果を検討した。
結果を図1に示す。図1中、「1st passage」はsphere形成培養3日後のsphere数を示している。sphere形成培養開始3日後に細胞を分離し、1x103個の細胞を再度sphere形成条件で3日間培養した後のsphere数を「2nd passage」のsphere数として計測した。図中、「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示す。
図1に示された結果から明らかである通り、メトホルミンを洗浄により除去した後も、メトホルミンを含む培地で培養された細胞は、ガン幹細胞のsphere形成能を持続的に抑制していることが示されている。すなわち、メトホルミンはガン幹細胞によるsphere形成を抑制することが明らかとなった。この結果はメトホルミンがガン幹細胞を非ガン幹細胞に分化誘導している可能性、ガン幹細胞の増殖を著しく抑制している可能性の他、細胞を殺傷している可能性を示している。
メトホルミンによる細胞殺傷の有無について検討を行った。
実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を、グルコース濃度を26.2mMとした培地で3日間培養する際に、メトホルミンを含まない培地、及び1mM〜10mMの各濃度のメトホルミンを含む培地を使用し、培養後の生細胞数、死細胞数を計測した。細胞の生死は色素排除法により行い、細胞の生存率(cell viability)は生細胞数/(生細胞数+死細胞数)により算出した。
メトホルミン濃度を0mM,1mM,10mMとした培地における結果を図2に示す。本検討によれば、メトホルミン濃度が6mM以下の場合には細胞の生存率の低下は認められず、図2に示された結果から明らかである通り、実施例1で採用したメトホルミン濃度(1mM)では細胞の生存率の低下は認められなかった。
この結果を考慮すれば、実施例1の結果は、メトホルミンによる細胞の殺傷に起因したものでなく、ガン幹細胞が非ガン幹細胞に分化誘導され、及び/又は、ガン幹細胞の増殖が著しく抑制された結果であると推察される。
メトホルミンの存在下でのガン幹細胞の培養後における、ガン幹細胞の分化度に関する検討を行った。
脳腫瘍のガン幹細胞は一般的にsphereを形成するが、sphereを形成する脳腫瘍細胞が必ずしもガン幹細胞とは限らない。そこで実験に用いたガン幹細胞におけるガン幹細胞マーカー(Dahlrot,Int J Clin Exp Pathol. 2013;6(3):334−48)の発現を調べた。
実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Met)と含まない培地(Cont.)で3日間培養したのち細胞を回収した。Matsuda, Sci Rep. 2012;2:516に記載の方法に従い細胞中のタンパク質を溶出させ、各種タンパク質(Nestin、Musashi、Bmi1、GFAP、βIII−tubulin、Actin)の発現量をウエスタンブロット法により解析した。なお、Actinの発現量は等量のタンパク質が泳動されていることを確認するために解析した。
結果を図3に示す。図3に示された結果より明らかである通り、メトホルミンを含まない培地で培養したグリオブラストーマガン幹細胞(図3中、Cont.のレーン)は、Nestin、Bmi1、Musashiなどの幹細胞マーカーを発現していることが確認された。これに対し、メトホルミンを含む培地で培養したガン幹細胞(図3中、Metのレーン)では、これら幹細胞マーカーの発現が減少又は消失していた(図3中、Metのレーン)。また、ガン幹細胞をメトホルミンを含む培地で培養した場合には、神経細胞の分化マーカー(βIII−tubulin)、アストロサイトの分化マーカー(glial fibrillary acidic protein;GFAP)(Singh, Cancer Res. 2003 Sep 15;63(18):5821−8)が発現した。
さらにメトホルミンを含む培地での培養による、神経細胞の分化マーカー(βIII−tubulin)、アストロサイトの分化マーカー(GFAP)の発現に対する影響を、免疫細胞化学法により検討した。
実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Metformin)と含まない培地(Control)で3日間、6日間培養したところで固定を行い、免疫細胞化学法によりGFAP、及びβIII−tubulinの免疫染色を行った。同時に、ヘキスト染色により細胞核を染色することで、染色を受けた全細胞数を計数した。
