TWI607751B - Statin compounds for the treatment of gastric cancer - Google Patents

Description

他汀類化合物用於治療胃癌之用途

本發明係有關於一種化合物之第二用途，特別係指一種他汀類化合物(statins)用於治療胃癌之用途。

按，根據我國衛生福利部2013年之死因統計資料顯示，癌症係為十大死因之首，而胃癌係為十大癌症死因之第5位。胃癌之特徵在於胃部黏膜病變，產生潰瘍，進而使惡性腫瘤細胞於胃部生成。而胃部細胞不會自然凋亡，會持續地進行細胞分裂與增生，並且胃癌細胞於增生過程中會同時侵入正常細胞之生長範圍，進而逐漸侵襲胃部以及其他器官，引發癌症細胞移轉。由於大部分胃癌患者之發病部位為胃部遠端，並且，胃癌患者係沒有特定之臨床症狀，以至於多數胃癌患者被診斷之時點多為晚期胃癌，因此，胃癌之死亡率一直以來皆無法下降。

目前臨床上治療胃癌之方式包含有手術切除、化學治療、放射線治療及投予標靶藥物等，其中，最主要之治療方法係為外科手術，即便對於無法以手術根治之患者，仍會採取姑息性切除，以減緩腫瘤生長及預防腫瘤移轉。化學治療係透過將適當之抗癌藥劑投予至患者，達到殺死或控制癌細胞之目的，惟，目前研究指出化學治療對於胃癌之效果不佳，並且使用單一種藥物進行治療之療效僅有20%，即便使用多種藥物，仍無法達到預期之治療效果。放射線治療係使X光射線或粒子殺死癌細胞，而一 般來說，放射線治療係為輔助療法，多用以去除無法切除、殘留或肉眼看不見之癌細胞，僅能達到局部控制癌細胞之功效。標靶藥物乃為目前胃癌治療方法中之發展重點，目前研究發現對於胃癌檢體呈HER-2陽性染色者，投予HER-2標靶藥物之療效比傳統化學療法佳，但是，標靶藥物無法適應所有胃癌患者，且醫療費用高昂，導致於許多癌症患者無法負擔該藥物而錯失治療。

由上可知，目前臨床上仍缺少一種有效且具經濟效益之胃癌治療方法。基於新藥開發需要耗費大量金錢與時間，並且開發成功率低，以致於新藥開發不易，而即便成功研發出新藥，患者亦需付出較高額之治療費用始能使用新藥。因此，為能減少藥物開發成本並且增進開發效率，自現有藥物中篩選出安全性高及療效佳之抗胃癌醫藥組合物乃為目前研究者之重要課題。

本發明之主要目的在於提供一種他汀類化合物之用途，其係用以製造治療胃癌之醫藥組合物，而能有效地且安全地於臨床上使用。

本發明之另一目的係在於提供他汀類化合物之用途，其係用以降低藥物開發之成本，並且節省藥物開發之時間。

為能達成上述目的，本發明係自現有藥物中篩選出具有治療胃癌活性之他汀類藥物，藉由投予有效量之他汀類化合物至一罹患胃癌之個體，能夠有效地改善或治療胃癌。

於本發明之實施例中係揭露一種將他汀類化合物(statins)用於製造治療胃癌之醫藥組合物之用途，其中，他汀類化合物係能有效地 抑制胃癌細胞生長、移轉及侵襲、誘導胃癌細胞走向凋亡、負調控與胃癌發展相關之轉錄因子。因此，本發明所揭含有他汀類化合物之醫藥組合物確實具有治療胃癌之功效。

較佳地，該他汀類化合物係為洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀钠(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、帕伐他丁(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)或匹伐他汀(pitavastatin)。

