KR20150138973A - 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20150138973A KR20150138973A KR1020140066109A KR20140066109A KR20150138973A KR 20150138973 A KR20150138973 A KR 20150138973A KR 1020140066109 A KR1020140066109 A KR 1020140066109A KR 20140066109 A KR20140066109 A KR 20140066109A KR 20150138973 A KR20150138973 A KR 20150138973A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- bee venom
- eae
- acute
- autoimmune
- acupuncture
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/63—Arthropods
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 봉독(bee venom)을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system)의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 봉독을 족삼리(ST36)혈에 투여한 결과 MBP(myelin basic protein) 및 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 펩타이드에 의해 유도된 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) 동물모델에서 질병의 신경학적인 임상증상 척도와 체중의 감소를 개선하고, 척수의 탈수초화, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고, 활성화된 면역기능을 억제하며, 염증매개인자 및 iNOS의 발현과 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 신호기전을 억제신호기전을 억제하며, 특히 봉독을 비경혈점(non-acupoint, 둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 투여하였을 때 상기 효과를 나타내지 않으므로, 상기 봉독의 족삼리(ST36)혈을 통한 투여는 신경계 자가면역 질환 발생을 예방하거나 발생 초기의 치료법으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 봉독(bee venom)을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system) 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 봉독을 이용한 신경계 자가면역 질환 치료 방법에 관한 것이다.
면역(immunity)은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질에 대한 생체의 자기보호체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절·비장·편도 등으로 순환하는 백혈구다. B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성한다. B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성 면역을 수행한다. T세포는 흉선에서 만들어져 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성 면역을 담당한다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 자가면역 질환(autoimmune disease)이 생긴다.
자가면역 질환은 숙주의 면역 반응이 외래 항원을 자가 분자(자가 항원)와 구별하는데 실패하여 비정상적인 면역 반응을 유도할 때 초래된다. 자가면역 질병에서 자가 분자에 대한 면역 반응은 자가-내성의 비정상적인 상태인데, 이는 면역계의 초기 발생과정에서 자가항원에 대해 반응할 수 있는 T 세포 및 B 세포가 파괴됨으로써 예방된다. 프로세싱된 펩티드를 T 세포에 결합시키고 제시하는 능력을 통해 면역 반응의 조절에서 중추적인 역할을 하는 세포 표면 단백질이 주조직적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC)분자이다. MHC의 두 개의 형태는 클래스Ⅰ또는 클래스Ⅱ로 존재하며, 두 형태 모두는 단일 유전자 복합체내에서 인코딩된다. 자가면역 질환은 MHC 클래스Ⅰ또는 클래스Ⅱ 유전자의 특정 대립유전자와 현저한 유전적 관련성을 갖는다.
자가면역 질환 중에는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system)이 있는데, 이는 중추신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in central nervous system)으로도 불린다. 신경계 자가면역 질환은 자가면역 프로세스가 뉴런의 수초(myelin sheath)의 손상에 관여하는 질환이다. 이러한 질환의 예로는 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레 증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 급성 파종 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 급성 횡단 척수염(acute transverse myelitis), 자가면역성 뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy) 등이 있다.
자가면역 질환은 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병이므로 자가면역 질환의 치료법으로는 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 치료에 한계가 있다. 여러 가지 면역요법들이 있으나 아직 확실한 치료효능을 보이는 방법으로 인정된 사례는 없다. 자가면역 질환의 치료법을 연구하기 위하여 다양한 동물 모델이 사용된다.
염증반응은 척수손상 후 나타나는 이차적 손상의 주된 요인 중 하나로서 급성, 만성 척수손상의 병리현상 조절에 중추적인 역할을 한다. 척수손상 후 염증반응은 염증과 관련한 유전자 및 단백질의 발현이나 활성이 증가되어 발생하는데, 특히 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α, 인터류킨(interleukin, IL)-1β, IL-6등의 염증성사이토카인(pro-inflammotory cytokines)이나 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase-2, COX-2), 유도형 일산화질소 합성 효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 프로스타글란딘 합성효소(prostaglandin synthase-2) 등의 염증 매개물질이 관여한다고 알려져 있다. 이러한 물질들은 손상 후에 유입된 혈액세포(blood cell)나 척수 내에 존재하는 미세아교세포(microglia)에서 분비되어 세포 독성을 나타내며 축삭퇴화나 탈수초화의 진행에도 영향을 미치게 된다. 또한, 척수손상 후에 유입되는 혈액세포 중에서 특히 호중성 백혈구(neutrophil)나 대식세포(macrophage) 등이 염증반응을 유도하여 세포사멸 및 신경아교성반흔(gliolic scar)의 형성에 관여하고, 주위 세포의 부가적인 활성화를 야기하여 연속적인 염증반응을 일으킨다고 알려져 있어 이들의 유입을 억제하는 것이 중요한 치료전략 중 하나로 평가되고 있다.
시신경 척수염은 주로 척수(spinal cord)와 시신경(optic nerve)을 침범하는 중추신경계의 염증성 탈수초 질환으로 다발성 경화증의 다른 형태로 여겨졌다. 시신경 척수염은 자가항체에 의해 주로 일측, 혹은 양측성 시신경염과 척수염을 주 증상으로 하는 질환이다. 다발성 경화증과 임상증상이 비슷하여 구분이 어렵고 진단에 혼란이 있어 왔지만, 중추신경계 수분통로 단백질인 aquaporin-4(AQP-4)에 대한 자가항체가 발견되면서 시신경 척수염의 발병기전과 임상적 특징에 대하여 많은 사실이 알려지게 되었다. 시신경 척수염은 양안성 시신경염과 척수염이 동시에, 혹은 짧은 시간에 연속적으로 발병하는 경우를 임상적으로 진단하여 왔으나 최근에는 AQP-4 항체와 특징적인 뇌 영상소견이 알려지면서 이러한 소견을 종합하여 새로운 진단기준이 마련되었다. 시신경 척수염은 다발경화증에 비해 초기에 재발이 잦고 빠르게 악화되기 때문에 예후가 더 나쁘며 면역억제제 등의 재발방지 효과도 더 낮은 것으로 알려져 있다.
만성 염증성 탈수초성 다발신경병증은 다리와 팔의 느린 진행성 약화 및 감각 장애를 특징으로 하는 신경계 질병이다. 이 질병은 말초 신경의 수초에의 손상에 의해 야기된다. 신경 뿌리의 팽윤 또한 이 질병의 특징이다. 이 질병은 어느 연령 및 성별에서도 일어날 수 있음에도 불구하고 젊은 성인에서 그리고 여자보다 남자에 더 일반적이다. 증상은 저림 또는 무감각(발가락 및 손가락에서 시작함), 팔과 다리의 약함, 근육통, 깊은 힘줄 반사의 소실(무반사), 피로 및 비정상적인 감각을 포함한다. 치료되지 않은 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증은 물리적 및 작업적 요법, 보조기학 장치 및 장기적 치료를 요하는 축적성 장애를 특징으로 한다.
다발성 경화증은 인체 내 면역계의 결손에 의해 유발되는 질환으로 뇌와 척수의 백질 부분의 신경을 덮는 지방질로 된 수초(myelin sheath)를 침범하여 탈수초화(demyelination)를 산발적으로 일으키는 질환으로 수초가 손상을 받아 수초막의 두께가 감소하면 신경 자극은 전달되지만 효율성이 떨어지고 이에 정상적인 신경 자극 전달이 방해를 받아 발병되는 질병이다. 쉽게 설명하자면 전선을 둘러싸고 있는 절연체가 손상되면 전기의 전도가 느려지는 것과 마찬가지로 신경 세포 간의 전도 속도가 느려지는 현상을 초래하여 증상을 일으킨다. 초기에는 수초가 회복되면서 완화 증상이 나타나지만, 결국 악화가 반복되며 손상이 영구화된다. 이 같은 수초의 손상으로 인해 신경이 적절히 작용을 하지 못하여 시야 장애나 균형감 상실 등의 증상이 야기되고 일부 환자에서는 마비가 올 수 있다.
다발성 경화증의 치료는 크게 급성기 치료와 장기적인 질병완화 치료, 그리고 증상완화 치료로 나눌 수 있다. 급성기에는 일반적으로 고용량 스테로이드의 정맥주사 요법을 사용한다. 스테로이드는 급성기에 증상을 완화시키고 회복 기간을 줄여주지만, 장기적으로 투여할 경우에는 다양한 부작용이 나타날 수 있으므로 사용에 주의를 요한다. 여러 가지 원인에 의해 질병완화 치료를 하기 어려운 환자들은 저용량 스테로이드 유지 요법을 사용하기도 한다. 대표적인 질병완화 치료제로는 인터페론(beta-interferon)과 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate)가 있다. 이들은 재발-완화형 다발성 경화증에서 재발하는 횟수를 줄이고, 재발 시에 나타나는 증상을 완화하는 효과를 가지고 있다. 그러나 이차진행형으로 전환된 환자에서는 뚜렷한 효과가 나타나지 않기 때문에 이 경우에는 환자의 장애를 예방하기 위한 조기 치료가 가장 중요하다. 다발성 경화증으로 인해 나타나는 여러 증상과 신경학적 장애를 줄여주기 위한 증상완화 치료도 시행한다. 이러한 치료들은 재발율이 높으며, 재발을 확실하게 방지하는 방법은 없다.
