JP6296622B2 - 損傷部治療用組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
幹細胞を用いた再生医療は、全ての難病にとっての新しい臨床プラットフォームにおける有望なツールである。胚性幹細胞(ES細胞)、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)、及び体性幹細胞を初めとする種々の幹細胞が報告されている。体性幹細胞のうち、骨髄、脂肪組織、皮膚、臍帯、胎盤等の種々の組織から単離される間葉系幹細胞(MSC)が皮膚再生における臨床的応用に特に用いられてきた。しかし、骨髄穿刺はドナーにとって侵襲性で有痛性の手技である。更に、骨髄幹細胞(BMSC)の数、増殖、及び分化能は年齢の進行と共に低下する
しかしながら、従来のSHEDやDPSCの研究においては、断片的な神経細胞系譜の解析や、神経分化誘導したSHEDやDPSCをげっ歯類に移植し生着を観察した以上の知見はあきらかにされていない(例えばArthur et al. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells (2008) vol. 26 (7) pp. 1787-1795;Huang et al. Putative dental pulp-derived stem/stromal cells promote proliferation and differentiation of endogenous neural cells in the hippocampus of mice. Stem Cells (2008) vol. 26 (10) pp. 2654-2663)。
また、近年の研究で、MSCが皮膚修復に寄与し得ることが示された。更に、種々の成長因子の外的応用による創傷治癒が広範に研究されている。しかし、成長因子を単回投与、複数回投与により使用すること又は相乗効果を期待して複数の因子と併用することの結果は未だ臨床的に確認されていない。
加齢の原因のひとつである短波長紫外線(UVB)への暴露は、真皮において、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)によるコラゲナーゼ産生を刺激し、コラゲナーゼ遺伝子の発現をアップレギュレートすることが知られている。これは、コラーゲンの分解並びに皮膚のしわ及び黄変として現れる変性弾性組織の沈着を誘導すると考えられている。
以前の研究において、MSCは、血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インシュリン様成長因子(IGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子−ベータ(TGF−β)等の種々のサイトカインを産生することが示されている。近年、サイトカインの産生及び分泌がMSCの重要な機能として報告されており、MSCの多様な薬理学的作用が特に皮膚生物学において実証されている(Jettanacheawchankit S, Sasithanasate S, Sangvanich P, Banlunara W, Thunyakitpisal P. Acemannan stimulates gingival fibroblast proliferation; expressions of keratinocyte growth factor-1, vascular endothelial growth factor, and type I collagen; and wound healing. J Pharmacol Sci. 2009 Apr;109(4):525-531;Miura et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences (2003) Vol.100, 5807-5812;Safavi SM, Kazemi B, Esmaeili M, Fallah A, Modarresi A, Mir M. Effects of low-level He-Ne laser irradiation on the gene expression of IL-1beta, TNF-alpha, IFN-gamma, TGF-beta, bFGF, and PDGF in rat's gingiva. Lasers Med Sci. 2008 Jul;23(3):331-335;Saygun I, Karacay S, Serdar M, Ural AU, Sencimen M, Kurtis B, Effects of laser irradiation on the release of basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin like growth factor-1 (IGF-1), and receptor of IGF-1 (IGFBP3) from gingival fibroblasts, Lasers Med Sci. 2008 Apr;23(2):211-215)。例えば、MSCは多様な成長因子の産生を介して皮膚治癒効果を有することが報告されている(Minoru Ueda, The Use of fibroblasts, The Biochemical Society, 11-15, 2007、参照)。これらの成長因子はHDFを活性化し、HDFの増殖/移動を増加させ、HDFからのコラーゲン分泌を仲介した。MSCの分泌因子がHDFを酸化ストレスから保護することが示されたことで、MSCの抗酸化効果も実証された。局所成長因子の使用は、顔の光加齢の修復を刺激し、新たなコラーゲン合成、上皮肥厚、及び目に見えるしわが減少したより滑らかな皮膚の臨床的外観をもたらした(He H, Yu J, Liu Y, et al. Effects of FGF2 and TGFbeta1 on the differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Cell Biol Int 2008;32:827-834;Robey PG. Stem cells near the century mark. J Clin Invest 2000;105:1489-1491.)。
本発明の課題は、歯髄幹細胞を利用した新規な治療手段を提供することにある。
[1] 歯髄幹細胞を無血清培養することによって得られた幹細胞培養上清を含み、歯髄幹細胞を含まない損傷部治療用組成物を製造する方法であって、
以下のステップ(1)、(2')及び(3')を含む、損傷部治療用組成物の製造方法:
(1)歯髄細胞から接着性細胞を選抜するステップ;
(2')前記接着性細胞を、前記ステップ(1)に次ぐ培養において、更なる添加物を含まないDMEM/F12を用いて無血清培養するステップ;
(3')前記ステップ(2')の無血清培養の培養上清を回収するステップ。
[2] 前記ステップ(2')が、更なる添加物を含まないDMEM/F12を用いて72時間、無血清培養するステップである、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記ステップ(1)が、以下のステップ(1')である、[1]又は[2]に記載の製造方法:
(1')歯髄細胞を、DMEM、IMDM、ハムF12培地及びRPMI1640培地から選ばれる1種又は2種以上からなる基本培地に成長因子が添加されてなる培地で一次培養し、次いで、DMEM、IMDM、ハムF12培地及びRPMI1640培地から選ばれる1種又は2種以上からなる基本培地に成長因子が添加されてなる培地で1回〜3回継代培養することにより、歯髄細胞から接着性細胞を選抜するステップ。
[4] 前記損傷部治療用組成物が、皮膚の損傷、歯周組織の損傷、骨の損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、又は神経細胞の障害を伴う網膜疾患のいずれかの治療に用いるための組成物である、[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5] 以下のステップ(4)を更に含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法:
(4)回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも1の処理を行うステップ。
[6] 以下のステップ(a)及び(b)の少なくとも一方を更に含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法:
(a)回収した培養上清について、神経再生阻害物質の存在下での神経突起伸長作用の有無を確認するステップ;
(b)回収した培養上清について、神経細胞に対するアポプトーシス抑制作用の有無を確認するステップ。
本発明の損傷部治療用組成物は、幹細胞を培養することによって得られた幹細胞培養上清を含む、標的組織の損傷部を修復するための損傷部治療用組成物である。
また、本発明の損傷部治療方法は、標的組織の損傷部を修復又は回復するための損傷部治療方法であって、前記損傷部治療用組成物を、前記損傷部治療用組成物の標的組織を有する患者に、前記標的組織の損傷部を修復するために有効な量で投与することを含む損傷部治療方法である。
本発明において「修復」とは、標的組織における損傷によって失われた機能の一部又は全部が、損傷時における損傷部の機能と比較して維持又は回復していることを意味し、組織の機能が回復することのみならず、機能的な組織として再生することも広く包含する。機能が維持又は回復していることの評価については、損傷した組織において異なるが、外観、対象となる機能の程度を評価するために通常用いられるアッセイ等に基づいて行えばよい。
(i)生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン(例えばボルヒール(登録商標))等を使用することができる。
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明の組成物の適用目的(適用組織)に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性(酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等)であることが好ましい。
製剤上許容される他の成分(例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、pH調整剤、成長因子(例えば、上皮細胞成長因子(EGF)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF))等を含有させることにしてもよい。
本発明の別の態様は、特に、中枢神経疾患治療用組成物及び中枢神経疾患治療方法を包含する。
本発明者らは上記背景の下で研究を進めた。そして、歯髄幹細胞が神経幹細胞マーカー、分化した神経細胞のマーカー、アストロサイトマーカー、及びオリゴデンドロサイトマーカーなど、全ての神経系譜マーカーを共発現する希有な細胞集団であること、歯髄幹細胞が脳由来神経栄養因子(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor)を高発現することを明らかにするとともに、歯髄幹細胞が神経の再生を促すことを動物実験によって実証した(特願2010−92585号を参照)。
[1]歯髄幹細胞の培養上清を含むことを特徴とする、中枢神経疾患治療用組成物。
[2]神経再生阻害物質の存在下で神経突起伸長作用を示す、[1]に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[3]前記神経再生阻害物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン又はミエリン関連糖タンパク質である、[2]に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[4]神経細胞に対するアポプトーシス抑制作用を示す、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[5]歯髄幹細胞を含まない、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[6]歯髄幹細胞を組み合わせてなる、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[7]前記歯髄幹細胞が、採取後に分化誘導処理をしていない未分化型歯髄幹細胞であることを特徴とする、[6]に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[8]血清を含まない、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[9]前記培養上清が、歯髄細胞の中の接着性細胞又はその継代細胞を培養して得た培養上清である、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[10]前記中枢神経疾患が、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等の神経変性疾患、脳虚血、脳内出血又は脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患からなる群より選択される疾患ないし病態である、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物。