第一圖係為AGS、MKN45及TSGH9201胃癌細胞株經不同濃度之他汀類藥物處理後之細胞活性。

第二圖A係為AGS胃癌細胞株以他汀類藥物處理不同時間之細胞活性。

第二圖B係為MKN45胃癌細胞株以他汀類藥物處理不同時間之細胞活性。

第二圖C係為TSGH9201胃癌細胞株以他汀類藥物處理不同時間之細胞活性。

第三圖A係為AGS胃癌細胞株以不同濃度他汀類藥物處理後，以流式細胞儀檢測其細胞數量之結果。

第三圖B係為MKN45胃癌細胞株以不同濃度他汀類藥物處理後，以流式細胞儀檢測其細胞數量之結果。

第三圖C係為TSGH9201胃癌細胞株以不同濃度他汀類藥物處理後，以流式細胞儀檢測其細胞數量之結果。

第四圖A係為AGS胃癌細胞株以不同濃度他汀類藥物處理後，以TUNEL檢測其細胞凋亡之結果。

第四圖B係為MKN45胃癌細胞株以不同濃度他汀類藥物處理後，以TUNEL檢測其細胞凋亡之結果。

第四圖C係為TSGH9201胃癌細胞株以不同濃度他汀類藥物處理後，以TUNEL檢測其細胞凋亡之結果。

第五圖係為以西方墨點法分析經他汀類藥物處理不同時間之AGS、MKN45及TSGH9201胃癌細胞，檢測各該胃癌細胞內調控調控胃癌細胞凋亡之蛋白質的表現情形。

第六圖A係為經不同處理之各組AGS胃癌細胞以transwell培養基培養12小時後，觀察分析各組AGS胃癌細胞之細胞轉移之結果。

第六圖B係為經不同處理之各組MKN45胃癌細胞以transwell培養基培養12小時後，觀察分析各組MKN45胃癌細胞之細胞轉移之結果。

第六圖C係為經不同處理之各組TSGH9201胃癌細胞以transwell培養基培養12小時後，觀察分析各組TSGH9201胃癌細胞之細胞轉移之結果。

第七圖A係為經不同處理之各組AGS胃癌細胞以膠體培養基培養16小時後，觀察分析各組AGS胃癌細胞之細胞轉移之結果。

第七圖B係為經不同處理之各組MKN45胃癌細胞以膠體培養基培養16小時後，觀察分析各組MKN45胃癌細胞之細胞轉移之結果。

第七圖C係為經不同處理之各組TSGH9201胃癌細胞以膠體培養基培養12小時後，觀察分析各組TSGH9201胃癌細胞之細胞轉移之結果。

第八圖A係將經不同處理之各組AGS胃癌細胞進行螢光染色，並且以共 聚焦顯微鏡觀察各組AGS胃癌細胞螢光染色之結果。

第八圖B係將經不同處理之各組MKN45胃癌細胞進行螢光染色，並且以共聚焦顯微鏡觀察各組MKN45胃癌細胞螢光染色之結果。

第八圖C係將經不同處理之各組TSGH9201胃癌細胞進行螢光染色，並且以共聚焦顯微鏡觀察各組TSGH9201胃癌細胞螢光染色之結果。

第九圖係以Rho蛋白質活性分析法檢測以不同條件處理12小時之各該組胃癌細胞的結果。

第十圖係以明膠基質金屬蛋白酵素活性分析法檢測各該組胃癌細胞內基質金屬蛋白酶2活性之結果。

第十一圖係以西方墨點法測定經他汀類藥物處理不同時間之各該組胃癌細胞中磷酸化之SATA3、波形蛋白、轉錄因子Snail以及轉錄因子Twist之表現。

第十二圖係以西方墨點法測定經不同條件處理之各該組胃癌細胞中磷酸化之SATA3、波形蛋白、轉錄因子Snail以及轉錄因子Twist之表現。

第十三圖係為他汀類藥物經常使用者與非使用者之胃癌總死亡率統計結果。

本發明係揭露一種他汀類化合物(statins)之用途，具體來說，由於該他汀類化合物係具有抑制胃癌細胞生長、移轉及侵襲之能力，並能夠使胃癌細胞趨向凋亡，因此，藉由投予含有效量他汀類化合物之醫藥組合物至一胃癌患者，能夠達到製造治療胃癌之功效。

除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之 技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。

所謂「他汀類化合物」，係為目前臨床上用以治療高血脂疾病之藥物，主要係藉由抑制肝細胞中膽固醇合成反應之關鍵酵素之活性，降低膽固醇之生成，並且能夠減少冠狀動脈心臟病之發生率及死亡率。而相對於其它降血脂藥物來說，他汀類合物之副作用較少，根據先前研究之統計，僅有少於5%之患者會出現明顯副作用，因此，他汀類化合物係被認為是安全性高之醫藥組合物。目前臨床上使用之他汀類化合物種類甚多，包含有洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀钠(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、帕伐他丁(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)等。基於他汀類化合物之作用機制皆相似，是以，於以下實例中係以辛伐他汀為例，惟，此非用以限制本案申請專利範圍。

