CN114533708A - Boropinol-B在制备治疗脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了Boropinol‑B在制备治疗脑卒中药物中的应用。Boropinol‑B的结构如式I所示，其可显著改善脑缺血模型大鼠急性期神经功能评分，减小脑梗死体（面）积，改善脑水肿程度和血脑屏障通透性，促进脑缺血再灌注模型大鼠恢复期体重和神经运动功能恢复，减小脑梗死体（面）积，预防或缓解脑组织萎缩，延长中位生存期；也可显著提高糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞模型的存活率；还可显著改善脑出血模型大鼠的神经功能缺损评分，减轻脑水肿，保护血脑屏障完整。Boropinol‑B对于本发明中的脑卒中动物或细胞模型具有显著的神经保护作用，且无明显毒副作用，有望成为极具应用前景的治疗脑卒中的候选药物。

Description

Boropinol-B在制备治疗脑卒中药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及Boropinol-B在制备治疗脑卒中药物中的应用。

背景技术

脑卒中，俗称“中风”，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一种疾病。临床上包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占全部卒中的87%。脑卒中是全球第二大死亡病因，也是造成长期残疾的主要原因，其具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高的特点。中国现有脑卒中患者约1500万，每年新增病人240万，约有110万人死于脑卒中，造成了巨大的社会经济负担。

目前针对缺血性脑卒中的治疗策略主要是溶栓治疗和神经保护治疗。静脉溶栓是目前临床主要且有效的治疗方式，但其治疗时间窗口较窄（症状出现后3~4.5小时内），且有颅内出血、再灌注损伤、血管再闭塞等风险，仅有不到10%的患者适用该方案。临床用于治疗缺血性脑卒中的神经保护药物，如自由基清除剂依达拉奉、GABA受体激动剂氯美噻唑等对脑卒中的疗效尚不够理想。对于出血性脑卒中，临床上主要采用药物治疗和手术治疗。药物治疗包括降低颅内压、调整血压、止血治疗、钙离子拮抗剂等，但疗效甚微。手术治疗因存在术后再出血、伤口感染、神经损伤、有效灌注压不足等风险，应用范围较窄。因此，研发可有效治疗缺血性脑卒中和出血性脑卒中的药物具有重要的临床价值。

缺血性脑卒中和出血性脑卒中都属于中枢神经系统疾病，发病过程中伴随着复杂的病理生理过程，包括能量代谢异常、氧化应激、兴奋毒性、凋亡自噬、免疫炎症等，最终导致神经元变性坏死，迟发性神经元死亡和细胞凋亡。其中，谷氨酸(glutamic acid, Glu)浓度异常升高导致的兴奋性毒性是造成神经细胞死亡的主要原因。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）是重要的抑制性神经递质。研究表明，通过增强其介导的抑制性电流来抗衡谷氨酸浓度异常升高所致的兴奋毒性，可发挥神经保护作用，减轻神经细胞损伤。

Boropinol-B属于苯丙烷类化合物，化学名称为5-[3-甲氧基-1-丙烯基]-1,2,3-三甲氧基苯，最初从芸香科石南香属植物Boronia pinnata Sm. (Rutaceae)中分离得到。本课题组前期研究结果表明，Boropinol-B可作用于神经元GABA_A受体，增加氯离子内流使神经细胞超极化，产生中枢神经镇静与抑制作用。然而迄今为止，Boropinol-B治疗脑卒中的作用尚未见报道。发明人在对Boropinol-B进一步研究的过程中，意外地发现其对脑卒中所致的神经功能损伤起到保护作用。基于此，发明人发现了Boropinol-B在制备治疗脑卒中药物中的新用途。

发明内容

为了克服现有技术中治疗脑卒中药物的问题，本发明提供了Boropinol-B治疗脑卒中的药理活性。

为此，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了式I所示化合物（反式-1,2,3-三甲氧基-5-[3-甲氧基-1-丙烯基]-苯，又称Boropinol-B）在制备治疗脑卒中药物中的应用，

式I 。

本发明意外地发现，式I所示化合物可显著改善脑缺血模型大鼠急性期神经功能评分，减小脑梗死体（面）积，改善脑水肿程度和血脑屏障通透性，促进脑缺血再灌注模型大鼠恢复期体重和神经运动功能恢复，减小脑梗死体（面）积，预防或缓解脑组织萎缩，延长中位生存期；也可显著提高糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞模型的存活率；还可显著改善脑出血模型大鼠的神经功能缺损评分，减轻脑水肿，保护血脑屏障完整。Boropinol-B对于缺血性脑卒中和出血性脑卒中的动物或细胞模型具有确切的治疗作用，且无明显毒副作用。

本发明通过将Boropinol-B用于治疗线栓法构建的大脑中动脉闭塞/再灌注（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）和永久性栓塞（permanentmiddle cerebral occlusion，pMCAO）大鼠模型，发现Boropinol-B可显著改善脑缺血模型大鼠急性期神经功能评分，减小脑梗死体（面）积，改善脑水肿程度和血脑屏障通透性，促进脑缺血再灌注模型大鼠恢复期体重和神经运动功能恢复，减小脑梗死体（面）积，预防或缓解脑组织萎缩，延长中位生存期。

本发明中，所述的式I所示化合物可具有如下药理作用：（1）降低脑内炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平，抑制免疫炎症反应；（2）降低Glu/GABA的比值，维持脑内兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸（EAA/IAA）平衡。

本发明中，所述的药物可具有如下药理作用：（1）降低脑内炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平，抑制免疫炎症反应；（2）降低Glu/GABA的比值，维持脑内兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸（EAA/IAA）平衡。