結果を図4に示す。図4は全細胞数に対するGFAP、βIII−tubulin陽性細胞の割合を示している。なお、図中「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示す。
図4の結果から明らかである通り、メトホルミンを含む培地での培養によりβIII−tubulin及びGFAPのいずれの分化マーカーも発現の上昇が認められ、実施例3における結果と同様の傾向が確認された。
実施例3,4の結果は、いずれもメトホルミンが本来未分化なガン幹細胞を分化したガン細胞、すなわち非ガン幹細胞へと変質させていることを示している。このため実施例1で確認されたメトホルミンを含む培地での培養によるガン幹細胞によるsphere形成の抑制は、メトホルミンによりガン幹細胞が非ガン幹細胞へと分化した結果、sphere形成能を失ったことによると解される。
上記実施例1〜4において、メトホルミンによる分化誘導によりガン幹細胞がsphere形成能を失うことが推察された。一方、上記のとおり、ガン幹細胞は未分化であるとともに、腫瘍形成能をもつことを特徴とするガン細胞である。そこで、本実施例においては、メトホルミンによる分化誘導により、実際にガン幹細胞がその重要な性質である腫瘍形成能を失っているか否かについて検討を行った。なお、ガン幹細胞の基本概念において、ガン幹細胞から非ガン幹細胞への変化は不可逆的であることが前提とされている。
具体的には、ガン幹細胞をメトホルミンを含む培地での培養したものを、マウス脳内に移植して、その後の生存期間の変化により移植したガン細胞の腫瘍形成能を検討した。
実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Metformin)と含まない培地(Control)で3日間培養し、その後にメトホルミンを洗浄除去後、各々1x104個の細胞をヌードマウス脳内(各群5匹)に移植し、ヌードマウスが脳腫瘍死するまでの生存期間をカプランマイヤー生存曲線にて表した。なお、本明細書に記載したヌードマウスを用いた各種検討は、山形大学動物実験委員会の承認を得て行った。
結果を図5に示す。図中「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示す。
図5に示された結果より明らかである通り、メトホルミンを含まない培地で培養したガン幹細胞を移植した場合と比較して、メトホルミンを含む培地で培養したガン幹細胞を移植した場合のほうが、マウスが細胞移植後脳腫瘍により死亡するまでの期間、すなわち生存期間が延長することが示された。
なお、実施例2で示された通り、本実施例において作用させたメトホルミンの濃度が細胞死を誘導する濃度ではないことは明らかである。また、メトホルミン暴露は一時的であり移植時にはメトホルミンが除去されている。これらを考慮に入れると、実施例5で得られた結果は一過的なメトホルミンとの接触が、多くのガン幹細胞を、腫瘍形成能力をもたない非ガン幹細胞へと不可逆的に変化させたという考え方を支持している。つまり、メトホルミンを含む培地での培養によりガン幹細胞が非ガン幹細胞へと分化する結果、通常の幹細胞培養条件下におけるsphere形成能を失うと共に、生体内における腫瘍形成能力が失われると解される。
本実施例においては、上記で検討したメトホルミンが示すガン幹細胞の分化促進作用に関して、メトホルミンを作用させる際のグルコース濃度の影響を検討する。つまり、実施例1〜実施例5ではグルコース濃度が26.2mMの培養液を用いたのに対し、更に低いグルコース濃度におけるメトホルミンの効果を検証する。このグルコース濃度の培養液はグルコース濃度が17.5mMの市販の培養液(Invitrogen社から販売されているDMEM/F12培地、製品番号11320−082)にグルコースを添加して調製している。
実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Metformin+)と含まない培地(Metformin−)で培養した。その際、それぞれの場合の培養液として、グルコース濃度が17.5mMの市販の培養液(Invitrogen社から販売されているDMEM/F12培地、製品番号11320−082)、及び、当該培養液にグルコースを添加してグルコース濃度を26.2mMとした培養液の2種類を用いて培養を行った。それぞれ、3日間の培養の後に細胞を回収、細胞中のタンパク質を溶出し、各種タンパク質(βIII−tubulin、GFAP、Musashi、Sox2、Actin)の発現量をウエスタンブロット法により解析した。Actinの発現量は等量のタンパク質が泳動されていることを確認するために解析した。