실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis)은 수초 염기성 단백질(MBP, myelin basic protein) 및 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG, myelin oligodendrocyte glycoprotein)에 대하여 실험동물을 자가면역시킴으로써 유도되고 신경계 자가면역 질환에서 관찰되는 동일한 임상적 증상인 탈수초화와 마비(paralysis)를 발생시킨다. EAE 동물모델에서 임상증상이 발현하는 원인이 사람의 다발성 경화증과 동일하기 때문에 다발성 경화증을 비롯한 신경계 자가면역 질환 연구를 위하여 적합한 동물모델이다. Steinman 등은 다발성 경화증 환자의 뇌 병소에서 관찰되는 우세한 세포 유형이 CD4+ T-세포라는 것(Oksenberg et al., 1990, Nature 345:344-345), 그리고 이들 뇌 병소에서 세포와 연관된 T-세포 수용체(항원 인식을 주도하는 분자)가 EAE를 유발하는 원인이 되는 CD4+T-세포 상에서 동일한, 항원 인식을 위한 3개의 아미노산 결합 모티프를 갖는다는 것(Oksenberg et al., 1993, Nature 362:68-70)을 증명하였다.
봉독(bee venom)은 벌이 가지고 있는 독으로서, 봉독에 함유된 성분은 펩타이드, 생리활성 아민류 및 비펩타이드 성분이다. 특히, 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 엠씨디 펩타이드(MCD-peptide 401), 아돌라핀(adolapin), 프로테아제 억제인자(protease inhibitor), 진정 펩타이드(secapin), 델티아핀(tertiapin) 등의 펩타이드 성분들은 세포용해작용, 항염증작용, 면역작용, 신경통 완화작용, 해열작용, 진정작용, 방사선 보호성이 보고되어 있고, 히스타민(histamine), 도파민(dopamine) 등의 아민류는 혈압강화 작용, 장관수축 작용 등이 알려져 있다(Sangmi Hanet al., Korean J. Apiculture, 24(3): 175-178, 2009).
상기와 같이 다양한 성분이 복합적으로 구성된 봉독은 봉침 요법으로 오래전부터 민간요법의 하나로 관절염, 통풍 등의 질환에 사용되어 오고 있다(Kim, H.W. et al., J. Vet. Med. Sci., 65: 349-355). 상기 봉독이 갖는 항균효과는 국내에서 돼지, 젖소와 같은 가축에 기존항생제 대체 물질로서 사용되고 있으며(Han, S. M. et al., Am. J. Chin. Med, 37: 833-842, 2009), 항염효과는 피부질환치료나(대한민국 특허출원 제 10-2009-0135780), 모돈에 있어 분만 후 유방염, 자궁 내막염 및 무유증의 복합증후군을 치료(대한민국 특허출원 제 10-1999-0005477) 하는데 이용되고 있으나, 봉독침요법이 신경계 자가면역 질환에 대한 유의적인 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구하던 중, 봉독을 족삼리(足三里, zusanli acupoint, ST36)혈에 투여한 결과, MBP(myelin basic protein) 및 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 펩타이드에 의해 유도된 EAE 동물모델에서 질병의 신경학적인 임상증상의 척도와 체중의 감소를 개선하고, 척수의 탈수초화, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고, 활성화된 면역기능을 억제하며, 염증매개인자 및 iNOS의 발현과 MAPKs(mitogen activated protein kinases)의 신호기전을 억제하였다. 특히 봉독을 비경혈점(non-acupoint, 둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 투여한 경우에는 상기 효과를 나타내지 않으므로, 봉독의 족삼리(ST36)혈을 통한 투여는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료용으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 봉독(bee venom)을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system) 예방 및 치료용 조성물, 및상기 봉독을 이용한 신경계 자가면역 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉독(bee venom)을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 봉독을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 봉독을 족삼리(ST36)혈에 투여한 결과, MBP(myelin basic protein) 및 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 펩타이드에 의해 유도된 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) 동물모델에서 질병의 신경학적인 임상증상 척도와 체중의 감소를 개선하고, 척수의 탈수초화, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고, 활성화된 면역기능을 억제하며, 염증매개인자 및 iNOS의 발현과 MAPKs(mitogen activated protein kinases)의 신호기전을 억제하였다. 특히 봉독을 비경혈점(non-acupoint, 둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 투여한 경우에는 상기 효과를 나타내지 않으므로, 봉독의 족삼리(ST36)혈을 통한 투여는 신경계 자가면역 질환 발생을 예방하거나 발생 초기의 치료법으로 활용할 수 있다.
도 1은 프로토콜(protocol)을 나타낸 도이다:
(A)는 랫트를 이용한 급성 EAE의 프로토콜을 나타내고, (B)는 마우스를 이용한 만성 EAE의 프로토콜을 나타내며, (C)는 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(non-acupoint)에 적용하였을 때의 프로토콜을 나타낸다.
도 2는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 본 발명의 봉독침요법의 적용위치에 따른 효과를 확인한 도이다:
(A)와 (B)는 본 발명의 봉독침요법을 전투여(급성 EAE를 유도하기 20분 전부터 3일마다 1회씩) 하였을 때의 임상증상의 척도와 체중의 변화를 나타내고, (C)는 본 발명의 봉독침요법을 후투여(급성 EAE를 유도한 다음 임상증상이 나타나기 시작하는 날부터 3일마다 매일) 하였을 때의 임상증상의 척도를 나타내며, (D)는 본 발명의 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(non-acupoint, 둔부(1)와 근위부 꼬리(2))에 적용하였을 때의 임상증상의 척도를 나타낸다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 3a 내지 3b는 급성 EAE 유도된 동물 모델에서 탈수초화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 룩솔 페스트 블루 염색(LFB, luxol fast blue)의 사진과 그래프로 나타낸 도이다:
도 3a의 (A)와 (E)는 정상 대조군의 사진이고, (B)와 (F)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (C)와 (G)는 급성 EAE 유도 후에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (D)와 (H)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침용법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (I)는 이를 그래프로 나타낸 도이며, 도 3b의 (J)와 (N)는 정상 대조군의 사진이고, (K)와 (O)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (L)와 (P)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델의 사진이고, (M)와 (Q)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침용법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델의 사진이고, (R)는 이를 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
둔부 : 급성 EAE 유도한 후에 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델;
근위부 꼬리 : 급성 EAE를 유도한 후에 본 발명의 봉독침요법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델.
도 4는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 탈수초화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 웨스턴 블롯의 사진과 그래프로 나타낸 도이다:
(A)는 웨스턴 블롯 분석으로 MBP 단백질의 발현 정도를 나타내며, (B)는 (A)의 MBP 단백질의 발현 정도를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 5는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 탈수초화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction) 분석법으로 확인하여 나타낸 도이다:
(A)는 MBP mRNA의 발현량을 상대적으로 나타내며, (B)는 희소돌기아교세포전구체의 마커인 PDGFαR mRNA의 발현량을 상대적으로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 6a 내지 6c는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 대식세포와 미세아교세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 면역염색 사진 및 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸 도이다:
도 6a의 (A) 내지 (H)는 H&E 염색한 사진이고, (I) 내지 (P)는 미세아교세포의 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1)에 대한 항체를 이용하여 면역염색한 사진이다;
(A)와 (E)는 정상 대조군의 사진이고, (B)와 (F)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (C)와 (G)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (D)와 (H)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이다. (I)와 (M)는 정상 대조군의 사진이고, (J)와 (N)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (K)와 (O)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (L)와 (P)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이다;
도 6b의 (Q)는 도 6a의 H&E 염색한 사진을 정량화하여 그래프로 나타낸 도이고, (R)은 Iba-1에 대하여 면역염색한 사진을 정량화하여 그래프로 나타낸 도이며, (S)는 미세아교세포 마커인 CD11b의 mRNA 발현량을 상대적으로 나타낸 도이다;
도 6c의 (A′) 내지 (H′)는 H&E 염색한 사진이고, (I′)는 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다;
(A′)와 (E′)는 정상 대조군의 사진이고, (B′)와 (F′)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (C′)와 (G′)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델의 사진이고, (D′)와 (H′)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델의 사진이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
둔부 : 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델;
근위부 꼬리 : 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델.