本发明中，所述的药物可通过（1）降低脑内炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平，抑制免疫炎症反应，减少神经元细胞死亡或凋亡；（2）降低Glu/GABA的比值，维持脑内兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸（EAA/IAA）平衡，拮抗过量谷氨酸引起的神经兴奋性毒性，从而改善脑缺血模型大鼠急性期神经功能评分，减小脑梗死体（面）积，改善脑水肿程度和血脑屏障通透性，促进恢复期脑缺血再灌注模型大鼠体重和神经运动功能恢复，减小脑梗死体（面）积，预防或缓解脑组织萎缩，延长中位生存期，发挥抗缺血性脑卒中的作用。

本发明通过将Boropinol-B用于治疗20mM连二亚硫酸钠所致糖氧剥夺/复糖复氧（oxygen and glucose deprivation, OGD）损伤PC12细胞模型，发现Boropinol-B在10~100μM浓度范围内对细胞无毒性，且能显著性提高OGD细胞损伤模型的存活率。

本发明通过将Boropinol-B用于治疗血管内穿刺构建的蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage, SAH）模型大鼠和胶原酶注射构建的脑实质出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）大鼠模型，发现Boropinol-B能显著性改善脑出血模型大鼠的神经功能缺损评分，减轻脑水肿，保护血脑屏障完整。

在一些实施方案中，所述的脑卒中为短暂性脑缺血、永久性脑缺血、脑实质出血和蛛网膜下腔出血中的至少一种所导致的脑卒中。

在一些实施方案中，所述的药物用于下列中的至少一种：改善神经或运动功能损伤（例如tMCAO、pMCAO、ICH或SAH所致的神经或运动功能损伤）、减小脑梗死体（面）积（例如tMCAO或pMCAO所致的脑梗死）、改善继发性脑损伤（例如tMCAO、pMCAO、ICH或SAH所致的急性期脑组织水肿或血脑屏障功能障碍），降低tMCAO所致的急性期死亡率、促进恢复期体重和神经运动功能恢复、预防或缓解脑组织萎缩以及延长中位生存期。

在一些实施方案中，所述的式I所示化合物为所述药物中的唯一有效成分。

在一些实施方案中，所述的药物可含有药用辅料。较佳地，所述的式I所示化合物与药用辅料的总重量比例为1：20~1000，例如1：20~200。更佳地，所述的式I所示化合物为所述药物中的唯一有效成分，其与药用辅料的总重量比例为1：20~1000，例如1：20~200。

在一些实施方案中，所述的药物的给药对象可以是人或动物。当所述的药物用于治疗脑卒中模型大鼠时，所述的药物中式I所示化合物的每日有效剂量可为5mg~20mg/kg体重。当所述的药物用于治疗患有脑卒中的人时，所述的药物中式I所示化合物的每日给药剂量范围可为0.3mg~3.0mg/kg体重，优选为0.5mg~2.0mg/kg体重。例如，每日给药1~2次，每次给药剂量范围为0.3mg~3.0mg/kg体重，优选为0.5mg~2.0mg/kg体重。上述剂量可根据不同种属动物之间的剂量换算关系得到。

在一些实施方案中，所述的药物的给药途径是注射、口服、皮下植入、吸入、透皮、黏膜等。优选地，所述的药物的给药途径为注射，更优选地，所述的药物的给药途径为静脉注射给药。

本发明中，所述的药物可制成适宜于人和/或动物使用的剂型，例如与不同给药途径相适应的任何剂型，只要该剂型可使式I所示化合物进入脑内并达到有效治疗浓度即可。

在一些实施方案中，所述的药物为乳剂（例如乳状注射液）。

在一些实施方式中，所述的乳剂可含有式I所示化合物、可药用的油、可药用的乳化剂以及水。

其中，所述的可药用的油可由大豆油、中链油、橄榄油和鱼油中的至少一种组成。

其中，所述的可药用的乳化剂可由蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、普朗尼克F-68和聚乙二醇硬脂酸-15（Solutol HS15）中的至少一种组成。

其中，所述的水为纯化水或注射用水。

其中，根据乳化性能的需要，所述的乳剂还可含有油酸和油酸钠中的至少一种。配制时油酸溶于油相，油酸钠溶于水相，二者的混合物则可分别溶于油、水两相。

其中，所述的乳剂还可含有甘油。

其中，所述的乳剂还可含有抗氧剂。所述的抗氧剂可为亚硫酸氢钠、维生素E、焦性没食子酸酯等。

在一些实施方案中，以重量百分比计，所述的乳剂可含有式I所示化合物0.5%~5%、可药用的油5%~30%、乳化剂0.6%~1.8%、甘油0%~2.5%、以及余量的水（例如纯化水或注射用水）。式I所示化合物在乳剂中的浓度可在一定范围内变化，浓度变化范围取决于给药量、给药体积和式I所示化合物在油相中的溶解度。

在一些实施方案中，所述的乳剂为乳状注射液。优选地，所述的乳状注射液中，式I所示化合物与药用辅料（包括注射用水）的总重量比例为1：20~1000，例如1：20~200。

其中，所述的乳剂的制备方法可包括以下步骤：将式I所示化合物、可药用的油、可药用的乳化剂以及水经高速剪切混合，得到初乳；将初乳经高压均质处理，得到乳剂。

在一些实施方式中，所述的乳剂的制备方法可包括以下步骤：

步骤1：在氮气或惰性气体保护条件下，将式I所示化合物溶解于60~80℃的可药用的油中，得到油相，再将乳化剂和甘油溶解或分散于60~80℃的水中，得到水相；或者，在氮气或惰性气体保护条件下，将式I所示化合物和乳化剂溶解或分散于60~80℃的可药用的油中，得到油相，再将甘油溶解于60~80℃的水中，得到水相；

步骤2：将上述油相和水相经高速剪切混合，使油相分散于水相中，得到初乳；

步骤3：将初乳经高压均质（均质次数例如可为高压均质1~3次），使乳滴平均粒径值不大于0.5μm，过滤，在氮气或惰性气体保护条件下，灌装于玻璃安瓿、输液瓶、西林瓶、软袋等药用容器中；根据给药途径的需要，采用旋转式热压灭菌或不经灭菌而添加防腐剂，得到乳剂。