結果を図6に示す。図6に示された結果より明らかである通り、グルコース濃度が26.2mMの場合と比較して、グルコース濃度17.5mMの条件下では幹細胞マーカー(Musashi、Sox2)の発現減少の程度と、分化マーカー(βIII−tubulin、GFAP)の発現亢進の程度が共に増強された。この結果は、メトホルミンを含む培地での培養によりガン幹細胞が非ガン幹細胞へと分化する程度は、培地中のグルコース濃度に影響を受け、グルコース濃度が低い場合に分化促進が増強されることが明らかとなった。
本実施例では、ガン幹細胞の培地での培養後における非ガン幹細胞の割合について、メトホルミンの有無、及びグルコース濃度の影響を免疫細胞化学法により調べた。
実施例6に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Metformin+)と含まない培地(Metformin−)で培養した。その際、それぞれの場合につき培地中のグルコース濃度を26.2mMと17.5mMとの2種類とした。それぞれ、3日間の培養の後に固定を行い、免疫細胞化学法によりβIII−tubulin、glial fibrilary acidic protein(GFAP)の免疫染色を行った。同時に、ヘキスト染色により細胞核を染色することで、染色を受けた全細胞数を計数した。
結果を図7に示す。図は全細胞数に対するGFAP、βIII−tubulin陽性細胞の割合を示している。図中「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示す。また、「n.s.」は統計学的有意差がないことを示す。
図7に示された結果より明らかである通り、メトホルミンを含まない培地においては、グルコース濃度によらず非ガン幹細胞の割合が1割程度であった。これに対して、メトホルミンを含む培地においては、グルコース濃度26.5mMでは4割程度のガン幹細胞が非ガン幹細胞に変化し、更に、グルコース濃度17.5mMでは8割近い細胞がこの時点で非ガン幹細胞へと変化していることが示唆された。
この結果から、メトホルミンがガン幹細胞を非ガン幹細胞へと分化促進する際に、細胞培養環境に存在するグルコース濃度が影響し、低いグルコース濃度において分化促進が増強されると解される。
上記の各実施例の結果から、メトホルミンはガン幹細胞を含む細胞群のsphere形成能を低下させること、及び、当該作用はメトホルミンがガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化を促進することに起因することが明らかになった。本実施例では、特にメトホルミンがガン幹細胞を含む細胞群に対して長期的に示すsphere形成能の低下作用について試験を行った。
実施例6に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Metformin+)と含まない培地(Metformin−)で培養した。その際、それぞれの場合につき培地中のグルコース濃度を26.2mMと17.5mMの2種類とした。それぞれ、3日間の培養の後にメトホルミンを洗浄除去し、1x103個の細胞をsphere形成条件での培養試験に用いた。
図8中、「1st passage」は、上記1x103個の細胞を用いてsphere形成培養を3日間行った後のsphere数を示している。更に、「2nd passage」は、当該「1st passage」でsphere数を計測した培地から1x103個の細胞を分離して再度sphere形成条件で3日間培養した後のsphere数を示す。以下、「3rd passage」、「4th passage」についても同様の要領でsphere数を計測した。なお、メトホルミンを除去した後の各培養試験においては、グルコース濃度を26.2mMで統一した。図中「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示し、「n.s.」は統計学的有意差がないことを示す。
図8に示された結果より明らかである通り、メトホルミンを含む培地のグルコース濃度が26.2mMの場合は、メトホルミンにより明らかなsphere形成能の低下効果が観察されるが、sphere形成実験を繰り返すとメトホルミンによって一旦抑制されたsphere形成能に回復傾向が見られる。これに対し、グルコース濃度が17.5mMの場合は、メトホルミンによるsphere形成抑制効果が、sphere形成実験を繰り返しても持続することが確認できた。