更進一步來說，根據目前研究資料顯示，臨床上所使用之他汀類藥物最初使用的頻率為每日一次，劑量為2~80毫克，而後續持續使用的頻率為每日一次，劑量為1~80毫克。舉例來說，不同他汀類藥物之使用劑量會有所不同，如下表一所示。

所謂「醫藥組合物」，係包含一有效量之欲產生特定效果之所需化合物或活性成份，以及至少一藥學上能接受之載體。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，醫藥組合物之型態得隨著欲引起特定效果之投予方式有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著醫藥組合物之型態而得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。

所謂「有效量」，係指醫藥組合物內活性成份或化合物欲產生所求特定效果之量，通常以活性成份或化合物於醫藥組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予方式而有所不同。一般來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。

以下，為能更進一步說明本發明之功效，將茲舉若干實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。

實例一：他汀類化合物對癌症細胞活性之影響

取三種胃癌細胞株：AGS、MKN45及TSGH9201，分別進行培養，並將各該胃癌細胞株以濃度為0、1.25、2.5、5、10和20μg/ml之辛伐他汀(simvastatin)處理72小時。以細胞活性染色分析法(MTS assay)分析以不同濃度辛伐他汀處理之各該胃癌細胞株之活性，結果如第一圖所示。更進一步地，將該三種胃癌細胞株分別區分為兩組，其中，第一組係不處理辛伐他汀；第二組係以濃度為20μg/ml之辛伐他汀處理72小時。分別於經辛伐他汀處理第0、24、48及72小時時，以細胞活性染色分別分析各該胃癌細胞株之第一組及第二組之細胞活性，結果如第二圖所示。

再者，收集經不同濃度(0、1.25、2.5、5、10和20μg/ml)辛伐他汀處理之各該胃癌細胞株，分別以流式細胞儀檢測技術(Flow Cytometer，FCM)及TUNEL檢測法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)分析經不同濃度辛伐他汀處理之各該胃癌細胞株的DNA含量以及細胞凋亡之情形，結果分別如第三圖及第四圖所示。

由第一圖及第二圖之結果顯示，如辛伐他汀之他汀類化合物確實能夠降低胃癌細胞之活性，並且，當他汀類化合物之處理濃度增加或處理時間增加，胃癌細胞之活性亦會隨之越低。由第三圖及第四圖之結果可知，如辛伐他汀之他汀類化合物確實能夠誘導胃癌細胞走向細胞凋亡，因而能夠達到降低胃癌細胞活性及抑制胃癌細胞生長之功效。

綜合第一圖至第四圖之結果顯示，本發明所揭他汀類化合物係具有抑制胃癌細胞生長及誘導胃癌細胞凋亡之能力，而能夠作為治療或減緩胃癌及其病徵之醫藥化合物中的有效成份。

實例二：他汀類化合物對癌症細胞凋亡之影響

將該三胃癌細胞株：AGS、MKN45及TSGH9201，分別以濃度為20μg/ml之辛伐他汀處理後進行培養，並將分別培養0、2、6、12及24小時之各該位鹽細胞株以西方墨點法進行蛋白質特異性分析，用以觀察各該胃癌細胞株中調控胃癌細胞凋亡之蛋白質：MCL-1、BAX、Bcl-2、Bcl-xL、NOXA、PUMA、裂解之凋亡蛋白酶-3(cleaved caspase-3)以及裂解之PARP(cleaved PARP)之表現情況，結果如第五圖所示，其中，β肌動蛋白為對照組。

由第五圖之結果可知，辛伐他汀能夠抑制抗凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-1L之表現，且同時增進促進細胞凋亡蛋白：BAX、NOXA、PUMA及Mcl-1S之表現，並增加細胞凋亡之標記蛋白：凋亡蛋白酶-3及PARP。

