WO2022249535A1 - 癌悪液質の改善剤および癌悪液質の改善方法 - Google Patents

Abstract

癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物であり、培養上清が、前記歯髄由来幹細胞に由来する微小粒子を含む、癌悪液質の改善剤は、新規な癌悪液質の改善剤である；癌悪液質の改善方法。

Description

癌悪液質の改善剤および癌悪液質の改善方法

　本発明は、癌悪液質の改善剤および癌悪液質の改善方法に関する。

　癌性食欲不振－悪液質症候群（ＣＡＣＳ）と呼ばれることが多い癌悪液質は、癌の末期における多因子性症状である。癌悪液質の症状は、特に体重減少であり、その他に低栄養状態、貧血などが挙げられる。
　癌の末期における悪液質を治療する方法として、生存期間を延ばせなくても、これらの症状を改善または緩和することにより生存期間におけるＱＯＬ（クオリティオブライフ）やＡＤＬ（日常生活動作；ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｄａｉｌｙ　ｌｉｖｉｎｇ）をできる限り高めることが求められている。

　悪液質を治療する方法として、特許文献１には、治療有効量のアナモレリンを治療有効期間にわたって１日１回ヒト癌患者に投与することを含む、患者の悪液質を治療する方法が記載されている。

特表２０１９－５３５６９１号公報 特表２０１９－５１４４１６号公報 特開２０１８－１５４６５５号公報

　一方、アナモレリン以外の物質を用いて悪液質の治療をする方法が検討されている。特許文献１には、その他に酢酸メゲストロール、メラトニン、オスタリンなどの低分子化合物を用いて悪液質の治療をすることが記載されている。また、特許文献２および３には、間葉系幹細胞から分泌される細胞外小胞を含む医薬組成物が開示されており、適用される疾患として悪液質が例示されている（特許文献２の請求項６、特許文献３の［０２１０］など）。

　本発明が解決しようとする課題は、新規な癌悪液質の改善剤を提供することである。

　本発明者らは、歯髄由来幹細胞の培養上清、または培養上清に由来するエクソソーム等の微小粒子が、癌悪液質モデルマウスの悪液質の諸症状を改善できることを見出した。

　なお、歯髄由来幹細胞の悪液質に対する影響は特許文献２および３には記載されていない。特許文献２の実施例では、［０２２７］にＤＰ－ＭＳＣ（歯髄由来幹細胞のエクソソーム）は、効果は低いが、ＵＣ－（臍帯由来の幹細胞）およびＣＨ－ＭＳＣ（胎盤繊毛膜由来の幹細胞のエクソソーム）と同様に挙動すると記載がある程度であり、歯髄由来幹細胞を用いて悪液質の検討をした実施例はなかった。特許文献３には、歯髄由来幹細胞の培養上清から得られたエクソソームを用いた実施例はなかった。
　具体的に、本発明および本発明の好ましい構成は、以下のとおりである。

［１］　癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、
　歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物であり、
　培養上清が、歯髄由来幹細胞に由来する微小粒子を含む、癌悪液質の改善剤。
［２］　癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、
　歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物であり、
　組成物が、培養上清から微小粒子を除いたものを含まない、癌悪液質の改善剤。
［３］　微小粒子がエクソソームである、［１］または［２］に記載の癌悪液質の改善剤。
［４］　癌悪液質を発症した対象の体重減少を治療するための用途である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の癌悪液質の改善剤。
［５］　対象の体重減少が過去１４日間に２％以上である、［４］に記載の癌悪液質の改善剤。
［６］　癌悪液質を発症した対象の貧血を治療するための用途である、［１］～［５］のいずれか一つに記載の癌悪液質の改善剤。
［７］　癌悪液質を発症した対象の赤血球数、ヘモグロビン値およびヘマトクリット値の減少を抑制するための用途である、［６］に記載の癌悪液質の改善剤。
［８］　癌悪液質を発症した対象の血中のＩＬ－６濃度およびＴＦＮ－α濃度の増加を抑制するための用途である、［１］～［７］のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤。
［９］　癌悪液質の改善剤を治療有効期間にわたって１週間に１回以上、癌悪液質を発症した対象に投与する用途である、［１］～［８］のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤。
［１０］　有効量の［１］～［９］のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤を、癌悪液質を発症した対象に投与することを含む、癌悪液質の改善方法。
［１１］　癌悪液質を発症した対象が、ヒト以外の動物である、［１０］に記載の癌悪液質の改善方法。

　本発明によれば、新規な癌悪液質の改善剤を提供することができる。

図１は、癌悪液質モデルマウスに対してサンプルを投与して癌悪液質の改善を評価するための実験プロトコルの概略図である。 図２は、癌悪液質モデルマウスに対して実施例１および２の癌悪液質の改善剤または比較例のサンプル（生理食塩水）を投与した場合の、処置日からの日数と体重（％対コントロールとして用いる正常マウス）との関係を示したグラフである。 図３は、正常マウスの場合と、癌悪液質モデルマウスに対して実施例１および２の癌悪液質の改善剤または比較例のサンプル（生理食塩水）を投与した場合における、血液中ＩＬ－６濃度を示したグラフである。 図４は、正常マウスの場合と、癌悪液質モデルマウスに対して実施例１および２の癌悪液質の改善剤または比較例のサンプル（生理食塩水）を投与した場合における、血液中ＴＦＮ－α濃度を示したグラフである。 図５は、正常マウスの場合と、癌悪液質モデルマウスに対して実施例１および２の癌悪液質の改善剤または比較例のサンプル（生理食塩水）を投与した場合の、処置日からの日数と生存率との関係を示したグラフである。 図６は、正常マウスの場合と、癌悪液質モデルマウスに対して実施例２の癌悪液質の改善剤の投与量を１．２５倍とした場合または比較例のサンプル（生理食塩水）を投与した場合の、処置日からの日数と生存率との関係を示したグラフである。 図７は、ＬＰＳの刺激により惹起した、サイトカインストームの主原因となる活性化マクロファージ細胞に対して、未処理の場合（比較例Ａ）と、実施例１および２の癌悪液質の改善剤または比較例のサンプル（比較例Ｂの生理食塩水、比較例ＣおよびＤの臍帯由来幹細胞の培養上清またはエクソソーム）を投与した場合の、培養後に培養液中に遊離したＩＬ－６濃度を示したグラフである。

　以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。

［癌悪液質の改善剤］
　本発明の癌悪液質の改善剤の第１の態様は、癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物であり、培養上清が、前記歯髄由来幹細胞に由来する微小粒子を含む。
　本発明の癌悪液質の改善剤の第２の態様は、癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物であり、組成物が、培養上清から微小粒子を除いたものを含まないものである。
　本発明の癌悪液質の改善剤は、癌悪液質の改善効果を高くする観点からは、歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物であることがより好ましく、歯髄由来幹細胞の培養上清であることが特に好ましい。
　以下、本発明の癌悪液質の改善剤の好ましい態様を説明する。