도 7은 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 대식세포와 미세아교세포의 활성화 및 탈수초부위로의 이동에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 미세아교세포의 표식인자인 CD11b+/CD45+( low )와 대식세포의 표식인자인 CD11b+/CD45+( high )를 이용하여 Flow cytometry(FACS)로 분석하여 나타낸 도이다:
(A)는 FACS 분석 데이터를 나타내며, (B)는 이를 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 8은 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 T세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 RT-PCR과 FACS 분석을 이용하여 나타낸 도이다:
(A)는 RT-PCR 분석법으로 분석한 T세포의 마커인 CD3의 발현을 나타내며, (B)는 척수에서의 도움 T세포(helper T cell)의 항체인 CD4와 세포독성 T세포의 항체인 CD8을 이용한 FACS 분석 데이터를 나타내며, (C)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, (D)는 림프절에서의 도움 T세포의 항체인 CD4와 세포독성 T세포의 항체인 CD8을 이용한 FACS 분석 데이터를 나타내며, (E)는 이를 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 9a 내지 9b는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 T세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 T세포에서 분비하는 염증성 사이토카인의 항체인 IFN-γ와 IL-17로 FACS와 RT-PCR 분석법을 이용하여 나타낸 도이다:
도 9a의 (A)는 척수에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (B)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, (C)는 림프절에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (D)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, 도 9b의 (E)는 IFN-γ의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (F)는 IL-17의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이며, (G)는 IL-17α의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 10a 내지 10b는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 T세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 조절 T세포의 마커인 Foxp3와 조절 T세포에서 분비되는 IL-4와 IL-5를 FACS와 RT-PCR 분석법을 이용하여 나타낸 도이다:
도 10a의 (A)는 척수에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (B)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, (C)는 림프절에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (D)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, 도 10b의 (E)는 IL-4의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (F)는 IL-5의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이며, (G)는 Foxp3의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 11은 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 염증매개인자(사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine)) 및 iNOS에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 RT-PCR 분석법을 이용하여 나타낸 도이다:
(A)는 RANTES의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (B)는 MCP-1의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (C)는 MCP-1α의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (D)는 TNF-α의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (E)는 IL-1β의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이며, (F)는 iNOS의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 12는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 신호기전에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 웨스턴 블롯 분석으로 나타낸 도이다:
(A) 내지 (B)는 MAPKs인 ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, p65(NF-κB) 및 IκBα의 발현 정도를 나타내며, (C) 내지 (E)는 (A) 내지 (B) 중 p38, p-p38, p65(NF-κB) 및 p-IκBα를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 13은 만성 EAE가 유도된 동물 모델에서 본 발명의 봉독침요법의 치료 효과를 임상증상의 척도와 체중으로 확인한 도이다:
(A) 내지 (B)는 본 발명의 봉독침요법을 온셋투여한 후 임상증상의 척도와 체중을 확인한 도이고, (C) 내지 (D)는 본 발명의 봉독침요법을 후투여한 후 임상증상의 척도와 체중을 확인한 도이며, (E) 내지 (F)는 본 발명의 봉독침요법을 최고점투여한 후 임상증상의 척도와 체중을 확인한 도이다.
Nor : 만성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 만성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 만성 EAE를 유도한 후 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
ANOVA test(일원배치분산분석);*p<0.01 및 **p<0.05는 급성 또는 만성 EAE가 유도된 동물 모델을 기준으로 하고, #p<0.01 및 ##p<0.05는 정상 대조군을 기준으로 한다.
(A)는 랫트를 이용한 급성 EAE의 프로토콜을 나타내고, (B)는 마우스를 이용한 만성 EAE의 프로토콜을 나타내며, (C)는 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(non-acupoint)에 적용하였을 때의 프로토콜을 나타낸다.
도 2는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 본 발명의 봉독침요법의 적용위치에 따른 효과를 확인한 도이다:
(A)와 (B)는 본 발명의 봉독침요법을 전투여(급성 EAE를 유도하기 20분 전부터 3일마다 1회씩) 하였을 때의 임상증상의 척도와 체중의 변화를 나타내고, (C)는 본 발명의 봉독침요법을 후투여(급성 EAE를 유도한 다음 임상증상이 나타나기 시작하는 날부터 3일마다 매일) 하였을 때의 임상증상의 척도를 나타내며, (D)는 본 발명의 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(non-acupoint, 둔부(1)와 근위부 꼬리(2))에 적용하였을 때의 임상증상의 척도를 나타낸다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 3a 내지 3b는 급성 EAE 유도된 동물 모델에서 탈수초화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 룩솔 페스트 블루 염색(LFB, luxol fast blue)의 사진과 그래프로 나타낸 도이다:
도 3a의 (A)와 (E)는 정상 대조군의 사진이고, (B)와 (F)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (C)와 (G)는 급성 EAE 유도 후에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (D)와 (H)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침용법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (I)는 이를 그래프로 나타낸 도이며, 도 3b의 (J)와 (N)는 정상 대조군의 사진이고, (K)와 (O)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (L)와 (P)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델의 사진이고, (M)와 (Q)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침용법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델의 사진이고, (R)는 이를 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
둔부 : 급성 EAE 유도한 후에 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델;
근위부 꼬리 : 급성 EAE를 유도한 후에 본 발명의 봉독침요법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델.
도 4는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 탈수초화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 웨스턴 블롯의 사진과 그래프로 나타낸 도이다:
(A)는 웨스턴 블롯 분석으로 MBP 단백질의 발현 정도를 나타내며, (B)는 (A)의 MBP 단백질의 발현 정도를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 5는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 탈수초화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction) 분석법으로 확인하여 나타낸 도이다:
(A)는 MBP mRNA의 발현량을 상대적으로 나타내며, (B)는 희소돌기아교세포전구체의 마커인 PDGFαR mRNA의 발현량을 상대적으로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 6a 내지 6c는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 대식세포와 미세아교세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 면역염색 사진 및 RT-PCR 분석의 결과를 나타낸 도이다:
도 6a의 (A) 내지 (H)는 H&E 염색한 사진이고, (I) 내지 (P)는 미세아교세포의 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1)에 대한 항체를 이용하여 면역염색한 사진이다;
(A)와 (E)는 정상 대조군의 사진이고, (B)와 (F)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (C)와 (G)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (D)와 (H)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이다. (I)와 (M)는 정상 대조군의 사진이고, (J)와 (N)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (K)와 (O)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이고, (L)와 (P)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델의 사진이다;
도 6b의 (Q)는 도 6a의 H&E 염색한 사진을 정량화하여 그래프로 나타낸 도이고, (R)은 Iba-1에 대하여 면역염색한 사진을 정량화하여 그래프로 나타낸 도이며, (S)는 미세아교세포 마커인 CD11b의 mRNA 발현량을 상대적으로 나타낸 도이다;
도 6c의 (A′) 내지 (H′)는 H&E 염색한 사진이고, (I′)는 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다;
(A′)와 (E′)는 정상 대조군의 사진이고, (B′)와 (F′)는 급성 EAE가 유도된 동물 모델의 사진이고, (C′)와 (G′)는 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델의 사진이고, (D′)와 (H′)는 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델의 사진이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
둔부 : 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 둔부에 적용한 동물 모델;
근위부 꼬리 : 급성 EAE 유도 후 본 발명의 봉독침요법을 근위부 꼬리에 적용한 동물 모델.
도 7은 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 대식세포와 미세아교세포의 활성화 및 탈수초부위로의 이동에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 미세아교세포의 표식인자인 CD11b+/CD45+( low )와 대식세포의 표식인자인 CD11b+/CD45+( high )를 이용하여 Flow cytometry(FACS)로 분석하여 나타낸 도이다:
(A)는 FACS 분석 데이터를 나타내며, (B)는 이를 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 8은 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 T세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 RT-PCR과 FACS 분석을 이용하여 나타낸 도이다:
(A)는 RT-PCR 분석법으로 분석한 T세포의 마커인 CD3의 발현을 나타내며, (B)는 척수에서의 도움 T세포(helper T cell)의 항체인 CD4와 세포독성 T세포의 항체인 CD8을 이용한 FACS 분석 데이터를 나타내며, (C)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, (D)는 림프절에서의 도움 T세포의 항체인 CD4와 세포독성 T세포의 항체인 CD8을 이용한 FACS 분석 데이터를 나타내며, (E)는 이를 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 9a 내지 9b는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 T세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 T세포에서 분비하는 염증성 사이토카인의 항체인 IFN-γ와 IL-17로 FACS와 RT-PCR 분석법을 이용하여 나타낸 도이다:
도 9a의 (A)는 척수에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (B)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, (C)는 림프절에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (D)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, 도 9b의 (E)는 IFN-γ의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (F)는 IL-17의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이며, (G)는 IL-17α의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 10a 내지 10b는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 T세포의 활성화에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 조절 T세포의 마커인 Foxp3와 조절 T세포에서 분비되는 IL-4와 IL-5를 FACS와 RT-PCR 분석법을 이용하여 나타낸 도이다:
도 10a의 (A)는 척수에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (B)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, (C)는 림프절에서의 FACS 분석 데이터를 나타내며, (D)는 이를 그래프로 나타낸 도이고, 도 10b의 (E)는 IL-4의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (F)는 IL-5의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이며, (G)는 Foxp3의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 11은 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 염증매개인자(사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine)) 및 iNOS에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 RT-PCR 분석법을 이용하여 나타낸 도이다:
(A)는 RANTES의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (B)는 MCP-1의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (C)는 MCP-1α의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (D)는 TNF-α의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이고, (E)는 IL-1β의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이며, (F)는 iNOS의 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 12는 급성 EAE가 유도된 동물 모델에서 MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 신호기전에 대한 본 발명의 봉독침요법의 효과를 웨스턴 블롯 분석으로 나타낸 도이다:
(A) 내지 (B)는 MAPKs인 ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, p65(NF-κB) 및 IκBα의 발현 정도를 나타내며, (C) 내지 (E)는 (A) 내지 (B) 중 p38, p-p38, p65(NF-κB) 및 p-IκBα를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.