[11]以下のステップ(1)〜(3)を含む、中枢神経疾患治療用組成物の製造法:
(1)歯髄細胞から接着性細胞を選抜するステップ;
(2)前記接着性細胞を培養するステップ;
(3)培養上清を回収するステップ。
[12]血清を含まない培地を使用してステップ(2)を行う、[11]に記載の製造法。
[13]ステップ(3)において、継代培養後の培養上清が回収される、[11]又は[12]に記載の製造法。
[14]以下のステップ(4)を更に含む、[11]〜[13]のいずれか一項に記載の製造法:
(4)回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される一以上の処理を行うステップ。
[15]以下のステップ(a)及び/又は(b)を更に含む、[11]〜[14]のいずれか一項に記載の製造法:
(a)回収した培養上清について、神経再生阻害物質の存在下での神経突起伸長作用の有無を確認するステップ;
(b)回収した培養上清について、神経細胞に対するアポプトーシス抑制作用の有無を確認するステップ。
[16]前記中枢神経疾患が、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等の神経変性疾患、脳虚血、脳内出、又は脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患からなる群より選択される疾患ないし病態である、[11]〜[15]のいずれか一項に記載の製造法。
[17][1]〜[10]のいずれか一項に記載の中枢神経疾患治療用組成物を中枢神経疾患患者に治療上有効量投与するステップを含む、中枢神経疾患の治療法。
[18]前記中枢神経疾患治療用組成物の投与と同時又は投与後に、歯髄幹細胞を前記中枢神経疾患患者に投与する、[17]に記載の治療法。
[19]前記歯髄幹細胞が、採取後に分化誘導処理をしていない未分化型歯髄幹細胞、又は採取後に神経系細胞へと分化誘導した分化誘導型歯髄幹細胞である、[18]に記載の治療法。
[20]前記中枢神経疾患治療用組成物の投与後に、神経系細胞へと分化誘導した多能性幹細胞を前記中枢神経疾患患者に投与する、[17]に記載の治療法。
[21]調製した歯髄幹細胞の培養上清が中枢神経系疾患治療用の有効成分として有効か否かを判定する方法であって、以下のステップ(a)及び/又は(b)を含む方法:
(a)前記培養上清について、神経再生阻害物質の存在下での神経突起伸長作用の有無を確認するステップ;
(b)前記培養上清について、神経細胞に対するアポプトーシス抑制作用の有無を確認するステップ。
末梢神経系と異なり、中枢神経系には神経再生阻害物質(神経突起伸長阻害因子)が存在する。中枢神経疾患の治療(主として神経再生)を図る上でこの点は重要であり、考慮を要する。上記特性を備える前記中枢神経疾患治療用組成物によれば、神経再生阻害物質の作用を抑え、神経の再生を促すことが可能となる。神経再生阻害物質の例はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)及びミエリン関連糖タンパク質(MAG)である。前記中枢神経疾患治療用組成物が当該特性を備えるか否かは、例えば、神経細胞及び神経再生阻害物質(CSPG又はMAG)を用いたインビトロの実験(詳細は後述の実施例を参照)によって確認することができる(被検組成物とCSPG又はMAGの共存下で神経細胞を培養した場合に神経突起の伸長が観察されれば、被検組成物が当該特性を備えると判断できる)。
前記中枢神経疾患治療用組成物が当該特性を備えるか否かは、例えば、神経細胞を用いたインビトロの実験(詳細は後述の実施例を参照)によって確認することができる(被検組成物の存在下で神経細胞を培養した場合に、アポプトーシスによる細胞死が抑制されれば、被検組成物が当該特性を備えると判断できる)。尚、前記中枢神経疾患治療用組成物は好ましい態様において、当該特性と上記特性(神経再生阻害物質の存在下で神経突起伸長作用を示すこと)を併せもつ。
この場合、第1構成要素を投与した治療対象(通常は中枢神経疾患の患者)に対して、第1構成要素の投与と同時又は投与後に第2構成要素が投与されることになる。第1構成要素と第2構成要素を同時に投与するという使用法は急性期や亜急性期の中枢神経疾患への適用に特に適する。急性期や亜急性期に適用された場合に高い治療効果が発揮されるように、第2構成要素の有効成分として未分化型歯髄幹細胞を用いることが好ましい。
尚、ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に対象へ投与する等、両要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両要素の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。
(i)生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン(例えばボルヒール(登録商標))等を使用することができる。
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本発明の組成物の適用目的(適用組織)に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性(酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等)であることが好ましい。
製剤上許容される他の成分(例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、pH調整剤、成長因子(例えば神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF))等を含有させることにしてもよい。
自然に脱落した乳歯(又は抜歯した乳歯、或いは永久歯)をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
採取した歯髄組織を基本培地(10%ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地)に懸濁し、2mg/mlのコラゲナーゼ及びディスパーゼで37℃、1時間処理する。5分間の遠心操作(5000回転/分)により酵素処理後の歯髄細胞を回収する。セルストレーナーによる細胞選別はSHEDやDPSCの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるので原則、使用しない。