実施例6〜実施例8で示された結果はいずれも、メトホルミンがガン幹細胞を非ガン幹細胞に安定的に変化させる効率がグルコース濃度により大きく影響を受けるという考え方を支持している。また、低グルコース濃度環境等のメトホルミン暴露に適した環境でメトホルミンに暴露されたガン幹細胞を含む細胞群において、その後にも本来のsphere形成能を回復しにくいことは、メトホルミンが身体に対して低負担で有効に腫瘍の増殖を抑制できる可能性を示すものと考えられる。
上記実施例6〜8において、メトホルミンによるガン幹細胞の分化誘導によるsphere形成能の低下に、メトホルミン暴露の際のグルコース濃度が関連することが示された。そこで、本実施例では、ガン幹細胞をメトホルミンに暴露する際の培養液中のグルコース濃度が、実際の生体内でのガン幹細胞の腫瘍形成能の抑制に影響を与えるか否かについて検討を行った。
実施例6に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞を1mMのメトホルミンを含む培地(Metformin+)と含まない培地(Metformin−)で培養した。その際、それぞれの場合につき培地中のグルコース濃度を26.2mMと17.5mMの2種類とした。それぞれ、3日間の培養の後にメトホルミンを洗浄除去し、各々の培地に含まれる1x104個の細胞をヌードマウス脳内に移植し(各群5匹)、ヌードマウスが脳腫瘍死するまでの生存期間をカプランマイヤー生存曲線にて表した。
結果を図9に示す。図中「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示す。
図9に示された結果より明らかである通り、メトホルミンに暴露しない場合はグルコース濃度の如何にかかわらず40日程度の生存期間であったのに対し、メトホルミンに暴露した場合は、グルコース濃度が26.2mMの場合は約50日程度までの生存期間の延長が見られた。更に、グルコース濃度が17.5mMの場合は約70日にまで延長した。
この結果は、ガン幹細胞を非ガン幹細胞へと変化させることで腫瘍形成能を低下・喪失させるメトホルミンの効果が、細胞培養環境中のグルコース濃度の低下により増強されることを示し、実施例6〜8におけるsphere形成能についての検討結果を支持するものである。
上記実施例においては、培地において、メトホルミンがガン幹細胞を非ガン幹細胞へと分化させ、その結果としてガン幹細胞が示すsphere形成能や腫瘍形成能を低下・喪失させることが示された。本実施例では、実際の治療の観点から、全身的に投与されたメトホルミンが、生体内において上記実施例から期待される治療的効果をもつことができるかを検討した。
ガン幹細胞が元来移植により腫瘍を形成可能な細胞として定義されていることからも明らかなように、生体に形成された腫瘍中に存在するガン幹細胞の頻度を、信頼性をもって推定することのできる唯一広く認知された方法は腫瘍再移植実験である(Nguyen et, Nat Rev Cancer. 2012 Jan 12;12(2):133−43)。
まず腫瘍の形成を目視下に確認できるようにするためガン幹細胞をマウス皮下に移植し、腫瘍の形成が確認された後メトホルミンを10日間にわたり全身投与した。10日間のメトホルミン投与終了後、皮下腫瘍を摘出し、分離した腫瘍細胞の細胞数を変化させながら別のマウスの脳内に再移植した。
皮下腫瘍中にはガン幹細胞と非ガン幹細胞が存在し、再移植した腫瘍細胞の中にガン幹細胞が含まれる場合は脳腫瘍が形成され、マウスは脳腫瘍死することになる。そこでマウス脳内への腫瘍細胞の再移植後、マウスが脳腫瘍死するまでの生存期間を調べた。
メトホルミン治療群は500mg/kgのメトホルミンを1日1回腹腔内に投与した。
対照群は溶媒に用いたリン酸緩衝生理食塩水を1日1回腹腔内投与した。
両群とも10日間投与を行った後、最終投与の翌日皮下腫瘍を摘出、腫瘍細胞を分離した。
その後、1,000個、10,000個、100,000個の分離した細胞(No. of cells transplanted)を別に用意したヌードマウス脳内に移植した(各群5匹を使用)。結果を表1に示す。表1は脳内移植後160日の時点での各群の生存ヌードマウス数と、生存期間中央値(Median)を示す。