Nor : 급성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 급성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하기 전부터 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델;
봉독침요법 : 급성 EAE를 유도하지 않은 정상 대조군에 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
도 13은 만성 EAE가 유도된 동물 모델에서 본 발명의 봉독침요법의 치료 효과를 임상증상의 척도와 체중으로 확인한 도이다:
(A) 내지 (B)는 본 발명의 봉독침요법을 온셋투여한 후 임상증상의 척도와 체중을 확인한 도이고, (C) 내지 (D)는 본 발명의 봉독침요법을 후투여한 후 임상증상의 척도와 체중을 확인한 도이며, (E) 내지 (F)는 본 발명의 봉독침요법을 최고점투여한 후 임상증상의 척도와 체중을 확인한 도이다.
Nor : 만성 EAE가 유도되지 않은 정상 대조군;
EAE : 만성 EAE가 유도된 동물 모델;
EAE+봉독침요법 : 만성 EAE를 유도한 후 본 발명의 봉독침요법을 적용한 동물 모델.
ANOVA test(일원배치분산분석);*p<0.01 및 **p<0.05는 급성 또는 만성 EAE가 유도된 동물 모델을 기준으로 하고, #p<0.01 및 ##p<0.05는 정상 대조군을 기준으로 한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 봉독(bee venom)을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 봉독은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액을 의미하는 것으로, 전기 충격법을 통해 수득한 봉독에 증류수를 부어 봉독에서 벌 또는 이물질을 부유시키고, 부유된 벌 또는 이물질을 걸러내어 수득한, 정제된 상태의 봉독을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 봉독침요법은 봉독을 몸에 침투시키는 방법으로, 살아있는 벌의 꽁무니를 시술하고자 하는 부위에 대고 찌른 다음 약 30~60 초 가량 유침하여 봉독이 충분히 스며들게 한 다음 침을 뽑아주는 "직자법(直刺法)", 벌에서 침을 떼어내어 시술하고자 하는 부위에 살짝 댄 후 뽑아서 또 다른 부위에 시술하는 "발침법(拔針法)", 봉독 침을 재빠르게 찔렀다 빼는 동작을 반복하여 넓은 환부를 소량의 침으로 치료하는 "산자법(散刺法)", 한방용 침의 끝단에 봉독을 묻힌 상태에서 표피를 뚫고 경혈의 내부로 봉독을 침투시키는 한방용 봉독침요법을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 봉독은 족삼리(ST36)혈에 투여되어야 하고, 상기 족삼리(ST36)혈을 통한 투여가 아닌 경우, 신경계 자가면역 질환에 대한 효과를 나타내지 못하므로, 봉독은 봉독침요법을 통해 족삼리(ST36)혈에 적용되어야 한다. 또한, 상기 족삼리(ST36)혈은 한의학적으로 사용되는 혈자리로써, 무릎에서 아래로 3치 내려가 정강이뼈 바깥쪽 큰 힘줄 안쪽 우묵한 곳을 의미한다.
상기 신경계 자가면역 질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레 증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 급성 파종 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 급성 횡단 척수염(acute transverse myelitis), 자가면역성 뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 봉독약침을 준비한 후, MBP(myelin basic protein) 및 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 펩타이드에 의해 유도된 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) 동물 모델을 제조하여 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈에 시행한 결과, 급성 EAE에 의한 질병의 임상증상과 체중의 감소를 개선시키는 효과를 확인하였고, 봉독을 비경혈점(non-acupoint, 둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 시행하였을 때는 임상증상과 체중의 감소를 개선하지 않는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료의 효과를 확인하기 위해, 봉독침요법의 급성 EAE 동물모델에서의 탈수초화 현상의 억제 효과를 확인하기 위하여 수초의 주성분인 지질을 염색하는 룩솔 페스트 블루 염색을 통해 탈수초화 정도를 비교한 결과, 급성 EAE에 의해 나타나는 탈수초화 정도를 감소시키고, 봉독을 비경혈점(둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 시행하였을 때는 탈수초화 정도의 변화가 없음을 확인하였고(도 3 참조), MBP의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 이용해서 확인한 결과, 급성 EAE에 의하여 감소된 MBP의 발현이 증가하였으며(도 4 참조), MBP와 희소돌기아교세포전구체(OPC, oligodendrocyte precursor cells)의 마커인 PDGFαR(platelet-derived growth factor-α receptor)의 발현을 RT-PCR 분석법을 이용해서 확인한 결과, 급성 EAE에 의하여 감소된 MBP 및 PDGFαR의 mRNA 발현 정도를 회복시키는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 대식세포 및 미세아교세포의 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 면역 염색 및 미세아교세포 마커인 CD11b primer(표 2)를 이용하여 RT-PCR 분석을 수행한 결과, 급성 EAE에 의해 나타나는 대식세포와 Iba-1 면역양성 미세아교세포의 활성화 정도가 감소함을 확인하였고, 봉독을 비경혈점(둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 시행하였을 때는 대식세포와 미세아교세포의 활성화 정도의 변화가 없음을 확인하였으며(도 6 참조), 미세아교세포 표식인자인 CD11b+/CD45+( low )와 대식세포 표식인자인 CD11b+/CD45+(high)를 이용하여 Flow cytometry(FACS) 분석을 수행한 결과, 급성 EAE에 의하여 활성화된 대식세포와 Iba-1 면역양성 미세아교세포의 수를 감소시키는 것을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 T세포의 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여 RT-PCR과 FACS 분석을 수행한 결과, 급성 EAE에 의하여 활성화된 CD3의 발현량과 급성 EAE에 의하여 증가된 CD4+ T세포의 수를 감소시키는 것을 확인하였고(도 8 참조), 급성 EAE에 의하여 증가된 IFN-γ 및 IL-17 세포 수를 감소시키고, IFN-γ, IL-17 및 IL-17α의 발현을 감소시키는 것을 확인하였으며(도 9 참조), Foxp3 면역양성 세포의 집합 및 침윤을 증가시키고, naive Th세포의 Treg 세포로의 분화를 증가시킴을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 본 발명자들은 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 염증매개인자(사이토카인, 케모카인) 및 iNOS의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 수행한 결과, 급성 EAE에 의하여 증가된 염증매개인자인 RANTES, MCP-1, MIP-1α, TNF-α 및 IL-1β와 iNOS의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였고(도 11 참조), MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 신호기전 억제효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 한 결과, 급성 EAE에 의하여 증가된 p-p38 MAPKs, NF-κB(p65) 및 p-IκBα의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 12 참조).
아울러, 본 발명자들은 봉독침요법의 MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델에서의 신경계 자가면역 질환에서의 치료 효과를 확인하기 위하여 신경학적인 임상증상 및 체중을 비교한 결과, 만성 EAE에 의해 나타나는 임상증상과 감소된 체중이 개선되는 것을 확인하였다(도 13 참조).
따라서, 본 발명의 봉독을 족삼리(ST36)혈에 투여한 결과 MBP 및 MOG 펩타이드에 의해 유도된 EAE 동물모델에서 질병의 신경학적인 임상증상 척도와 체중의 감소를 개선하고, 척수의 탈수초화, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고, 활성화된 면역기능을 억제하며, 염증매개인자 및 iNOS의 발현과 MAPKs 및 NF-κB의 신호기전을 억제하며, 특히 봉독을 비경혈점(둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 투여하였을 때 상기 효과를 나타내지 않으므로, 봉독은 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 활용할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 생지황, 복령, 인삼 및 꿀의 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 신경계 자가면역 질환은 다발성 경화증, 시신경 척수염, 중증 근무력증, 길랑바레 증후군, 자가면역성 포도막염, 급성 파종 뇌척수염, 급성 횡단 척수염, 자가면역성 뇌증 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 봉독을 족삼리(ST36)혈에 투여한 결과 MBP 및 MOG 펩타이드에 의해 유도된 EAE 동물모델에서 질병의 신경학적인 임상증상 척도와 체중의 감소를 개선하고, 척수의 탈수초화, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고, 활성화된 면역기능을 억제하며, 염증매개인자 및 iNOS의 발현과 MAPKs 및 NF-κB의 신호기전을 억제하며, 특히 봉독을 비경혈점(둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 투여하였을 때 상기 효과를 나타내지 않으므로, 봉독은 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품의 유효성분으로 활용할 수 있다.
