CN114306319A - 神经酸在修复脑缺血再灌注损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经酸在修复脑缺血再灌注损伤中的应用，属于生物医药技术领域。一种神经酸药物组合物，包括组分：神经酸、银杏黄酮和虾青素，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:(0.3‑20):(0.3‑20)。本发明将神经酸、虾青素和银杏黄酮应用于脑缺血再灌注损伤的修复，在单独使用时，神经酸的修复作用最佳，虾青素和银杏黄酮的修复作用次之，当神经酸、虾青素和银杏黄酮联合使用时，出现了明显的协同增效现象，神经酸、虾青素和银杏黄酮联合给药的作用效果明显优于任何一种药物单独给药的作用效果。神经酸与虾青素和银杏黄酮发挥协同作用，减少了脑梗死体积，降低了对神经功能的损伤，提高了对脑缺血再灌注损伤的修复效果。

Description

神经酸在修复脑缺血再灌注损伤中的应用

技术领域

本发明涉及神经酸在修复脑缺血再灌注损伤中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

脑卒中，又称脑中风，是一种急性脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高复发率等特点。脑卒中包括出血性卒中和缺血性卒中，其中缺血性卒中是由于颅内重要供血动脉的狭窄或闭塞，导致大脑血液循环发生障碍、脑组织受损，引发局灶性神经功能障碍，约占脑卒中总数的80％。而及时恢复大脑血液供应可减轻脑组织受损，恢复神经功能，但因治疗时间窗短等原因容易进一步诱发再灌注损伤。因而脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemiareperfusion injury,CIRI)是指在发生脑缺血时，一定时间内恢复血液供应后，大脑功能不仅没有得到改善，反而出现更加严重的神经功能障碍及组织损伤。

缺血性脑卒中常与高血压、高血脂和糖尿病等疾病密切相关，尤其易发生在中老年人群，严重影响人的生活与健康。因此，降低脑卒中的致死率、致残率，减少脑缺血再灌注损伤，具有重要意义。

神经酸(Nervonic acid)，是一种长链单不饱和脂肪酸，其化学名为顺-15-二十四碳烯酸(C24:1)，最早发现于哺乳动物的神经组织，是大脑神经纤维和神经细胞的核心成分，在促进神经系统发育、增强脑细胞活性中发挥着重要作用。1972年，Sinclar等人研究发现鲨鱼脑组织在受重创后的短时期内能自行修复，证明了神经酸在修复神经纤维、促使神经细胞再生方面具有良好功效。迄今为止，已有很多研究表明神经酸对脑疾病具有治疗功效，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、策尔韦斯综合症、肾上腺脑白质营养不良、肿瘤等疾病。神经酸的出现和应用，拓宽了医疗界对脑部疾病治疗的途径。虽然神经酸对脑神经的修复与营养、脑组织的保护、防治脑血管疾病有良好的作用，但是心脑血管疾病通常是相伴发生的，单独使用神经酸对心脑血管疾病的整体防治会有不足，并且神经酸熔点较低，在39～40℃或42～43℃，稳定性差，不利于生产加工。

银杏黄酮，是色原烷及色原酮的衍生物，它的主要有效成分包括银杏双黄酮(gilobetin)、白果素(bilobetin)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)等具有3,3,4-三羟基结构的化合物，具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、调血脂等药理作用。银杏黄酮可引起冠状血管扩张，并且可以增加帕金森病患者的脑血量，改善脑组织供血及供氧，促进血液循环，预防心脑血管疾病；提升记忆力，预防老年痴呆症；还可以在缺氧的条件下保护脑细胞，起到抗凝及清除自由基的作用。

虾青素，是一种酮或类胡萝卜素，色泽为粉红色，具脂溶性，不溶于水，可溶于有机溶剂，广泛存在于生物界中，特别是水生动物如虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中，起显色的作用。虾青素是自然界中最强的抗氧化剂，抗氧化活性是维他命E的550倍、β-胡萝卜素的10倍，可以清除NO₂、硫化物、二硫化物等，也可降低脂质过氧化作用。近年随着虾青素生物功能研究和药理药效实验的不断深入，发现虾青素在心血管疾病、癌症、代谢综合征、糖尿病、神经退行性疾病、眼科疾病、皮肤病等疾病的预防和治疗中具有出色的效果，表明虾青素在医药、保健品等领域中具有巨大的潜在应用价值和广阔的开发前景。