＜癌悪液質の定義＞
　癌悪液質は、癌を発症した対象の悪液質を意味する。なお、本発明の癌悪液質の改善剤は、癌悪液質を改善するものであるが、癌悪液質以外の悪液質を改善できてもよい。
　「悪液質」は、本発明の主要な実施態様又は下位実施態様のいずれかにおける様々な方法によって定義することができる。特に、以下の定義のいずれかを用いることができる：
（１）食欲不振、早期満腹感、体重減少、筋肉疲労、低栄養状態、貧血、及び浮腫の１つ又はこれらの組合せを特徴とする臨床的症候群であるが、好ましくはこれらの症状の３つ、４つ、５つ又は全てによって定義される臨床的症候群。
（２）過去６ヶ月間に５％以上の体重減少、及び／又は２０ｋｇ／ｍ^２未満の体格指数。
（３）ＢＭＩ＜２０で、過去３又は６ヶ月間に２％を上回る体重減少。
（４）サルコペニアと一致する四肢骨格筋指数（男性＜７．２６ｋｇ／ｍ^２；女性＜５．４５ｋｇ／ｍ^２）では、過去３又は６ヶ月間に体重減少＞２％。
（５）重度の体重、脂肪、及び筋肉の減少、並びに基礎疾患に起因するタンパク質異化の増加を特徴とする多因子症候群。
　体重減少に関し、本発明の癌悪液質の改善剤が、癌悪液質を発症した対象の体重減少を治療するための用途である場合、対象の体重減少が過去１４日間に２％以上である対象を治療できることが好ましい。
　早期満腹感は、食事を摂取する際に早期に膨満感又は満腹感を経験する傾向を指す。
　疲労は、一般に、疲労感（ｆｅｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｗｅａｒｉｎｅｓｓ）、疲れ（ｔｉｒｅｄｎｅｓｓ）、又はエネルギー不足と定義される。疲労はまた、疲労感、疲れ、又はエネルギー不足を順位付けするように設計された質問を含む、様々な評価又は自己評価に関する患者スコアの観点から定義することもできる。具体的な評価は、２７項目の一般的癌治療の機能的評価（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　－Ｇｅｎｅｒａｌ）（ＦＡＣＴ－Ｇ）と、０～４にスコア化され、疲労及び貧血関連の懸念に対する患者の認識を測定することができる、１３の質問からなる疲労サブスケール（Ｆａｔｉｇｕｅ　Ｓｕｂｓｃａｌｅ）を含有するＦＡＣＩＴ－Ｆとを含む。

＜癌悪液質の症状の改善＞
　本発明では、癌悪液質の症状の中でも特に、体重減少、低栄養状態、貧血の改善をできることが好ましい。これらの症状を改善することにより、生存期間におけるＱＯＬ、ＡＤＬを高めることが求められている。特に、癌悪液質を発症した対象が末期癌である場合、死亡する間際まで体重減少、低栄養状態、貧血を抑制、緩和またはコントロールしつつ、安らかに死期を迎えられることが好ましい。
　以下、癌悪液質の改善剤の作用機序とあわせて説明する。

＜癌悪液質の改善剤の作用機序＞
（血液中サイトカインの抑制）
　血液中サイトカインの抑制により、悪液質の症状の中でも、体重減少、貧血、低栄養状態が改善される。
　サイトカインとは、炎症反応と免疫応答に関与するタンパク質の総称であり、数百種類以上知られている。サイトカインは、それぞれ多彩な活性を有し、それらがバランス良く協調的に相互作用することで生体機能を維持または調節している。通常は感染症などに対する免疫応答によりサイトカインが産生・放出されるが、癌悪液質では腫瘍細胞からのサイトカインの産生・放出が無秩序になって血液中の複数種類のサイトカイン濃度が異常上昇する。特に癌悪液質の病態に炎症性サイトカインが関与し、特にＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γが重要である。その他に抑制されるべきサイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１αなどが挙げられる。腫瘍細胞から放出されたサイトカインは、腫瘍局所の炎症反応の促進を通して宿主の免疫・炎症細胞を活性化し、いわゆるサイトカインストームを引き起こす。癌悪液質では骨格筋の減少による体重減少の病態が特徴的である。

　ＩＬ－１は、炎症や感染防御に関与する炎症性サイトカインである。
　ＩＬ－２は、細胞の免疫に関与するサイトカインである。ＩＬ－２の過剰発現は、Ｔ細胞のサブセットである制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の選択的増加につながる。Ｔｒｅｇは、他の細胞の免疫応答を抑制することにより末梢性寛容を維持する作用を発揮している。末梢性寛容の破綻はヒトにおいて自己免疫疾患を引き起こすと考えられている。したがって、Ｔｒｅｇの免疫抑制能は自己免疫疾患の発症を防いでいると考えられている。また、Ｔｒｅｇはがんにも関与しており、充実性腫瘍および血液悪性腫瘍はＴｒｅｇ数の増加を伴う（特開２０２０－００２１５４号公報の［０００７］参照）。
　ＩＬ－４は、ヘルパーＴ細胞からＴｈ２（ヘルパーＴ２型）サブセットへの分化に関与する非重複サイトカインであり、Ｔｈ２は未熟Ｂ細胞からＩｇＥ産生形質細胞への分化を促進する。ＩｇＥレベルはアレルギー性喘息において上昇する。したがって、ＩＬ－４はアレルギー性喘息の発症に関連する（特開２０２０－００２１５４号公報の［０００８］参照）。
　ＩＬ－６は、Ｂ細胞分化因子；Ｂ細胞刺激因子－２；肝細胞刺激因子；ハイブリドーマ増殖因子；および形質細胞腫増殖因子である。ＩＬ－６は代表的な炎症性サイトカインであり、また、急性炎症応答の制御、ＢおよびＴ細胞分化を含む特定の免疫応答の調節、骨代謝、血小板産生、上皮増殖、月経、神経細胞分化、神経保護、加齢、癌、アルツハイマー病において起こる炎症反応などに関与する多機能サイトカインである。ＩＬ－６は、疲労、悪液質、自己免疫疾患、骨格系の疾患、癌、心臓疾患、肥満、糖尿病、喘息、アルツハイマー病および多発性硬化症を含む、多数の疾患および障害の発展に役割を果たすと考えられている（特開２０１９－０４７７８７号公報の［０００２］～［０００５］参照）。
　ＩＬ－１０は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞で産生される１６０アミノ酸残基のホモ二量体のタンパク質である。ＩＬ－１０は、マクロファージ機能抑制、Ｂ細胞活性化などに関与することが知られている（再表２０１８／２１２２３７号公報の［００５２］参照）。また、抗炎症性サイトカインである。
　ＩＬ－１７は、ＣＤ４記憶Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞で産生される１３２アミノ酸残基のタンパク質である。ＩＬ－１７は、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞からの炎症性サイトカイン産生などに関与することが知られている（再表２０１８／２１２２３７号公報の［００５３］参照）。
　ＩＬ－１８は、ウイルス感染やがん活性酸素などにより、強いストレスが細胞にかかると放出される。
　ＩＦＮ（インターフェロン）は、ウイルス複製の阻害、免疫細胞（例えばナチュラルキラー細胞及びマクロファージなど）を活性化する機能などを有する。ＩＦＮはＩ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、及びＩＩＩ型ＩＦＮに分けられる。その中でもＩＩ型ＩＦＮであるＩＦＮγは、活性化した免疫細胞により産生される多面的サイトカインであり、マクロファージ活性の増加、ＭＨＣ分子の発現の増加、およびＮＫ細胞活性の増加などの細胞応答を誘発することができる（特表２０２０－５２２２５４号公報の［０２０９］参照）。
　ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ；腫瘍壊死因子）は、代表的な炎症性サイトカインである。ＴＮＦとして、ＴＮＦα、ＴＮＦβおよびＬＴβが知られている。この中でもＴＮＦαは二次リンパ器官の構造的および機能的組織化、アポトーシスおよび抗腫瘍活性、ウイルス複製の阻害、免疫調節ならびに炎症を含めたいくつもの重要な生活機能を媒介する。ＴＮＦはまた、自己免疫疾患の病理発生、急性期反応、敗血症性ショック、発熱および悪液質においても重要な役割を果たす（特開２０２０－０７９３０６号公報の［０００４］参照）。
　ＭＩＧは、１型免疫応答をつかさどるサイトカインである。マクロファージや上皮細胞、血管内皮細胞などから産生され、Ｔｈ１細胞やＣＤ８Ｔ細胞、一部のマクロファージなどを炎症部位に遊走させる。
　ＭＩＰ－１αは、マクロファージや線維芽細胞、上皮細胞、血管平滑筋細胞などから炎症に応じて産生されるサイトカインである。
　これらの中でも、本発明の癌悪液質の改善剤は、癌悪液質を発症した対象の血中のＩＬ－６濃度およびＴＦＮ－α濃度の増加を抑制するための用途であることが好ましい。