これらの結果はメトホルミンの全身投与が皮下腫瘍中に存在するガン幹細胞の割合を減少させたこと、ならびに10日間という期間限定のメトホルミン投与の効果が可逆的なものでなく、ガン幹細胞の腫瘍形成能力を長期安定的に喪失させるものであるという考えを裏付けるものであり、メトホルミンが生体内でガン幹細胞に作用し、治療的効果をもたらしうることを実証している。特に、メトホルミン全身投与群の皮下腫瘍に由来する腫瘍細胞を10000個程度、脳内に再移植した群において、その後に脳腫瘍の形成が見られなかった固体が有意に存在することは、当該再移植された腫瘍細胞内にガン幹細胞がほぼ含まれなかった結果であると推察される。つまり、上記結果は、メトホルミン単独のマウス全身投与により、ガン幹細胞の移植に起因する皮下腫瘍内において、ガン幹細胞が分化等により著しく減少したことを示すと推察される。
メトホルミンの全身投与が皮下腫瘍に与える作用を検証するため、本実施例では、実施例10に記載した方法でガン幹細胞を皮下に移植したヌードマウスに対して、メトホルミンを短期間(10日間)投与した際の、投与前後の皮下腫瘍の体積変化を検討した。
実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞をヌードマウス皮下に移植し、腫瘍が形成された時点でメトホルミン治療群(Metformin)と対象群(Control)の2群に分けた。
メトホルミン治療群は500mg/kgのメトホルミンを1日1回腹腔内に投与した。対照群は溶媒に用いたリン酸緩衝生理食塩水を1日1回腹腔内投与した。投与は10日間行った。メトホルミン治療開始時(Pre−treatment)と終了時(Post−treatment)に腫瘍体積([最長径]x[最短径]2/2)を測定した。
結果を図11に示す。図11に示された結果より明らかである通り、10日間の短期の試験においては、メトホルミン治療群においても腫瘍体積が3倍程度に増大することが観察された。増大の程度は、対象群と比較して小さいものの、その差は軽微であった。このことから、実施例10で観察されたメトホルミン投与による大幅な延命効果は、直接的なガン細胞の殺傷による腫瘍体積の縮小でなく、腫瘍内のガン幹細胞の割合の減少による、長期的観点での腫瘍体積の増大抑制にあると推察される。
実施例10においては、脳腫瘍に起因する腫瘍が皮下に形成されたヌードマウスにおいて、メトホルミンの全身投与により当該腫瘍組織に特定の変化が生じ、再び脳内に移植されて生じる脳腫瘍の進展を抑制可能であることが示され、当該腫瘍組織にメトホルミンが一定の治療効果を示すことが明らかにされた。
しかしながら、特に脳腫瘍の治療薬としてのメトホルミンの適用性を確認するためには、メトホルミンが血液脳関門を通過可能であることに加えて、メトホルミンが実際に治療効果を発揮するに足る濃度、持続時間で脳組織内の腫瘍細胞に作用できることが示される必要がある。
このため、本実施例では、脳実質内に移植した直後のガン幹細胞による脳腫瘍形成に対して、全身投与されたメトホルミンが示す治療効果を検討した。
このため、本実施例では、脳組織内に存在するガン幹細胞による脳腫瘍形成に対して全身投与されたメトホルミンが示す作用を調べるため、ヌードマウス脳内にガン幹細胞を移植後、翌日からすみやかにメトホルミンの全身投与を開始し、5日間ないし10日間で投与を中止した後ヌードマウスが脳腫瘍死するまでの生存期間を調べた。
具体的には、以下の方法により、生存期間の検討を行った。
すなわち、実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞(1x104個)をヌードマウス脳内に移植し、対象群(Control)、メトホルミン5日間治療群(Metformin,5days)とメトホルミン10日間治療群(Metformin,10days)の3群(各群5匹)に分け移植翌日から治療を開始した。
メトホルミン治療群は500mg/kgのメトホルミンを1日1回5日間又は10日間腹腔内に投与した。対照群は溶媒に用いたリン酸緩衝生理食塩水を1日1回10日間腹腔内投与した。ガン幹細胞の脳内移植から脳腫瘍死するまでの生存期間をカプランマイヤー生存曲線にて表した。結果を図12に示す。図中「*」は統計学的有意差(P<0.05)があることを示し、「**」は統計学的有意差(P<0.01)があることを示す。
実施例6〜実施例12で得られた結果は、メトホルミンが単独でガン幹細胞を標的とする治療に有用であり、特に脳腫瘍の治療に対しても有効であることを示している。
しかしながら実臨床では他の治療法と併用が必要となる状況、特に残存腫瘍が存在し殺細胞的な化学療法等を併用する必要がある状況が想定される。このため、このような他の治療法と併用される場合について、メトホルミンがガン幹細胞を標的とする治療薬として示す有効性についての情報は有用である。
具体的には、以下の方法により、生存期間の検討を行った。