所述高速剪切的剪切速率可为本领域小量试制或大生产制备乳剂时所采用的常规的剪切速率，例如实验室小量试制可为10000~20000 r·min^-1，又例如大生产制备为2000~4000 r·min^-1，实际剪切速率的大小取决于剪切半径，二者决定了剪切力的大小。

所述高速剪切的剪切时间可为本领域制备乳剂所采用的常规的剪切时间，例如可为2~10分钟，又例如为3~5分钟。

所述的高压均质的均质压力可为本领域制备乳剂所采用的常规的均质压力，例如可为500~1500 bar，又例如为500~1000 bar。

所述的高压均质的循环次数可为本领域制备乳剂所采用的常规的循环次数，例如可为1~3次。

本发明还提供了一种用于治疗脑卒中的药物组合物，其中，所述的药物组合物含有式I所示化合物以及药用辅料。

在一些实施方案中，所述的式I所示化合物为所述药物组合物中的唯一有效成分。

在一些实施方案中，所述的药物组合物为乳剂。

本发明还提供了一种治疗受试者脑卒中的方法，其包括：给予所述受试者治疗有效量的如式I所示化合物。

定义与说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

除非另有说明，本发明中，术语“可药用的”是指针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

除非另有说明，本发明中，术语“药学上可接受量的”是指针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型的量而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

除非另有说明，术语 “药用辅料”，是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂，是除活性成分以外，包含在药物制剂中的所有物质。可参见中华人民共和国药典（2020年版）四部、或Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C Rowe, 2009Sixth Edition)。

除非另有说明，术语“治疗”指治疗性疗法。涉及具体病症时，治疗指：（1）缓解疾病或者病症的一种或多种生物学表现，（2）干扰(a)导致或引起病症的生物级联中的一个或多个点或(b)病症的一种或多种生物学表现，（3）改善与病症相关的一种或多种症状、影响或副作用，或者与病症或其治疗相关的一种或多种症状、影响或副作用，或（4）减缓病症或者病症的一种或多种生物学表现发展。

除非另有说明，术语“治疗有效量”是指在给予受试者时足以有效治疗本文所述的疾病或病症的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、病症及其严重度、以及欲治疗患者的年龄而变化，但可由本领域技术人员根据需要进行调整。给药对象不同（如人或动物），该有效量也不同。

除非另有说明，术语“受试者”是指根据本发明的实施例，即将或已经接受了该化合物给药的任何动物，哺乳动物为优，人类最优。术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴、人等，以人类为最优。

本发明中未指明反应温度的，其反应温度为室温，室温一般为20~35℃。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所提供式I所示化合物由发明人自制，其余所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明首次公开了Boropinol-B具有治疗脑卒中的作用，药效学研究结果表明：Boropinol-B可显著改善脑缺血模型大鼠急性期神经功能评分，减小脑梗死体（面）积，改善脑水肿程度和血脑屏障通透性，促进脑缺血再灌注模型大鼠恢复期体重和神经运动功能恢复，减小脑梗死体（面）积，预防或缓解脑组织萎缩，延长中位生存期；也可显著提高糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞模型的存活率；还可显著改善脑出血模型大鼠的神经功能缺损评分，减轻脑水肿，保护血脑屏障完整。

Boropinol-B安全、有效，在本发明的全部实验过程中未见Boropinol-B有明显的毒副作用。据此，Boropinol-B有望成为极具应用前景的治疗脑卒中的药物。

附图说明

图1：Boropinol-B对tMCAO模型大鼠的影响。A：各组大鼠mNSS神经功能缺损评分；B：各组大鼠脑梗死体（面）积；C：各组大鼠患侧脑组织含水量；D：各组大鼠脑组织伊文思蓝渗出量；S、T、L、M、H分别表示假手术组、tMCAO模型组、Boropinol-B低剂量组、Boropinol-B中剂量组、Boropinol-B高剂量组；与假手术组相比，^## P<0.01，^# P<0.05；与模型组相比，^** P<0.01，^* P<0.05。

图2：Boropinol-B对tMCAO模型大鼠长期实验的影响。A：各组大鼠生存曲线；B：各组大鼠体重变化曲线；C：各组大鼠第1、3、7、10、14天mNSS神经功能评分；D：各组大鼠第14天脑组织萎缩情况；S、T、L分别表示假手术组、tMCAO模型组、Boropinol-B给药组；与模型组相比，^** P<0.01，^* P<0.05。

图3：Boropinol-B对tMCAO模型大鼠患侧脑组织炎症因子含量的影响。A：各组大鼠患侧脑组织IL-1β含量；B：各组大鼠患侧脑组织TNF-α含量；C：各组大鼠患侧脑组织IL-6含量；D：各组大鼠患侧脑组织Glu/GABA的比值；与正常组相比，^## P<0.01，^# P<0.05；与模型组相比，^** P<0.01，^* P<0.05。

图4：Boropinol-B对糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞的影响。A：不同浓度Boropinol-B对PC12细胞存活率的影响；B：不同浓度依达拉奉（EDA）对PC12细胞存活率的影响；C：不同浓度连二亚硫酸钠（Na₂S₂O₄）损伤对PC12细胞存活率的影响；D：不同浓度Boropinol-B对糖氧剥夺/复糖复氧损伤的PC12细胞存活率的影响；与正常组相比，^## P<0.01，^# P<0.05；与模型组相比，^** P<0.01，^* P<0.05。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

