TWI736173B - 牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物、牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物的化合物及其用於治療缺血性腦中風的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物、牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物的化合物及其用於治療缺血性腦中風的用途。

Description

牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物、牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物的化合物及其用於治療缺血性腦中風的用途

本發明是有關於一種牛樟芝萃取物、牛樟芝萃取物的化合物及其用於治療缺血性腦中風的用途。

中風為台灣十大死因中排名第三位，WHO列中風為「全球第二大死因」，全球2005年有五百八十萬人因為中風死亡，2015年預計會有六百五十萬因中風死亡。台灣已漸漸步入老化的社會結構，而老化卻是引起中風疾病的重要危險因子，根據本土中風中心的健康醫療資料，大於80歲的老人，中風風險是30歲以下年輕人的384倍。

缺血性中風為腦部血液供應異常所導致的腦部功能快速發展喪失。醫學上又稱為腦血管意外(cerebrovascular accident,CVA)，起因於腦部的血液供應受到破壞，使得腦局部細胞無法獲得足夠的養分和氧氣，造成神經的機能受損。中風可分為出血性中風(hemorrhage stroke)及缺血性中風(ischemia stroke)。一般而言，缺血性中風約佔80%，而出血性中風約佔20%，且兩者起因相當不同。出血性中風則為腦血管破裂所導致之腦出血，通常死亡率較高。而缺血性中風為腦部血液流通不良或阻塞造成的腦局部缺血，死亡率通常較低，但容易導致神經行為能力方面的損害。

在美國FDA於1996年核准靜脈血栓溶解劑(rt-PA)治療中風後，rt-PA是目前臨床上治療缺血性中風的唯一藥物，rt-PA的作用機制是將栓塞的組 織血塊溶解以達到血液恢復通暢，其會令使用rt-PA的患者腦出血的機率增加10倍。此外，缺血性中風患者身體所造成的傷殘傷害，衍生的問題便是造成家庭的人力照護與經濟負擔，也造成國家的醫療經濟負擔。因此，為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有治療中風功效之新穎醫藥品以造福有此需求的廣大族群，期可減少缺血性中風所導致之神經細胞損害，進而提升缺血性中風之治療效果。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種牛樟芝(Antrodia camphorata)萃取物，包含麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol,EK100)，其中該牛樟芝萃取物是以一萃取溶劑對一牛樟芝的菌絲體進行萃取而製得，該萃取溶劑是用甲醇或乙醇、其萃取物用乙酸乙酯(或正己烷)與水做分配萃取，取乙酸乙酯可溶層(或正己烷可溶層)。

本發明之另一目的為提供一種牛樟芝(Antrodia camphorata)萃取物用於製備一治療中風的醫藥品之用途，其中該牛樟芝萃取物包含麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol,EK100)，該牛樟芝萃取物是以一萃取溶劑對一牛樟芝的菌絲體進行萃取而製得，該萃取溶劑是甲醇或乙醇、其萃取物後用乙酸乙酯(或正己烷)與水做分離，取乙酸乙酯可溶層(或正己烷可溶層)或其組合。

本發明之另一目的為提供一種化合物用於製備一治療中風的醫藥品之用途，其中該化合物為麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol,EK100)。

在本發明的一實施例中，該治療中風是治療腦中風。

在本發明的一實施例中，該治療腦中風是治療腦缺血性中風損傷。

在本發明的一實施例中，該治療腦缺血性中風損傷包含透過抑制神經細胞發炎和凋亡來減緩急性缺血性中風後腦梗死及血腦障壁(blood brain barrier,BBB)損傷。

在本發明的一實施例中，該治療腦缺血性中風損傷包含透過抑制GSK-3及藉由活化PI3K/Akt信號傳遞活化β-鏈蛋白(β-catenin)以促進內生性神經再生。

在本發明的一實施例中，該牛樟芝液態發酵菌絲體萃取物的有效濃度為至少0.3g/kg。

在本發明的一實施例中，該麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)是純化自一牛樟芝萃取物，該牛樟芝萃取物是以一萃取溶劑對一牛樟芝的菌絲體進行萃取而製得，該萃取溶劑是甲醇或乙醇、乙酸乙酯、正己烷或其組合。

本發明之另一目的為提供一種化合物用於製備一增強治療中風藥物的效用之促效劑的用途，其中該化合物為麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)。