細胞を4cc基本培地で再懸濁し、直径6cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。培養液(例えば、10%FCS含有DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))を添加した後、5%CO2、37℃に調整したインキュベータにて2週間程度培養する。培養液を除去した後、PBS等で細胞を1回又は数回洗浄する。この操作(培養液の除去及び細胞の洗浄)に代えて、コロニーを形成した接着性細胞(歯髄幹細胞)を回収することにしてもよい。この場合には例えば、0.05%トリプシン・EDTAにて5分間、37℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収する。
(a)培養上清について、神経再生阻害物質の存在下での神経突起伸長作用の有無を確認するステップ
(b)培養上清について、神経細胞に対するアポプトーシス抑制作用の有無を確認するステップ
本発明に包含される損傷部治療用組成物及び中枢神経疾患の治療用組成物については、幹細胞培養上清に含まれる生理活性物質を製剤化することが可能である。これにより、例えば神経再生活性物質を製剤化することが可能となる。製剤化のための細胞培養上清の濃縮方法としては、この目的のための通常行われている方法を適用することができる。濃縮方法の例としては、例えば、以下の二つの方法を挙げることができる。
1. スピンカラム濃縮法
培養上清をAmicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(ミリポア社製)を用いて濃縮する(最大75倍濃縮)。具体的な操作手順は次の通りである。
(i) 培養上清(最大15ml)をAmicon Ultra Centrifugal Filter Units-10Kへ投入し、×4000gで約60分間遠心し、200μlまで濃縮する。
(ii) 上記チューブへ培養上清と同量の滅菌PBSを投入し、再度×4000gで約60分間遠心し、ベース溶液をPBSへ置換する。
(iii) 得られた溶液200μlをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
培養上清をエタノール沈殿法を用いて濃縮する(最大10倍濃縮)。具体的な操作手順は次の通りである。
(i) 培養上清5mlに対し100%エタノール45mlを加え、混和し、-20℃で60分間放置する。
(ii) 4℃、×15000gで15分間遠心する。
(iii) 上澄みを除去し、90%エタノール10mlを加え、よく攪拌する。
(iv) 4℃、×15000gで5分間遠心する。
(v) 上澄みを除去し、得られたペレットを滅菌水500μlに溶解し、マイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
また本発明における組成物における幹細胞培養上清は、凍結乾燥することもできる。これにより、良好な保存安定性が得られる。幹細胞培養上清の凍結乾燥方法としては、この目的のための通常行われている方法を適用することができる。凍結乾燥方法の例としては、例えば、以下の方法を挙げることができる。
(i) 上記方法で得られた幹細胞培養上清又は濃縮幹細胞培養上清を-80℃で2時間から半日凍結する。
(ii) 凍結後、サンプルチューブの蓋を開放し、凍結乾燥機へセットする。
(iii) 1〜2日間凍結乾燥を行う。
(iv) 得られたサンプルを凍結乾燥幹細胞培養上清とする(-80℃で保存可能)。
<材料及び方法>
(1)被験体及び細胞培養
8名の患者の臨床的に健康な抜歯された乳歯及び永久歯からヒト歯髄組織を得た。本実験プロトコールは名古屋大学倫理委員会の承認を受けている。SHED及びDPSCを、Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:13625-30又はProc Natl Acad Sci U S A 2003;100:5807-12に報告されているようにして単離及び培養した。
簡潔には、歯髄をゆっくりと取り、3mg/mLのI型コラゲナーゼ及び4mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて1時間消化した。70mmの細胞ストレーナ(Falcon; BD Labware, Franklin Lakes, NJ)を用いて濾過した後、20%の間葉系細胞成長サプリメント(Lonza Inc, Walkersville, MD)及び抗生物質(100U/mLのペニシリン、100mg/mLのストレプトマイシン、及び0.25mg/mLのアムホテリシンB;GIBCO社製)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;GIBCO, Rockville, MD)中で37℃、5%CO2下にて細胞を培養した。一次培養後、約1×104細胞/cm2で細胞を継代培養した。1〜3回継代した細胞を実験に用いた。ヒトBMMSCはロンザ社から購入し、メーカーの取扱説明書に従って培養した。
BrdU染色キットをメーカー(Invitrogen, Carlsbad, CA)の取扱説明書に従って用いてブロモデオキシウリジン(BrdU)を12時間取り込ませ、SHED、DPSC、及びBMSCの増殖速度を評価した(各群についてn=3)。実験は5回繰り返した。1元配置分散分析後にテューキー−クレイマー検定(Tukey−Kramer test)により統計的有意差を評価した。
5週齢の雌無毛マウス(Hos;HR−1)はSLC社(SLC Inc.)(日本、静岡)から提供された。全マウスを、気候制御された区域(22±1℃、湿度50%)に12/12hの光暗サイクルで収容した。動物は水及び固形飼料を自由に摂取でき、毎日観察された。UVB放射装置RMX−3W(Handok Biotech, Seoul, Korea)を用いてマウスの背中に1週間に5回、8週間照射を行った。10個の東芝社製SEランプからなる列を、UVB用のフィルター処理をせずに用いた(放射ピークは312nm付近であり、290〜320nmの照射がUVB全量の55%に相当する)。ランプから動物の背中までの距離は89cmとした。暴露中、動物はケージ中を自由に行動できた。照射線量は、最初の2週間は1MED(最小紅斑量;60mJ/cm2)、3週目は2MED(120mJ/cm2)、4週目は3MED(180mJ/cm2)、5〜8週目は4MED(240mJ/cm2)とした。全UVB線量は約115MED(6.9J/cm2)であった。しわ誘導後5週間で、マウスの限定的な領域にSH−CM(100%)を皮下注射した。正の対照としてPBS懸濁SHED(4×105)を直接真皮に注射し、負の対照としてPBSのみで真皮を処置した。