发明内容

本发明提供了神经酸在修复脑缺血再灌注损伤中的应用，主要是通过研究神经酸、虾青素、银杏黄酮单独作用及其联合应用时，对脑缺血再灌注损伤的修复作用，得出具有一定有效性，能够发挥特定功能的组合药物，尤其是神经酸与虾青素和银杏黄酮联合使用时的优势性，减少脑缺血再灌注带来的损伤，为脑卒中疾病的治疗提供新的药物组合参考。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物。

一种神经酸药物组合物，包括组分：神经酸、银杏黄酮和虾青素，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:(0.3-20):(0.3-20)。

根据本发明优选的，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:(1-7.5):(1-7.5)。

根据本发明优选的，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:2.5:2.5。

本发明的第二方面，提供一种上述药物组合物的制备方法，包括：将神经酸、虾青素和银杏黄酮混合，所得混合物即为药物组合物。

根据本发明优选的，所述制备方法还包括：在上述药物组合物中加入羧甲基纤维素钠作为药物载体。

根据本发明优选的，所述制备方法还包括：在上述药物组合物中加入吐温-20，促进药物组分混匀。

在本发明一种优选的技术方案中，一种治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为0.5-1.5％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.03-0.2％和0.3-0.7％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入神经酸和银杏黄酮，使神经酸和银杏黄酮的终浓度分别为0.01-0.1％和0.03-0.2％，搅拌至混匀即得，以上浓度均为质量百分比浓度。

本发明的第三方面，提供一种上述神经酸药物组合物在制备修复脑缺血再灌注损伤药品中的应用。

本发明中，上述神经酸药物组合物中神经酸的给药浓度为2mg/kg/day、银杏黄酮的给药浓度为5mg/kg/day、虾青素的给药浓度为5mg/kg/day时，脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑梗死体积减少66.07％，SOD活性上升66.21％，MDA含量降低49.15％。

有益效果：

本发明将神经酸、虾青素和银杏黄酮应用于脑缺血再灌注损伤的修复，发现神经酸、虾青素和银杏黄酮对于脑缺血再灌注损伤都具有一定的修复作用，其中，在单独使用时，神经酸的修复作用最佳，虾青素和银杏黄酮的修复作用次之。另外，当神经酸、虾青素和银杏黄酮联合使用时，出现了明显的协同增效现象，神经酸、虾青素和银杏黄酮联合给药的作用效果明显优于任何一种药物单独给药的作用效果。神经酸与虾青素和银杏黄酮发挥协同作用，减少了脑梗死体积，降低了对神经功能的损伤，提高了对脑缺血再灌注损伤的修复效果，为脑缺血再灌注损伤的修复提供了一种新的给药思路。

附图说明

图1为大鼠缺血性再灌注损伤修复实验流程示意图；

图2为不同处理组大鼠神经功能ZeaLonga评分(图A)和mNSS评分(图B)结果；

图3为不同处理组大鼠脑梗死体积柱状图；

图4为不同处理组大鼠脑组织中SOD活性(图A)与MDA含量(图B)柱状图；

图5为不同处理组大鼠脑组织中炎症因子TNF-α含量(图A)，IL-1β含量(图B)及IL-6含量(图C)柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

健康成年大鼠88只，SD级别，个体质量为300g左右，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，于山东第一医科大学脑科所饲养。

其他材料来源：

神经酸购自深圳迪克曼科技开发有限公司；

银杏黄酮：ZY190403，克拉玛尔试剂；

虾青素购自昆明白鸥微藻技术有限公司；

麻醉剂：异氟烷，00454，Sigma-Aldrich；

TTC试剂：362883，Sigma-Aldrich；

丙二醛(MDA)含量检测试剂盒：BC0025，北京索莱宝科技有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒：BC0170，北京索莱宝科技有限公司；

肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒：RAB0480-1KT，Sigma-Aldrich；

IL-6ELISA检测试剂盒：RAB0311-1KT，Sigma-Aldrich；

IL-1βELISA检测试剂盒：RAB0278-1KT，Sigma-Aldrich。

实施例中涉及的百分比均为质量百分比。

实施例1

一种神经酸药物组合物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.1％和0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入神经酸和银杏黄酮，使神经酸和银杏黄酮的终浓度分别为0.04％和0.1％，搅拌至混匀即得。