본 발명의 봉독이 상기와 같은 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강 기능 식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강 기능 식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강 기능 식품을 섭취함으로써 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 봉독을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법을 제공한다.
상기 인간을 제외한 개체는 본 발명에 따른 예방 및 치료 방법에 의해 증상이 호전될 수 있는 신경계 자가면역 질환을 가진 인간만을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다.
상기 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법은 비록 인간을 제외한 동물을 대상으로 하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 예방 및 치료 방법에 의해 증상이 호전될 수 있는 신경계 자가면역 질환을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용되어 질 수 있다.
상기 봉독은 족삼리(ST36)혈에 투여되어야 하고, 상기 족삼리(ST36)혈을 통한 투여가 아닌 경우, 신경계 자가면역 질환에 대한 효과를 나타내지 못하므로, 봉독은 봉독침요법을 통해 족삼리(ST36)혈에 투여되어야 한다. 또한, 상기 족삼리(ST36)혈은 한의학적으로 사용되는 혈자리로써, 무릎에서 아래로 3치 내려가 정강이뼈 바깥쪽 큰 힘줄 안쪽 우묵한 곳을 의미한다.
상기 신경계 자가면역 질환은 다발성 경화증, 시신경 척수염, 중증 근무력증, 길랑바레 증후군, 자가면역성 포도막염, 급성 파종 뇌척수염, 급성 횡단 척수염, 자가면역성 뇌증 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 봉독을 족삼리(ST36)혈에 투여한 결과 MBP 및 MOG 펩타이드에 의해 유도된 EAE 동물모델에서 질병의 신경학적인 임상증상 척도와 체중의 감소를 개선하고, 척수의 탈수초화, 대식세포 및 미세아교세포의 활성화를 감소시키고, 활성화된 면역기능을 억제하며, 염증매개인자 및 iNOS의 발현과 MAPKs 및 NF-κB의 신호기전을 억제하며, 특히 봉독을 비경혈점(둔부 또는 근위부 꼬리 부위)에 투여하였을 때 상기 효과를 나타내지 않으므로, 봉독의 족삼리(ST36)혈을 통한 투여는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법으로 활용할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
봉독약침의
준비
봉독은 양봉꿀벌(Apis mellifera)(Sigma-Aldrich)에서 벌독을 추출해낸 다음, 멸균상태로 정제하여 용량에 맞게 생리식염수로 희석하여 한방용 침의 끝단에 봉독을 묻힌 상태에서 표피를 뚫고 경혈의 내부로 봉독을 침투시키는 한방용 봉독침요법을 사용하였다.
<
실시예
2> 실험적
자가면역성
뇌척수염(
EAE
,
experimental
autoimmune
encephalomyelitis) 동물 모델의 제조
<2-1> 수초 염기성 단백질(
MBP
,
myelin
basic
protein
)에 의해 유도된 동물 모델 제조
본 발명의 봉독침요법의 효과를 알아보기 위해 하기와 같은 방법으로 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물 모델을 제조하였다.
구체적으로, 동물 모델은 출생 후 10주령의 암컷 Lewis 랫트(Japan SLC, 일본)를 준비하여 일주일 동안 안정시킨다. 랫트에 MBP68 -82(Sigma-Aldrich, 미국) 200 ug이 포함된 에멀전과 결핵균(mycobacterium tuberculosis, Difco, 미국) 100 ug이 포함된 불완전프로인트보강제(IFA, incomplete Freund's adjuvant, Difco, 미국)를 혼합하여 도합 0.2 ml의 에멀전을 정상대조군과 봉독침요법 단독군을 제외하고 두 개의 뒷다리 발바닥에 피하주사 하였고, 동시에 백일해독소(PTX, pertussis toxin, List Biologic, 미국) 200 ng을 복강으로 주사하였다. 48시간 후에 동일한 양의 백일해독소를 복강으로 다시 주사하였다.
제조된 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델은 두 그룹으로 실험을 진행하였다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, 급성 EAE 유도 20분 전부터 3일마다 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈에 시행한 실험군(전투여, pre-treatment) 및 급성 EAE 유도 후 10일 내지 15일부터 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈에 시행한 실험군(후투여, post-treatment)으로 진행하였다(도 1A).
이후 진행된 실험의 봉독침요법군은 모두 족삼리(ST36)혈에 시행하였다.
<2-2>
마이엘린
희소돌기아교세포 당단백질(
MOG
,
myelin
oligodendrocyte
glycoprotein)
펩타이드에
의해 유도된 동물 모델 제조
본 발명의 봉독침요법의 효과를 알아보기 위해 하기와 같은 방법으로 MOG 펩타이드에 의해 유도된 만성 EAE 동물 모델을 제조하였다.
구체적으로, 동물 모델은 출생 후 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Narabiotechnology, 대한민국)를 준비하여 일주일 동안 안정시킨다. 마우스에 MOG 펩타이드35 -55(Sigma-Aldrich, 미국) 200 ug이 포함된 에멀전과 결핵균(Difco, 미국) 400 ug이 포함된 IFA(Difco, 미국)를 혼합하여 도합 0.1 ml의 에멀전을 정상대조군과 봉독침요법 단독군을 제외하고 양쪽 허리부위에 피하주사로 하였고, 동시에 백일해독소(List Biologic, 미국) 200 ng을 복강으로 주사하였다. 48시간 후에 동일한 양의 백일해독소를 복강으로 다시 주사하였다.
제조된 MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델은 세 그룹으로 실험을 진행하였다.
도 1B에 나타낸 바와 같이, 만성 EAE 유도 후 7일부터 3일마다 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈에 시행한 실험군(온셋투여, onset-treatment), 만성 EAE 유도 후 11일부터 3일마다 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈에 시행한 실험군(후투여, post-treatment) 및 만성 EAE 유도 후 19일부터 3일마다 봉독침요법을 족삼리(ST36)혈에 시행한 실험군(최고점투여, peak-treatment)으로 진행하였다(도 1B).
이후 진행된 실험의 봉독침요법군은 모두 족삼리(ST36)혈에 시행하였다.
<
실시예
3>
봉독침요법의
신경계 자가면역 질환에서의 예방 효과 확인
<3-1> 신경학적인 행동 변화 확인
상기 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델의 임상 증상의 척도를 표 1에 나타낸 바와 같이 8가지로 구분하여 확인하였다.
본 발명의 봉독침요법을 0.25 mg/kg 또는 0.8 mg/kg으로 적용하고, 족삼리(ST36)혈이 아닌 위치, 즉 비경혈점(둔부(1)와 근위부 꼬리(2))에 0.8 mg/kg으로 적용(도 1C)하여 신경학적인 임상증상 및 체중을 비교하였다.
그 결과 도 2A 내지 2C에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 봉독침요법을 전투여하였을 때, 급성 EAE군에 비하여 봉독침요법을 시행한 후 급성 EAE를 유도한 군에서 농도 의존적으로 급성 EAE에 의해 나타나는 임상증상과 감소된 체중이 개선되는 것을 확인하였고, 본 발명의 봉독침요법을 후투여하였을 때, 급성 EAE에 의해 나타나는 임상증상과 감소된 체중의 변화가 없음을 확인하였다(도 2A 내지 2C).
또한 도 2D에 나타낸 바와 같이, 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(둔부(1)와 근위부 꼬리(2))에 시행하였을 때, 급성 EAE에 의해 나타나는 임상증상이 개선되지 않는 것을 확인하였다(도 2D).
상기 결과를 토대로 이후 진행된 실험의 봉독침요법은 모두 전투여로 시행하였다.
| 등급 | MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델 | MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델 |
| 0 | 증상없음 | 증상없음 |
| 0.5 | 꼬리끝 처짐 | - |
| 1 | 꼬리마비 | 꼬리끝 처짐 |
| 2 | 불완전마비(한쪽 뒷다리) | 꼬리마비 |
| 3 | 하지대마비(양쪽 뒷다리) | 불완전마비(한쪽 뒷다리) |
| 4 | 한쪽 앞다리까지 마비 | 하지대마비(양쪽 뒷다리) |
| 5 | 사지마비(양쪽 앞다리) | 한쪽 앞다리까지 마비 |
| 6 | 죽음 | 사지마비(양쪽 앞다리) |
| 7 | - | 죽음 |
<3-2>
LFB
염색을 통한 척수의
탈수초화
억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 탈수초 현상의 억제 효과를 확인하기 위하여 수초의 주성분인 인지질을 염색하는 LFB 염색을 통해 탈수초화 정도를 비교하였다.