SHED(4×105細胞)をDMEM/F12(Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY)無血清培地中で培養した。培養72時間後にSHEDの培養上清を回収し、300×gで5分間遠心し、0.22mmのシリンジフィルターを用いて濾過した。
しわ誘導時及び注射1週間後に、シリコーン系印象材フレックスタイム1(Flextime1;Heraeus Kulzer, New York, NY)を用いて背中の皮膚表面のネガ型レプリカを取った。同じ皮膚領域からしわのレプリカを得るために油性マーカーペンで皮膚に印を付けた。皮膚にSH−CM及びSHEDを最後に注射してから5週間後に、印をつけた領域から印象を取った。測定し易いように、全レプリカを1cm四方に切り、同じ印象材を用いて各レプリカの裏を平坦な面に加工した。208°の角度で光を当て、CCDカメラを用いてレプリカから画像を取り込んだ。ネガ型レプリカの画像を、しわ解析装置スキン・ビジオメーター(skin visiometer)SV 600(Courage & Khazaka, Cologne, Germany)を用いて観察した。皮膚のしわの評価に用いたパラメータは、数、深さ、面積である。
背中の皮膚(1cm×1cm)を10%ホルマリン中性緩衝溶液で固定し、ポリエステルワックス中に包埋し、6mmの切片を作製した。切片をヘマトキシリン&エオシン(H&E)にさらし、マッソン三色染色を行った。
10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、及び100mg/mlのストレプトマイシンを添加したDMEM中で、5%CO2下、37℃にてHDFを培養した。無血清培地で24時間飢餓させた後、細胞をPBSで洗浄し、3〜4滴のPBSと一緒にUVBに暴露した。UVB照射は、UV光源(Waldmann, Schwenningen, Germany)を用いて行った。照射後すぐに、PBSを吸引して完全培地に置き換えた。UVB照射線量は、50〜250mJ/cm2の範囲で試験し、最終的に、以降の実験用に70mJ/cm2に固定した。
HDFを96ウェルプレート中に5×103細胞/ウェルの密度でプレーティングし、CCK−8キット(Dojindo, Gaithersburg, MD)を用いてHDFの増殖を測定した。無血清培地で24時間飢餓させた後、SH−CMと一緒に又はSH−CMなしで細胞を24時間連続培養し、UVB(70mJ/cm2)に90秒間暴露した。次いで、UVB照射細胞を完全培地中で24時間培養して回収した。HDFを10mLのCCK−8溶液に入れ、3時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー(TECAN, Gro¨ dig, Austria)を用いて450nmの吸収を測定した。各ウェルのOD値を、比較可能な標準曲線に基づき、相対的細胞数に変換した。
HDF(2×104細胞/ウェル)を24ウェルプレートに播種し、前述したように前処理を行った。次いで、細胞をRIPA緩衝液(50mMのTris−HCl、0.15MのNaCl、1mMのEDTA、1%のトリトンX−100、1%のSDS、50mMのNaF、1mMのNa3VO4、5mMのジチオスレイトール、1mg/mlのロイペプチン、及び20mg/mlのPMSF、pH 7.4)中で溶解させた。タンパク質50マイクログラムを8%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離した。タンパク質をPVDF膜に転写した。この膜を、I型コラーゲンに対する抗体(Santa Cruz, Saint Louis, MO)、マトリックスメタロプロテイナーゼ1(MMP−1)に対する抗体(Calbiochem, Darmstadt, Germany)と一緒にインキュベートした。次いで、膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ヤギIgG抗体(1:10,000、Santa Cruz, Saint Louis, MO)と一緒にインキュベートした。ブロットを免疫グロブリンウェスタン試薬と反応させ、X線フィルムにさらした。
(1)SHED、DPSC、及びBMSCの特徴解析
SHED及びDPSCはBMSCと同様な線維芽細胞の形態を示した(図2A〜C)。免疫蛍光の解析から、SHED、DPSC、及びBMSCがSTRO−1陽性細胞を含むことが示された(図2D〜F)。SHEDの増殖速度はDPSC及びBMSCよりも有意に速かった(図2G)。
UV暴露期間中、マウスの皮膚の細かいしわを観察した。しかし、処置中、SH−CM処置群及びSHED注射群はPBS群よりもしわが少ないようであった(各群についてn=8)。レプリカの解析において、図3及び図4は、UVB照射で誘導された細かいしわがSH−CMの反復処置により軽減されたことを示している。SHED注射群もSH−CH群と同じ傾向を示した。本発明者らのグループがスキン・ビジオメーターSV 600でレプリカのしわのパラメータを測定したところ、天然レベル(100%)のSH−CMを注射した時にしわの全パラメータが有意に低下していた。しかし、SHED処置された皮膚はSH−CM群よりも高い有効性を示した。
UVB照射無毛マウスは皮膚付属器に大きな変化を示し、UVB照射無毛マウスにおける真皮の厚さに対するSH−CMの影響を調べた。図5に、H&E染色による無毛マウスの皮膚の真皮厚さの組織学的測定を示す。図5に示されるように、コラーゲン線維が染色されており、SH-CM処理群(A)とSHED注入群(B)において顕著に高くなっている。真皮厚さの測定から、SHED注射群及びSH−CM処置群において有意な増加が示された(図6)。更に、膠原線維束の顕著な増加が両方の群において観察されたが、これは対照群では観察されなかった(図5)。
SHEDによる皮膚のしわの改善に関して更にパラクリン機構を調べるために、SH−CMと一緒に一次培養したHDFで細胞増殖アッセイを行った。UVB照射はHDFの増殖を有意に低下させたが、SH−CMによる前処理はHDFに対して保護効果を示した(図7)。SH−CMは多様な成長因子を含み、成長因子の固有の特性は静止細胞の有糸分裂を開始させる能力である場合、本実験中でのSH−CMによる増殖促進はSHEDから分泌された成長因子が仲介するものであり得る。