制备实施例1：Boropinol-B的制备

实验材料：

3,4,5-三甲氧基肉桂酸（C10067426，上海麦克林公司）

甲醇（2021091602，成都科龙试剂厂）

浓硫酸（170303，四川西陇化工公司）

乙酸乙酯（20210922，成都金山化学试剂公司）

二异丁基氢化铝（C11337170，上海麦克林公司）

无水硫酸镁（Q/12KM3936-2019，天津科密欧公司）

无水四氢呋喃（MOTRRBDK，上海萨恩化学技术公司）

N,N-二甲基甲酰胺（MQRD1HIE，上海萨恩化学技术公司）

石油醚（2019年7月20日，天津富宇精细化工公司）

NaH（C10255393，上海麦克林公司）

CH₃I（MA1229A，上海麦克林公司）

取3,4,5-三甲氧基肉桂酸2.0 ~5.0 g溶于50~150 mL甲醇溶液中，滴入浓硫酸溶液1~3mL，在40~80℃下搅拌0.5~2.5小时，冷却后减压蒸馏除去甲醇，加入50 mL水，用50mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到反应中间体1。取反应中间体1 1.0 ~3.0 g溶于40 mL无水四氢呋喃溶液中，反应温度降至-30~-70℃，缓慢滴加5 ~15mL的氢化二异丁基铝（1.5N），将上述混合物在0℃搅拌10分钟，加入50mL水，用50mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到反应中间体2。取1.0 ~2.5 g反应中间体2溶于30~50mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.2~0.5g的NaH以及0.4~0.8 mL的CH₃I，在30~50℃下搅拌1.5~3小时。减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺，加入50mL水，用50mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，制得粗品经硅胶柱色谱法（洗脱液石油醚：乙酸乙酯=20:1)纯化，得到Boropinol-B。

制备实施例2：Boropinol-B注射乳剂的制备

称取Boropinol-B0.50~50.0g、注射用大豆油50.0~300.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂6.0~18.0g，加入其中，搅拌使溶解（必要时加入油酸、油酸钠或二者的混合物0.10~0.50g），制得油相，备用。另称取普朗尼克（F68）0~3.0g、甘油0~25.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5~15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1~3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于5mL~20mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8~12min，即得Boropinol-B注射乳剂，其中含Boropinol-B的浓度为0.5~50mg/mL。

制备实施例3：Boropinol-B注射乳剂的制备

称取Boropinol-B10.0g、注射用大豆油50.0g、注射用中链甘油三酯（MCT）50.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸钠0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5~15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1~3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于5mL或10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8min，即得Boropinol-B注射乳剂，其中含Boropinol-B的浓度为10mg/mL。

制备实施例4：Boropinol-B注射乳剂的制备

称取Boropinol-B20.0g、注射用大豆油100.0g、注射用中链甘油三酯（MCT）100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5~15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1~3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于5mL或10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8min，即得Boropinol-B注射乳剂，其中含Boropinol-B的浓度为20mg/mL。

制备实施例5：Boropinol-B注射乳剂的制备

称取Boropinol-B1.0g、注射用大豆油100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5~15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1~3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于50mL输液瓶中，旋转式热压灭菌121℃×12min，即得Boropinol-B注射乳剂，其中含Boropinol-B的浓度为1mg/mL。

制备实施例6：Boropinol-B注射乳剂的制备

称取Boropinol-B1.0g~20.0g、注射用大豆油50.0g~200.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0~0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60~80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5~15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1~3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于2mL、5mL、10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8~12 min，即得Boropinol-B乳状注射液，其中Boropinol-B的含量为1mg/mL~20mg/mL。

制备实施例7：Boropinol-B注射乳剂（又称乳状注射液）的制备

实验材料：

Boropinol-B（20210530，实验室自制，方法见制备实施例1）；

注射用大豆油（DD20200603，山东瑞生药用辅料有限公司）；

蛋黄卵磷脂（202008013，上海太伟药业股份有限公司）；

油酸（160907，西安力邦制药有限公司）；

甘油（20191213，浙江遂昌惠康药业有限公司）；

实验步骤：称取Boropinol-B10.0g、注射用大豆油100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，以19000 r/min高速剪切10分钟，使油相分散于水相中，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机以1000bar压力均质3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于2mL、5mL、10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8min，即得Boropinol-B乳状注射液，其中Boropinol-B的含量为10mg/mL，批号20201228。

效果实施例1：Boropinol-B对tMCAO大鼠的短期治疗作用

实验材料：SPF级SD大鼠，雄性，体重200～220g，购于四川省成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2020-030；

线栓（2432-A405，北京西浓科技有限公司）；

2,3,5-氯化三苯基四氮唑 TTC（918F032，北京索莱宝科技有限公司）；

4%多聚甲醛（21245132，Biosharp生物公司）；

伊文思蓝（C11891158，上海麦克林生化科技）；

甲酰胺（20190716，天津博迪化工）；

Boropinol-B原料药（20210530，实验室自制，方法见制备实施例1）。

模型建立：线栓法建立tMCAO模型大鼠；

术前大鼠禁食12小时，大鼠用10%水合氯醛（3.5ml/kg）麻醉后，仰卧位固定，维持动物体温为37℃左右。颈部备皮，取颈部正中切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，暴露右侧并钝性分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA近心端、ICA及ECA处置线备用。结扎CCA近心端、ECA，用动脉夹暂时夹闭ICA，然后在CCA距分叉部约4mm处用针头戳一小孔，将线栓经CCA插入ICA，松开ICA上的动脉夹，将线栓轻轻往里插入。当线栓头端距颈总动脉分叉处约18～19mm，或稍有阻力感时停止，系紧ICA处的细线。使用生理盐水清洗创面后缝合。栓塞2小时后，轻轻拔出线栓，实现再灌注，同时通过尾静脉给予规定剂量的药物溶液或空白乳剂。假手术组只分离血管，不插入线栓，其余操作步骤与实验组相同。麻醉清醒后，正常饲养。