구체적으로, 급성 EAE를 유도한 후에 임상증상이 가장 심한 시기인 12일 내지 13일 사이에 동물을 펜토바비탈 나트륨(sodium pentobarbital, 50 mg/kg)을 복강 내로 과다 투여하여 마취하고 4 % 파라포름알데하이드(PFA, paraformaldehyde)를 포함한 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.4)을 심장으로 관류하여 고정하고 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하였다. 적출한 척수는 인산 완충 식염수(PBS, phosphate buffered saline)로 2번 씻어준 후, 4 % PFA에 담가 4℃에서 하루 정도 더 고정시킨 다음 10, 20 및 30 % 수크로스(sucrose)로 바꾸어 4℃에서 48시간 동안 보관하여 동결손상을 방지하였다. 동결절편기(Leica, 독일)를 이용하여 척수를 10 또는 30 um 두께로 잘라 PBS에 5분간 담근 후 95 % 에탄올에 5분 동안 담갔다. 그 후 95 % 에탄올에 녹아있는 0.1 % 룩솔 페스트 블루 염색액에 조직을 담가 56℃에서 14시간 동안 방치한 다음 0.5 % 리튬 카보네이트(lithium carbonate) 용액과 70 % 에탄올, 증류수에 순서대로 각각 30초씩 담그는 과정을 5-6회 반복하여 색을 조절한 뒤 95 %, 100 % 에탄올에 5분씩 담가 탈수한 후 자일렌(xylene)에 담근 뒤 커버 그라스를 덮었다. 척수 바깥 부분의 백질에 축삭이 존재하기 때문에 정상 조직을 염색한 경우에는 척수 백질이 진한 파란색으로 나타나지만, 외상 후 탈수초화 현상으로 인하여 수초가 소실되게 되면 듬성듬성 염색이 되며 흐린 파란색을 띤다. 이러한 탈수초화 척도는, 탈수초화 없음(0 단계), 백질의 25% 미만을 포함하는 약간의 탈수초화(1 단계), 백질의 50% 미만을 포함하는 탈수초화(2 단계) 및 백질의 50% 이상을 포함하는 광범위한 탈수초화(3 단계)로 구분하였다.
그 결과 도 3a에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의해 나타나는 탈수초화 정도를 감소시키는 것을 확인하였고(도 3a), 또한 도 3b에 나타낸 바와 같이, 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(둔부(1)와 근위부 꼬리(2))에 시행하였을 때, 급성 EAE에 의해 나타나는 탈수초화 정도의 변화가 없음을 확인하였다(도 3b).
<3-3>
웨스턴
블롯을
통한 척수의
탈수초화
억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 탈수초 현상의 억제 효과를 확인하기 위하여 MBP의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 이용해서 확인하였다.
구체적으로, 급성 EAE를 유도한 후에 임상증상이 가장 심한 시기인 12일 내지 13일 사이에 동물을 펜토바비탈 나트륨(sodium pentobarbital, 50 mg/kg)을 복강 내로 과다 투여하여 마취하고 4 % 파라포름알데하이드(PFA, paraformaldehyde)를 포함한 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.4)을 심장으로 관류하여 고정하고 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하였고, 이를 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer; 50 mM Tris-cl, pH 7.5, 150 mM Nacl, 1 % Triton X-100, 10 % glycerol 및 단백질 분해효소 저해제 혼합물)을 넣고 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin, sigma, 미국)를 사용한 Bradford(Bio-rad, 미국) 방법을 이용하여 각 개체의 단백질을 정량한 뒤 단백질 30 ug은 10 % SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(membrane)으로 이동시켰다. PVDF 멤브레인은 5 % 탈지유(nonfat dry milk)가 포함된 TBST(Tris-buffered saline, 20 mM Tris, pH 7.4, 0.1 % Tween 20 및150 mM Nacl)에서 1시간 동안 블로킹시켰다. TBST로 씻은 후 1차 항체 MBP(Millipore, 미국)를 1:1,000으로 희석시켜 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 TBST로 10분씩 3회 씻고 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후 TBST에 씻은 뒤 ECL system(Amersham Pharmacia Biotechnology, 미국)로 밴드를 확인하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 감소된 MBP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
<3-4>
역전사
중합효소 연쇄반응(
RT
-
PCR
,
reverse
transcription
-polymerase
chain
reaction
)을 통한 척수의
탈수초화
억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 탈수초 현상의 억제 효과를 확인하기 위하여 MBP와 희소돌기아교세포전구체(OPC, oligodendrocyte precursor cells)의 마커인 PDGFαR(platelet-derived growth factor-α receptor)의 발현을 RT-PCR 분석법을 이용해서 확인하였다.
구체적으로, 급성 EAE를 유도한 후에 임상증상이 가장 심한 시기인 12일 내지 13일 사이에 동물을 펜토바비탈 나트륨(sodium pentobarbital, 50 mg/kg)을 복강 내로 과다 투여하여 마취하고 4 % 파라포름알데하이드(PFA, paraformaldehyde)를 포함한 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.4)을 심장으로 관류하여 고정하고 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하여 트리졸(Trizol, Invitrogen, 미국) 1 ml을 넣고 분쇄기로 조직을 갈고 원심분리하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 RT-PCR kit(Invitrogen, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 cDNA 4 ul와 MBP 및 PDGFαR primer(표 2) 각 10 pM과 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, 미국) 5 ul를 이용하여 50℃ 2분 1회, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 60℃ 1분 40회의 조건으로 ABI PRIAM 7500 기기를 통하여 실시간 RT-PCR 분석법을 사용하여 측정하여 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 감소된 MBP 및 PDGFαR의 mRNA 발현 정도를 회복시키는 것을 확인하였다(도 5).
| 목적 유전자 |
Primer | |||
| 명칭 | 서열 | 방향 | 서열번호 | |
| CD11b |
CD11b_F | GGGATCCGTAAAGTAGTGAGAA | 정방향 | 서열번호 : 1 |
| CD11b_R | AAAGGAGCTGGTACTTCCTGTCT | 역방향 | 서열번호 : 2 | |
| MBP |
MBP_F | CAT CCT TGA CTC CAT CGG | 정방향 | 서열번호 : 3 |
| MBP_R | TTT CAT CTT GGG TCC TCT G | 역방향 | 서열번호 : 4 | |
| PDGFαR |
PDGFaR_F | AAC TCG CTG GTC TTG AAC G | 정방향 | 서열번호 : 5 |
| PDGFaR_R | CTG GTG CCT GCC TCC TAC | 역방향 | 서열번호 : 6 | |
| GAPDH |
GAPDH_F | AGG TCA TCC CAG AGC TGA ACG | 정방향 | 서열번호 : 7 |
| GAPDH_R | CAC CCT GTT GCT GTA GCC GTA T | 역방향 | 서열번호 : 8 | |
<3-5>
Hematoxylin
&
Eosin
(H&E) 염색과 면역 염색을 통한 대식세포와 미세아교세포의 활성화 억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 대식세포 및 미세아교세포의 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색과 면역 염색을 수행하였다.
구체적으로, 급성 EAE를 유도한 후에 임상증상이 가장 심한 시기인 12일 내지 13일 사이에 동물을 sodium pentobarbital(50 mg/kg)를 복강 내로 과다 투여하여 마취하고 4 % PFA를 포함한 0.1 M phosphate buffer(pH 7.4)을 심장으로 관류하여 고정하고 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하였다. 적출한 척수는 PBS로 2번 씻어준 후, 4 % PFA에 담가 4℃에서 하루 정도 더 고정시킨 다음 10, 20 및 30 % 수크로스로 바꾸어 4℃에서 48시간 동안 보관하여 동결손상을 방지하였다. 동결절편기(Leica, 독일)를 이용하여 척수를 10 또는 30 um 두께로 잘라 H&E 염색을 위해 척수조직을 슬라이드에 두고 hematoxylne 용액을 떨어뜨려 3분간 기다린 후 증류수로 1분씩 세 번 세척하였다. 그리고 eosin 용액을 떨어뜨려 10분간 기다린 후 증류수로 1분씩 세 번 세척하였으며, 70 %, 90 %, 95 %, 100 % 에탄올에 차례로 2분간 담그어 탈수하였다.
또한, 면역염색은 30 um 두께로 자른 척수조직을 3 % 과산화수소를 포함한 PBS에 20분 동안 담그어 내재성 퍼옥시다아제(endogenous peroxidase) 활성을 제거하고, PBS로 씻었다. 이를 블로킹 용액에 담그어 2시간 동안 반응시킨 후, 미세아교세포의 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1) 항체(1:2,000, WAKO, 일본)와 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 PBS로 씻고 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후 세척하고 탈수시킨 후, 퍼마운트(permount)로 봉입한 후 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 6a에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의해 나타나는 대식세포와 Iba-1 면역양성 미세아교세포의 활성화 정도가 감소함을 확인하였다(도 6a).