SH−CM処置した無毛マウスにおいて真皮中のコラーゲン含有量が有意に増加していたことから、SH−CM処理後のHDF中におけるI型コラーゲン及びMMP1のタンパク質発現を調べた(図8)。UVB照射は明らかにI型コラーゲンの発現を低下させ、MMP1の発現を誘導していた。しかし、I型コラーゲンの発現はSH−CM前処理後に有意に増加し、一方、MMP1の発現はSH−CM前処理後に低下していた。これらの結果は、SH−CM処置した無毛マウスの真皮中のコラーゲン含有量増加が真皮線維芽細胞中におけるコラーゲン合成の刺激及びコラーゲン分解の抑制によってもたらされたことを示している。
SHEDの特徴を、組織工学及び再生医療で標準的な幹細胞源とみなされているDPSC及びBMSCと比較した。その結果、SHEDは高い増殖能を有し、細胞外マトリックスによって強化されることが示された。このことは、幹細胞に基づく治療にとって、SHEDは有用な源であることを示唆している。STRO−1陽性細胞がSHED、DPSC、及びBMMSC中で見られた。STRO−1は、高い成長・分化能を有する優勢な比率の骨幹細胞を含む骨髄細胞の亜集団及びコロニー形成単位の線維芽細胞集団上に存在するトリプシン耐性細胞表面抗原を認識することが知られている。高い増殖能は生後体性幹細胞の最も重要な特徴の1つである。BrdUを用いた増殖研究により、SHED、DPSC、及びBMSCのうちでSHEDが最も高い集団比率を示すことが明らかになった。以前に、SHEDは、この経路に関連するFGF、TGF−b、CTGF、NGF、BMP等の複数の成長因子を高レベルで発現することがマイクロアレイ解析により報告されている(S. Nakamura, Y.Yamada et al. Stem Cell Proliferation Pathways Comparison between Human Exfoliated Deciduous Teeth and Dental Pulp Stem Cells by Gene Expression Profile from Promising Dental Pulp, JOE, Vol.35, (11), 1536-1542, 2009)。FGF2は、組織再生及び創傷治癒中に多種類の細胞の増殖を促進し、細胞外マトリックスの生成を制御する作用をするサイトカインとして報告されている。
(1)成長因子混合物(粉末)の調製
不死化ヒト間葉系幹細胞(MSC;Ronza Co., Ltd, USA)を成長因子(GF)混合物の調製に用いた。10%FSC含有DMEMを用いて細胞を2〜8代培養し、培養皿中の細胞コンフルエンスが80%の段階で上清(培養培地:CM)をサンプリングし、エタノールに加えた(CM:エタノール=1:9)。このCMを、−20℃で60分間インキュベートした後、スピン(4℃、1500rpm、15分間)して濃縮した。残ったCMを90%エタノール中で−20℃で洗浄した後、再度スピンした。
この濃縮されたCMを凍結乾燥することで、成長因子粉末を得た。
粉末中の各成長因子をウェスタンブロッティング法で解析した。検出された成長因子は以下の通りである:PDGF、VEGF、IGF、KGF、HGF、及びTGF。
<成長因子による骨再生の実験研究>
(1)方法
イヌ下顎骨中に、直径10mm、深さ10mmの4つの円筒形の欠損を形成した。
各欠損の中心にチタンインプラント(直径3.75mm)を挿入した。
インプラント周辺の空間に以下のような移植材料を詰めた:(1)PRP、(2)100%GF、(3)MSC(1×1,000,000)、及び(4)空の欠損(対照)(図10)。
8週間後、イヌを安楽死させ、インプラントの付いた下顎骨を解剖した。組織学的標本を作製し、光学顕微鏡及び画像解析装置を用いてBIC(骨−インプラント接触部 (Bone - Implant Contact) )を計算した(図11)。
*BIC=インプラント表面と接触する骨部分の全長/インプラント表面の全長×100(%)
結論として、間葉系幹細胞に由来する成長因子は、骨再生に関して生きた幹細胞と同じ能力を有する。
上顎骨の大臼歯領域に2個のインプラントを設置してサイナスリフト法を行った。100%細胞ベースのGFとb−TCP(β−tricalcium phosphate)顆粒を副鼻腔に移植した。8週間後、移植部分は新しい骨で満たされており、X線観察により、インプラントと骨の間の骨結合が確認された(図14及び15)。
<成長因子による歯周組織再生の実験研究>
(1)方法
イヌ下顎骨の臼歯の遠位部分に2壁性の歯周欠損を作製した(図16)。各イヌの欠損を以下の方法又は手順で処置した(図17及び18)。
1)歯肉剥離掻爬手術(FO、対照)
2)GTR法
3)MSC(1×100,000)
4)GF(100%)
手術から8週間後、臼歯及び歯肉の付いたイヌ下顎骨を解剖し、その組織学的標本を作成した。組織学的観察により、光学顕微鏡を用いてポケットの深さ(N1−JE:上皮の下方成長の長さ)及び新たに形成されたセメント質の長さ(N2−NC)を評価した。(図19)。これらのパラメータは、歯周病の改善評価に有用であった。新しいセメント質の長さは、GTR及び対照よりGF及びMSCではるかに長かった。更に、GF群及びMSC群は、GTR群及び対照群と比較してポケットの深さが顕著に改善されていた(図20〜22)。
MSC由来成長因子は、歯周組織の再生に関してMSC自体と同じ能力を有する。
右下の犬歯の内側部分に深さ7mmの深い歯周欠損が見られた。100%GFとアテロコラーゲンスポンジを欠損部に詰めた(図23、24)。16週間後、新たに形成された歯周組織によって欠損は臨床的に修復されたようであった(図25)。
[実施例5]
脳虚血モデル
全ての動物実験について動物実験委員会(名古屋大学医学部)の承認を受けた。300〜400gの雄の成獣スプレーグ・ドーリーラット(日本、静岡の日本エスエルシー株式会社)を用いた。動物に最初に5%イソフルラン(Abbott Laboratories, North Chicago)で麻酔をし、1.5%イソフルランを含む70%N2Oと30%O2の混合物を用いて麻酔下に維持した。加熱パッド上で直腸温度を37℃±0.5℃に維持した。永久局所脳虚血により、局所脳虚血を誘発した(pMCHO)(0日目)(図26)。火炎加熱で先端を丸めた4−0モノフィラメントナイロン縫合糸(Shirakawa, Tokyo, Japan)及びシリコーン(KE−200、Shin-Etsu Chemical, Tokyo, Japan)を、MCAの起源が塞がれるまで外頸動脈から内頸動脈中に進めた。閉塞後、レーザー−ドプラー血流計(Omega FLO−N1:Omega Wave Inc, Tokyo, Japan)を用いてMCA領域の局所脳血流を測定した。反応は、局所脳血流の減少が70%超の場合のみ陽性であるとみなして含めた。