（血液中の血球などの量の改善）
　本発明の癌悪液質の改善剤は、血液中の血球などの量の改善をできることが好ましく、赤血球数、ヘモグロビン値（血色素数）、血小板数、ヘマトクリット値の改善をできることがより好ましい。本発明の癌悪液質の改善剤は、癌悪液質を発症した対象の赤血球数、ヘモグロビン値およびヘマトクリット値の減少を抑制するための用途であることが特に好ましい。これらを改善することにより、低栄養状態、貧血が改善される。

（癌のタイプ）
　本発明の癌悪液質の改善剤は、任意のタイプの癌において実施することができるが、これらの方法の各々は好ましくは、一般に癌悪液質に伴うタイプの癌において実施される。関連のある癌の非限例には、例えば、乳癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、移行細胞癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、腎癌、甲状腺癌、及び副甲状腺機能亢進症を引き起こす他の癌、腺癌、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管癌、胆嚢癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、子宮頸癌、膀胱癌、神経芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、原発性骨癌（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、アダマンチノーマ、巨細胞腫、及び脊索腫）と続発性（転移性）骨癌の両方を含む骨癌、軟部組織肉腫、基底細胞癌、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫（骨原性肉腫）、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、消化管癌、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍａマクログロブリン血症、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、上皮癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、髄様癌、胸腺腫などが含まれる。好ましい実施態様において癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、さらに好ましくは切除不能なＩＩＩ期又はＩＶ期のＮＳＣＬＣである。

＜癌悪質液の改善剤の成分＞
　本発明の癌悪液質の改善剤の有効成分は、歯髄由来幹細胞の培養上清であり、または歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子である。

　本発明の癌悪液質の改善剤は、従来の癌悪液質の改善剤として用いることができる組成物と比較して、大量生産しやすい、従来は産業廃棄物等として廃棄されていた幹細胞の培養液を利活用できる、幹細胞の培養液の廃棄コストを減らせる等の利点がある。特に歯髄由来幹細胞の培養上清が、ヒト歯髄由来幹細胞の培養上清である場合は、本発明の癌悪液質の改善剤をヒトに対して適用する場合に、免疫学上などの観点での安全性が高く、倫理性の問題も少ないという利点もある。歯髄由来幹細胞の培養上清が、癌悪液質の患者からの歯髄由来幹細胞の培養上清である場合は、本発明の癌悪液質の改善剤をその患者に対して適用する際により安全性が高まり、倫理性の問題も少なくなるであろう。
　本発明の癌悪液質の改善剤は、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来するため、修復医療の用途にも用いられる。特に歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物は、修復医療の用途に好ましく用いられる。ここで、幹細胞移植を前提とした再生医療において、幹細胞は再生の主役ではなく、幹細胞の産生する液性成分が自己の幹細胞とともに臓器を修復させる、ということが知られている。従来の幹細胞移植に伴うがん化、規格化、投与方法、保存性、培養方法などの困難な問題が解決され、歯髄由来幹細胞の培養上清またはそれに由来する微小粒子を用いた組成物により修復医療が可能となる。幹細胞移植と比較すると、本発明の癌悪液質の改善剤を用いた場合は細胞を移植しないために腫瘍化などが起こりにくく、より安全と言えるだろう。また、本発明の癌悪液質の改善剤は一定に規格化した品質のものを使用できる利点がある。大量生産や効率的な投与方法を選択することができるので、低コストで利用ができる。

（歯髄由来幹細胞の培養上清）
－歯髄由来幹細胞－
　歯髄由来幹細胞等の培養上清は、特に制限はない。
　歯髄由来幹細胞等の培養上清は、血清を実質的に含まないことが好ましい。例えば、歯髄由来幹細胞等の培養上清は、血清の含有量が１質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以下であることがより好ましく、０．０１質量％以下であることが特に好ましい。

　歯髄由来幹細胞は、ヒト由来であっても、ヒト以外の動物由来であってもよい。ヒト以外の動物としては、後述する本発明の癌悪液質の改善剤投与する対象の動物（生物種）と同様のものを挙げることができ、哺乳動物が好ましい。

　培養上清に用いられる歯髄由来幹細胞としては、特に制限はない。脱落乳歯歯髄幹細胞（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ　ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ　ｔｅｅｔｈ）や、その他の方法で入手される乳歯歯髄幹細胞や、永久歯歯髄幹細胞（ｄｅｎｔａｌ　ｐｕｌｐ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ＤＰＳＣ）を用いることができる。ヒト乳歯歯髄幹細胞やヒト永久歯歯髄幹細胞の他、ブタ乳歯歯髄幹細胞などのヒト以外の動物由来の歯髄由来幹細胞を用いることができる。
　歯髄由来幹細胞は、エクソソームに加え、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）－１および－３、ＴＧＦ－α、ＫＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＳＰＡＲＣ、その他の成長因子、ケモカイン等の種々のサイトカインを産生し得る。また、その他の多くの生理活性物質を産生し得る。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清に用いられる歯髄由来幹細胞が、多くのタンパク質が含まれる歯髄由来幹細胞であることが特に好ましく、乳歯歯髄幹細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明では、乳歯歯髄幹細胞の培養上清を用いることが好ましい。