이를 정량화하여 그래프로 나타내고, 본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 미세아교세포의 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여 미세아교세포 마커인 CD11b primer(표 2)를 이용하여 상기 실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 RT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과 도 6b에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 증가된 대식세포와 Iba-1 면역양성 미세아교세포의 활성화 정도를 감소시키는 것을 확인하였다(도 6b).
또한 도 6c에 나타낸 바와 같이, 족삼리(ST36)혈이 아닌 비경혈점(둔부(1)와 근위부 꼬리(2))에 시행하였을 때, 급성 EAE에 의해 나타나는 대식세포와 Iba-1 면역양성 미세아교세포의 활성화 정도의 변화가 없음을 확인하였다(도 6c).
<3-6>
Flow
cytometry
(
FACS
) 분석을 통한 대식세포와 미세아교세포의 활성화 억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 대식세포 및 미세아교세포의 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여 미세아교세포 표식인자인 CD11b+/CD45+( low )와 대식세포 표식인자인 CD11b+/CD45+( high )를 이용하여 Flow cytometry(FACS) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 단일 세포 현탄액을 2 % PFA로 고정시키고, 이를 2 % FBS가 포함된 PBS로 씻은 후, mouse anti-rat CD32(BD Biosciences, 미국)로 10분간 Fc receptor를 블로킹 시킨 후, 2 % FBS가 포함된 PBS로 두 번 씻는다. 세포 내 분석을 위해 PMA(phorbol myristate acetate), ionomycin 및 Golgistop이 들어있는 RPMI 배지로 재자극시킨다. 5시간 후, 이를 APC anti-rat CD11b/c(OX-42;Biolegend)와 PE anti-rat CD45 항체(OX-1;Biolegend)로 30분간 4 ℃에서 반응시킨 후, 2 % FBS가 포함된 PBS로 두 번 씻는다. 이를 FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)를 이용하여 결과를 얻고, CellQuest Pro software(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 활성화된 대식세포와 Iba-1 면역양성 미세아교세포의 수를 감소시키는 것을 확인하였다(도 7).
<3-7> 활성화된 면역 기능 억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 T세포의 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여 RT-PCR과 FACS 분석을 수행하였다.
구체적으로, RT-PCR 분석은 분화가 끝난 T세포(mature T cell)의 T세포 수용체(T cell receptor) 복합체의 부분인 CD3의 primer(표 3)를 이용하여 상기 실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과 도 8A에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 활성화된 CD3의 발현량을 감소시키는 것을 확인하였다(도 8A).
또한, FACS 분석은 척수와 림프절에서의 도움 T세포(helper T cell, CD4+)의 항체인 APC anti-rat CD4(OX-35;BD Biosciences)와 세포독성 T세포(cytotoxic T cell, CD8+)의 항체인 PE anti-rat CD8a(OX-8;BD Biosciences)를 이용하여 상기 실시예 <3-6>과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과 도 8B 내지 8E에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 증가된 CD4+ T세포의 수를 감소시키는 것을 확인하였다. CD8+ T세포는 급성 EAE에 의하여 변화가 없었다(도 8B 내지 8E).
또한, T세포 염증성 사이토카인(IFN-γ(Th1) 및 IL-17(Th17))의 항체인 PE anti-rat IFN-γ(DB-1;BD Biosciences)와 FITC anti-mouse/rat IL-17A(eBio 17B7;eBiosciences)을 이용하여 상기 실시예 <3-6>과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하였고, IFN-γ, IL-17 및 IL-17α primer(표 3)를 이용하여 상기 실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 RT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과 도 9a 내지 9b에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 증가된 IFN-γ 및 IL-17 세포 수를 감소시키고, IFN-γ, IL-17 및 IL-17α의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 9a 내지 9b).
또한, 조절 T세포(Treg cell, regulatory T cell)인 IL-4와 Foxp3의 항체인 PE anti-rat IL-4(OX-81;BD Biosciences)와 APC anti-mouse/rat Foxp3(FJK-16s;eBiosciences)을 이용하여 상기 실시예 <3-6>과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하였고, IL-4, IL-5 및 Foxp3 primer(표 3)를 이용하여 상기 실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 RT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과 도 10a 내지 10b에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 Foxp3 면역양성 세포의 집합 및 침윤을 증가시키고, naive Th세포의 Treg 세포로의 분화를 증가시킴을 확인하였다(도 10a 내지 10b).
| 목적 유전자 |
Primer | |||
| 명칭 | 서열 | 방향 | 서열번호 | |
| CD3 |
CD3_F | GATCCCAAACTCTCTATAGCTA | 정방향 | 서열번호 : 9 |
| CD3_R | CTTTCATGCCAATCTCACTGTG | 역방향 | 서열번호 : 10 | |
| IFN-γ |
IFNg_F | GAA AGC CTA GAA AGT CTG AAT AAC | 정방향 | 서열번호 : 11 |
| IFNg_R | GCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT | 역방향 | 서열번호 : 12 | |
| IL-17 |
IL17_F | CTC AGA CTA CCT CAA CCG TTC C | 정방향 | 서열번호 : 13 |
| IL17_R | AGG ATC TCT TGC TGG ATG AGA AC | 역방향 | 서열번호 : 14 | |
| IL-17α |
IL17a_F | TCT GAG CCA GCC AAG AAG AAG TGT | 정방향 | 서열번호 : 15 |
| IL17a_R | TTC CAA CCC AAA CAT AGG CAC | 역방향 | 서열번호 : 16 | |
| IL-4 |
IL4_F | GGT ATC CAC GGA TGT AAC GAC AGC | 정방향 | 서열번호 : 17 |
| IL4_R | CCG TGG TGT TCC TTG TTG CCG TAA | 역방향 | 서열번호 : 18 | |
| IL-5 |
IL5_F | GTT GAC GAG CAA TGA GAC GAT | 정방향 | 서열번호 : 19 |
| IL5_R | GCC ACA CTT CTC TTT TTG TCC | 역방향 | 서열번호 : 20 | |
| Foxp3 |
Foxp3_F | TGC ATC AGC TCT CCA CTG TAG ACG CA | 정방향 | 서열번호 : 21 |
| Foxp3_R | CTG TCT TTC CTG GGT GTA CCT GAGCG | 역방향 | 서열번호 : 22 | |
<3-8>
염증매개인자
(사이토카인(
cytokine
),
케모카인
(
chemokine
)) 및 iNOS의
mRNA
발현 억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 염증매개인자(사이토카인, 케모카인) 및 iNOS의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 하였다.
구체적으로, 염증매개인자로 알려진 RANTES, MCP-1, MIP-1α, TNF-α 및IL-1β와 iNOS primer(표 4)를 이용하여 상기 실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 RT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과 도 11에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 증가된 염증매개인자인 RANTES, MCP-1, MIP-1α, TNF-α 및 IL-1β와 iNOS의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였다(도 11).
| 목적 유전자 |
Primer | |||
| 명칭 | 서열 | 방향 | 서열번호 | |
| RANTES |
RANTES_F | CAT CCC TCA CCG TCA TC | 정방향 | 서열번호 : 23 |
| RANTES_R | CCT CTC TGG GTT GGC AC | 역방향 | 서열번호 : 24 | |
| MCP-1 |
MCP1_F | GGC CTG TTG TTC ACA GTT GCT | 정방향 | 서열번호 : 25 |
| MCP1_R | ACA CCT GCT GCT GGT GAT TCT | 역방향 | 서열번호 : 26 | |
| MIP-1α |
MIP1a_F | GAA GGT CTC CAC CAC TGC CCT TGC | 정방향 | 서열번호 : 27 |
| MIP1a_R | TCA GGC ATT CAG TTC CAG CTC AG | 역방향 | 서열번호 : 28 | |
| TNF-α |
TNFa_F | TGA TCG GTC CCA ACA AGG A | 정방향 | 서열번호 : 29 |
| TNFa_R | TGC TTG GTG GTT TGC TAC GA | 역방향 | 서열번호 : 30 | |
| IL-1β |
IL1b_F | ACA GCA ATG GTC GGG ACA TAG | 정방향 | 서열번호 : 31 |
| IL1b_R | CTG CCC ATT CTC GAC AAG G | 역방향 | 서열번호 : 32 | |
| iNOS |
iNOS_F | TCT GTG CCT TTG CTC ATG ACA | 정방향 | 서열번호 : 33 |
| iNOS_R | TGC TTC GAA CAT CGA ACG TC | 역방향 | 서열번호 : 34 | |
<3-9>
MAPKs
(
mitogen
-
activated
protein
kinases
)
신호기전
억제 확인
본 발명의 봉독침요법의 MBP에 의해 유도된 급성 EAE 동물모델에서의 MAPKs 신호기전 억제효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 하였다.