pMCAOの72時間後(3日目)、ラットを再度5%イソフルラン(Abbott Laboratories, North Chicago)で麻酔し、1.5%イソフルランを含む70%N2Oと30%O2の混合物を用いて麻酔下に維持した。加熱パッド上で直腸温度を37℃±0.5℃に維持した。動物を無作為に3群に分け、SHED由来培養上清(SH−CM)を鼻腔内投与するか(n=1、16日目、屠殺=1)(I群)、生理食塩水のリン酸緩衝液(PBS)を鼻腔内投与するか(n=1、16日目、屠殺=1)(II群)、pMCAO操作だけを行った(n=5、16日目、屠殺=5)(III群)。SH−CMは、実施例1と同様に調製し、本実験に用いた。ラットを仰向けにし、巻いた4cm×4cmのガーゼで首を上げ、ハミルトンマイクロシリンジを用いて嗅覚経路でラット1頭当たり合計100μlを、1度に10μl、鼻腔を交互に変えながら、投与間隔2分で投与した。これらの手順中、口及び反対側の鼻腔は閉じておいた。鼻腔内投与は3日目〜15日目まで毎日行った。
標準化された運動障害尺度に軽微な変更を加えて用い、1、3、6、9、12、及び15日目にラットを盲検的に調べた。以下のパラメータのそれぞれについてラットに1ポイントを付加した:尾を持って瞬間的に吊した時のストロークと対側の前肢の屈曲、テーブルから引張られた時の対側後肢の伸展、及び抵抗に対して麻痺側への回転。更に、歩こうとした時の麻痺側への旋回運動に対して1ポイント付加し、直径50cmの円から10秒以内に歩いて出られなかった場合は1ポイント付加し、円を20秒以内に出られなかった場合は2ポイントを付加し、円を60秒以内に出られなかった場合は3ポイントを付加した。更に、テーブルに上から押しつけた時、横方向に(laterally)押した時、及び横に(sideways)押した時に、ラットが麻痺した前肢を伸ばすことができなかった場合、それぞれ1ポイントを付加した。運動障害尺度は、各動物時点につき3回評価した。
16日目のサンプルから得られた凍結切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。Image J(ML、米国国立衛生研究所)を用いて、厚さ20mm、1.00mm間隔の12個の冠状切片における各梗塞面積を求めた。これら12個の冠状切片は全梗塞領域を網羅していた。梗塞面積を合計し、これらの面積に切片間の距離(1.00mm)を乗じることで、局所梗塞体積を計算し、その後、脳水腫の治療を行った。
運動機能の評価
早い段階では全群(I群、II群、及びIII群)が運動機能について高いスコアを示した(スコアは、1日目が8;9;8.2±0.45、3日目が8;9;8.6±0.89)。6日目に、6日後のI群における運動障害の漸進的向上がII群及びIII群と比較して顕著になり(6;9;8.2±0.84)、9日目にはII群及びIII群と比較してより顕著になった(5;8;8.8±1.0)(図27)。I群では12日目(4)及び15日目(3)において持続的改善が記録され、II群及びIII群では15日目において運動障害の持続的損傷(8を超えるスコア)が観察された(9;8.25±0.96)。
梗塞体積は16日目にII群及びIII群(16日目、192.7mm3、n=1;16日目、222.7mm3、n=1)と比較してI群(16日目、54.3mm3、n=1)において有意に減少していた(図28)。これらの結果は、SH−CMの鼻腔内投与が再生を促進したことを示唆している。
また、サイトカイン療法では、鼻腔内投与を選択することにより侵襲性が低く、血管脳関門を通過して虚血部位に直接効果を発揮することがわかった。更に、乳歯幹細胞の培養上清には種々の栄養因子が含まれていると思われるため、栄養因子の単独投与よりも迅速な回復が期待される。
1.歯髄幹細胞の培養上清の調製
以下の手順に従って歯髄幹細胞(SHED及びDPSC)の培養上清を調製し(図29参照)、神経再生効果の検証実験に用いた。
(i) 歯髄幹細胞を血清(10%FBS)含有培地で、培養皿が70〜80%コンフルエントになるまで37℃、5%CO2下で培養する。
(ii) 70〜80%コンフルエントになったらPBSにて2回培養皿を洗浄し、無血清(0%FBS)培地へ培地交換する。
(iii) 48時間、37℃、5%CO2下で培養する。
(iv) 48時間経過した無血清培地を遠沈管へ回収する。
(v) 回収した無血清培地を1500回転で4〜5分遠心し、死細胞等の不純物を沈殿させる。
(vi) 遠心した遠沈管から不純物を吸引しないように、上澄みを新たな遠沈管へ回収する。
(vii) 回収した上澄みをさらに4℃、15000回転で1分間遠心し、再度不純物を沈殿させる。
(viii) 遠心した遠沈管から不純物を吸引しないように上澄みを再度新たな遠沈管へ回収する。
(ix) 得られた上澄みを歯髄幹細胞培養上清とする。
神経系細胞としてPC12細胞を使用した。当該細胞は、不死化株化されたラット副腎褐色細胞腫細胞である。神経栄養因子の一つであるNGF(nerve growth factor)を添加することで神経軸索様突起を伸長し、神経細胞様細胞へと分化することが知られており、様々なin vitroにおける神経系実験のモデル細胞として用いられている。
歯髄幹細胞の培養上清の神経突起伸長効果及びアポプトーシス抑制効果を、神経再生阻害物質(神経突起伸長阻害因子)の存在下及び非存在下で調べた。神経再生阻害物質としてCSPG及びMAGを用いた。実験の操作手順は以下の通りである。
(1)神経突起伸長実験
(i) 細胞培養用ウェル(ポリ-L-リジンコート)へ神経再生阻害物質(CSPG又はMAG)を24時間、37℃の条件でコートする。
(ii) PC12細胞を神経再生阻害物質コーティングプレートへ播種し、歯髄幹細胞の培養上清で24時間培養する。比較対照群としては、無血清培地、繊維芽細胞の培養上清、骨髄間葉系幹細胞の培養上清を用いる。
(iii) PC12細胞の神経突起伸長を位相差顕微鏡写真で評価する。
P12細胞を神経再生阻害物質コーティングプレートへ播種し、歯髄幹細胞の培養上清で24時間培養する。細胞のアポプトーシスをTUNEL法にて評価する。比較対照群としては、無血清培地、繊維芽細胞の培養上清、骨髄間葉系幹細胞の培養上清を用いる。
また、図31に示されるように、神経再生阻害物質CSPGが存在する条件であっても、歯髄幹細胞の培養上清は、神経突起の伸長を示す細胞の割合を高め、より長い突起の形成を促進する。
図34及び図35に示されるように、神経再生阻害物質MAGやCSPGをコートしたディッシュ上でPC12神経様細胞を24時間培養すると、ほぼ全ての細胞がアポプトーシスを起こす。歯髄幹細胞の培養上清は、このアポプトーシスをほぼ完全に抑制する。
(1)培養上清投与による下肢運動機能の改善