模型入选标准：参照Zea Longa神经功能评分，术后2小时待大鼠麻醉清醒后进行评分，评分为1～3分者入组；

0分：无神经功能缺失症状，活动正常者；

1分：不能完全伸展对侧前爪；

2分：动物爬行时出现转圈；

3分：身体向偏瘫侧倾倒；

4分：不能自发行走，意识丧失者。

实验分组：线栓法造模，栓塞2小时后采用Zea Longa评分判断造模是否成功，取造模成功的大鼠随机分组给药。

大鼠随机分为假手术组（C组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的生理盐水）、模型组（T组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的空白乳剂）、Boropinol-B乳状注射液低剂量组（由制备实施例7制得，10mg/kg，L组）、Boropinol-B乳状注射液中剂量组（由制备实施例7制得，20mg/kg，M组），Boropinol-B乳状注射液高剂量组（由制备实施例7制得，40mg/kg，H组），每组10只，各组均通过尾静脉给药。

改善tMCAO大鼠神经功能缺损评分

造模24小时后采用Longa评分、mNSS评分对大鼠神经功能进行全面评估，mNSS评分标准见表1，对大鼠的感觉、运动、反射和平衡能力进行评价，评分范围为0～18分，得分越高，神经功能损伤越重；Longa评分标准如前所述，对大鼠的四肢伸展性和行走能力进行评价，评分范围为0~4分，得分越高，神经功能损伤越严重。评分由未参与造模和给药的不知情者独立完成。

实验结果由表2所示，相较于假手术组（C组），模型组（T组）在术后24小时的mNSS评分和Longa评分显著性升高（P<0.001），表明造模后大鼠出现明显的神经功能缺损，提示造模成功。相较于模型组（T组），低（L组）、中（M组）、高剂量（H组）给药组均能显著性降低tMCAO模型大鼠术后24小时mNSS评分，L组和M组还能显著降低模型大

鼠术后24小时Longa评分。L组和M组对模型大鼠神经功能改善效果相当，而当剂量提高到40mg/kg时，高剂量组大鼠的神经功能评分出现一定程度的升高，可能是由于药物剂量过高反而产生抑制作用。

减小tMCAO大鼠脑梗死体（面）积

完成24小时神经功能评分后，用10%水合氯醛（4ml/kg）深度麻醉大鼠，经心脏灌注生理盐水，迅速断头取脑。用适量生理盐水小心地漂洗脑组织后吸除水分。然后立即将脑组织置于-20℃冰箱中冷冻20分钟。取出后将脑组织横向均匀地切为5片（每片厚度约为2mm），然后加入2%TTC染液，迅速置于37℃水浴锅中，避光恒温孵育30分钟。染色结束后，吸出TTC染液，加入适量4%多聚甲醛固定，24小时后拍照采集脑片图像，白色区域为脑梗死区域，用Image J软件分析测定脑梗死体（面）积。脑梗死体（面）积计算：脑梗死体（面）积=切片梗死体（面）积/整个脑组织切片总体（面）积×100%；

实验结果由表3所示，相较于假手术组（C组），模型组（T组）脑切片有明显白色梗死区域（P<0.001），表明造模后大鼠神经元细胞损伤严重，提示造模成功。相较于模型组（T组），低（L组）、中剂量（M组）给药组能显著性降低tMCAO模型大鼠脑梗死体（面）积；而高剂量（H组）给药组只能一定程度减小模型大鼠脑梗死体（面）积，但没有显著性差异。表明Boropinol-B对tMCAO模型大鼠的治疗作用在一定剂量范围内有效，且不具有剂量依赖性。

改善tMCAO大鼠脑水肿程度和血脑屏障通透性

完成24小时神经功能评分后，将2%伊文思蓝溶液（5mL/kg）经尾静脉注入大鼠体内，循环1小时，然后用10%水合氯醛（4ml/kg）深度麻醉大鼠，经心脏灌注100mL生理盐水，迅速断头取脑，立即分为左侧半球、右侧半球、小脑和脑干。左、右半球冠状分为两部分，一部分用精度为0.1mg的天平分别称量脑组织（湿重）；随后，将样品置于烘箱105℃烘干24小时，再次分别称重（干重）；脑含水量计算：脑含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%。将另一部分脑组织称得湿重后，置于1.5ml甲酰胺中浸泡，45℃孵育72小时，25℃、5000rpm/min离心10分钟，吸取上清采用紫外分光光度法在622nm处检测吸光度，并根据标准曲线定量，最终结果显示为每克脑组织中伊文思蓝含量（μg/g）。

实验结果如表4所示，相较假手术组（C组），模型组（T组）缺血侧大脑半球在术后24小时脑含水量明显升高，伊文思蓝渗出量明显增多、血脑屏障通透性增大，而Boropinol-B低（L组）、中剂量（M组）给药组能显著降低大鼠缺血侧脑组织含水量、减轻脑水肿，减少伊文思蓝渗出、改善血脑屏障通透性；

效果实施例2：Boropinol-B对tMCAO大鼠的长期保护作用

实验材料：同效果实施例1。

实验分组：线栓法造模，栓塞2小时后采用Zea Longa评分判断造模是否成功，取造模成功的大鼠随机分组给药。

大鼠随机分为假手术组（C组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的生理盐水）、模型组（T组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的空白乳剂）、Boropinol-B乳状注射液给药组（由制备实施例7制得，10mg/kg，L组），每组10只，各组均通过腹腔给药。

模型建立：手术操作同效果实施例1，唯一不同之处在于，栓塞2小时后拔出线栓，同时腹腔给药（10mg/kg）。术后24小时记为第1天，长期喂养14天，每日腹腔给药（10mg/kg）。假手术组只分离血管，不插入线栓，其余操作步骤与实验组相同。麻醉清醒后，正常饲养。