在本發明的一實施例中，該治療中風藥物是取甲醇或乙醇，其乙酸乙酯可溶部(或正己烷可溶部)及其主成分麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol,EK100)單獨或組合而合成組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)。

在本發明的一實施例中，該麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)的有效濃度為至少60mg/kg。

綜上所述，本發明牛樟芝萃取物及其化合物之功效在於可透過抑制神經細胞發炎和凋亡減緩急性缺血性中風後腦梗死和血腦障壁損傷、透過抑制GSK-3及藉由活化PI3K/Akt信號傳遞活化β-鏈蛋白(β-catenin)來促進內生性神經再生、及保護神經元，達到治療中風(特別是腦缺血性中風損傷)及增強治療中風藥物的效用之功效。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1是本發明的實驗方案流程圖，其中MCAO表示右大腦中動脈閉塞。

圖2是本發明牛樟芝萃取物與其化合物在減緩小鼠急性缺血性中風後腦梗死上的效用之示意圖，其中S表示假手術組；Veh表示媒液組；Et(0.3)表示乙酸乙酯層萃取物組1，即投藥0.3g/kg乙酸乙酯層萃取物；Et(0.6)表示乙酸乙酯層萃取物組2，即投藥0.6g/kg乙酸乙酯層萃取物；EK60表示EK100組1，即投藥60mg/kg EK100；EK120表示EK100組2，即投藥120mg/kg EK100；TPA表示TPA組(rt-PA)；TPA/EK60表示組合組；*表示p<0.05。

圖3A及圖3B是本發明牛樟芝萃取物與其化合物在透過抑制發炎細胞閉合蛋白減緩小鼠缺血性中風損傷和血腦障壁(blood brain barrier,BBB)損傷上的效用之示意圖，其中S或Sham表示假手術組；Veh表示媒液組；Et(0.3)或EtOAc-AC(0.3)表示乙酸乙酯層萃取物組1；Et(0.6)或EtOAc-AC(0.6)表示乙酸乙酯層萃取物組2；EK60表示EK100組1；EK120表示EK100組2；TPA表示TPA組(rt-PA)；TPA/EK60表示組合組；†表示與假手術組相比，p<0.05；*表示與媒液組相比，p<0.05。

圖4A及圖4B是本發明牛樟芝萃取物與其化合物在透過抑制發炎細胞p65 NF-κB減緩小鼠缺血性中風損傷上的效用之示意圖，其中S或Sham表示假手術組；Veh表示媒液組；Et(0.3)或EtOAc-AC(0.3)表示乙酸乙酯層萃取物組1；Et(0.6)或EtOAc-AC(0.6)表示乙酸乙酯層萃取物組2；EK60表示EK100組1；EK120表示EK100組2；TPA表示TPA組(rt-PA)；TPA/EK60表示組合組；†表示與假手術組相比，p<0.05；*表示與媒液組相比，p<0.05；#表示與TPA組(rt-PA)相比，p<0.05。

圖5A及圖5B是本發明牛樟芝萃取物與其化合物在透過抑制發炎及細胞凋亡標記減緩小鼠缺血性中風損傷上的效用之示意圖，其中S或Sham表示假手術組；Veh表示媒液組；Et(0.3)或EtOAc-AC(0.3)表示乙酸乙酯層萃取物組1；Et(0.6)或EtOAc-AC(0.6)表示乙酸乙酯層萃取物組2；EK60表示EK100組1；EK120表示EK100組2；TPA表示TPA組(rt-PA)；TPA/EK60表示組合組；†表示與假手術組相比，p<0.05；*表示與媒液組相比，p<0.05；#表示與TPA組(rt-PA)相比，p<0.05。

圖6A及圖6B顯示牛樟芝萃取物與其化合物在小鼠急性缺血性中風後促進內生性神經再生上的效用，其中S或Sham表示假手術組；Veh表示媒液組；Et(0.3)或EtOAc-AC(0.3)表示乙酸乙酯層萃取物組1；Et(0.6)或EtOAc-AC(0.6)表示乙酸乙酯層萃取物組2；EK60表示EK100組1；EK120表示EK100組2；TPA表示TPA組(rt-PA)；TPA/EK60表示組合組；†表示與假手術組相比，p<0.05；*表示與媒液組相比，p<0.05；#表示與TPA組(rt-PA)相比，p<0.05。