由上述結果顯示，本發明所揭他汀類化合物係透過胃癌細胞中之粒線體路徑進行對於胃癌細胞凋亡之調控，而能使胃癌細胞走向凋亡，達到治療胃癌之功效。

實例三：他汀類化合物對癌症細胞轉移與侵蝕之影響

將該三胃癌細胞株：AGS、MKN45及TSGH9201，分別分為四組，其中，第一組為空白組；第二組係以濃度為5μg/ml之辛伐他汀處理細胞；第三組係以3mM之甲羥戊酸(mevalonate)處理細胞；第四組係同時以5μg/ml之辛伐他汀及3mM之甲羥戊酸處理細胞。將以不同條件處理之各該胃癌細胞株分別於細胞遷移transwell培養基培養12小時，用以觀察胃癌細胞轉移，結果如第六圖所示。另將經不同條件處理之各該胃癌細胞株分別於膠體培養基培養16小時，用以觀察胃癌細胞侵蝕，結果如第七圖所示。

由先前技術可知，纖維肌動蛋白(F-actin)為細胞骨架成份之一，亦為癌細胞移轉之重要生理組成物，因而得藉由觀察細胞中纖維肌動蛋白分析癌細胞移轉情形。是以，將各該胃癌細胞株之第一組至第四組分別以其處理條件處理12小時後，以玫瑰紅標記之鬼筆毒環肽(rhodamine labeled phalloidin)標記細胞骨架，及DAPI染劑染其細胞核，進行細胞螢光染色，再以共聚焦顯微鏡觀察螢光染色之結果，如第八圖所示，其中，藍色為細胞核染色之結果，紅色為纖維肌動蛋白(F-actin)染色之結果。

先前技術中揭露，Rho蛋白質屬於小G蛋白家族，具有與GDP結合之活化態及與GTP結合之非活化態，並且，Rho蛋白質之過度表現係與腫瘤發展及惡性程度有密切關聯性，因而得藉由觀察細胞內Rho蛋白質之表現，能夠用以分析腫瘤細胞之發展程度。因此，以Rho蛋白質活性分析法檢測以不同條件處理12小時之各該組胃癌細胞，結果如第九圖所示。

再者，將第一組至第四組之各該胃癌細胞株分別以不同條件處理後，於無血清培養基培養24小時，而後以明膠基質金屬蛋白酵素活性分析法(Gelatin zymogram assay)檢測各該組胃癌細胞內基質金屬蛋白酶9及基質金屬蛋白酶2之活性，結果如第十圖所示。由於基質金屬蛋白酶9及基質金屬蛋白酶2被認為與腫瘤轉移具有相關性，因此，藉由觀察細胞中基質金屬蛋白酶9及基質金屬蛋白酶2之活性，得用以檢測辛伐他汀對於腫瘤細胞移轉之影響。

由第六圖及第七圖之結果可知，相較於其他三組，經辛伐他汀處理之第二組，其胃癌細胞移轉及侵襲之現象確實下降。由第八圖之結果發現，於第一組、第三組及第四組中，胃癌細胞之細胞骨架係呈絲狀交 錯排列，而相較於其他組別，第二組之胃癌細胞外型係明顯改變，細胞骨架結構較為鬆散、染色較淡，並且明顯可看出細胞骨架含量變少。

另由第九圖之結果可知，經由辛伐他汀處理之第二組，RhoA-GTP之活化被抑制，更增進RhoA-GDP之失去活性。以及，由第十圖之結果可知，經由辛伐他汀處理之第二組，胃癌細胞中之基質金屬蛋白酶2係明顯被抑制，又以經辛伐他汀處理之AGS胃癌細胞之抑制效果最為顯著。

綜合第六圖至第十圖之結果可知，本發明所揭他汀類化合物除能夠抑制胃癌細胞生長外，更能抑制胃癌細胞轉移並且侵襲其他細胞。據此，本發明所揭他汀類化合物係具有治療或改善胃癌及其相關病徵之功效。

實例四：他汀類化合物能負調控上皮間質化標誌(epithelial to mesenchymal transition marker，EMT marker)

由於轉錄因子SATA-3與Twist為胃癌細胞發展之關鍵調節因子，因此，將該三胃癌細胞株：AGS、MKN45及TSGH9201，分別以濃度為5μg/ml之辛伐他汀處理0、6、12、24小時後，以西方墨點法測定經辛伐他汀處理不同時間之各該細胞中磷酸化之SATA3、波形蛋白(vimentin)、轉錄因子Snail以及轉錄因子Twist之表現，結果如第十一圖所示。

