CN117355316A - 癌症恶病质的改善剂和癌症恶病质的改善方法 - Google Patents

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Abstract

一种新型的癌症恶病质的改善剂，其是对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，该癌症恶病质的改善剂是包含来自牙髓的干细胞的培养上清的组合物，其中，培养上清包含来源于上述来自牙髓的干细胞的微小颗粒；以及癌症恶病质的改善方法。

Description

癌症恶病质的改善剂和癌症恶病质的改善方法
技术领域
本发明涉及癌症恶病质(恶液质)的改善剂和癌症恶病质的改善方法。
背景技术
经常被称作癌症性食欲不振-恶病质综合征(CACS)的癌症恶病质是癌症晚期的多因子性症状。癌症恶病质的症状特别是体重减少(体重减轻)，此外还可列举：低营养状态、贫血等。
作为治疗癌症晚期的恶病质的方法，要求即使不延长存活期间，也要通过改善或缓解这些症状来尽可能地提高存活期间的QOL(Quality ofLife；生活质量)或ADL(日常生活活动；Activities ofDaily Living)。
作为治疗恶病质的方法，专利文献1中记载了治疗患者的恶病质的方法，该方法包括：在治疗有效期间对人癌症患者按1天1次给予治疗有效量的阿那莫林(Anamorelin)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2019-535691号公报；
专利文献2：日本特表2019-514416号公报；
专利文献3：日本特开2018-154655号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
另一方面，研究了使用阿那莫林以外的物质进行恶病质的治疗的方法。此外，在专利文献1中还记载了使用醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、褪黑素(Melatonin)、奥斯塔琳(Ostarine)等小分子化合物进行恶病质的治疗。另外，在专利文献2和3中公开了包含由间充质干细胞分泌的细胞外小泡(Extracellular Vesicles，细胞外囊泡)的药物组合物，作为适用的疾病，示例了恶病质(专利文献2的权利要求6、专利文献3的[0210]等)。
本发明所要解決的课题在于：提供新型的癌症恶病质的改善剂。
用于解决课题的手段
本发明人发现了：来自牙髓的干细胞的培养上清、或来源于培养上清的外来体等微小颗粒可改善癌症恶病质模型小鼠的恶病质的各种症状。
需要说明的是，在专利文献2和3中没有记载来自牙髓的干细胞对恶病质的影响。在专利文献2的实施例中，在[0227]中记载了DP-MSC(来自牙髓的干细胞的外来体)的效果低，但其表现与UC-(来自脐带的干细胞)和CH-MSC(来自胎盘纤毛膜的干细胞的外来体)相同，没有使用来自牙髓的干细胞进行恶病质的研究的实施例。在专利文献3中没有使用由来自牙髓的干细胞的培养上清而得到的外来体的实施例。
具体而言，本发明和本发明的优选构成如下。
[1]癌症恶病质的改善剂，其是对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，
该癌症恶病质的改善剂是包含来自牙髓的干细胞的培养上清的组合物，
培养上清包含来源于来自牙髓的干细胞的微小颗粒。
[2]癌症恶病质的改善剂，其是对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，
该癌症恶病质的改善剂是包含来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物，
组合物不包含从培养上清中去除了微小颗粒后的物质。
[3][1]或[2]所述的癌症恶病质的改善剂，其中，微小颗粒为外来体。
[4][1]～[3]中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于治疗发生癌症恶病质的对象的体重减少。
[5][4]所述的癌症恶病质的改善剂，其中，对象的体重减少在过去14天内为2％以上。
[6][1]～[5]中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于治疗发生癌症恶病质的对象的贫血。
[7][6]所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于抑制发生癌症恶病质的对象的红细胞数、血红蛋白值和血细胞比容值的减少。
[8][1]～[7]中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于抑制发生癌症恶病质的对象的血中的IL-6浓度和TFN-α浓度的增加。
[9][1]～[8]中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为对发生癌症恶病质的对象在治疗有效期间每周给予1次以上的癌症恶病质的改善剂。
[10]癌症恶病质的改善方法，其包括对发生癌症恶病质的对象给予有效量的[1]～[9]中任一项所述的癌症恶病质的改善剂。
[11][10]所述的癌症恶病质的改善方法，其中，发生癌症恶病质的对象为人以外的动物。
发明效果
根据本发明，可提供新型的癌症恶病质的改善剂。
附图说明
[图1]图1是用于对癌症恶病质模型小鼠给予样品以评价癌症恶病质的改善的实验方案的概略图。
[图2]图2是显示在对癌症恶病质模型小鼠给予实施例1和2的癌症恶病质的改善剂或比较例的样品(生理盐水)的情况下，从处置日起的天数与体重(％相对于用作对照的正常小鼠)的关系的图。
[图3]图3是显示在正常小鼠的情况下和对癌症恶病质模型小鼠给予了实施例1和2的癌症恶病质的改善剂或比较例的样品(生理盐水)的情况下，血液中IL-6浓度的图。
[图4]图4是显示在正常小鼠的情况下和对癌症恶病质模型小鼠给予了实施例1和2的癌症恶病质的改善剂或比较例的样品(生理盐水)的情况下，血液中TFN-α浓度的图。
[图5]图5是显示在正常小鼠的情况下和对癌症恶病质模型小鼠给予实施例1和2的癌症恶病质的改善剂或比较例的样品(生理盐水)的情况下，从处置日起的天数与存活率的关系的图。
[图6]图6是显示在正常小鼠的情况下和对癌症恶病质模型小鼠将实施例2的癌症恶病质改善剂的给药量设为1.25倍的情况下或给予比较例的样品(生理盐水)的情况下，从处置日起的天数与存活率的关系的图。
[图7]图7是显示对于由LPS的刺激引起的、成为细胞因子风暴的主要原因的激活(活化)巨噬细胞，在未处理的情况下(比较例A)和给予实施例1和2的癌症恶病质的改善剂或比较例的样品(比较例B的生理盐水、比较例C和D的来自脐带的干细胞的培养上清或外来体)的情况下，培养后游离到培养液中的IL-6浓度的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。以下记载的构成要件的说明有时是根据代表性的实施方式或具体例子而进行的说明，但本发明并不限定于这样的实施方式。需要说明的是，本说明书中用“～”表示的数值范围是指包括“～”前后所记载的数值作为下限值和上限值的范围。