圖7A及圖7B顯示牛樟芝萃取物與其化合物在小鼠急性缺血性中風後(於第24小時)促進神經再生相關蛋白質水準上的效用，其中S或Sham表示假手術組；Veh表示媒液組；Et(0.3)或EtOAc-AC(0.3)表示乙酸乙酯層萃取物組1；Et(0.6)或EtOAc-AC(0.6)表示乙酸乙酯層萃取物組2；EK60表示EK100組1；EK120表示EK100組2；TPA表示TPA組(rt-PA)；TPA/EK60表示組合組；†表示與假手術組相比，p<0.05；*表示與媒液組相比，p<0.05。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

依據本發明，所有實驗數據均以平均值±S.E.M.(平均值的標準誤)。使用單因子變異數分析(ANOVA)，然後採用事後Student-Newman-Keuls(S-N-K)t檢定對數據進行分析，以進行多個比較。對於所有成對的多重比較，使用對數排序法(Log-Rank)檢驗，然後採用Holm-Sidak方法評估存活率。p<0.05的值被認為具有統計上顯著性。

依據本發明，牛樟芝(Antrodia camphorata)又名牛樟菇、樟菇、窟內菰、及神明菇，是一種藥用真菌，為擬層孔菌科(Fomitopsidaceae)薄孔菌屬(Antrodia)的一種真菌，僅原生於台灣。

本文所述之「有效濃度」係表示能直接治療患有中風之個體所需醫藥品的數量。有效濃度依所治療的生物種類或個體差異而可能不同，但可藉由例如濃度遞增試驗(concentration escalation)以實驗決定其有效濃度。

如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。

依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。

依據本發明，醫藥品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

實施例1. 牛樟芝(Antrodia camphorata)萃取物與其化合物的製備及其在治療腦中風(brain infarction)上的效用評估

首先，本發明牛樟芝萃取物及其化合物的製備流程如下：參考Y.Y.Shao,C.C.Chen,H.Y.Wang,H.L.Chiu,T.H.Hseu and Y.H.Kuo,Chemical constituents of Antrodia camphorata submerged whole broth,Nat.Prod.Res.,2008,22,1151-1157文獻當中所述方法進行牛樟芝萃取物及其化合物的製備。簡言之，準備4.782kg的牛樟芝(Antrodia camphorata)菌絲體粉末，然後用甲醇(methanol,MeOH)或乙醇(Ethanol,EtOH)萃取得到1681.28g的甲醇萃取物(或乙醇萃取物)。接著，取甲醇萃取物(或乙醇萃取物)並使用乙酸乙酯(ethyl acetate,EtOAc)與水的液相分配處理，俾以形成一乙酸乙酯層萃取物以及一水層萃取物，之後，收集乙酸乙酯層，繼而移除水層。本發明一實施例是由1.0g的甲醇萃取物中得到282.5mg的乙酸乙酯層萃取物，並在矽膠上用10%乙酸乙酯(配於己烷)進行層析，然後再結晶，得到經純化的化合物：麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol，以下簡稱EK100)，具有下列化學式(I)：

將甲醇或乙醇萃取物、乙酸乙酯層萃取物和EK100分別溶解在二甲基亞碸(DMSO)中至各別的50mg/ml儲備溶液，並分別在-20℃下保存。本發明一實施例所使用的合成組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)(唯一的FDA批准用於缺血性中風的藥物)購自一家製藥公司(Boehringer Ingelheim GmbH,Ingelheim am Rhein，德國)。含0.1% DMSO的生理鹽水用作參考試劑或媒液對照組。