すなわち、実施例1に記載の方法と同様の方法によりグリオブラストーマ手術摘出組織から直接樹立したガン幹細胞(1x104個)をヌードマウス脳内に移植し、対象群(Vehicle)、テモゾロミド単独治療群(TMZ)、メトホルミン単独治療群(Metformin)、テモゾロミドおよびメトホルミンの併用治療群(Met+TMZ)の4群(各群5匹)に分け、移植後10日の時点から治療的介入を開始した。
対照群は15日間にわたり1日1回溶媒であるリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内に、テモゾロミド単独治療群は1日1回テモゾロミド50mg/kgを5日間、続いてリン酸緩衝生理食塩水を10日間腹腔内に、メトホルミン治療群は1日1回メトホルミン500mg/kgを10日間、続いてリン酸緩衝生理食塩水を5日間腹腔内に、併用治療群はメトホルミン500mg/kgを10日間、続いてテモゾロミド50mg/kgを5日間腹腔内に、投与を行った。
結果を図13に示す。図13の結果は、ガン幹細胞の脳内移植からヌードマウスが脳腫瘍死するまでの生存期間をカプランマイヤー生存曲線にて表している。
図13に示された結果からも明らかである通り、併用治療群の生存率の高さは、テモゾロミド単独治療群、メトホルミン単独治療群、対照群のいずれと比較しても統計学的に有意であった(P<0.05)。この所見は、メトホルミンは単独のみならずテモゾロミドとの併用でもその治療効果を発揮しうることを示している。
Claims (13)
- メトホルミン又はその薬理学的に許容される塩の少なくとも1種を有効成分として含有し、生体内において脳腫瘍に含まれるガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化を促進するために使用される分化促進薬。
- 前記ガン幹細胞がムサシ(musashi)、ネスチン(nestin)、bmi1及びsox2からなる群より選ばれる少なくとも1種の分子マーカーを発現するものである請求項1に記載の分化促進薬。
- 有効成分の投与量が500mg/日〜3000mg/日である請求項1又は請求項2に記載の分化促進薬。
- さらに、血中グルコース濃度を4.44mmol/L〜6.06mmol/Lに制御可能な成分を含む請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の分化促進薬。
- さらに、グルコース代謝拮抗薬を有効成分として含有する請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の分化促進薬。
- メトホルミン又はその薬理学的に許容される塩の少なくとも1種を有効成分として含有し、前記有効成分の投与量が500mg/日〜3000mg/日である脳腫瘍の治療薬。
- 前記脳腫瘍は、ムサシ(musashi)、ネスチン(nestin)、bmi1及びsox2からなる群より選ばれる少なくとも1種の分子マーカーを発現するガン幹細胞が含まれる請求項6に記載の脳腫瘍の治療薬。
- 脳腫瘍に含まれるガン幹細胞の非ガン幹細胞への分化を促進することにより脳腫瘍を治療する請求項6又は請求項7に記載の脳腫瘍の治療薬。
- さらに、血中グルコース濃度を4.44mmol/L〜6.06mmol/Lに制御可能な成分を含む請求項6〜請求項8のいずれか1項に記載の脳腫瘍の治療薬。
- さらに、グルコース代謝拮抗薬を有効成分として含有する請求項6〜請求項9のいずれか1項に記載の脳腫瘍の治療薬。
- 前記グルコース代謝拮抗薬として、2−deoxyglucose、3−bromopyruvate及び3−bromo−2−oxopropionate−1−propyl esterからなる群より選ばれる少なくとも1種を含有する請求項10に記載の脳腫瘍の治療薬。
- さらに、脳腫瘍に対する化学療法薬剤を有効成分として含有する請求項6〜請求項11のいずれか1項に記載の脳腫瘍の治療薬。
- 前記化学療法薬剤として、テモゾロミド、ニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ラニムスチン、プロカルバジン、ベバシズマブ、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、インターフェロン、メソトレキセート、シタラビンからなる群より選ばれる少なくとも1種を含有する請求項12に記載の脳腫瘍の治療薬。
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