[癌症恶病质的改善剂]
本发明的癌症恶病质改善剂的第1方案为对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，其是包含来自牙髓的干细胞的培养上清的组合物，培养上清包含来源于上述来自牙髓的干细胞的微小颗粒。
本发明的癌症恶病质改善剂的第2方案为对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，其是包含来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物，组合物不包含从培养上清中去除了微小颗粒后的物质。
从提高癌症恶病质的改善效果的观点来看，本发明的癌症恶病质的改善剂更优选为包含来自牙髓的干细胞的培养上清的组合物，特别优选为来自牙髓的干细胞的培养上清。
以下，对本发明的癌症恶病质改善剂的优选方案进行说明。
＜癌症恶病质的定义＞
癌症恶病质是指发生癌症的对象的恶病质。需要说明的是，本发明的癌症恶病质的改善剂虽然是改善癌症恶病质的改善剂，但也可改善除癌症恶病质以外的恶病质。
“恶病质”可通过本发明的主要实施方案或下位实施方案的任一种方案中的各种方法来定义。特别是可采用以下定义的任一种：
(1)以食欲不振、早期饱腹感、体重减少、肌肉疲劳、低营养状态、贫血和浮肿中的1种或它们的组合为特征的临床综合征，但优选由这些症状中的3种、4种、5种或全部定义的临床综合征。
(2)在过去6个月内5％以上的体重减少和/或小于20kg/m2的体质指数。
(3)BMI＜20、且在过去3或6个月内超过2％的体重减少。
(4)在与肌少症(Sarcopenia)一致的四肢骨骼肌指数(男性＜7.26kg/m2；女性＜5.45kg/m2)下，在过去3或6个月内体重减少＞2％。
(5)以重度的体重、脂肪和肌肉的减少、以及由基础疾病引起的蛋白质异化(分解代谢)的增加为特征的多因子综合征。
关于体重减少，在本发明的癌症恶病质的改善剂为用于治疗发生癌症恶病质的对象的体重减少的用途的情况下，优选可治疗对象的体重减少在过去14天内为2％以上的对象。
早期饱腹感是指摄取食物时早期体验到饱满感或饱腹感的倾向。
疲劳通常被定义为疲劳感(Feeling of Weariness)、疲倦(Tiredness)或能量不足。还可从患者评分的观点来定义疲劳，患者评分涉及各种评价或自我评价，包括设计成对疲劳感、疲倦或能量不足进行排序的问题。具体评价包括27项的一般癌症治疗功能评价(Functional Assessment of Cancer Therapy-General)(FACT-G)和FACIT-F，该FACIT-F含有由13个问题构成的疲劳亚标度(Fatigue Subscale)，评分为0-4，并可测定患者对疲劳和贫血相关担心的认知。
＜癌症恶病质的症状改善＞
本发明中，即使在癌症恶病质的症状中，也特别优选可改善体重减少、低营养状态和贫血。要求通过改善这些症状来提高存活期间的QOL、ADL。特别是，在发生癌症恶病质的对象为癌症晚期的情况下，优选在死亡之前抑制、缓解或控制体重减少、低营养状态、贫血，同时安详地迎接死期。
以下，结合癌症恶病质的改善剂的作用机制进行说明。
＜癌症恶病质的改善剂的作用机制＞
(血液中细胞因子的抑制)
通过抑制血液中细胞因子，即使在恶病质的症状中也可改善体重减少、贫血和低营养状态。
细胞因子是指参与炎症反应和免疫应答的蛋白的总称，已知有数百种以上。细胞因子各自具有丰富多彩的活性，它们均衡、协调地相互作用，从而维持或调节生物功能。通常，通过对感染症等的免疫应答而产生/释放细胞因子，但在癌症恶病质中，由肿瘤细胞产生/释放细胞因子是无秩序的，血液中的多种细胞因子浓度会异常上升。特别是炎性细胞因子参与癌症恶病质的病态，特别是IL-1、IL-6、TNFα、IFN-γ较为重要。此外，作为应被抑制的细胞因子的例子，可列举：IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IL-18、MIG、MIP-1α等。由肿瘤细胞释放的细胞因子通过促进肿瘤局部的炎症反应而激活宿主的免疫/炎症细胞，引起所谓的细胞因子风暴。在癌症恶病质中，骨骼肌减少引起的体重减少的病态是特征性的。
IL-1是参与防御炎症或感染的炎性细胞因子。
IL-2是参与细胞免疫的细胞因子。IL-2的过度表达关系到作为T细胞的亚群的调节性T细胞(Treg)的选择性的增加。Treg通过抑制其他细胞的免疫应答来发挥维持外周耐受(Peripheral Tolerance)的作用。认为外周耐受的破绽对于人而言会引起自身免疫疾病。因此，认为Treg的免疫抑制能力可防止自身免疫疾病的发病。另外，Treg还与癌症有关，实体瘤和血液恶性肿瘤伴有Treg数的增加(参照日本特开2020-002154号公报的[0007])。
IL-4是参与由辅助性T细胞向Th2(辅助性T2型)亚群分化的非重复细胞因子，Th2促进由未成熟B细胞向产生IgE的浆细胞的分化。在过敏性哮喘中IgE水平上升。因此，IL-4与过敏性哮喘的发病有关(参照日本特开2020-002154号公报的[0008])。
IL-6是B细胞分化因子、B细胞刺激因子-2、肝细胞刺激因子、杂交瘤生长因子、以及浆细胞瘤生长因子。IL-6是代表性的炎性细胞因子，另外，IL-6还是参与急性炎症应答的控制、包括B和T细胞分化的特定的免疫应答的调节、骨代谢、血小板产生、上皮增殖、月经、神经细胞分化、神经保护、年龄增加、癌症、在阿尔茨海默病中发生的炎症反应等的多功能细胞因子。认为IL-6对包括疲劳、恶病质、自身免疫疾病、骨骼系统疾病、癌症、心脏疾病、肥胖、糖尿病、哮喘、阿尔茨海默病和多发性硬化症在内的多种疾病和障碍的发展起作用(参照日本特开2019-047787号公报的[0002]～[0005])。
IL-10是在T细胞、巨噬细胞、树状细胞中产生的160个氨基酸残基的同源二聚体的蛋白。已知IL-10参与巨噬细胞功能抑制、B细胞激活等(参照日本再表2018/212237号公报的[0052])。另外，IL-10是抗炎性细胞因子。
IL-17是在CD4记忆T细胞、Th17细胞中产生的132个氨基酸残基的蛋白。已知IL-17参与由巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生炎性细胞因子等(参照日本再表2018/212237号公报的[0053])。
若由于病毒感染或癌活性氧等使细胞受到强应激，则释放IL-18。
IFN(干扰素)具有抑制病毒复制、激活免疫细胞(例如天然杀伤细胞和巨噬细胞等)的功能等。IFN分为I型IFN、II型IFN和III型IFN。其中，作为II型IFN的IFNγ是由已激活的免疫细胞产生的多面的细胞因子，可诱发巨噬细胞活性的增加、MHC分子表达的增加和NK细胞活性的增加等细胞应答(参照日本特表2020-522254号公报的[0209])。