对比例1

一种神经酸(Nervonic acid，NA)药物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入吐温-20，使吐温-20的终浓度为0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入神经酸，使神经酸的终浓度为0.24％，搅拌至混匀即得。

对比例2

一种神经酸(Nervonic acid，NA)药物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入吐温-20，使吐温-20的终浓度为0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入神经酸，使神经酸的终浓度为0.04％，搅拌至混匀即得。

对比例3

一种虾青素(Astaxanthin，ASX)药物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.24％和0.5％，用搅拌器搅拌均匀即得。

对比例4

一种虾青素(Astaxanthin，ASX)药物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.1％和0.5％，用搅拌器搅拌均匀即得。

对比例5

一种银杏黄酮(ginkgo flavonoids，GA)药物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入吐温-20，使吐温-20的终浓度为0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入银杏黄酮，使银杏黄酮的终浓度为0.24％，搅拌至混匀即得。

对比例6

一种银杏黄酮(ginkgo flavonoids，GA)药物：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入吐温-20，使吐温-20的终浓度为0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入银杏黄酮，使银杏黄酮的终浓度为0.1％，搅拌至混匀即得。

对比例7

一种药物组合物，包括神经酸和虾青素：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.17％和0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入神经酸，使神经酸的终浓度为0.07％，搅拌至混匀即得。

对比例8

一种药物组合物，包括银杏黄酮和虾青素：称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为1％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.12％和0.5％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入银杏黄酮，使神银杏黄酮的终浓度为0.12％，搅拌至混匀即得。

实施例2

研究各药物及药物组合物在缺血性再灌注损伤中的作用，实验流程示意图如图1，具体研究内容如下：

(1)构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型

采用线栓法造模，首先用异氟烷溶液麻醉大鼠，术区常规剃毛消毒，将颈部正中右旁侧切开，逐层分离，暴露右侧颈总动脉，挂线备用。随后于颈外和颈内动脉挂线，分离露出颈外动脉主干，在其根部打结。用动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉近心端。在颈总动脉近头端距分叉部5mm左右斜剪一小口，导入线栓进入颈内动脉。移除颈内动脉上的动脉夹，将线栓插至所需深度，遇阻力即停。结扎切口处颈总动脉挂线，移开颈总动脉上的血管夹。确认无出血后计时，缺血1h后拔除线栓形成再灌注，构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型。

(2)分组与给药

将88只脑缺血再灌注损伤模型大鼠随机分为神经酸高剂量给药组(NA-H)，神经酸低剂量给药组(NA-L)，虾青素高剂量给药组(ASX-H)，虾青素低剂量给药组(ASX-L),银杏黄酮高剂量给药组(GA-H)，银杏黄酮低剂量给药组(GA-L)，神经酸和虾青素联合给药组(NA-ASX)，银杏黄酮和虾青素联合给药组(GA-ASX)，神经酸、银杏黄酮及虾青素三者联合给药组(NA-ASX-GA)，模型组(MG)和假手术组(Sham)，每组8只。其中，神经酸高剂量给药组(NA-H)，神经酸低剂量给药组(NA-L)，虾青素高剂量给药组(ASX-H)，虾青素低剂量给药组(ASX-L)，银杏黄酮高剂量给药组(GA-H)，银杏黄酮低剂量给药组(GA-L)，神经酸和虾青素联合给药组(NA-ASX)，银杏黄酮和虾青素联合给药组(GA-ASX)和神经酸、银杏黄酮及虾青素三者联合给药组(NA-ASX-GA)分别给予对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8和实施例1制备的药物，模型组(MG)和假手术组(Sham)给予1％的羧甲基纤维素钠溶液。给药方式均为灌胃喂养，给药剂量均为1.5mL/rat/day，连续给药7天。其中，Sham组只剪开皮肤组织，未造成损伤。各组给药药品的配制浓度以及最终给药浓度如下表所示：