　本発明に用いられる歯髄由来幹細胞は、目的の処置を達成することができれば、天然のものであってもよく、遺伝子改変したものであってもよい。
　特に本発明では、歯髄由来幹細胞の不死化幹細胞を用いることができる。実質的に無限増殖が可能な不死化幹細胞を用いることで、幹細胞の培養上清中に含まれる生体因子の量と組成を、長期間にわたって安定させることができる。歯髄由来幹細胞の不死化幹細胞としては、特に制限はない。不死化幹細胞は、癌化していない不死化幹細胞であることが好ましい。歯髄由来幹細胞の不死化幹細胞は、歯髄由来幹細胞に、以下の低分子化合物（阻害剤）を単独または組み合わせて添加して培養することにより、調製することができる。
　ＴＧＦβ受容体阻害薬としては、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、２－［（５－クロロ－２－フルオロフェニル）プテリジン－４－イル］ピリジン－４－イルアミン（ＳＤ－２０８）、３－［（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（以上、メルク社）、ＳＢ４３１５４２（シグマアルドリッチ社）などが挙げられる。好ましくはＡ－８３－０１が挙げられる。
　ＲＯＣＫ阻害薬としては、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害薬としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎｍｅｄｃｈｅｍ社）、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２（以上、富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。好ましくはＹ－２７６３２が挙げられる。
　ＧＳＫ３阻害薬としては、ＧＳＫ－３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　３，グリコーゲン合成酵素３）を阻害するものであれば特に限定されることはなく、Ａ　１０７０７２２、ＢＩＯ、ＢＩＯ－ａｃｅｔｏｘｉｍｅ（以上、ＴＯＣＲＩＳ社）などが挙げられる。
　ＭＥＫ阻害薬としては、ＭＥＫ（ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅ－ＥＲＫ　ｋｉｎａｓｅ）の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６－９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ（以上、Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５（以上、コスモ・バイオ株式会社）などが挙げられる。

　本発明の癌悪質液の改善剤を再生医療に用いる場合、再生医療等安全性確保法の要請から、歯髄由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清や、それに由来する微小粒子を含む組成物は、歯髄由来幹細胞等以外のその他の体性幹細胞を含有しない態様とする。本発明の癌悪質液の改善剤は、歯髄由来幹細胞等以外の間葉系幹細胞やその他の体性幹細胞を含有していてもよいが、含有しないことが好ましい。
　間葉系幹細胞以外のその他の体性幹細胞の例としては、真皮系、消化系、骨髄系、神経系等に由来する幹細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。真皮系の体性幹細胞の例としては、上皮幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。消化系の体性幹細胞の例としては膵臓（全般の）幹細胞、肝幹細胞等が含まれる。（間葉系幹細胞以外の）骨髄系の体性幹細胞の例としては、造血幹細胞等が含まれる。神経系の体性幹細胞の例としては、神経幹細胞、網膜幹細胞等が含まれる。
　本発明の癌悪質液の改善剤は、体性幹細胞以外の幹細胞を含有していてもよいが、含有しないことが好ましい。体性幹細胞以外の幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）が含まれる。

－歯髄由来幹細胞の培養上清の調製方法－
　歯髄由来幹細胞またはこの不死化幹細胞の培養上清の調製方法としては特に制限はなく、従来の方法を用いることができる。
　歯髄由来幹細胞等の培養上清は、歯髄由来幹細胞を培養して得られる培養液である。例えば歯髄由来幹細胞の培養後に細胞成分を分離除去することによって、本発明に使用可能な培養上清を得ることができる。各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。特に、培養上清が、歯髄由来幹細胞を培養して得られた培養液に対して、歯髄由来幹細胞またはその死細胞を取り除ける程度の遠心分離処理を行って得られた、微小粒子を含む培養上清であることが好ましい。遠心分離処理を行った後に、微小粒子を多く含む特定の画分を分取して培養上清を調製してもよい。

　歯髄由来幹細胞の培養上清を得るための歯髄由来幹細胞は、常法により選別可能であり、細胞の大きさや形態に基づいて、または接着性細胞として選別可能である。脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞から、接着性細胞またはその継代細胞として選別することができる。歯髄由来幹細胞の培養上清には、選別された幹細胞を培養して得られた培養上清を用いることができる。

　なお、「歯髄由来幹細胞等の培養上清」は、歯髄由来幹細胞等を培養して得られる細胞そのものを含まない培養液であることが好ましい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、その一態様では全体としても細胞（細胞の種類は問わない）を含まないことが好ましい。当該態様の組成物はこの特徴によって、歯髄由来幹細胞自体は当然のこと、歯髄由来幹細胞を含む各種組成物と明確に区別される。この態様の典型例は、歯髄由来幹細胞を含まず、歯髄由来幹細胞の培養上清のみで構成された組成物である。
　本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞および大人歯髄由来幹細胞の両方の培養上清を含んでいてもよい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞の培養上清を有効成分として含むことが好ましく、５０質量％以上含むことがより好ましく、９０質量％以上含むことが好ましい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞の培養上清のみで構成された組成物であることがより特に好ましい。

　培養上清を得るための歯髄由来幹細胞の培養液には基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。なお、基本培地としてはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
　但し、血清を含まない「歯髄由来幹細胞の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後または最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄由来幹細胞を培養することによって、血清を含まない歯髄由来幹細胞の培養上清を調製することができる。１回または複数回の継代培養を行うことにし、最後または最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない歯髄由来幹細胞等の培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない歯髄由来幹細胞の培養上清を得ることができる。

　培養上清を得るための歯髄由来幹細胞の培養には、通常用いられる条件をそのまま適用することができる。歯髄由来幹細胞の培養上清の調製方法については、幹細胞の種類に応じて幹細胞の単離および選抜工程を適宜調整する以外は、後述する細胞培養方法と同様とすればよい。歯髄由来幹細胞の種類に応じた歯髄由来幹細胞の単離および選抜は、当業者であれば適宜行うことができる。
　また、歯髄由来幹細胞の培養には、エクソソームを多量に生産させるために、特別な条件を適用してもよい。特別な条件として、例えば、低温条件、低酸素条件、微重力条件など、何らかの刺激物と共培養する条件などを挙げることができる。

　本発明でエクソソームの調製に用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、歯髄由来幹細胞の培養上清の他にその他の成分を含んでいてもよいが、その他の成分を実質的に含まないことが好ましい。
　ただし、エクソソームの調製に使用する各種類の添加剤を、歯髄由来幹細胞の培養上清に添加してから保存しておいてもよい。

（微小粒子）
　微小粒子は、例えば、歯髄由来幹細胞からの分泌、出芽または分散などにより、歯髄由来幹細胞から導き出され、細胞培養培地に浸出、放出または脱落する。そのため、微小粒子は、歯髄由来幹細胞の培養上清に含まれる。
　歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子は、培養上清に含まれた状態で用いてもよく、または培養上清から精製した状態で用いてもよい。微小粒子が培養上清から精製された微小粒子であることが好ましい。
　微小粒子の由来は、公知の方法で判別することができる。例えば、微小粒子は、Ｊ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ　（２０１８）　８：２に記載の方法で、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞などのいずれの幹細胞に由来するか判別することができる。具体的には、微小粒子のｍｉＲＮＡパターンに基づいて、それぞれの微小粒子の由来を判別することができる。

　微小粒子は、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソーム（Ｅｃｔｏｓｏｍｅ）およびエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）、またはマイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）からなる群から選択される少なくとも１種類であることが好ましく、エクソソームであることがより好ましい。
　微小粒子の直径は、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、３０～５００ｎｍであることがより好ましく、５０～１５０ｎｍであることが特に好ましい。
　また、微小粒子の表面には、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１などのテトラスパニンという分子が存在することが望ましく、それはＣＤ９単独、ＣＤ６３単独、ＣＤ８１単独でもよく、あるいはそれらの２つないしは３つのどの組み合わせでも良い。
　以下、微小粒子として、エクソソームを用いる場合の好ましい態様を説明することがあるが、本発明に用いられる微小粒子はエクソソームに限定されない。