TNF(TumorNecrosis Factor；肿瘤坏死因子)是代表性的炎性细胞因子。作为TNF，已知有TNFα、TNFβ和LTβ。其中，TNFα介导包括二次淋巴器官的结构和功能的组织化、凋亡和抗肿瘤活性、病毒复制的抑制、免疫调节以及炎症在内的几种重要的生理机能。另外，TNF在自身免疫疾病的病理发生、急性期反应、败血症性休克、发热和恶病质中也起到重要作用(参照日本特开2020-079306号公报的[0004])。
MIG是掌管1型免疫应答的细胞因子。由巨噬细胞或上皮细胞、血管内皮细胞等产生，使Th1细胞或CD8T细胞、一部分巨噬细胞等游走于炎症部位。
MIP-1α是由巨噬细胞或成纤维细胞、上皮细胞、血管平滑肌细胞等根据炎症产生的细胞因子。
这些之中，本发明的癌症恶病质的改善剂优选为用于抑制发生癌症恶病质的对象的血中的IL-6浓度和TFN-α浓度的增加的用途。
(血液中的血细胞等的量的改善)
本发明的癌症恶病质的改善剂优选可改善血液中的血细胞等的量，更优选可改善红细胞数、血红蛋白值(血色素数)、血小板数、血细胞比容值。本发明的癌症恶病质的改善剂特别优选为用于抑制发生癌症恶病质的对象的红细胞数、血红蛋白值和血细胞比容值的减少的用途。通过改善这些，使低营养状态、贫血得到改善。
(癌症的类型)
本发明的癌症恶病质的改善剂可在任意类型的癌症中实施，这些方法分别优选在通常伴随癌症恶病质的类型的癌症中实施。有关联的癌症的非限定性例子例如包括：乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、肾癌、甲状腺癌和引起甲状旁腺功能亢进的其他癌、腺癌、白血病(例如，慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、头颈部癌、食道癌、胃癌、大肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、宫颈癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、肉瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤、扁平上皮癌、包括原发性骨癌(例如，骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、成釉细胞瘤(Adamantinoma，釉质瘤)、巨细胞瘤和脊索瘤)和继发性(转移性)骨癌两者的骨癌、软组织肉瘤、基底细胞癌、血管肉瘤(Angiosarcoma)、血管肉瘤(Hemangiosarcoma)、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤(骨源性肉瘤)、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、睾丸癌、子宫癌、消化道癌、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头癌、Waldenstroma巨球蛋白血症、乳头腺癌、囊腺癌、支气管癌、绒毛癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、上皮癌、神经胶质瘤、神经胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤、视网膜母细胞瘤、髓样癌、胸腺瘤等。在优选的实施方案中，癌为非小细胞肺癌(NSCLC)、进一步优选为无法切除的III期或IV期的NSCLC。
＜癌症恶病质的改善剂的成分＞
本发明的癌症恶病质改善剂的有效成分是来自牙髓的干细胞的培养上清，或者是来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒。
与以往的可用作癌症恶病质改善剂的组合物相比，本发明的癌症恶病质的改善剂具有以下优点：容易大量生产，可有效利用以往作为产业废弃物等废弃的干细胞的培养液，降低干细胞培养液的废弃成本等。特别是在来自牙髓的干细胞的培养上清为来自人牙髓的干细胞的培养上清的情况下，还具有以下优点：在对人适用本发明的癌症恶病质改善剂的情况下，在免疫学上等观点上的安全性高、伦理性的问题也少。在来自牙髓的干细胞的培养上清为来自源于癌症恶病质的患者的牙髓的干细胞的培养上清的情况下，在对该患者适用本发明的癌症恶病质改善剂时，安全性进一步提高，伦理性的问题也会减少。
由于本发明的癌症恶病质的改善剂是来源于来自牙髓的干细胞的培养上清，所以也被用于修复医疗的用途。特别是包含来源于来自牙髓的干细胞等的培养上清的微小颗粒的组合物优选用于修复医疗的用途。这里，已知在以干细胞移植为前提的再生医疗中，干细胞并不是再生的主角，而是干细胞所产生的液体成分与自身的干细胞一起修复脏器。以往的干细胞移植所伴随的癌化、标准化、给药方法、保存性、培养方法等困难问题得到解决，利用使用了来自牙髓的干细胞的培养上清或来自其的微小颗粒的组合物可进行修复医疗。与干细胞移植相比，由于在使用本发明的癌症恶病质改善剂的情况下没有移植细胞，所以不易发生肿瘤化等，可谓是更安全的。另外，本发明的癌症恶病质的改善剂具有可使用一定标准化的品质的改善剂的优点。由于可选择大量生产或有效的给药方法，所以可低成本地进行利用。
(来自牙髓的干细胞的培养上清)
-来自牙髓的干细胞-
对来自牙髓的干细胞等的培养上清没有特别限制。
来自牙髓的干细胞等的培养上清优选实质上不含血清。例如，来自牙髓的干细胞等的培养上清优选血清含量为1质量％以下、更优选为0.1质量％以下、特别优选为0.01质量％以下。
来自牙髓的干细胞可来源于人，也可来源于人以外的动物。作为人以外的动物，可列举：与后述的给予本发明的癌症恶病质改善剂的对象的动物(生物种类)同样的动物，优选哺乳动物。
对用于培养上清的来自牙髓的干细胞没有特别限制。可使用脱落乳牙牙髓干细胞(Stem Cells From ExfoliatedDeciduous Teeth)、或通过其他方法获取的乳牙牙髓干细胞、或恒牙牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells；DPSC)。除人乳牙牙髓干细胞或人恒牙牙髓干细胞以外，还可使用猪乳牙牙髓干细胞等来源于人以外的动物的来自牙髓的干细胞。
来自牙髓的干细胞除产生外来体以外，还可产生血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)-1和-3、TGF-α、KGF、HBEGF、SPARC、其他的生长因子、趋化因子等各种细胞因子。另外，还可产生其他的多种生理活性物质。
在本发明中，用于来自牙髓的干细胞的培养上清的来自牙髓的干细胞特别优选为包含大量蛋白的来自牙髓的干细胞，优选使用乳牙牙髓干细胞。即，在本发明中，优选使用乳牙牙髓干细胞的培养上清。