구체적으로, MAPKs인 ERK(extracellular signal-regulated kinase 1/2), JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38, p65(NF-κB) 및 IκBα의 항체인 rabbit-anti-p-JNK, p-ERK, p-p38(1:1,000; Cell Signaling Technology, 미국), NF-κB(p65), p-IκBα(1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, 미국), JNK, ERK 1/2 및 p38(1:2,000; Cell Signaling technology, 미국)을 이용하여 상기 실시예 <3-3>과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 이를 정량화하여 확인하였다.
그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, EAE+봉독침요법군은 EAE군에 비하여 급성 EAE에 의하여 증가된 p-p38 MAPKs, NF-κB(p65) 및 p-IκBα의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 12).
<
실시예
4>
봉독침요법의
신경계 자가면역 질환에서의 치료 효과 확인
본 발명의 봉독침요법의 상기 실시예 <2-2>의 MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델에서의 신경계 자가면역 질환에서의 치료 효과를 확인하기 위하여 임상 증상의 척도를 표 1에 나타낸 바와 같이 8가지로 구분하여 확인하였다.
본 발명의 봉독침요법을 0.8 mg/kg의 농도로 시행하여 신경학적인 임상증상 및 체중을 비교하였다.
그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 봉독침요법을 온셋투여하거나 후투여하였을 때, EAE군에 비하여 봉독침요법을 시행한 후 만성 EAE를 유도한 군에서 만성 EAE에 의해 나타나는 임상증상과 감소된 체중이 개선되는 것을 확인하였고, 본 발명의 봉독침요법을 최고점투여하였을 때, 만성 EAE에 의해 나타나는 임상증상과 감소된 체중의 변화가 없음을 확인하였다(도 13).
<110> University-Industry Cooperation Croup of Kyung Hee University
<120> Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of
autoimmune disease in nervous system comprising bee venom
<130> 2014P-04-022
<160> 34
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD11b_F
<400> 1
gggatccgta aagtagtgag aa 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD11b_R
<400> 2
aaaggagctg gtacttcctg tct 23
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP_F
<400> 3
catccttgac tccatcgg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP_R
<400> 4
tttcatcttg ggtcctctg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFaR_F
<400> 5
aactcgctgg tcttgaacg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFaR_R
<400> 6
ctggtgcctg cctcctac 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH_F
<400> 7
aggtcatccc agagctgaac g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH_R
<400> 8
caccctgttg ctgtagccgt at 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3_F
<400> 9
gatcccaaac tctctatagc ta 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3_R
<400> 10
ctttcatgcc aatctcactg tg 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFNg_F
<400> 11
gaaagcctag aaagtctgaa taac 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFNg_R
<400> 12
gcagcgactc cttttccgct tcct 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL17_F
<400> 13
ctcagactac ctcaaccgtt cc 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL17_R
<400> 14
aggatctctt gctggatgag aac 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL17a_F
<400> 15
tctgagccag ccaagaagaa gtgt 24
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL17a_R
<400> 16
ttccaaccca aacataggca c 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL4_F
<400> 17
ggtatccacg gatgtaacga cagc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL4_R
<400> 18
ccgtggtgtt ccttgttgcc gtaa 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL5_F
<400> 19
gttgacgagc aatgagacga t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL5_R
<400> 20
gccacacttc tctttttgtc c 21
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foxp3_F
<400> 21
tgcatcagct ctccactgta gacgca 26
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foxp3_R
<400> 22
ctgtctttcc tgggtgtacc tgagcg 26
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RANTES_F
<400> 23
catccctcac cgtcatc 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RANTES_R
<400> 24
cctctctggg ttggcac 17
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCP1_F
<400> 25
ggcctgttgt tcacagttgc t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MCP1_R
<400> 26
acacctgctg ctggtgattc t 21
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIP1a_F
<400> 27
gaaggtctcc accactgccc ttgc 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIP1a_R
<400> 28
tcaggcattc agttccagct cag 23
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNFa_F
<400> 29
tgatcggtcc caacaagga 19
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNFa_R
<400> 30
tgcttggtgg tttgctacga 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1b_F
<400> 31
acagcaatgg tcgggacata g 21
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1b_R
<400> 32
ctgcccattc tcgacaagg 19
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS_F
<400> 33
tctgtgcctt tgctcatgac a 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS_R
<400> 34
tgcttcgaac atcgaacgtc 20
Claims (8)
- 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환(autoimmune disease in nervous system) 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 신경계 자가면역 질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레 증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 급성 파종 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 급성 횡단 척수염(acute transverse myelitis), 자가면역성 뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 탈수초화 및 활성화된 면역기능 억제를 특징으로 하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품.
- 제 4항에 있어서, 상기 신경계 자가면역 질환은 다발성 경화증, 시신경 척수염, 중증 근무력증, 길랑바레 증후군, 자가면역성 포도막염, 급성 파종 뇌척수염, 급성 횡단 척수염, 자가면역성 뇌증 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품.
- 봉독을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 봉독은 족삼리(ST36)혈에 투여하는 것을 특징으로 하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 신경계 자가면역 질환은 다발성 경화증, 시신경 척수염, 중증 근무력증, 길랑바레 증후군, 자가면역성 포도막염, 급성 파종 뇌척수염, 급성 횡단 척수염, 자가면역성 뇌증 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경계 자가면역 질환 예방 및 치료 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140066109A KR20150138973A (ko) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140066109A KR20150138973A (ko) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150138973A true KR20150138973A (ko) | 2015-12-11 |
Family
ID=55020224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140066109A KR20150138973A (ko) | 2014-05-30 | 2014-05-30 | 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20150138973A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200048078A (ko) * | 2018-10-29 | 2020-05-08 | 경북대학교 산학협력단 | 고치벌 유래의 천연독을 이용한 항염증 조성물 |
| WO2020226450A1 (ko) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | 경희대학교 산학협력단 | 포스포리파아제 a2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2014
- 2014-05-30 KR KR1020140066109A patent/KR20150138973A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200048078A (ko) * | 2018-10-29 | 2020-05-08 | 경북대학교 산학협력단 | 고치벌 유래의 천연독을 이용한 항염증 조성물 |
| WO2020226450A1 (ko) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | 경희대학교 산학협력단 | 포스포리파아제 a2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7386455B2 (ja) | 乾癬の治療薬 | |
| KR101986229B1 (ko) | 천연물 추출물을 포함하는 근육질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 | |
| JP6573293B2 (ja) | 炎症性疾患の予防または治療用ペプチド及びこの用途 | |
| US10548858B2 (en) | Inhibition of sphingosine 1-phosphate receptor for treatment and prevention of lymphedema | |
| EP1920778B1 (en) | Composition for treatment of uveitis | |
| KR101713822B1 (ko) | 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 | |
| KR101910733B1 (ko) | 파이퍼롱구민을 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| Fyfe et al. | The effects of silica on lymph nodes and vessels—a possible mechanism in the pathogenesis of non-filarial endemic elephantiasis | |
| KR20150138973A (ko) | 봉독을 유효성분으로 함유하는 신경계 자가면역 질환의 예방 및 치료용 조성물 | |
| KR101989517B1 (ko) | 수국차 추출물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
| WO2022249535A1 (ja) | 癌悪液質の改善剤および癌悪液質の改善方法 | |
| KR20150051387A (ko) | 큰열매모자반 추출물을 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 | |
| JP2021169465A (ja) | モノアセチルジアシルグリセロール化合物を含有する乾癬の予防または治療用組成物 | |
| US11052099B2 (en) | Use of cimicifugae rhizoma triterpenoid saponin extract, actein, and deoxyactein | |
| KR20170106167A (ko) | 염증성 질환의 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이의 용도 | |
| KR101916945B1 (ko) | 오미자 씨앗 추출물을 함유하는 신경계 면역학적 질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| KR101705361B1 (ko) | Ｅｇｃｇ를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| JP2006315988A (ja) | ケモカイン産生誘導効果を有する血管新生阻害物質 | |
| WO2018228430A1 (zh) | 异阿魏酸、含异阿魏酸中药提取物及升麻的用途 | |
| KR102146226B1 (ko) | 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| KR100329835B1 (ko) | 베체트병 치료에 사용되는 수산화 알루미늄 애쥬번트에흡착된 오발부민을 포함하는 티에이치2 애쥬번트 | |
| KR102001730B1 (ko) | 옻나무 추출물을 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN107260723B (zh) | 5Z-7-oxozeaenol在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用 | |
| KR20190056048A (ko) | 황련, 황금, 황백 및 치자의 추출물을 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| Papazahariadou et al. | Autoimmunity and parasites |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| WITB | Written withdrawal of application |