接著，誘發及製備急性腦缺血性中風損傷(acute cerebral ischemic stroke injury)小鼠模型，流程如下：所有動物程序和規程均按照實驗動物的護理和使用指南(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(美國國家科學研究委員會，2011年)進行，並由衛生福利部國家中醫藥研究所動物研究委員會(Animal Research Committee of the National Research Institute of Chinese Medicine)審查批准(批准文號：NRICM-IACUC-106-912-1)。使用唑拉西泮(zolazepam)(40mg/kg，i.p.)和鹽酸塞拉嗪(xylazine)(10mg/kg，i.p.)的混合物麻醉重28~30g的雄性ICR小鼠(台灣台北國家實驗研究院國家實驗動物中心)。根據中風療法學術行業圓桌會議(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable,STAIR)的建議，誘發了小鼠急性腦缺血性中風損傷。簡而言之，使用塗有矽油(silicone)的熱鈍尼龍單絲手術縫線(heat-blunted nylon monofilament surgical suture)(直徑約100μm)進行短暫性局灶性腦缺血(transient focal cerebral ischemia)，將手術縫線引入裸露的外頸動脈中，前進至內頸動脈，並楔入威利氏環阻塞了右大腦中動脈(right middle cerebral artery,MCA)的起源，從而阻斷了MCA血液的流動，這可由顱內都卜勒(transcranial Doppler)檢查確認血流中止。將細絲在麻醉下放置40分鐘。右大腦中動脈閉塞(MCA occlusion,MCAO)40分鐘後，將縫線抽出以進行再灌注。在再灌注後2小時給予所有治療(參見圖1)。為了減少治療偏倚，與本研究無關的研究者隨機分配小鼠於媒液對照組或試劑(甲醇萃取物、乙醇萃取物、乙酸乙酯層萃取物、EK100或rt-PA)治療組。進行上述手術之後，閉合手術切口，並允許小鼠在加熱燈下從麻醉中恢復，以確保恢復過程中身體溫度維持在36.0~37.0℃。此手術過程導致可重複的梗死(reproducible infarcts)，其體積大小和分佈與使用類似的短暫MCAO手法研究報導的其他梗死體積相似。

在MCAO之前和再灌注後30分鐘從股動脈採集的血樣品立即用於動脈血氣體分析(arterial blood gas analysis)。將小鼠隨機分為以下幾組：(1)無MCAO的假手術組(Sham，n=30)；(2)MCAO後2小時，每天一次，一次0.3g/kg的甲醇萃取物，口服)組別(甲醇萃取物組)(中風+甲醇萃取物，n=10)；(3和4)兩個乙酸乙酯層萃取物(0.3g/kg或0.6g/kg，MCAO後2小時，每天一次，口服)治療組(乙酸乙酯層萃取物組1(0.3g/kg乙酸乙酯層萃取物)及乙酸乙酯層萃取物組2(0.6g/kg乙酸乙酯層萃取物))，n=30；(5和6)兩個EK100(60mg/kg或120mg/kg)治療組，每天一次，口服，MCAO後2小時(EK100組1(60mg/kg EK100)及EK100組2(120mg/kg EK100))；(7)1個rt-PA(rt-PA劑量為10mg/kg，在MCAO之後2小時，靜脈內注射1次)MCAO治療組(中風+rt-PA，n=30)(TPA組(rt-PA))；(8)1個rt-PA+EK100(rt-PA為10mg/kg，在MCAO之後2小時，一次靜脈內注射rt-PA再加上EK100以60mg/kg口服)(組合組)；(9)用MCAO及媒液(含0.1% DMSO的生理鹽水)處理的組(中風+媒液，n=30)(媒液組)。實驗方案如圖1所示。

為了確認牛樟芝的甲醇萃取物(0.3g/kg)或乙醇萃取物和乙酸乙酯層萃取物(0.3g和0.6g/kg)改善缺血性中風腦損傷的能力以及EK100的最佳保護劑量(30~120mg/kg，口服)，以闡明急性缺血性中風損傷模型的機制，評估了動物存活率(中風誘發後2天內)。幾乎有80%的接受媒液(含0.1% DMSO的生理鹽水)治療的小鼠(媒液組)在中風後2天內死亡。相反地，甲醇萃取物組或乙醇萃取物組、乙酸乙酯層萃取物組1、乙酸乙酯層萃取物組2、EK100組1、EK100組2、TPA組(rt-PA)、及組合組具有更高的生存率。對於用乙酸乙酯層萃取物組2、EK100組1、EK100組2和組合組處理的小鼠，在中風後第1天(D1)，這種差異尤為明顯(表1，p<0.05)。

在中風誘發後24小時，還檢查了小鼠的神經功能缺損(以行蹤移動距離的減少為測定)。與假手術組的小鼠相比，給媒液組的小鼠，中風手術誘發極端嚴重的神經功能缺損，如行蹤移動的距離顯著減少(以m為單位)(表1，媒液組vs.假手術組，p<0.05)。甲醇萃取物組、乙醇萃取物組、乙酸乙酯層萃取物組1、乙酸乙酯層萃取物組2、EK100組1及EK100組2，而不是rt-PA進行處理在中風損傷後均顯著改善了行蹤移動距離的減少(表1，p<0.05)。但是，組合組比單獨TPA組(rt-PA)可顯著改善行蹤移動距離(表1，p<0.05)。