用于本发明的来自牙髓的干细胞只要可实现目标处置即可，可以是天然的干细胞，也可以是基因修饰后的干细胞。
特别是，在本发明中可使用来自牙髓的干细胞的永生化干细胞。通过使用实质上可无限增殖的永生化干细胞，可使干细胞的培养上清中所含的生物因子的量和组成长期稳定。对来自牙髓的干细胞的永生化干细胞没有特别限制。永生化干细胞优选为未癌化的永生化干细胞。来自牙髓的干细胞的永生化干细胞可通过向来自牙髓的干细胞中单独或组合添加以下的小分子化合物(抑制剂)进行培养来调制。
对TGFβ受体抑制剂没有特别限定，只要是具有抑制转化生长因子(TGF)β受体功能的作用的物质即可，例如可列举：2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯硫基氨基甲酰基-1H-吡唑(A-83-01)、2-[(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基]吡啶-4-基胺(SD-208)、3-[(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(以上，Merck公司)、SB431542(Sigma-Aldrich公司)等。可优选列举A-83-01。
对ROCK抑制剂没有特别限定，只要是具有抑制Rho结合激酶功能的作用的物质即可。作为ROCK抑制剂，例如可列举：GSK269962A(Axonmedchem公司)、盐酸法舒地尔(FasudilHydrochloride)(Tocris Bioscience公司)、Y-27632、H-1152(以上，富士胶片和光纯药株式会社)等。可优选列举Y-27632。
对GSK3抑制剂没有特别限定，只要是抑制GSK-3(Glycogen Synthase Kinase 3(糖原合酶激酶3)：糖原合成酶3)的物质即可，可列举：A 1070722、BIO、BIO-丙酮肟(以上，TOCRIS公司)等。
对MEK抑制剂没有特别限定，只要是具有抑制MEK(MAP激酶-ERK激酶)功能的作用的物质即可，例如可列举：AZD6244、CI-1040(PD184352)、PD0325901、RDEA119(BAY86-9766)、SL327、U0126-EtOH(以上，Selleck公司)、PD98059、U0124、U0125(以上，Cosmo Bio株式会社)等。
在将本发明的癌症恶病质的改善剂用于再生医疗的情况下，从再生医疗等安全性保障法的要求出发，包含来自牙髓的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清或来自其的微小颗粒的组合物为不含除来自牙髓的干细胞等以外的其他体干细胞的方案。本发明的癌症恶病质的改善剂可含有除来自牙髓的干细胞等以外的间充质干细胞或其他体干细胞，但优选不含有。
作为除间充质干细胞以外的其他体干细胞的例子，包括来自真皮系、消化系、骨髓系、神经系等的干细胞，但并不限于这些。作为真皮系的体干细胞的例子，包括上皮干细胞、毛囊干细胞等。作为消化系的体干细胞的例子，包括胰腺(整体的)干细胞、肝干细胞等。作为(除间充质干细胞以外的)骨髓系的体干细胞的例子，包括造血干细胞等。作为神经系的体干细胞的例子，包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
本发明的癌症恶病质的改善剂可含有体干细胞以外的干细胞，但优选不含有。作为体干细胞以外的干细胞，包括胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)。
-来自牙髓的干细胞的培养上清的调制方法-
对来自牙髓的干细胞或其永生化干细胞的培养上清的调制方法没有特别限制，可采用以往的方法。
来自牙髓的干细胞等的培养上清是培养来自牙髓的干细胞而得到的培养液。例如，通过在培养来自牙髓的干细胞之后分离去除细胞成分，可得到可用于本发明的培养上清。可使用适当施行了各种处理(例如，离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等)的培养上清。特别是，培养上清优选为对培养来自牙髓的干细胞而得到的培养液进行去除来自牙髓的干细胞或其死细胞的程度的离心分离处理而得到的、含有微小颗粒的培养上清。在进行离心分离处理后，可分取含有大量微小颗粒的特定组分来调制培养上清。
用于得到来自牙髓的干细胞的培养上清的来自牙髓的干细胞可通过常规方法筛选，可根据细胞的大小或形态、或作为粘附性细胞来筛选。可从由脱落的乳牙或恒牙采集的牙髓细胞中作为粘附性细胞或其传代细胞来筛选。在来自牙髓的干细胞的培养上清中，可使用培养所筛选的干细胞而得到的培养上清。
需要说明的是，“来自牙髓的干细胞等的培养上清”优选为培养来自牙髓的干细胞等而得到的、不含其细胞本身的培养液。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清在其一个方案中优选作为整体也不含细胞(无论细胞的种类如何)。该方案的组合物根据该特征自然地使来自牙髓的干细胞本身与包含来自牙髓的干细胞的各种组合物明确地区别开来。该方案的典型例子是：不含来自牙髓的干细胞、而仅由来自牙髓的干细胞的培养上清构成的组合物。
本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清可包含来自乳牙牙髓的干细胞和来自成人牙髓的干细胞两者的培养上清。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清优选包含来自乳牙牙髓的干细胞的培养上清作为有效成分，更优选包含50质量％以上、优选包含90质量％以上。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清更特别优选为仅由来自乳牙牙髓的干细胞的培养上清构成的组合物。
在用于得到培养上清的来自牙髓的干细胞的培养液中，可使用基础培养基、或在基础培养基中添加了血清等的培养液等。需要说明的是，作为基础培养基，除Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)以外，还可使用Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(GIBCO公司等)、HamF-12培养基(HamF12)(SIGMA公司、GIBCO公司等)、RPMI1640培养基等。另外，作为可添加在培养基中的成分的例子，可列举：血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)、血清替代品(Knockout SerumReplacement(KSR：敲除血清替代品)等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、各种维生素、各种矿物质。