表1.各处理组的药品配制浓度及给药浓度

(3)神经功能评分

采用ZeaLonga评分法和mNSS评分法进行评分，ZeaLonga评分标准如下：(1)活动正常，不表现出神经功能缺损体征，得0分；(2)手术对侧前肢、前爪不能完全伸展，表现为轻度局灶性神经功能缺损体征，得1分；(3)行走时向偏瘫侧转圈，表现为中度局灶性神经功能缺损体征，得2分；(4)行走时向偏瘫侧倾倒，显示严重的局灶性神经功能缺损体征，得3分；(5)不能自发行走，表现为意识丧失，得4分。结果如图2A所示，MG组ZeaLonga评分为(3.88±0.35)分，NA-ASX-GA组为(1.63±0.52)分，GA-H组为(3.13±0.64)分，GA-L组为(3.63±0.52)分，NA-H组为(2.38±0.52)分，NA-L组为(2.88±0.64)分，ASX-H组为(3.25±0.71)分，ASX-L组为(3.63±0.52)分，NA-ASX组为(2.63±0.52)分，GA-ASX组为(3.19±0.53)分，Sham组为0分。

参照chen等改良的神经功能缺损严重程度评分(Modified NeurologicalSeveritycore，mNSS，评分标准见表2)，该评分标准包括运动、感觉、反射和平衡功能测试。

表2.改良的神经功能缺损严重程度评分标准

备注：重度神经功能缺损13-18分；中度神经功能缺损7-12分；轻度神经功能缺损1-6分。

结果如图2B所示，MG组mNSS评分为(10.63±1.69)分，NA-ASX-GA组为(4.75±0.71)分，GA-H组为(6.50±1.69)分，GA-L组为(7.75±1.16)分，NA-H组为(5.63±0.52)分，NA-L组为(7.25±0.46)分，ASX-H组为(6.63±1.19)分，ASX-L组为(7.63±1.19)分，NA-ASX组为(6.44±0.18)分，GA-ASX组为(6.56±1.43)分，Sham组为(0.75±0.46)分。

各药物给予组的ZeaLonga得分和mNSS得分均低于模型组(MG组)，说明各处理组的药物对于大鼠的脑缺血再灌注损伤均有一定的修复作用。当各药物单独作用时，高剂量组的作用效果优于低剂量组，且与低剂量组相比，高剂量用药也并未对大鼠造成任何毒害作用。另外NA-ASX-GA组评分与其他各组具有显著性差异(p＜0.05)，说明神经酸组合药物NA-ASX-GA有助于发生脑缺血再灌注损伤的大鼠进行神经功能缺损的修复，且组合药物的修复效果要优于单一药物组分单独作用的效果。

(4)脑组织TTC染色与切片

TTC是一种脂溶性光敏感复合物，它能够与正常脑组织中的脱氢酶发生反应，生成红色的不溶物质，而缺血脑组织线粒体受损，无法诱导染色反应而呈白色，从而能够区分正常和梗死的脑组织。

各组大鼠给药结束后，将大鼠断头取脑，用生理盐水漂洗，随后置于冰箱冷冻层冷冻20min，去除嗅脑、小脑和脑干，作冠状切片，共6片。37℃条件下0.5％TTC溶液孵育10min，用滤纸吸干表面，拍照，采用Image J软件计算出脑梗死体积，结果如图3所示，相较于MG模型组，NA-ASX-GA组的TTC染色脑梗死体积减少66.07％，GA-H组减少38.37％，GA-L组减少22.76％，NA-H组减少59.15％，NA-L组减少48.74％，ASX-H组减少41.10％，ASX-L组减少28.09％，NA-ASX组减少53.94％，GA-ASX组减少39.73％，神经酸组合药物NA-ASX-GA大大降低了脑组织的梗死面积。

(5)脑组织生化指标检测

自由基是介导脑梗死后神经元死亡的一个最关键因素。SOD具有清除氧自由基，保护生物膜免受自由基攻击的作用。组织MDA(脂质过氧化物)水平间接反映了组织受自由基损伤程度。

取右脑称定质量后置于冰水浴的研钵内，加入4℃生理盐水100μL碾磨，碾磨过程中持续加入低温生理盐水，加入总量为脑组织质量的9倍量。3000r/min离心15min，取上清得10％脑匀浆，上清稀释10倍后，可得1％脑匀浆。按照试剂盒说明书测定MDA、SOD以及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