　エクソソームは、原形質膜との多胞体の融合時に細胞から放出される細胞外小胞であることが好ましい。
　エクソソームの表面は、歯髄由来幹細胞の細胞膜由来の脂質およびタンパク質を含むことが好ましい。
　エクソソームの内部には、核酸（マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡなど）およびタンパク質など歯髄由来幹細胞の細胞内の物質を含むことが好ましい。
　エクソソームは、ある細胞から別の細胞への遺伝情報の輸送による、細胞と細胞とのコミュニケーションのために使用されることが知られている。エクソソームは、容易に追跡可能であり、特異的な領域に標的化され得る。

－微小粒子の含有量－
　本発明の癌悪液質の改善剤は、微小粒子の含有量は特に制限はない。本発明の癌悪液質の改善剤は、微小粒子を０．５×１０^８個以上含むことが好ましく、１．０×１０^８個以上含むことがより好ましく、２．０×１０^８個以上含むことが特に好ましく、２．５×１０^８個以上含むことがより特に好ましく、１．０×１０^９個以上含むことがさらにより特に好ましい。
　また、本発明の癌悪液質の改善剤は、微小粒子の含有濃度は特に制限はない。本発明の癌悪液質の改善剤は微小粒子を１．０×１０^８個／ｍＬ以上含むことが好ましく、２．０×１０^８個／ｍＬ以上含むことがより好ましく、４．０×１０^８個／ｍＬ以上含むことが特に好ましく、５．０×１０^８個／ｍＬ以上含むことがより特に好ましく、２．０×１０^９個／ｍＬ以上含むことがさらにより特に好ましい。
　本発明の癌悪液質の改善剤の好ましい態様は、微小粒子をこのように多量または高濃度で含むことにより、血液中の血球などの量を高く維持でき、（特に炎症性の）サイトカイン量を抑制でき、生存期間をある程度長くできる傾向がある。

－微小粒子の調製方法－
　歯髄由来幹細胞等の培養上清から、微小粒子を精製して、微小粒子を調製することができる。
　微小粒子の精製は、歯髄由来幹細胞の培養上清から微小粒子を含む画分の分離であることが好ましく、微小粒子の単離であることがより好ましい。
　微小粒子は、微小粒子の特性に基づいて非会合成分から分離されることにより、単離され得る。例えば、微小粒子は、分子量、サイズ、形態、組成または生物学的活性に基づいて単離され得る。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清を遠心処理して得られた、微小粒子を多く含む特定の画分（例えば沈殿物）を分取することにより、微小粒子を精製することができる。所定の画分以外の画分の不要成分（不溶成分）は除去してもよい。本発明の癌悪液質の改善剤からの、溶媒および分散媒、ならびに不要成分の除去は完全な除去でなくてもよい。遠心処理の条件を例示すると、１００～２００００ｇで、１～３０分間である。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清またはその遠心処理物を、ろ過処理することにより、微小粒子を精製することができる。ろ過処理によって不要成分を除去することができる。また、適切な孔径のろ過膜を使用すれば、不要成分の除去と滅菌処理を同時に行うことができる。ろ過処理に使用するろ過膜の材質、孔径などは特に限定されない。公知の方法で、適切な分子量またはサイズカットオフのろ過膜でろ過をすることができる。ろ過膜の孔径はエクソソームを分取しやすい観点から、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、３０～５００ｎｍであることがより好ましく、５０～１５０ｎｍであることが特に好ましい。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清またはその遠心処理物あるいはそれらのろ過処理物を、ラムクロマトグラフィーなど、さらなる分離手段を用いて分離することができる。例えば様々なカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用できる。カラムは、サイズ排除カラムまたは結合カラムを使用できる。
　各処理段階におけるそれぞれの画分中で、微小粒子（またはその活性）を追跡するために、微小粒子の１つ以上の特性または生物学的活性を使用できる。例えば、微小粒子を追跡するために、光散乱、屈折率、動的光散乱またはＵＶ－可視光検出器を使用できる。または、それぞれの画分中の活性を追跡するために、特定の酵素活性などを使用できる。
　微小粒子の精製方法として、特表２０１９－５２４８２４号公報の［００３４］～［００６４］に記載の方法を用いてもよく、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。

＜その他の成分＞
　本発明の癌悪液質の改善剤は、微小粒子の他に、投与する対象の動物の種類や目的に応じて、本発明の効果を損なわない範囲でその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、栄養成分、抗生物質、サイトカイン、保護剤、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤などを挙げられる。
　栄養成分としては、例えば、脂肪酸等、ビタミン等を挙げることができる。
　抗生物質としては、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等が挙げられる。
　担体としては、薬学的に許容可能な担体として公知の材料を挙げることができる。
　本発明の癌悪液質の改善剤は、歯髄由来幹細胞の培養上清それ自体または微小粒子それ自体であってもよく、薬学的に許容可能な担体や賦形剤などをさらに含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物の目的は、投与対象への歯髄由来幹細胞の培養上清や微小粒子の投与を促進することである。

　薬学的に許容可能な担体は、投与対象に対して顕著な刺激性を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しない担体（希釈剤を含む）であることが好ましい。担体の例は、プロピレングリコール；（生理）食塩水；エマルション；緩衝液；培地、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど；フリーラジカルを除去する成分を含有する低温保存培地である。

　本発明の癌悪液質の改善剤は、従来公知の癌悪液質の改善剤の有効成分を含んでいてもよい。当業者であれば用途や投与対象などにあわせて適切に変更することができる。

　一方、本発明の癌悪液質の改善剤は、所定の物質を含まないことが好ましい。
　例えば、本発明の癌悪液質の改善剤は、歯髄由来幹細胞を含まないことが好ましい。
　また、本発明の癌悪液質の改善剤は、ＭＣＰ－１を含まないことが好ましい。ただし、ＭＣＰ－１以外のサイトカインを含んでいてもよい。その他のサイトカインとしては、特開２０１８－０２３３４３号公報の［００１４］～［００２０］に記載のもの等が挙げられる。
　また、本発明の癌悪液質の改善剤は、シグレック９を含まないことが好ましい。ただし、シグレック９以外のその他のシアル酸結合免疫グロブリン様レクチンを含んでいてもよい。
　なお、本発明の癌悪液質の改善剤は、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）を実質的に含まないことが好ましい。また、本発明の癌悪液質の改善剤は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）などの従来の血清代替物を実質的に含まないことが好ましい。
　本発明の癌悪液質の改善剤は、上記したその他の成分の含有量（固形分量）がいずれも１質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以下であることがより好ましく、０．０１質量％以下であることが特に好ましい。

＜癌悪液質の改善剤の製造方法＞
　本発明の癌悪液質の改善剤の製造方法は、特に制限はない。
　歯髄由来幹細胞の培養上清を上記した方法で調製し、癌悪液質の改善剤を調製してもよい。続けて歯髄由来幹細胞の培養上清から微小粒子を精製して、本発明の癌悪液質の改善剤を調製してもよい。あるいは、商業的に購入して入手した歯髄由来幹細胞の培養上清から微小粒子を精製して、本発明の癌悪液質の改善剤を調製してもよい。さらには、廃棄処理されていた歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物を譲り受けて（またはその組成物を適宜精製して）、そこから微小粒子を精製して、本発明の癌悪液質の改善剤を調製してもよい。