然而，为了调制不含血清的“来自牙髓的干细胞的培养上清”，关于贯穿整个过程或最后或从最后起的数次的传代培养，可使用无血清培养基。例如，通过用不含血清的培养基(无血清培养基)培养来自牙髓的干细胞，可调制不含血清的来自牙髓的干细胞的培养上清。进行1次或多次的传代培养，通过将最后或从最后起的数次的传代培养用无血清培养基进行培养，也可得到不含血清的来自牙髓的干细胞等的培养上清。另一方面，通过利用透析或基于柱的溶剂置换等从回收的培养上清中去除血清，也可得到不含血清的来自牙髓的干细胞的培养上清。
在用于得到培养上清的来自牙髓的干细胞的培养中，可直接适用通常所采用的条件。关于来自牙髓的干细胞的培养上清的调制方法，除了根据干细胞的种类适当调整干细胞的分离和选拔步骤以外，可与后述的细胞培养方法同样进行。本领域技术人员可根据来自牙髓的干细胞的种类适当进行来自牙髓的干细胞的分离和选拔。
另外，在来自牙髓的干细胞的培养中，为了大量生产外来体，可适用特别的条件。作为特别的条件，例如可列举：低温条件、低氧条件、微重力条件等与任何刺激物进行共培养的条件等。
本发明中用于调制外来体的来自牙髓的干细胞的培养上清除了包含来自牙髓的干细胞的培养上清以外，还可包含其他成分，但优选实质上不含其他成分。
然而，可将用于调制外来体的各种添加剂添加至来自牙髓的干细胞的培养上清中，之后再进行保存。
(微小颗粒)
微小颗粒例如通过从来自牙髓的干细胞的分泌、出芽或分散等，从来自牙髓的干细胞导出，并浸出、释放或脱落到细胞培养基中。因此，微小颗粒包含在来自牙髓的干细胞的培养上清中。
来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒可以以包含在培养上清中的状态使用，或者可以以由培养上清纯化的状态使用。微小颗粒优选为由培养上清纯化的微小颗粒。
微小颗粒的来源可通过已知方法判别。例如，可按照J Stem Cell Res Ther(2018)8：2中记载的方法判别微小颗粒来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自骨髓的干细胞、来自脐带的干细胞等中的哪一种干细胞。具体而言，可根据微小颗粒的miRNA模式(miRNA pattern)判别各自的微小颗粒的来源。
微小颗粒优选为选自外来体(Exosome)、微小泡、膜颗粒、膜小泡、核外颗粒体(Ectosome)和外囊泡(Exovesicle)或微囊泡(Microvesicle)的至少1种，更优选为外来体。
微小颗粒的直径优选为10～1000nm、更优选为30～500nm、特别优选为50～150nm。
另外，希望在微小颗粒的表面存在CD9、CD63、CD81等称为四旋蛋白(Tetraspanin)的分子，其可以是单独的CD9、单独的CD63、单独的CD81，或者可以是它们中的2种或3种的任意组合。
以下，有时对使用外来体作为微小颗粒的情况下的优选方案进行说明，但用于本发明的微小颗粒并不限定于外来体。
外来体优选为在多胞体与原生质膜融合时由细胞释放的细胞外小泡。
外来体的表面优选包含来源于来自牙髓的干细胞的细胞膜的脂质和蛋白。
在外来体的内部优选包含核酸(微小RNA、信使RNA、DNA等)和蛋白等来自牙髓的干细胞的细胞内物质。
已知外来体被用于通过从某个细胞向其他细胞运输遗传信息而进行细胞与细胞的通信。外来体可容易地追踪，可靶向至特异性区域。
-微小颗粒的含量-
本发明的癌症恶病质的改善剂对微小颗粒的含量没有特别限制。本发明的癌症恶病质的改善剂优选包含0.5×108个以上的微小颗粒、更优选包含1.0×108个以上、特别优选包含2.0×108个以上、更特别优选包含2.5×108个以上、更进一步特别优选包含1.0×109个以上。
另外，本发明的癌症恶病质的改善剂对微小颗粒的含有浓度没有特别限制。本发明的癌症恶病质的改善剂优选包含1.0×108个/mL以上的微小颗粒、更优选包含2.0×108个/mL以上、特别优选包含4.0×108个/mL以上、更特别优选包含5.0×108个/mL以上、更进一步特别优选包含2.0×109个/mL以上。
本发明的癌症恶病质改善剂的优选方案通过如此大量地或以高浓度包含微小颗粒，可将血液中的血细胞等的量维持在高水平，可抑制(特别是炎性)细胞因子量，存在可一定程度延长存活期间的倾向。
-微小颗粒的调制方法-
可由来自牙髓的干细胞等的培养上清纯化微小颗粒以调制微小颗粒。
微小颗粒的纯化优选为从来自牙髓的干细胞的培养上清中分离包含微小颗粒的组分，更优选为分离微小颗粒。
微小颗粒可通过根据微小颗粒的特性从非缔合成分中分离而分离出来。例如，微小颗粒可根据分子量、大小、形态、组成或生物学活性进行分离。
在本发明中，可通过对来自牙髓的干细胞的培养上清进行离心处理，将所得到的含有大量微小颗粒的特定组分(例如沉淀物)进行分取来纯化微小颗粒。可去除规定组分以外的组分的不需要的成分(不溶成分)。从本发明的癌症恶病质的改善剂中去除溶剂和分散介质、以及不需要的成分，可以是不完全的去除。离心处理的条件可示例如下：在100～20000g下进行1～30分钟。
在本发明中，可通过对来自牙髓的干细胞的培养上清或其离心处理物进行过滤处理来纯化微小颗粒。可通过过滤处理去除不需要的成分。另外，如果使用适当孔径的滤膜，则可同时进行不需要的成分的去除和灭菌处理。对用于过滤处理的滤膜的材质、孔径等没有特别限定。可按照已知的方法用适当的分子量或尺寸截留的滤膜进行过滤。从容易分取外来体的观点来看，滤膜的孔径优选为10～1000nm、更优选为30～500nm、特别优选为50～150nm。
本发明中，可采用柱色谱等进一步的分离方法分离来自牙髓的干细胞的培养上清或其离心处理物或它们的过滤处理物。例如可采用使用了各种柱的高效液相色谱(HPLC)。柱可使用尺寸排阻柱或结合柱。
在各处理阶段的各组分中，为了追踪微小颗粒(或其活性)，可利用微小颗粒的1种以上的特性或生物学活性。例如，为了追踪微小颗粒，可使用光散射、折射率、动态光散射或UV-可见光检测器。或者，为了追踪各组分中的活性，可利用特定的酶活性等。
作为微小颗粒的纯化方法，可采用日本特表2019-524824号公报的[0034]～[0064]中记载的方法，该公报的内容作为参照而纳入到本说明书中。
＜其他成分＞
本发明的癌症恶病质的改善剂除了含有微小颗粒以外，还可根据给药对象的动物的种类或目的，在不损及本发明效果的范围内含有其他成分。作为其他成分，可列举：营养成分、抗生素、细胞因子、保护剂、载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂(镇痛剂)、稳定剂、保存剂、防腐剂等。
作为营养成分，例如可列举：脂肪酸等、维生素等。
作为抗生素，例如可列举：青霉素、链霉素、庆大霉素等。
作为载体，可列举：作为药学上可接受的载体而已知的材料。
本发明的癌症恶病质的改善剂可以是来自牙髓的干细胞的培养上清本身或微小颗粒本身，也可以是进一步含有药学上可接受的载体或赋形剂等的药物组合物。药物组合物的目的在于促进对给药对象给予来自牙髓的干细胞的培养上清或微小颗粒。