實施例2. 牛樟芝萃取物與其化合物在透過抑制發炎和凋亡減緩小鼠急性缺血性中風後腦梗死和BBB損傷上的效用評估

以下實驗所用到的2,3,5-三苯基四唑氯化物(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色的流程如下：再灌注後二十四小時，在深度麻醉下透過快速斷頭犧牲小鼠。快速取出整個大腦，切成1mm厚的冠狀 切片，用TTC(Sigma-Aldrich，USA)染色。對所有腦切片進行拍照以確定梗塞體積並確認水腫。

急性缺血性中風會引起缺血性腦半球嚴重腦梗塞，嚴重損害腦組織，其梗塞體積約為62±5mm³(圖2，中風+媒液，TTC染色)，強烈發炎(p65NFκB染色(紅色)，其為一種發炎標記)(圖3A及4A)表現在中風皮質所有梗塞區域周圍和齒狀回(dentate gyrus)(在中風組中)並出現明顯的血腦障壁(BBB)滲漏(圖3A及圖3B，中風組，缺少閉合蛋白(occludin)染色(綠色))，以及非常顯著的腦組織凋亡(圖5A及圖5B，中風組，凋亡蛋白酶3(caspase 3)染色(紅色))。相反地，用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物(0.3和0.6kg/kg，口服)和EK100(60~120mg/kg，口服)治療中風損傷小鼠在降低死亡率和神經系統缺陷的同時，還可顯著降低腦梗死的嚴重程度(在TTC染色中降低)(圖2，p<0.05)、BBB滲漏(缺少閉合蛋白(occluding)染色)(圖3B，p<0.05)、減少發炎(p65NFκB染色)(圖4B，p<0.05)並減少了腦組織凋亡的細胞(凋亡蛋白酶3)(圖5B，p<0.05)。單用rt-PA的治療不足以保護腦組織免受這些缺血性腦損傷(腦梗塞、BBB損傷、發炎和腦組織細胞凋亡)的影響(與中風組相比，圖2至圖5B，p>0.05)，除了減少p65NFκB染色(圖4A及圖4B，與中風組相比，p<0.05)外，然而，令人印象深刻的是，與單獨使用rt-PA或EK100(60mg/kg)相比，EK100(60mg/kg)與rt-PA的組合可以進一步增強保護活性(圖2至圖5B，p<0.05)。

實施例3. 牛樟芝萃取物與其化合物在小鼠急性缺血性中風後透過抑制GSK-3及藉由活化PI3K/Akt信號傳遞活化β-鏈蛋白(β-catenin)來促進內生性神經再生上的效用評估

急性缺血性中風會嚴重損害海馬齒狀回周圍的內生性神經再生(endogenous neurogenesis)。本實施例研究在缺血性中風損傷後24小時，牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100處理是否能促進內生性神經再生，使用雙皮質素(doublecortin,DCX)作為闡明內生性神經再生的指標。與假手術組相比，缺血性中風損傷後用媒液處理的小鼠的DCX染色表現水平明顯下降(橙色，圖6A，中風+齒狀回中的媒液(Veh))(圖6A及圖6B，中風(stroke)+Veh vs.假手術組(Sham,S)，p<0.05)。值得注意的是，用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100而不是rt-PA處理可強烈上調DCX表現，與媒液組(圖6B，p<0.05)相比，它幾乎與鏈蛋白(紅 色)染色共定位(圖6A及6B)。此外，與僅用媒液處理的組(圖6B，p<0.05)或僅用rt-PA治療的組相比，EK100(60mg/kg)與rt-PA的共同治療組(組合組)顯著上調了DCX表現以及鏈蛋白的表現(圖6B，p<0.05)。