模型入选标准同效果实施例1。

大鼠生存状态观察

对tMCAO大鼠连续治疗14天，每天观察大鼠的生存状况及存活率。实验结果如表5及图2A所示，24小时内，假手术组（C组）没有动物死亡，模型组（T组）动物死亡率为40%，给药组（L组）动物死亡率为22.2%；到第14天，C组能全部存活，而T组动物死亡率高达80%，L组为33.3%。T组和L组大鼠中位生存期分别为3天和undefined。与T组相比，L组能显著性降低脑缺血再灌注大鼠急性期死亡率，延长其中位生存期；

治疗过程中，每日记录大鼠体重。体重变化情况如图2B所示，相较于假手术组（C组），模型组（T组）大鼠术后精神萎靡，缺少进食欲望，体重下降幅度大且持续时间长。与模型组（T组）相比，给药组（L组）大鼠体重下降比例明显降低且恢复较快，自术后第5天起开始增重，精神状态和运动活跃程度也逐渐恢复正常。

神经功能评分和脑梗死体（面）积

第1、3、7、10、14天进行mNSS评分，评分细则同效果实施例1。第14天评分后经心脏灌注取脑，测定脑梗死体（面）积，具体实验操作同效果实施例1。实验结果如图2C及表6所示，与T组相比，L组能显著性改善tMCAO模型大鼠第1、3、7、10、14天神经功能评分，减小其脑梗死体（面）积；

如图2D所示，长期观察发现T组大鼠患侧脑组织出现发白、萎缩的现象；而C组和L组则没有表明Boropinol-B长期给药可以促进脑缺血再灌注模型大鼠运动功能的恢复，减小脑梗死体（面）积，还可缓解其恢复期脑组织萎缩的情况。

效果实施例3：Boropinol-B对pMCAO大鼠的神经保护作用

实验材料：同效果实施例1。

实验分组：线栓法造模，栓塞2小时后采用Zea Longa评分判断造模是否成功，取造模成功的大鼠随机分组给药。

大鼠随机分为假手术组（C组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的生理盐水）、模型组（P组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的空白乳剂）、Boropinol-B乳状注射液给药组（由制备实施例7制得，20mg/kg，M组），每组10只，各组均通过尾静脉给药。

模型建立：手术操作同效果实施例1，唯一不同之处在于，栓塞2小时后不拔出线栓，始终保持线栓阻塞大脑中动脉。栓塞2小时后，通过尾静脉给予规定剂量的药物溶液或空白乳剂。假手术组只分离血管，不插入线栓，其余操作步骤与实验组相同。麻醉清醒后，正常饲养。

模型入选标准同效果实施例1。

改善pMCAO大鼠神经功能评分

栓塞24小时后对各组大鼠进行mNSS评分，评分细则同效果实施例1；

实验结果如表7所示，相较于假手术组（C组），模型组（P组）术后24小时的mNSS评分显著性升高，提示造模成功。相较于模型组（P组），给药组（M组）能显著性降低pMCAO模型大鼠术后24小时mNSS评分，有助于改善神经运动功能。

减小pMCAO大鼠脑梗死体（面）积

完成24小时短期神经功能评分后，经心脏灌注取脑后测定脑梗死体（面）积，具体实验操作同效果实施例1。实验结果如表8所示，相较于假手术组（C组），模型组（P组）脑梗死体（面）积显著性增大，提示造模成功。相较于模型组（P组），给药组（M组）能显著性降低pMCAO模型大鼠脑梗死体（面）积，减少神经元细胞的死亡，发挥抗缺血性脑卒中的作用。

Boropinol-B改善pMCAO大鼠脑水肿程度和血脑屏障通透性

完成24小时短期神经功能评分后，经心脏灌注取脑后测定患侧脑水肿程度，具体实验操作同效果实施例1；

实验结果如表9所示，相较假手术组（C组），模型组（P组）缺血侧大脑半球在术后24小时脑含水量明显升高，伊文思蓝渗出量明显增多、血脑屏障通透性增大，而给药组（M组）能显著降低大鼠缺血侧脑组织含水量、减轻脑水肿，减少伊文思蓝渗出、改善血脑屏障通透性。

效果实施例4：Boropinol-B抗缺血性脑卒中的作用机制研究

实验材料：

PBS，1×（GP21090010951武汉赛维尔生物科技有限公司）；

大鼠白细胞介素1（IL-1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（20210525，上海江莱生物）；

大鼠白细胞介素6（IL-6）酶联免疫吸附测定试剂盒（20210525，上海江莱生物）

大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（20210525，上海江莱生物）；

大鼠谷氨酸（Glu）酶联免疫吸附测定试剂盒（20210525，上海江莱生物）

大鼠γ氨基丁酸（GABA）酶联免疫吸附测定试剂盒（20210525，上海江莱生物）。

实验步骤与结果：

降低炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平

造模后24小时，将大鼠深度麻醉，经心脏灌注生理盐水，断头取脑，用预冷的PBS冲洗脑组织，去除残留血液，用滤纸将表面水分拭干。称取约100mg脑组织放入2ml大小的EP管内，加入脑组织9倍重量的PBS缓冲液，冰浴下匀浆10分钟，4℃。匀浆液5000×g离心10分钟，取上清液按大鼠白细胞介素1（IL-1β）/白细胞介素6（IL-6）/肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒说明书要求分别检测患侧脑组织中炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的含量。

实验结果如图3A~C所示，相较假手术组（S组），模型组（T）大鼠缺血侧脑半球造模后24小时炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显升高，说明造模后大鼠体内发生免疫炎症反应，引发神经元死亡或凋亡。相较模型组（T组），给药组（L组）能显著性降低脑缺血大鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α含量，表明Boropinol-B可通过抑制免疫炎症反应来发挥抗缺血性脑卒中的神经保护作用。

降低Glu/GABA的比值

造模后24小时，经心脏灌注取脑，脑组织处理过程同上。取制得的上清液按大鼠谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）酶联免疫吸附测定试剂盒说明书要求检测患侧脑组织中Glu与GABA含量，结果表示为Glu/GABA。