药学上可接受的载体优选为不会对给药对象引起显著的刺激性、不会抑制所给予的化合物的生物学活性和特性的载体(包括稀释剂)。载体的例子为：丙二醇；(生理)盐水；乳液；缓冲液；培养基、例如DMEM或RPMI等；含有去除自由基的成分的低温保存培养基。
本发明的癌症恶病质的改善剂可包含以往已知的癌症恶病质改善剂的有效成分。本领域技术人员可根据用途或给药对象等进行适当变更。
另一方面，本发明的癌症恶病质的改善剂优选不含规定的物质。
例如，本发明的癌症恶病质的改善剂优选不含来自牙髓的干细胞。
另外，本发明的癌症恶病质的改善剂优选不含MCP-1。然而，可包含除MCP-1以外的细胞因子。作为其他细胞因子，可列举：日本特开2018-023343号公报的[0014]～[0020]中记载的细胞因子等。
另外，本发明的癌症恶病质的改善剂优选不含Siglec-9。但是，可包含除Siglec-9以外的其他唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素。
需要说明的是，本发明的癌症恶病质的改善剂优选实质上不含血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)。另外，本发明的癌症恶病质的改善剂优选实质上不含敲除血清替代品(KSR)等以往的血清替代品。
本发明的癌症恶病质的改善剂优选上述的其他成分的含量(固体成分量)均为1质量％以下、更优选为0.1质量％以下、特别优选为0.01质量％以下。
＜癌症恶病质的改善剂的制造方法＞
对本发明的癌症恶病质改善剂的制造方法没有特别限制。
可按照上述方法调制来自牙髓的干细胞的培养上清，调制癌症恶病质的改善剂。接着，可由来自牙髓的干细胞的培养上清纯化微小颗粒，调制本发明的癌症恶病质的改善剂。或者，可由商业上购入而获取的来自牙髓的干细胞的培养上清纯化微小颗粒，调制本发明的癌症恶病质的改善剂。而且，也可接受(譲り受ける)被废弃处理的包含来自牙髓的干细胞的培养上清的组合物(或适当纯化其组合物)，从中纯化微小颗粒，以调制本发明的癌症恶病质的改善剂。
对本发明的癌症恶病质改善剂的最终形态没有特别限制。例如，本发明的癌症恶病质的改善剂可列举：将来自牙髓的干细胞的培养上清填充至容器中而成的形态；将微小颗粒与溶剂或分散介质一同填充至容器中而成的形态；将微小颗粒与凝胶一同凝胶化且填充至容器中而成的形态；将来自牙髓的干细胞的培养上清或微小颗粒冷冻和/或干燥进行固化制成制剂或填充至容器中而成的形态等。作为容器，例如可列举：适于冷冻保存的管、离心管、袋等。冷冻温度例如可设为-20℃～-196℃。
[癌症恶病质的改善方法]
本发明的癌症恶病质的改善方法包括：对发生癌症恶病质的对象给予有效量的本发明的癌症恶病质的改善剂。
对发生癌症恶病质的对象给予本发明的癌症恶病质改善剂的步骤没有特别限制。
给药方法可列举：对口腔、鼻腔或呼吸道的喷雾或吸引、点滴、局部给药、滴鼻剂等，优选侵袭少。作为局部给药的方法，优选注射。另外，还优选电穿孔，其是通过对皮肤表面施加电压(电脉冲)，在细胞膜上暂时开出微细的孔，使有效成分渗透至常规护理中无法达到的真皮层。在局部给药的情况下，可列举：静脉内给药、动脉内给药、门静脉内给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、腹腔内给药等，更优选为动脉内给药、静脉内给药、皮下给药或腹腔内给药。
对发生癌症恶病质的对象给予的本发明的癌症恶病质的改善剂，可在对象的体内循环，并到达规定的组织。
对给药次数和给药间隔没有特别限制。给药次数可设为每周1次以上、优选为5次以上、更优选为6次以上、特别优选为7次以上。给药间隔优选为1小时～1周、更优选为半天～1周、特别优选为1天(每天1次)。然而，可根据给药对象的生物种类或给药对象的症状适当调整。
本发明的癌症恶病质的改善剂优选为对发生癌症恶病质的对象在治疗有效期间1周给予1次以上的癌症恶病质改善剂的用途。在给药对象为人的情况下，优选每周的给药次数多，优选在治疗有效期间1周给药5次以上、优选每天给药。
在使用浓度为2.0×109个/ml的来自牙髓的干细胞的培养上清的情况下，在小鼠模型中，优选每只小鼠(约25g)为0.1～5ml、更优选为0.3～3ml、更特别优选为0.5～1ml。
在使用浓度为0.1×108个/μg的微小颗粒的情况下，在小鼠模型中，优选每只小鼠(约25g)为1～50μg、更优选为3～30μg、更特别优选为5～25μg。
对其他动物的每单位体重的给药量的优选范围可利用比例关系由对模型小鼠的每单位体重(约25g)的给药量来计算。然而，可根据给药对象的症状适当调整。
对给予本发明的癌症恶病质改善剂的对象的动物(生物种类)没有特别限制。给予本发明的癌症恶病质改善剂的对象的动物优选为哺乳动物、鸟类(鸡、鹌鹑、鸭等)、鱼类(鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲣鱼等)。作为哺乳动物，可以是人，也可以是非人哺乳动物，但优选为人。作为非人哺乳动物，更优选为牛、猪、马、山羊、绵羊、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠。
本发明的癌症恶病质的改善剂可与以往已知的癌症恶病质的改善剂并用。
实施例
以下，列举实施例和比较例或参考例，以进一步具体地说明本发明的特征。以下的实施例中所示的材料、使用量、比例、处理内容、处理顺序等只要不脱离本发明的宗旨即可，可适当变更。因此，本发明的范围不应由以下所示的具体例限定性地解释。
[实施例1]
＜实验方案＞
按照图1所示的实验方案，对癌症恶病质模型小鼠给予样品，之后采集全血，评价了恶病质的改善。
＜致死性癌症恶病质模型小鼠的调制＞
对于用作正常小鼠的7周龄裸鼠(Balb/c-nu/nu)，皮下移植1×106个B16-F10-luc-G5细胞(B16-luc细胞)，调制了致死性的癌症恶病质模型小鼠。该条件是小鼠在18天以内全部死亡的严酷条件。
＜来自牙髓的干细胞的培养上清的调制＞
使用DMEM培养基代替DMEM/HamF12混合培养基，其他则按照日本专利第6296622号的实施例6中记载的方法，调制人乳牙牙髓干细胞的培养上清，分取了培养上清。在原代培养中，添加胎牛血清(FBS)进行培养，在传代培养中分取使用原代培养液培养的传代培养液的上清，使其不含FBS，调制了乳牙牙髓干细胞的培养上清。需要说明的是，DMEM是Dulbecco改良Eagle培养基，F12是HamF-12培养基。
以所调制的来自牙髓的干细胞的培养上清作为实施例1的癌症恶病质的改善剂样品。
＜样品的给予＞
在调制癌症恶病质模型小鼠的处置日(第0天)和自处置日起的天数为7天后和14天后，从癌症恶病质模型小鼠的尾静脉以每只小鼠0.5ml(以外来体计为1.0×109个)给予了实施例1的样品。
[实施例2]
＜外来体的调制＞
按照以下的方法，由实施例1中得到的来自牙髓的干细胞的培养上清纯化了来自牙髓的干细胞的外来体。