更進一步地，將該三胃癌細胞株：AGS、MKN45及TSGH9201分別分為四組，而各該組之處理條件係如實例三中所述，並且，依據各該組之處理條件處理胃癌細胞24小時後，以西方墨點法測定各該組胃癌細胞中磷酸化之SATA3、波形蛋白(vimentin)、轉錄因子Snail以及轉錄因子Twist之表現，結果如第十二圖所示。

由第十一圖可知，辛伐他汀係能使調控胃癌細胞發展之轉錄因子表現量下降，並且，隨著處理時間增加，轉錄因子之表現量亦隨之下降。而由第十二圖之結果可知，第一組、第三組及第四組之胃癌細胞中與胃癌發展相關之轉錄因子，其表現量係分別無下降之趨勢。相較於此，第二組之胃癌細胞中與胃癌發展相關之轉錄因子係明顯下降。

由上述結果顯示，本發明所揭他汀類化合物確實能夠抑制胃癌細胞繼續發展，而能達到治療或改善胃癌及其相關病徵之功效。

實例五：統計分析

自台灣全民健康保險研究資料庫(National Health Insurance Research Database，NHIRD)之入院診斷資料及經登記之重大傷病患者數據庫中，取胃癌患者之數據資料，並且依據下列流程進行分析：首先，篩選出於1997年1月1日至2011年12月31日間，初診之主要診斷為胃癌且登記註冊於重大傷病患者數據庫之患者，共有44259位。再對於符合上述資格之44259位患者分別進行鑑定，發現共有15582位患者未接受胃部手術及166位患者皆受過非胃癌手術之治療，因而篩選出接受過胃癌治療及進行過胃癌手術之患者，共28511位。自該28511位患者中排除於胃癌手術前，診斷出罹患其他腫瘤之患者，剩下26806位患者，再排除追蹤時間不滿3個月之患者，最後剩下25010位患者。將該25010位患者依據其施予他汀類藥物之頻繁程度分為3組，其中，非使用組有22867位患者；經常使用組有1176位患者；使用組有967位患者。透過使用他汀類藥物之傾向及持續投藥3個月後，將經常使用組與非經常使用組以1：4比例分配，分成非使用組具4484位患者，經常使用組具1121位患者，其中，患者之數據如下表二所示。將上述 患者持續進行統計分析之結果係如第十三圖及下表三及四所示，顯示經常使用他汀類藥物之患者的八年後之總生存率為61.08%，而非使用他汀類藥物之患者的八年後之總生存率為47.07%。而其中，他汀類藥物之使用劑量係如上表一所示。

綜合上述各實例之結果顯示，本發明所揭含有他汀類化合物之醫藥組合物確實能夠治療或改善胃癌及/或其相關病徵，並且，相較於先前技術所揭者，本發明所揭醫藥組合物不僅能夠降低生產成本，更能夠提供胃癌患者較佳之預後存活率及存活年數。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

Claims (6)

1. 一種將他汀類化合物(statins)用於製造治療胃癌之醫藥組合物之用途，其中，該他汀類化合物係選自由洛伐他汀(lovastatin)及辛伐他汀(simvastatin)所組成之群。
2. 一種將他汀類化合物(statins)用於製造抑制胃癌細胞轉移之醫藥組合物之用途，其中，該他汀類化合物係選自由洛伐他汀(lovastatin)及辛伐他汀(simvastatin)所組成之群。
3. 依據申請專利範圍第1或2項所述用途，其中，該他汀類化合物之起始劑量係為2~80毫克/每天一次，維持劑量係為1~80毫克/每天一次。
4. 一種將他汀類化合物(statins)用於製造抑制與胃癌發展相關轉錄因子表現之醫藥組合物之用途，其中，該與胃癌發展相關轉錄因子係為上皮間質化標誌，並且，該他汀類化合物係選自由洛伐他汀(lovastatin)及辛伐他汀(simvastatin)所組成之群。
5. 依據申請專利範圍第3項所述用途，其中，該該與胃癌發展相關轉錄因子係選自由SATA-3及Twist所組成之群。。
6. 依據申請專利範圍第3項所述用途，其中，該他汀類化合物之起始劑量係為2~80毫克/每天一次，維持劑量係為1~80毫克/每天一次。