MDA和SOD的测定结果如图4所示，与MG模型组相比，NA-ASX-GA组脑组织中SOD活性上升66.21％，MDA含量降低49.15％；GA-H组脑组织中SOD活性上升39.29％，MDA含量降低31.27％；GA-L组脑组织中SOD活性上升9.85％，MDA含量降低27.36％；NA-H组脑组织中SOD活性上升56.48％，MDA含量降低43.96％；NA-L组脑组织中SOD活性上升31.48％，MDA含量降低40.65％；ASX-H组脑组织中SOD活性上升43.49％，MDA含量降低26.95％；ASX-L组脑组织中SOD活性上升14.96％，MDA含量降低23.04％；NA-ASX组脑组织中SOD活性上升43.98％，MDA含量降低42.31％；GA-ASX组脑组织中SOD活性上升23.72％，MDA含量降低29.11％。说明神经酸药物组合物NA-ASX-GA减轻了脑梗死后的自由基反应，且组合药物修复效果优于单一组分的作用效果。

炎症常常伴随并诱导脑缺血再灌注损伤的发生，在急性脑缺血的早期阶段，坏死细胞和氧自由基以及其他相关的信使分子可以激活NF-kB通路，诱导许多炎症分子的转录和释放，包括促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β，它们可以加重脑血管系统中的内皮细胞损伤。炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的测定结果如图5所示，MG组TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度显著高于Sham组，各药物给予组的TNF-α、IL-6、IL-1β浓度均低于模型组(MG组)，说明各处理组的药物对于大鼠的脑缺血再灌注损伤均有一定的修复作用。当各药物单独作用时，高剂量组的作用效果优于低剂量组，但高剂量用药并未对大鼠造成毒害作用，且较其他各组相比，NA-ASX-GA组的修复效果最好，说明神经酸组合药物NA-ASX-GA显著减轻了脑缺血再灌注损伤大鼠的炎症程度，且组合物修复效果优于单一药物组分单独作用效果。

综上可知，从神经功能评分、脑组织TTC染色、脑组织生化指标检测的实验结果可知，神经酸、虾青素和银杏黄酮对于脑缺血再灌注损伤都具有一定的修复作用，其中，在单独使用时，神经酸的修复作用最佳，虾青素和银杏黄酮的修复作用次之；当这三种组分联合使用时，出现了明显的协同增效现象，神经酸、虾青素和银杏黄酮联合给药组的作用效果明显优于任何一种药物单独给药的作用效果，取得了预料不到的技术效果。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例及实施过程中的优化建议而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种神经酸药物组合物，其特征在于，包括组分：神经酸、银杏黄酮和虾青素，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:(0.3-20):(0.3-20)。

2.如权利要求1所述的神经酸药物组合物，其特征在于，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:(1-7.5):(1-7.5)。

3.如权利要求1所述的神经酸药物组合物，其特征在于，所述神经酸、银杏黄酮和虾青素的质量比为1:2.5:2.5。

4.如权利要求1所述的神经酸药物组合物，其特征在于，当神经酸药物组合物中神经酸的给药浓度为2mg/kg/day、银杏黄酮的给药浓度为5mg/kg/day、虾青素的给药浓度为5mg/kg/day时，脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑梗死体积减少66.07％，SOD活性上升66.21％，MDA含量降低49.15％。

5.权利要求1所述的神经酸药物组合物的制备方法，其特征在于，包括：将神经酸、虾青素和银杏黄酮混合，所得混合物即为药物组合物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在上述药物组合物中加入羧甲基纤维素钠作为药物载体。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在上述药物组合物中加入吐温-20，促进药物组分混匀。

8.一种治疗脑缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

称取羧甲基纤维素钠溶解于水中，使羧甲基纤维素钠的终浓度为0.5-1.5％，待完全溶解后，加入虾青素与吐温-20，使虾青素与吐温-20的终浓度分别为0.03-0.2％和0.3-0.7％，用搅拌器搅拌均匀，之后加入神经酸和银杏黄酮，使神经酸和银杏黄酮的终浓度分别为0.01-0.1％和0.03-0.2％，搅拌至混匀即得，以上浓度均为质量百分比浓度。

9.权利要求1所述的神经酸药物组合物在制备修复脑缺血再灌注损伤药品中的应用。

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