用孔径尺寸为0.22微米的滤器过滤乳牙牙髓干细胞的培养上清(100mL)后，将其溶液在4℃下以100000×g离心分离60分钟。倾析上清，将外来体浓缩颗粒重新悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中。将重新悬浮样品以100000×g离心分离60分钟。再次将颗粒作为浓缩样品从离心管的底部回收(约100μl)。蛋白浓度通过微小BSA蛋白测定试剂盒(Pierce、Rockford、IL)来确定。含有外来体的组合物(浓缩溶液)在-80℃下保管。
以由来自牙髓的干细胞的培养上清纯化的含有外来体的组合物作为实施例2的癌症恶病质的改善剂样品。
对各实施例的癌症恶病质的改善剂中所含的微小颗粒的平均粒径、浓度进行评价。
各实施例的癌症恶病质的改善剂中所含的微小颗粒的平均粒径为50～150nm。
各实施例的癌症恶病质的改善剂是1.0×109个/ml以上的高浓度外来体溶液，特别是实施例1的癌症恶病质的改善剂是2.0×109个/ml的高浓度外来体溶液。
另外，按照已知方法对所得到的各实施例的癌症恶病质改善剂的成分进行分析。其结果可知：各实施例的癌症恶病质的改善剂不含来自牙髓的干细胞的干细胞，不含MCP-1，也不含Siglec-9。因此可知：不同于作为间充质干细胞的培养上清的有效成分的MCP-1和Siglec-9以及它们的类似物的有效成分是各实施例的癌症恶病质改善剂的有效成分。
除了对实施例1中调制的癌症恶病质模型小鼠给予20μg(以外来体计为2.0×108个)实施例2的样品以代替实施例1的样品以外，与实施例1同样地操作，进行了样品的给予。
[比较例1]
除了对实施例1中调制的癌症恶病质模型小鼠给予等量的0.5ml作为比较例1的样品的生理盐水以代替实施例1的样品以外，与实施例1同样地操作，进行了样品的给予。
[评价]
(体重减少的评价)
在调制癌症恶病质模型小鼠的处置日(第0天)和自处置日起的天数为7天后、14天后和21天后，测定癌症恶病质模型小鼠的体重。各组n＝10，例如在实施例1中求出给予了实施例1的样品的10只小鼠的平均体重。
使用7周龄的裸鼠(Balb/c-nu/nu)作为正常小鼠的参考例。以参考例1的正常小鼠的体重为对照(100％)，求出给予了各实施例和比较例的样品的10只小鼠的体重(相对于对照的％)。所得结果见图2。
由图2的结果可知：通过对癌症恶病质模型小鼠给予本发明的癌症恶病质的改善剂，与给予生理盐水的情况相比，可抑制体重减少。
由该结果预测：本发明的癌症恶病质的改善剂通过抑制恶病质患者的体重减少，可维持骨骼肌量等，也可改善贫血，还可改善QOL和ADL。
需要说明的是，根据后述的实施例的结果，认为这种抑制体重减少的作用机制在于炎性细胞因子的抑制或细胞因子风暴的抑制等。
(血液中的血细胞等的评价)
在从调制癌症恶病质模型小鼠的处置日(第0天)起21天后，采集全血。之后，定量血液中的红细胞数(单位：万/μL)、血红蛋白值(血色素。单位g/dL)、血小板数(单位：万/μL)、血细胞比容值(％)。所得结果见表1。
由表1的结果可知：通过对癌症恶病质模型小鼠给予本发明的癌症恶病质的改善剂，与给予生理盐水的情况相比，可将红细胞数、血红蛋白值(血色素)、血小板数和血细胞比容值维持在高水平。
另外，在给予了生理盐水的比较例1的癌症恶病质模型小鼠中可见贫血样症状，但在给予了本发明的癌症恶病质改善剂的癌症恶病质模型小鼠中特别是未见贫血样症状。
由这些结果预测：本发明的癌症恶病质的改善剂通过改善恶病质患者的贫血，可改善QOL和ADL。
[表1]
(血液中细胞因子量的评价)
在从调制癌症恶病质模型小鼠的处置日(第0天)起21天后，采集全血。之后，使用Immune Monitoring 48-Plex Mouse ProcartaPlex(注册商标)Panel(Invitrogen公司制造)进行了血液中的IL-6和TNF-α的定量。同时，也对作为参考例1的正常小鼠采集全血，同样地进行了血液中所含的细胞因子的定量。所得结果见图3和图4。
由图3和图4的结果可知：通过对癌症恶病质模型小鼠给予本发明的癌症恶病质的改善剂，与给予生理盐水的情况相比，可抑制血液中的IL-6和TNF-α浓度的增加。
由这些结果预测：本发明的癌症恶病质的改善剂通过抑制恶病质患者的炎性细胞因子的产生，可增加食欲，或者，通过抑制肿瘤局部的炎症反应或抑制细胞因子风暴来改善代谢异常等，从而可改善QOL和ADL。
(致死性癌症恶病质小鼠模型的存活率的评价(1))
从调制癌症恶病质模型小鼠的处置日(第0天)起，每天确认各组(n＝10)小鼠的存活率。所得结果见图5。
由图5的结果可知：在以实施例1和2的外来体浓度对癌症恶病质模型小鼠给予本发明的癌症恶病质改善剂的情况下，与给予生理盐水的情况相比，可稍微延长平均存活天数，稍微提高存活率。
[实施例11]
(致死性癌症恶病质小鼠模型的存活率评价(2))
除了对癌症恶病质模型小鼠给予25μg(以外来体计为2.5×108个)实施例2的样品(由来自牙髓的干细胞的培养上清纯化的外来体)以外，与实施例2同样地操作，进行了实施例11的存活率的评价。需要说明的是，实施例11的样品给予量为实施例2的样品给予量的1.25倍。实施例11以n＝10进行。所得结果见图6。
由图6的结果可知：在对癌症恶病质模型小鼠以提高至实施例11的外来体浓度给予本发明的癌症恶病质改善剂的情况下，与给予生理盐水的情况相比，可延长平均存活天数，提高存活率。
[实施例21]
＜在体外确认细胞因子风暴的抑制＞
为了强化实施例2的血液中的细胞因子量的评价结果，使用诱导了细胞因子风暴的细胞模型代替癌症恶病质模型小鼠，确认了本发明的癌症恶病质改善剂的细胞因子风暴抑制效果。
使用人外周血单核细胞(Peripheral-Blood Mononuclear Cell；PBMC)进行细胞因子风暴的诱导，按照以下方法在体外确认了基于实施例2的样品的细胞因子风暴抑制效果。
培养人PBMC，用作为细胞因子风暴诱导剂的伴刀豆球蛋白A(Con-A、富士胶片和光纯药(株)制造)刺激，诱导了细胞因子风暴。
向该系统中添加实施例2的样品和作为对照的生理盐水中的1种进行处理，使用细胞因子测定ELISA试剂盒(R&D Systems制造、商品名Quantikine ELISA Kit)进行了人PBMC的培养上清中所含的细胞因子的定量。定量化的细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFNγ和TNFα。
实施例2的样品的添加以每个PBMC细胞为100个颗粒的方式进行处理。在用实施例2的样品进行处理后，测定了48小时后的细胞因子量(N＝6)。
所得结果见下述表2。
[表2]
(N--6)
[实施例22]
＜在体内确认细胞因子风暴的抑制＞
进行小鼠模型中的细胞因子风暴的诱导，按照以下方法在体内确认了基于实施例2的样品的细胞因子风暴抑制效果。
每组各使用了6只C57BL/6J系统的8周龄小鼠。