　本発明の癌悪液質の改善剤の最終的な形態は、特に制限はない。例えば、本発明の癌悪液質の改善剤は、歯髄由来幹細胞の培養上清を容器に充填してなる形態；微小粒子を溶媒または分散媒とともに容器に充填してなる形態；微小粒子をゲルとともにゲル化して容器に充填してなる形態；歯髄由来幹細胞の培養上清または微小粒子を凍結および／または乾燥して固形化して製剤化または容器に充填してなる形態などが挙げられる。容器としては、例えば凍結保存に適したチューブ、遠沈管、バッグなどが挙げられる。凍結温度は、例えば－２０℃～－１９６℃とすることができる。

［癌悪液質の改善方法］
　本発明の癌悪液質の改善方法は、有効量の本発明の癌悪液質の改善剤を、癌悪液質を発症した対象に投与することを含む。

　本発明の癌悪液質の改善剤を、癌悪液質を発症した対象に投与する工程は特に制限はない。
　投与方法は、口腔、鼻腔または気道への噴霧または吸引、点滴、局所投与、点鼻薬などを挙げることができ、侵襲が少ないことが好ましい。局所投与の方法としては、注射が好ましい。また、皮膚表面に電圧（電気パルス）をかけることにより細胞膜に一時的に微細な穴をあけ、通常のケアでは届かない真皮層まで有効成分を浸透させられるエレクトロポレーションも好ましい。局所投与する場合、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与などを挙げることができ、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与または腹腔内投与であることがより好ましい。
　癌悪液質を発症した対象に投与された本発明の癌悪液質の改善剤は対象の体内を循環し、所定の組織に到達してもよい。
　投与回数および投与間隔は、特に制限はない。投与回数は１週間当たり１回以上とすることができ、５回以上であることが好ましく、６回以上であることがより好ましく、７回以上であることが特に好ましい。投与間隔は、１時間～１週間であることが好ましく、半日間～１週間であることがより好ましく、１日（毎日１回）であることが特に好ましい。ただし、投与対象の生物種や投与対象の症状に応じて、適宜調整することができる。
　本発明の癌悪液質の改善剤は、癌悪液質の改善剤を治療有効期間にわたって１週間に１回以上、癌悪液質を発症した対象に投与する用途であることが好ましい。投与対象がヒトである場合は、１週間当たりの投与回数は多い方が好ましく、治療有効期間にわたって１週間に５回以上投与することが好ましく、毎日投与することが好ましい。
　２．０×１０^９個／ｍｌの濃度の歯髄由来幹細胞の培養上清を用いる場合、マウスモデルでは、マウス１匹（約２５ｇ）当たり０．１～５ｍｌであることが好ましく、０．３～３ｍｌであることがより好ましく、０．５～１ｍｌであることがより特に好ましい。
　０．１×１０^８個／μｇの濃度の微小粒子を用いる場合、マウスモデルでは、マウス１匹（約２５ｇ）当たり１～５０μｇであることが好ましく、３～３０μｇであることがより好ましく、５～２５μｇであることがより特に好ましい。
　その他の動物への体重当たりの投与量の好ましい範囲は、モデルマウスへの体重（約２５ｇ）当たりの投与量から比例関係を用いて計算することができる。ただし、投与対象の症状に応じて、適宜調整することができる。

　本発明の癌悪液質の改善剤を投与する対象の動物（生物種）は、特に制限はない。本発明の癌悪液質の改善剤を投与する対象の動物は、哺乳動物、鳥類（ニワトリ、ウズラ、カモなど）、魚類（サケ、マス、マグロ、カツオなど）であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒトであっても、非ヒト哺乳動物であってもよいが、ヒトであることが特に好ましい。非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターであることがより好ましい。

　本発明の癌悪液質の改善剤は、従来公知の癌悪液質の改善剤と併用してもよい。

　以下に実施例と比較例または参考例とを挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。

［実施例１］
＜実験プロトコル＞
　図１に示した実験プロトコルにしたがって、癌悪液質モデルマウスに対してサンプルを投与した後、全採血を行い、悪液質の改善を評価した。

＜致死的な癌悪液質モデルマウスの調製＞
　正常マウスとして用いる７週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ）に対して、Ｂ１６－Ｆ１０－ｌｕｃ－Ｇ５　ｃｅｌｌｓ（Ｂ１６－ｌｕｃ　ｃｅｌｌｓ）を１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ皮下移植して、致死的な癌悪液質モデルマウスを調製した。この条件は、１８日間以内にマウスがすべて死亡する過酷な条件である。

＜歯髄由来幹細胞の培養上清の調製＞
　ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２混合培地の代わりにＤＭＥＭ培地を用い、その他は特許第６２９６６２２号の実施例６に記載の方法に準じて、ヒト乳歯歯髄幹細胞の培養上清を調製して、培養上清を分取した。初代培養ではウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加して培養し、継代培養では初代培養液を用いて培養した継代培養液の上清をＦＢＳが含まれないように分取し、乳歯歯髄幹細胞の培養上清を調製した。なお、ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地であり、Ｆ１２はハムＦ１２培地である。
　調製した歯髄由来幹細胞の培養上清を実施例１の癌悪液質の改善剤サンプルとした。

＜サンプルの投与＞
　癌悪液質モデルマウスを調製した処置日（ｄａｙ　０）と、処置日からの日数が７日後および１４日後に、癌悪液質モデルマウスの尾静脈から実施例１のサンプルをマウス１匹あたり０．５ｍｌ（エクソソームにして１．０ｘ１０^９個）投与した。

［実施例２］
＜エクソソームの調製＞
　実施例１で得られた歯髄由来幹細胞の培養上清から、歯髄由来幹細胞のエクソソームを以下の方法で精製した。
　乳歯歯髄幹細胞の培養上清（１００ｍＬ）を０．２２マイクロメーターのポアサイズのフィルターで濾過したのち、その溶液を、６０分間、４℃で１０００００×ｇで遠心分離した。上清をデカントし、エクソソーム濃縮ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。再懸濁サンプルを、６０分間１０００００×ｇで遠心分離した。再度ペレットを濃縮サンプルとして遠心チューブの底から回収した（およそ１００μｌ）。タンパク濃度は、マイクロＢＳＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。エクソソームを含む組成物（濃縮溶液）は、－８０℃で保管した。
　歯髄由来幹細胞の培養上清から精製したエクソソームを含む組成物を、実施例２の癌悪液質の改善剤サンプルとした。

　各実施例の癌悪液質の改善剤に含まれる微小粒子の平均粒径、濃度を評価した。
　各実施例の癌悪液質の改善剤に含まれる微小粒子の平均粒径は５０～１５０ｎｍであった。
　各実施例の癌悪液質の改善剤は１．０×１０^９個／ｍｌ以上の高濃度エクソソーム溶液であり、特に実施例１の癌悪液質の改善剤は２．０×１０^９個／ｍｌの高濃度エクソソーム溶液であった。
　また、得られた各実施例の癌悪液質の改善剤の成分を公知の方法で分析した。その結果、各実施例の癌悪液質の改善剤は、歯髄由来幹細胞の幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、シグレック９も含まないことがわかった。そのため、間葉系幹細胞の培養上清の有効成分であるＭＣＰ－１およびシグレック９ならびにこれらの類縁体とは異なる有効成分が、各実施例の癌悪液質の改善剤の有効成分であることがわかった。