结果如图3D所示，相较假手术组（S组），模型组（T）大鼠缺血侧脑半球造模后24小时Glu/GABA比值明显增大，说明造模后谷氨酸过度释放造成脑内兴奋/抑制平衡失调，引发神经兴奋性毒性。相较模型组（T组），给药组（L组）能显著性降低脑缺血大鼠脑组织Glu/GABA的比值，表明Boropinol-B可通过恢复脑内兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸（EAA/IAA）平衡来发挥神经保护作用。

效果实施例5：Boropinol-B提高糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞模型存活率

实验材料：

PC12细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司）；

连二亚硫酸钠（20201020，天津福晨化学有限公司）；

CellCountingKit-8 CCK-8（20210906，北京兰杰柯科技有限公司）；

四甲基偶氮唑蓝MTT（C12029690，美国Sigma-Aldrich）；

DMEM高糖培养基（AG29301810，美国Hyclone）；

胎牛血清（20010401，美国Gibco）

青霉素-链霉素溶液（双抗）（20201220，美国Hyclone公司）

PBS粉末（WK173618-1，北京中山金桥生物科技有限公司）；

DMSO（20201220，北京索莱宝科技有限公司）；

依达拉奉溶液（20210810，上海迈坤化工有限公司）；

Boropinol-B原料药（20210530，实验室自制，方法见制备实施例1）。

药物对PC12细胞的毒性

将处于对数生长期的细胞按1×10⁵个/ml接种于96孔板，每孔100μL，边缘孔用无菌PBS填充，之后置于37℃、5%CO₂的细胞孵育箱中培养24 小时，直至细胞完全贴壁。弃上清，加入100μL经无血清培养基稀释的Boropinol-B，浓度分别为0μmol/L（空白对照）、62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000 μmol/L（每个浓度设置6个复孔），然后置于细胞孵育箱中培养。24小时后每孔加入5mg/mL的MTT 10μL，细胞孵育箱中培养4小时；弃上清，加入DMSO 100μL/孔，并于37 ℃、500r/min摇床上振摇15分钟以充分溶解甲瓒，采用酶标仪检测570nm处OD值，计算PC12细胞活力。

最佳损伤浓度的确定

将处于对数生长期的细胞按1×10⁵个/ml接种于96孔板，每孔100μL，边缘孔用无菌PBS填充，之后置于37℃、5%CO₂的细胞孵育箱中培养24 小时，直至细胞完全贴壁。弃上清，加入终浓度分别为0mM（空白对照）、1mM、5mM、10mM、20mM、40mM的连二亚硫酸钠溶液，然后置于细胞孵育箱中培养。 24小时后，向每孔加入5mg/mL的MTT 10μL，然后置于细胞孵育箱中培养4小时；弃上清，加入DMSO 100μL/孔，并于37 ℃、500r/min摇床上振摇15分钟以充分溶解甲瓒，采用酶标仪检测570nm处OD值，计算PC12细胞活力。

对糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞模型的保护作用

另取完全培养基培养的处于对数生长期的PC12细胞，将其以3000~5000个/孔接种到96孔板，边缘孔用无菌PBS填充，之后置于37℃、5%CO₂的细胞孵育箱中培养24 小时，直至细胞完全贴壁；弃上清，对照组加入100μL无血清培养基，其余各组（包括模型组、阳性药物组和给药组）加入100μL终浓度为20mM的用无血清低糖培养基稀释的连二亚硫酸钠溶液。损伤2小时后，移出原培养基或损伤试剂，对照组和模型组加入100μL无血清培养基，阳性药物组加入100μL用无血清培养基稀释的浓度为50μM的依达拉奉溶液，给药组加入100μL用无血清培养基稀释的Boropinol-B乳剂（由制备实施例7制得，使Boropinol-B终浓度分别为10μM、25μM、50μM、100μM），然后置于细胞孵育箱中培养。24小时后，吸出药物溶液或空白培养基，每孔加入100μL PBS洗涤后吸出，然后每孔加入100μL完全培养基，再向每孔加入10μL的CCK-8溶液充分混匀，培养箱中继续培养2小时，用酶标仪在450nm处测定吸光度值，计算PC12细胞活力。

实验结果

如图4A/B所示，0~125μM浓度范围内Boropinol-B和EDA药物溶液对PC12细胞无毒性。一般来说，细胞损伤模型多选择细胞存活率为50%~70%时的损伤浓度。如图4C所示，与对照组相比，20mM Na₂S₂O4溶液损伤时PC12细胞存活率为68.22 %。因此，Na₂S₂O4损伤PC12细胞的最佳损伤浓度为20mM。如图4D所示，与模型组相比，10、25、50、100μM的Boropinol-B以及50μM的EDA均能显著性提高糖氧剥夺/复糖复氧损伤细胞模型的存活率。

效果实施例6：Boropinol-B对SAH和ICH大鼠的神经保护作用

实验材料：SPF级SD雄性大鼠，体重200～240g，购于四川省成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2020-030。

胶原酶Ⅶ购于美国Sigma-Aldrich公司（规格：1.5KU；批号：0000111586）。

Boropinol-B原料药（20210530，实验室自制，方法见制备实施例1）。

实验分组：血管内穿刺后或胶原酶Ⅶ注射后2小时采用Zea Longa评分判断造模是否成功，取造模成功的大鼠随机分组给药。

大鼠随机分为假手术组（C组，给予与乳状注射液低剂量组等体积的生理盐水）、模型组（S或I组，给予与乳状注射液低剂量组等体积的空白乳剂）、Boropinol-B乳状注射液低剂量组（由制备实施例7制得，10mg/kg，L组），每组10只，各组均通过尾静脉给药。