对于各小鼠分别以20mg/kg体重向小鼠腹腔内给予了作为细胞因子风暴诱导剂的脂多糖(LPS)。需要说明的是，通过给予脂多糖(LPS，内毒素)，引起炎性细胞因子的浓度上升等败血症的症状，可诱导细胞因子风暴(Medical Hypotheses(2020)144，109865)。
在刚刚给予脂多糖后，立即从各小鼠的尾静脉分别给予了等量的10μg的实施例2的样品(通过超离心法纯化)和作为对照的生理盐水中的1种。需要说明的是，实施例21的样品给予量为实施例2的样品给予量的0.5倍。
在24小时后采集全血，分取了小鼠的细胞因子风暴中的血清。使用ImmuneMonitoring 48-Plex Mouse ProcartaPlex(注册商标)Panel(Invitrogen公司制造)进行了小鼠的细胞因子风暴中的血清中所含的细胞因子的定量。同时，对于给予脂多糖前的正常小鼠也采集全血，同样地进行了血清中所含的细胞因子的定量。定量化的细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFNγ和TNFα。
所得结果见下述表3。
[表3]
ND：未检出
(N-6)
由上述表2和表3可知：通过对诱导细胞因子风暴而使各细胞因子量增多的动物(小鼠)给予作为本发明的癌症恶病质改善剂的实施例2的样品，与给予生理盐水的对照相比，血液中和/或血清中的细胞因子量、除IL-6和TNFα以外的细胞因子也得到显著抑制，可抑制细胞因子风暴。由这些结果预测：本发明的癌症恶病质改善剂通过抑制恶病质患者的炎性细胞因子或细胞因子风暴来增加食欲、改善代谢异常等，从而改善体重减少、贫血、低营养状态，可改善QOL和ADL。
[比较例A～D]
＜实施例1和2的来自牙髓的干细胞的培养上清和外来体、与来自脐带的干细胞的培养上清或外来体的比较＞
研究了在利用LPS的刺激引起来自小鼠的巨噬细胞RAW264.7的激活后，通过添加干细胞培养上清或外来体，是否会抑制成为细胞因子风暴的主要原因的来自激活巨噬细胞的IL-6的产生。
使用DMEM和10％FBS(目录号：DSDSM101)作为培养液。在96孔板上准备RAW264.7(1.2×106/mL、TIB-71、从ATCC购入)，在培养液中培养，在达到90％分汇合(Subconfluent)的时间点添加LPS(100ng/mL、ALX-581-007-L002、Cosmo Bio株式会社制造)和各实施例和各比较例的癌症恶病质的改善剂样品，在37℃、5％CO2下培养18小时。使用小鼠IL-6测定ELISA试剂盒(KE10007、Cosmo Bio株式会社制造)定量了在培养后游离到培养液中的IL-6量。所得到的实测值(N＝2的平均值)见图7。
另外，使用未给予LPS的未处理细胞(比较例A)、仅给予了LPS的细胞(比较例B)作为对照，没有添加癌症恶病质的改善剂样品，进行了同样的试验，结果也见图7。
作为癌症恶病质的改善剂样品，使用了本申请说明书的实施例1中使用的癌症恶病质的改善剂(来自牙髓的干细胞培养上清)、本申请说明书的实施例2中使用的癌症恶病质的改善剂(来自牙髓的干细胞外来体)、作为比较例C的来自脐带的干细胞培养上清、以及按照实施例2由来自脐带的干细胞培养上清调制的比较例D的外来体(来自脐带的干细胞外来体)。各外来体通过超离心法进行分离，每个来自小鼠的巨噬细胞使用了1000个外来体。
根据图7，与使用了来自脐带的干细胞的培养上清的情况(比较例C)相比，使用了来自牙髓的干细胞的培养上清的实施例1的癌症恶病质改善剂在诱发了细胞因子风暴的体外的细胞的细胞因子抑制中显著地显示出有利的效果。另外，与使用了由来自脐带的干细胞的培养上清得到的微小颗粒(外来体)的情况(比较例D)相比，使用了由来自牙髓的干细胞的培养上清得到的微小颗粒(外来体)的实施例2的癌症恶病质改善剂在诱发了细胞因子风暴的体外的细胞的细胞因子抑制中显著地显示出有利的效果。
这里，体外的实施例21是为了强化体内的实施例2的癌症恶病质模型小鼠的血液中细胞因子量(IL-6等)的抑制的评价结果，使用诱导了细胞因子风暴的动物细胞代替癌症恶病质模型小鼠，在体外确认了本发明的癌症恶病质改善剂的细胞因子风暴抑制的效果。即，通过像这样对诱发了细胞因子风暴的体外细胞进行IL-6等细胞因子抑制的评价，可评价在癌症恶病质模型小鼠等体内的动物的癌症恶病质的改善效果(抑制炎性细胞因子或细胞因子风暴)，另外，由此增加食欲，改善代谢异常等，从而改善体重减少、贫血、低营养状态，可改善QOL和ADL。
因此，由实施例1或2与比较例A～D的比较试验的结果(对诱发了细胞因子风暴的体外细胞进行的IL-6等细胞因子抑制的评价结果)可知：与来自脐带的干细胞的培养上清或由其得到的外来体相比，来自牙髓的干细胞的培养上清或由其得到的外来体起到可显著改善癌症恶病质的效果。

Claims (11)

1.癌症恶病质的改善剂，其是对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，
该癌症恶病质的改善剂是包含来自牙髓的干细胞的培养上清的组合物，
上述培养上清包含来源于上述来自牙髓的干细胞的微小颗粒。
2.癌症恶病质的改善剂，其是对发生癌症恶病质的对象给药的用途的癌症恶病质的改善剂，
该癌症恶病质的改善剂是包含来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物，
上述组合物不包含从上述培养上清中去除了上述微小颗粒后的物质。
3.权利要求1或2所述的癌症恶病质的改善剂，其中，上述微小颗粒为外来体。
4.权利要求1～3中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于治疗发生癌症恶病质的对象的体重减少。
5.权利要求4所述的癌症恶病质的改善剂，其中，上述对象的体重减少在过去14天内为2％以上。
6.权利要求1～5中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于治疗发生癌症恶病质的对象的贫血。
7.权利要求6所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于抑制发生癌症恶病质的对象的红细胞数、血红蛋白值和血细胞比容值的减少。
8.权利要求1～7中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为用于抑制发生癌症恶病质的对象的血中的IL-6浓度和TFN-α浓度的增加。
9.权利要求1～8中任一项所述的癌症恶病质的改善剂，其用途为对上述发生癌症恶病质的对象在治疗有效期间每周给予1次以上的上述癌症恶病质的改善剂。
10.癌症恶病质的改善方法，其包括：对发生癌症恶病质的对象给予有效量的权利要求1～9中任一项所述的癌症恶病质的改善剂。
11.权利要求10所述的癌症恶病质的改善方法，其中，上述发生癌症恶病质的对象为人以外的动物。
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