　実施例１で調製した癌悪液質モデルマウスに対して、実施例１のサンプルの代わりに実施例２のサンプルを２０μｇ（エクソソームにして２．０ｘ１０^８個）投与した以外は実施例１と同様にして、サンプルの投与を行った。

［比較例１］
　実施例１で調製した癌悪液質モデルマウスに対して、実施例１のサンプルの代わりに比較例１のサンプルとして生理食塩水を同量の０．５ｍｌ投与した以外は実施例１と同様にして、サンプルの投与を行った。

［評価］
（体重減少の評価）
　癌悪液質モデルマウスを調製した処置日（ｄａｙ　０）と、処置日からの日数が７日後、１４日後および２１日後に、癌悪液質モデルマウスの体重を測定した。各群ｎ＝１０とし、例えば実施例１では、実施例１のサンプルを投与したマウス１０匹の平均体重を求めた。
　７週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ）を正常マウスの参考例として用いた。参考例１の正常マウスの体重をコントロール（１００％）として、各実施例および比較例のサンプルを投与したマウス１０匹の体重（％対コントロール）を求めた。得られた結果を図２に示した。
　図２の結果から、癌悪液質モデルマウスに対して、本発明の癌悪液質の改善剤を投与することにより、生理食塩水を投与した場合よりも、体重減少を抑制できることがわかった。
　この結果から、本発明の癌悪液質の改善剤は、悪液質の患者の体重減少を抑制することにより、骨格筋量なども維持して、貧血も改善し、ＱＯＬおよびＡＤＬを改善できると予測される。
　なお、このような体重減少の抑制の作用機序は、後述する実施例の結果から炎症性サイトカインの抑制やサイトカインストームの抑制などによるものと考えられる。

（血液中の血球などの評価）
　癌悪液質モデルマウスを調製した処置日（ｄａｙ　０）から２１日後に全採血を行った。その後、血液中の赤血球数（単位：万／μＬ）、ヘモグロビン値（血色素。単位ｇ／ｄＬ）、血小板数（単位：万／μＬ）、ヘマトクリット値（％）を定量した。得られた結果を表１に示した。
　表１の結果から、癌悪液質モデルマウスに対して、本発明の癌悪液質の改善剤を投与することにより、生理食塩水を投与した場合よりも、赤血球数、ヘモグロビン値（血色素）、血小板数およびヘマトクリット値を高く維持できることがわかった。
　また、生理食塩水を投与した比較例１の癌悪液質モデルマウスでは貧血様症状がみられたが、本発明の癌悪液質の改善剤を投与した癌悪液質モデルマウスでは貧血様症状は特にみられなかった。
　これらの結果から、本発明の癌悪液質の改善剤は、悪液質の患者の貧血を改善することにより、ＱＯＬおよびＡＤＬを改善できると予測される。

（血液中サイトカイン量の評価）
　癌悪液質モデルマウスを調製した処置日（ｄａｙ　０）から２１日後に全採血を行った。その後、血液中のＩＬ－６およびＴＮＦ－αの定量をＩｍｍｕｎｅ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　４８－Ｐｌｅｘ　Ｍｏｕｓｅ　ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（登録商標）　Ｐａｎｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で行った。あわせて、参考例１とした正常マウスについても、全採血を行い、血液中に含まれるサイトカインの定量を同様に行った。得られた結果を図３および図４に示した。
　図３および図４の結果から、癌悪液質モデルマウスに対して、本発明の癌悪液質の改善剤を投与することにより、生理食塩水を投与した場合よりも、血液中のＩＬ－６およびＴＮＦ－α濃度の増加を抑制できることがわかった。
　これらの結果から、本発明の癌悪液質の改善剤は、悪液質の患者の炎症性サイトカイン産生を抑制することにより、食欲を増加すること、または、腫瘍局所の炎症反応の抑制やサイトカインストームの抑制によって代謝異常を改善することなどにより、ＱＯＬおよびＡＤＬを改善できると予測される。

（致死的な癌悪液質マウスモデルの生存率の評価（１））
　癌悪液質モデルマウスを調製した処置日（ｄａｙ　０）から１日ごとに、各群（ｎ＝１０）のマウスの生存率を確認した。得られた結果を図５に示した。
　図５の結果から、癌悪液質モデルマウスに対して、本発明の癌悪液質の改善剤を実施例１および２のエクソソーム濃度で投与した場合、生理食塩水を投与した場合よりも若干ながら平均的な生存日数を伸ばすことができ、若干ながら生存率を高められることがわかった。

［実施例１１］
（致死的な癌悪液質マウスモデルの生存率の評価（２））
　癌悪液質モデルマウスに対して、実施例２のサンプル（歯髄由来幹細胞の培養上清から精製したエクソソーム）を２５μｇ（エクソソームにして２．５ｘ１０^８個）投与した以外は実施例２と同様にして、実施例１１の生存率の評価を行った。なお、実施例１１のサンプル投与量は、実施例２のサンプル投与量の１．２５倍となる。実施例１１はｎ＝１０で行った。得られた結果を図６に示した。
　図６の結果から、癌悪液質モデルマウスに対して、本発明の癌悪液質の改善剤を実施例１１のエクソソーム濃度まで高めて投与した場合、生理食塩水を投与した場合よりも平均的な生存日数を伸ばすことができ、生存率を高められることがわかった。

［実施例２１］
＜ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのサイトカインストーム抑制の確認＞
　実施例２の血液中のサイトカイン量の評価の結果を補強する目的で、癌悪液質モデルマウスの代わりにサイトカインストームを誘導した細胞モデルを用いて、本発明の癌悪質の改善剤のサイトカインストーム抑制の効果を確認した。
　ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ－ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を用いたサイトカインストームの誘導を行い、実施例２のサンプルによるサイトカインストーム抑制効果を、以下の方法でｉｎ　ｖｉｔｒｏで確認した。
　ヒトＰＭＢＣを培養し、サイトカインストーム誘導剤であるコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ－Ａ、富士フイルム和光純薬（株）製）にて刺激し、サイトカインストームを誘導した。
　この系に、実施例２のサンプルおよびコントロールである生理食塩水のうち１種類を添加する処理をし、ヒトＰＭＢＣの培養上清に含まれるサイトカインの定量をサイトカイン測定ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ製、商品名Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ）で行った。定量化したサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαである。
　実施例２のサンプルの添加は、ＰＭＢＣの細胞あたり、１００ｐａｒｔｉｃｌｅｓとなるように処理した。実施例２のサンプルでの処理後、４８時間後のサイトカイン量を測定した（Ｎ＝６）。
　得られた結果を下記表２に示した。

［実施例２２］
＜ｉｎ　ｖｉｖｏでのサイトカインストーム抑制の確認＞
　マウスモデルにおけるサイトカインストームの誘導を行い、実施例２のサンプルによるサイトカインストーム抑制効果を、以下の方法でｉｎ　ｖｉｖｏで確認した。
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の８週令のマウスを１群あたり６匹ずつ用いた。
　各マウスに対して、サイトカインストーム誘導剤であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）をマウスの腹腔内に２０ｍｇ／ｋｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔずつ投与した。なお、リポポリサッカライド（ＬＰＳ。エンドトキシン）の投与により炎症性サイトカインの濃度上昇などの敗血症の症状が惹起され、サイトカインストームを誘導できる（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ　（２０２０）　１４４，１０９８６５）。
　リポポリサッカライド投与直後に、各マウスの尾静脈から実施例２のサンプル（超遠心法によって精製）およびコントロールである生理食塩水のうち１種類を、それぞれ同量の１０μｇ投与した。なお、実施例２１のサンプル投与量は、実施例２のサンプル投与量の０．５倍となる。
　２４時間後に全採血を行い、マウスのサイトカインストームにおける血清を分取した。マウスのサイトカインストームにおける血清に含まれるサイトカインの定量をＩｍｍｕｎｅ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　４８－Ｐｌｅｘ　Ｍｏｕｓｅ　ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（登録商標）　Ｐａｎｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で行った。あわせて、リポポリサッカライドを投与する前の正常マウスについても、全採血を行い、血清に含まれるサイトカインの定量を同様に行った。定量化したサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαである。
　得られた結果を下記表３に示した。