血管内穿刺法建立SAH

术前大鼠禁食12小时，大鼠用4%异氟烷诱导麻醉，并采用2%异氟烷维持麻醉。仰卧位固定，维持动物体温为37℃左右。颈部备皮，取颈部正中切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，暴露右侧并钝性分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA近心端、ICA及ECA处置线备用。结扎CCA近心端、ECA，用动脉夹暂时夹闭ICA，然后在CCA距分叉部约4mm处用针头戳一小孔，将穿刺线经CCA插入ICA，松开ICA上的动脉夹，将穿刺线向颅内插入。当穿刺线头端距颈总动脉分叉处约18～19mm后，有阻力感，表示穿刺线头端已达大脑前动脉与大脑中动脉分叉处，略用力再伸入约2mm后，此时穿刺线已刺破大脑前动脉与大脑中动脉分叉。完全拔除穿刺线，结扎ICA，使用生理盐水清洗创面后缝合。假手术组只是当穿刺线刺入感到阻力时退出，不刺破大脑前动脉与大脑中动脉分叉，其余操作步骤与实验组相同。麻醉清醒后，正常饲养。

胶原酶注入法构建ICH模型

术前大鼠禁食12小时，大鼠用4%异氟烷诱导麻醉，并采用2%异氟烷维持麻醉。俯卧位固定，维持动物体温为37℃左右。头部备皮，取头部正中切口，根据诸葛启钏主译的大鼠脑立体定位图谱（GeorgePaxinos, CharlesWatson, Paxinos, Watson, & 诸葛启钏. 大鼠脑立体定位图谱[M]. 人民卫生出版社, 2005），使用立体定位仪定位大鼠右侧尾状核（以前囟为原点，向右3mm，深度5.5mm），标记后使用颅骨转孔，将微量注射器针头插入脑组织尾状核，注入含0.5U Ⅶ型胶原酶1μL，注射时间5分钟，注射完后留针8 分钟，缓慢将针退出，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤，回笼饲养。假手术组大鼠只插针注射灭菌生理盐水，不注射药物，其他操作不变。

脑出血模型入选标准

同效果实施例1。

改善SAH或ICH大鼠神经功能缺损评分

造模24小时后采用Garcia评分、平衡木实验对大鼠神经功能进行全面评估，Garcia评分标准见表10，对大鼠的运动、感觉、攀爬、四肢对称性进行评价，评分范围为3～18分，得分越低，神经功能损伤越重；平衡木实验评分标准见表11，对大鼠的本体感觉和身体协调性进行评价，评分范围为0~6分，得分越高，神经功能损伤越严重。评分由未参与造模和给药的不知情者独立完成。

由表12所示，相较假手术组（C组），模型组（S或I组）在术后24小时的Garcia评分明显降低（P<0.01），平衡木评分明显升高（P<0.01），可见SAH或ICH后24小时模型组的大鼠发生明显神经功能缺损，提示造模成功；Boropinol-B给药组（L组）能显著性提高Garcia得分、降低平衡木评分，改善SAH或ICH引起的神经功能缺损。

改善SAH或ICH大鼠脑水肿程度和血脑屏障通透性

完成24小时短期神经功能评分后，经心脏灌注取脑后测定患侧脑组织脑含水量和血脑屏障通透性，具体实验操作同效果实施例1。由表13所示，相较假手术组（C组），模型组（S或I组）出血侧大脑半球在术后24小时脑含水量明显升高，伊文思蓝渗出量明显增多、血脑屏障通透性增大，而Boropinol-B给药组（L组）能显著降低大鼠出血侧脑组织含水量、减轻脑水肿，减少伊文思蓝渗出、改善血脑屏障通透性。

综上，体内外药效学研究结果表明：Boropinol-B可显著性改善脑缺血模型大鼠急性期神经功能评分，减小脑梗死体（面）积，改善脑水肿程度和血脑屏障通透性，促进脑缺血再灌注模型大鼠恢复期体重和神经运动功能恢复，减小脑梗死体（面）积，预防或缓解脑组织萎缩，延长中位生存期；也可显著提高糖氧剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞模型的存活率；还可显著改善脑出血模型大鼠的神经功能缺损评分，减轻脑水肿，保护血脑屏障完整。据此，Boropinol-B有望成为极具应用前景的治疗缺血性脑卒中和出血性脑卒中的药物。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (9)

1.如式I所示化合物（Boropinol-B），其特征在于，用于制备治疗脑卒中药物中的应用，

式I。

2.如权利要求1所述，其特征在于，所述的脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。

3.如权利要求2所述，其特征在于，所述的缺血性脑卒中为大脑中动脉闭塞/再灌注、大脑中动脉永久性缺血中的至少一种所导致的缺血性脑卒中。

4.如权利要求2所述，其特征在于，所述的出血性脑卒中为脑内出血和蛛网膜下腔出血中的至少一种所导致的出血性脑卒中。

5.如权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物用于下列中的至少一种：改善tMCAO、pMCAO、ICH或SAH所致的神经功能或运动功能的损伤，改善tMCAO、pMCAO、ICH或SAH所致的急性期脑组织水肿或血脑屏障功能障碍，减小tMCAO或pMCAO所致的脑梗死体（面）积，降低tMCAO所致的急性期死亡率、促进恢复期体重和神经运动功能恢复、预防或缓解脑组织萎缩以及延长中位生存期。

6.如权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，所述的式I所示化合物为所述药物中的唯一有效成分。

7.如权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，当所述的药物用于治疗患有脑卒中的人时，所述的药物中式I所示化合物的每日给药剂量范围为0.3mg~3.0mg/kg体重，优选为0.5mg~2.0mg/kg体重。

8.如权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物为乳剂。

9.一种治疗受试者脑卒中的方法，其特征在于，包括：给予所述受试者治疗有效量的如式I所示化合物；优选地，所述的方法用于治疗受试者缺血性脑卒中或出血性脑卒中。

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