為了確定神經再生促進信號(GSK-3抑制和β-鏈蛋白活化)是否參與牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100誘導的神經保護作用，採用西方墨點分析來檢測PI3K/Akt相關信號傳遞途徑對牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100的保護作用。結果表明，中風損傷顯著降低了Ser473(pAkt)殘基上Akt的磷酸化/活化的表現水準，中風同時顯著降低了SpGSK-3(GSK-3抑制)和β-鏈蛋白的表現及降低了β-鏈蛋白下游蛋白Bcl-2的表現(圖7B，媒液組與假手術組比較，p<0.05)，其中Ser473是Akt的胺基酸在473號位置的絲胺酸(Serine)被磷酸化，代表Akt被磷酸化而活化(pAkt)。用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物(0.6g/kg)和EK100(60和120mg/kg)的處理顯著增強Bcl-2的表現水準，可能是透過活化PI3K/Akt依賴性GSK-3抑制(SpGSK-3表現增加)和β-鏈蛋白上調(圖7A至圖7B，p<0.05)，而用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物(0.6g/kg)或EK100(120mg/kg)處理單獨使用於未中風鼠不會顯著改變這些蛋白質的表現水準(圖7B)。

實施例4. 牛樟芝萃取物與其化合物在氧氣與葡萄糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)誘導的神經元凋亡和LPS介導的微膠細胞(microglial cell)活化的細胞模型中的神經元保護和抗發炎上的效用評估

為了確定牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100是否能防止氧氣與葡萄糖同時剝奪(OGD)誘導的神經細胞凋亡並在細胞模型中顯示抗發炎活性，進行了OGD誘導的神經母細胞腫瘤Neuro 2A細胞(來自ATCC，CCL-131)凋亡和LPS介導的微膠細胞一氧化氮(NO)產生(即表2所示BV2/NO，其中BV2表示BV2細胞，其為一腦部微膠細胞(microglia cell)株)。如表2所示，本發明牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100對OGD誘導的神經細胞損傷具有抗凋亡活性，IC₅₀分別<10μg/ml和40μM。陽性對照組AR-a014418(一種GSK-3抑製劑)在該模型中顯示出強大的抗凋亡作用，IC₅₀約為10μM。此外，本發明牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物對LPS誘導的微膠細胞NO產生具顯著的抗炎作用，IC₅₀分別為9±1μg/ml和18±2μM。它們幾乎與NFκB抑製劑(PDTC)一樣有效。

有關OGD誘導的神經元凋亡之流程如下：Neuro 2A細胞在Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中於37℃生長，並補充了10%(按體積計)的胎牛血清(FBS)和在5% CO₂中的青黴素/鏈黴素、95%的潮濕環境。在測試試劑的存在下，對細胞(5×10⁵個細胞)進行氧氣與葡萄糖剝奪(OGD)，持續8小時，然後再灌注16小時。除去培養基，並用HEPES緩衝鹽溶液(HBSS，含有(以mM為單位)：137 NaCl、5 KCl、20 HEPES、1.4 CaCl₂、3 NaHCO₃、0.6 Na₂HPO₄、0.4 KH₂PO₄在pH 7.4洗滌)，洗滌至除去所有含有葡萄糖的培養基。然後，透過將培養基改為無血清和無葡萄糖的DMEM(Gibco Laboratories，Grand Island，NY，USA)來啟動OGD，首先將其與5% CO₂和其餘N₂的混合物一起鼓泡20分鐘以除去O₂。然後將培養物立即轉移到培養箱(Astec，福岡，日本)中，該培養箱具有5% CO2、1% O2和其餘N₂的濕潤低氧，保持在37℃。缺氧後，透過重新補充含葡萄糖的DMEM終止培養物中的OGD，然後將其轉移回空氣中含5% CO₂的正常環境的培養箱中16小時。

為了檢查單獨的牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物或EK100是否顯示出抗氧化能力，進行了DPPH自由基清除試驗。

DPPH自由基清除能力的測定流程如下：將試劑在甲醇中稀釋至5、20和50μM的濃度。將DPPH溶液(200μl；配於乙醇中200μM的最終濃度)添加到96孔微盤中的10μl每個稀釋樣品中，並使所得溶液在黑暗中於環境溫度下反應30分鐘。用微孔盤分光光度計測定由DPPH自由基在517nm處的吸光值。自由基清除能力表示為OD₅₁₇(△OD₅₁₇)，包括抗氧化劑trolox作為參考試劑。

與trolox(一種維生素E類似物)相比，牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100均未顯示出自由基清除活性，而trolox則顯示出DPPH自由基清除活性，IC₅₀為25±1μM。