　上記表２および表３より、本発明の癌悪液質の改善剤である実施例２のサンプルは、サイトカインストームを誘導されて各サイトカイン量が多くなった動物（マウス）に対して投与されることで、生理食塩水を投与したコントロールと比較して、血液中および／または血清中のサイトカイン量をＩＬ－６およびＴＮＦα以外のサイトカインについても顕著に抑制でき、サイトカインストームを抑制できることがわかった。これらの結果から、本発明の癌悪液質の改善剤は、悪液質の患者の炎症性サイトカインやサイトカインストームを抑制することにより、食欲を増加し、代謝異常を改善することなどにより、体重減少、貧血、低栄養状態を改善し、ＱＯＬおよびＡＤＬを改善できると予測される。

［比較例Ａ～Ｄ］
＜実施例１および２の歯髄由来幹細胞の培養上清およびエクソソームと、臍帯由来幹細胞の培養上清またはエクソソームとの比較＞
　マウス由来マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７の活性化をＬＰＳの刺激により惹起したのち、幹細胞培養上清またはエクソソームを添加することで、サイトカインストームの主原因となる活性化マクロファージからのＩＬ－６産生を抑制するかを検討した。
　培養液としてＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＤＳＤＳＭ１０１）を用いた。ＲＡＷ２６４．７（１．２×１０^６／ｍＬ、ＴＩＢ－７１、ＡＴＣＣから購入）を９６ウェルプレートに準備して培養液中で培養し、９０％サブコンフルエントになった時点で、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、ＡＬＸ－５８１－００７－Ｌ００２、コスモバイオ株式会社製）および各実施例および各比較例の癌悪液質の改善剤サンプルを添加し、１８時間、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。培養後に培養液中に遊離したＩＬ－６量をマウスＩＬー６測定ＥＬＩＳＡキット（ＫＥ１０００７、コスモバイオ株式会社製）により定量した。得られた実測値（Ｎ＝２の平均値）を図７に示した。
　また、コントロールとして、ＬＰＳを投与しない未処理の細胞（比較例Ａ）、ＬＰＳのみを投与した細胞（比較例Ｂ）を用いて、癌悪液質の改善剤サンプルを添加せずに同様の試験を行った結果も図７に示した。
　癌悪液質の改善剤サンプルとして、本願明細書の実施例１で用いた癌悪液質の改善剤（歯髄由来幹細胞培養上清）、本願明細書の実施例２で用いた癌悪液質の改善剤（歯髄由来幹細胞エクソソーム）、比較例Ｃである臍帯由来幹細胞培養上清、および臍帯由来幹細胞培養上清から［００５３］に準じて調製した比較例Ｄのエクソソーム（臍帯由来幹細胞エクソソーム）を用いた。各エクソソームは超遠心法にて分離し、マウス由来マクロファージ細胞あたり１０００個のエクソソームを用いた。

　図７より、歯髄由来幹細胞の培養上清を用いた実施例１の癌悪液質の改善剤は、臍帯由来幹細胞の培養上清を用いた場合（比較例Ｃ）と比較して、サイトカインストームを誘発したインビトロの細胞のサイトカイン抑制において顕著に有利な効果を示した。また、歯髄由来幹細胞の培養上清から得られた微小粒子（エクソソーム）を用いた実施例２の癌悪液質の改善剤は、臍帯由来幹細胞の培養上清から得られた微小粒子（エクソソーム）を用いた場合（比較例Ｄ）と比較して、サイトカインストームを誘発したインビトロの細胞のサイトカイン抑制において顕著に有利な効果を示した。
　ここで、インビトロの実施例２１は、インビボの実施例２の癌悪液質モデルマウスの血液中のサイトカイン量（ＩＬ－６など）の抑制の評価結果を補強する目的で、癌悪液質モデルマウスの代わりにサイトカインストームを誘導した動物細胞を用いて、本発明の癌悪液質の改善剤のサイトカインストーム抑制の効果をインビトロで確認したものである。すなわち、このようにサイトカインストームを誘発したインビトロの細胞に対してＩＬ－６などのサイトカイン抑制の評価をすることで、癌悪液質モデルマウスなどインビボでの動物の癌悪液質の改善の効果を評価できること（炎症性サイトカインやサイトカインストームを抑制すること、またそれにより食欲を増加し、代謝異常を改善することなどにより、体重減少、貧血、低栄養状態を改善し、ＱＯＬおよびＡＤＬを改善できる。
　したがって、実施例１または２と、比較例Ａ～Ｄとの比較試験の結果（サイトカインストームを誘発したインビトロの細胞に対してＩＬ－６などのサイトカイン抑制の評価結果）から、歯髄由来幹細胞の培養上清やそこから得られるエクソソームは、臍帯由来幹細胞の培養上清やそこから得られるエクソソームと比較して、癌悪液質を顕著に改善できる効果を奏することがわかった。

Claims (11)

1. 　癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、
   　歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物であり、
   　前記培養上清が、前記歯髄由来幹細胞に由来する微小粒子を含む、癌悪液質の改善剤。
2. 　癌悪液質を発症した対象に投与される用途の癌悪液質の改善剤であって、
   　歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物であり、
   　前記組成物が、前記培養上清から前記微小粒子を除いたものを含まない、癌悪液質の改善剤。
3. 　前記微小粒子がエクソソームである、請求項１または２に記載の癌悪液質の改善剤。
4. 　癌悪液質を発症した対象の体重減少を治療するための用途である、請求項１～３のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤。
5. 　前記対象の体重減少が過去１４日間に２％以上である、請求項４に記載の癌悪液質の改善剤。
6. 　癌悪液質を発症した対象の貧血を治療するための用途である、請求項１～５のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤。
7. 　癌悪液質を発症した対象の赤血球数、ヘモグロビン値およびヘマトクリット値の減少を抑制するための用途である、請求項６に記載の癌悪液質の改善剤。
8. 　癌悪液質を発症した対象の血中のＩＬ－６濃度およびＴＦＮ－α濃度の増加を抑制するための用途である、請求項１～７のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤。
9. 　前記癌悪液質の改善剤を治療有効期間にわたって１週間に１回以上、前記癌悪液質を発症した対象に投与する用途である、請求項１～８のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤。
10. 　有効量の請求項１～９のいずれか一項に記載の癌悪液質の改善剤を、癌悪液質を発症した対象に投与することを含む、癌悪液質の改善方法。
11. 　前記癌悪液質を発症した対象が、ヒト以外の動物である、請求項１０に記載の癌悪液質の改善方法。

Images