使用實驗性腦缺血性中風鼠模型，本發明證明了缺血再灌注後牛樟芝萃取物及其活性成分EK100對神經保護和促進神經再生的作用，並且還確定了分子信號傳遞機制作用。結果顯示，急性缺血性中風誘發後2小時，每天用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物(0.6g/kg)和EK100(60-120mg/kg，口服)一次處理，顯著提高了存活率及行蹤移動活性(中風後第1天)。低劑量(60mg/kg)的EK100與rt-PA(10mg/kg，i.v.)的組合可增強rt-PA的保護活性。乙酸乙酯層萃取物和EK100引起的發炎和凋亡中腦損傷的標記減少與GSK-3抑制和β-鏈蛋白上調高度相關。具體而言，牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100都下調NF-κB和凋亡蛋白酶3(caspase 3)，並促進神經再生相關蛋白(雙皮質素DCX)和神經保護蛋白(Bcl-2)的表現水準。本發明證實透過PI3K/Akt信號傳遞抑制GSK-3/β-鏈蛋白的活化調節牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物及其活性成分EK100在急性缺血性中風損傷後的神經保護和神經再生促進作用。

在本發明中，觀察到缺血性中風小鼠海馬齒狀回附近參與內生性神經再生的細胞(DCX陽性細胞)數量明顯減少。儘管如此，僅使用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物(0.3和0.6g/kg)和EK100(60和120mg/kg)，但不單獨使用 rt-PA，治療可以顯著增加DCX陽性細胞的數量，DCX陽性細胞在腦缺血性中風後24小時內是神經元母細胞/神經元祖細胞(neuroblasts/neuronal progenitor cell)的製造者。此外，低劑量(60mg/kg)的EK100與rt-PA的組合可促進DCX陽性細胞的表現水準。這種促進很可能是透過PI3K/Akt的活化而發生的，而PI3K/Akt的活化又會引起GSK-3磷酸化而抑制和β-鏈蛋白活化，從而上調其下游細胞保護蛋白(例如Bcl-2)。然而，在本發明中，在沒有缺血性中風損傷的小鼠中單獨使用牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100並不能顯著活化PI3K/Akt途徑來上調DCX陽性細胞的表現水準。本發明發現牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物或EK100(而不是單獨的rt-PA)的保護作用同時下調了凋亡蛋白酶3和p65NF-κB的表現。此外，使用體外模型，進一步觀察到牛樟芝的乙酸乙酯層萃取物和EK100表現出較強的抗凋亡作用(IC₅₀分別在<10μg/ml和40μM時)和抗發炎性(IC₅₀在9和18μM)作用。

綜上所述，本發明牛樟芝萃取物及其化合物可透過抑制發炎和凋亡減緩急性缺血性中風後腦梗死和血腦障壁損傷、透過抑制GSK-3及藉由活化PI3K/Akt信號傳遞活化β-鏈蛋白來促進內生性神經再生、及保護神經元，達到治療中風(特別是腦缺血性中風損傷)及增強治療中風藥物的效用之功效。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims (6)

1. 一種化合物用於製備一治療中風的醫藥品之用途，其中該化合物為麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol,EK100)，其中該治療中風是治療腦缺血性中風損傷，該治療腦缺血性中風損傷包含透過抑制發炎和凋亡來減緩急性缺血性中風後腦梗死及血腦障壁(blood brain barrier,BBB)損傷，及透過抑制GSK-3及藉由活化PI3K/Akt信號傳遞活化β-鏈蛋白(β-catenin)以促進內生性神經再生。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)是純化自一牛樟芝萃取物，該牛樟芝萃取物是以一萃取溶劑對一牛樟芝的菌絲體進行萃取而製得，該萃取溶劑是甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷或其組合。
3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)的有效濃度為至少60mg/kg。
4. 一種化合物用於製備一增強治療中風藥物的效用之促效劑的用途，其中該化合物為麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)，其中該治療中風藥物具有治療腦缺血性中風損傷之效用，該治療腦缺血性中風損傷包含透過抑制發炎和凋亡來減緩急性缺血性中風後腦梗死及血腦障壁(blood brain barrier,BBB)損傷，及透過抑制GSK-3及藉由活化PI3K/Akt信號傳遞活化β-鏈蛋白(β-catenin)以促進內生性神經再生。
5. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該治療中風藥物是合成組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)。
6. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該麥角抑菌素-7,9(11),22-三烯-3β-醇(EK100)的有效濃度為至少60mg/kg。

Images