8週齢メスSDラットをペントバルビタールナトリウムによる全身麻酔下に第十胸椎を切除し、硬膜外からIHインパクターを用いて200kDynの力で圧挫損傷を加え、脊髄圧挫損傷モデルとした。圧挫損傷を与えた直後より、歯髄幹細胞培養上清(SHED-CM)、骨髄間葉系幹細胞培養上清(BMSC-CM)もしくはPBS(コントロール)を填入した完全埋め込み式マイクロインフュージョンポンプに連結したシリコンチューブを第十二胸椎下のくも膜下腔より挿入し、損傷部直上で流出するように設置した。24μl/日の流速で、と殺までの8週間、持続的に投与し、1週毎に下肢運動機能評価を行った。評価にはBasso-Beattie-Bresnahan(BBB)スコア(Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma., 1995:12:1-21.)を用いた。
0. 股関節・膝関節・足関節を全く動かせない。
1. 1〜2関節がわずかに動かせる。
2. 1関節のみ伸展できる。
3. 2関節のみ伸展できる。
4. 3関節全てをわずかに動かせる。
5. 2関節をわずかに動かし、1関節は伸展できる。
6. 1関節をわずかに動かし、2関節は伸展できる。
7. 3関節全て伸展できる。
8. 体重までは支えられないが、足底部を地に着き、這うことができる。
9. 時に下肢で体重を支え、這ったり歩いたりする。
10. ときどき(5〜50%)体重を支えて歩くことができるが、上下肢の協調性はない。
11. しばしば(50〜100%)体重を支えて歩くことができるが、上下肢の協調性はない。
12. ときどき(5〜50%)体重を支えて歩き、ときどき(5〜50%)上下肢の協調性を認める。
13. しばしば(50〜100%)体重を支えて歩き、しばしば(50〜100%)上下肢の協調性を認める。
14. しばしば足底部で体重を支え、上下肢の協調性を認める/常に足底部で体重を支えるが、両足の向きは外転している(筋力が弱いため)。
15. 上下肢の協調性を認め、ときどき(5〜50%)さっと踵を上げて歩く。ただし足首は外転している。
16. 上下肢の協調性を認め、しばしば(50〜100%)さっと踵を上げて歩く。ときに足の位置は中間位である。
17. 上下肢の協調性を認め、しばしば(50〜100%)さっと踵を上げて歩く。足の位置は中間位である。
18. 上下肢の協調性を認め、さっと踵を上げて歩く。足の位置は中間位である。
19. 上下肢の協調性を認め、さっと踵を上げて歩く。足の位置は中間位である。尻尾は下ろしている。
20. 上下肢の協調性を認め、さっと踵を上げて歩く。足の位置は中間位である。尻尾を上げている。
21. 上下肢の協調性を認め、さっと踵を上げて歩く。足の位置は中間位である。尻尾を上げてかつ、体重を支えることができる。
SHEM-CM(又はBMSC-CM若しくはPBS)投与開始から8週目にラットをパラフォルムアルデヒド還流固定した。続いて、損傷部から頭尾側5mmで脊髄を切断し取り出した。Sham群、コントロール群、BMSC-CM群、SHED-CM群でその重量を比較した。
SHEM-CM(又はPBS)投与開始から8週目にラットをパラフォルムアルデヒド還流固定した。損傷部から頭尾側5mmで脊髄を切断し、取り出した。次に、脊髄をO.C.Tコンパウンドにて凍結包埋し、脊髄凍結切片スライドを作製した。脊髄凍結切片スライドをセロトニン(5-HT)に対する抗体と、神経軸索に対する抗体Neurofilament-M(NF-M)にて免疫染色を行った。
コントロール群、SHED-CM群を脊髄圧挫損傷後24時間および1週間でパラフォルムアルデヒド還流固定した。損傷部から頭尾側5mmで脊髄を切断し、取り出した。取り出した脊髄をO.C.Tコンパウンドにて凍結包埋し、脊髄凍結切片スライドを作製した。脊髄凍結切片スライドを断片化されたDNAに特異的に反応するTUNEL、アストロサイト特異的抗体GFAP、神経細胞特異的抗体NeuN、オリゴデンドロサイト特異的抗体CNPaseにてそれぞれ二重免疫染色を行い、神経細胞、グリア細胞の細胞死を比較検討した。
2010年3月26日に出願された米国仮出願第61/317,713号、2010年11月5日に出願された米国仮出願第61/410,370号、2010年12月1日に出願された日本国特許出願第2010−267962号、2011年1月31日に出願された米国仮出願第61/437,697号及び、2011年2月23日に出願された日本国特許出願第2011−037028号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
Claims (6)
- 歯髄幹細胞を無血清培養することによって得られた幹細胞培養上清を含み、歯髄幹細胞を含まない損傷部治療用組成物を製造する方法であって、
以下のステップ(1)、(2')及び(3')を含む、損傷部治療用組成物の製造方法:
(1)歯髄細胞から接着性細胞を選抜するステップ;
(2')前記接着性細胞を、前記ステップ(1)に次ぐ培養において、更なる添加物を含まないDMEM/F12を用いて無血清培養するステップ;
(3')前記ステップ(2')の無血清培養の培養上清を回収するステップ。 - 前記ステップ(2')が、更なる添加物を含まないDMEM/F12を用いて72時間、無血清培養するステップである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ステップ(1)が、以下のステップ(1')である、請求項1又は請求項2に記載の製造方法:
(1')歯髄細胞を、DMEM、IMDM、ハムF12培地及びRPMI1640培地から選ばれる1種又は2種以上からなる基本培地に成長因子が添加されてなる培地で一次培養し、次いで、DMEM、IMDM、ハムF12培地及びRPMI1640培地から選ばれる1種又は2種以上からなる基本培地に成長因子が添加されてなる培地で1回〜3回継代培養することにより、歯髄細胞から接着性細胞を選抜するステップ。 - 前記損傷部治療用組成物が、皮膚の損傷、歯周組織の損傷、骨の損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、又は神経細胞の障害を伴う網膜疾患のいずれかの治療に用いるための組成物である、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 以下のステップ(4)を更に含む、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の製造方法:
(4)回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも1の処理を行うステップ。 - 以下のステップ(a)及び(b)の少なくとも一方を更に含む、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の製造方法:
(a)回収した培養上清について、神経再生阻害物質の存在下での神経突起伸長作用の有無を確認するステップ;
(b)回収した培養上清について、神経細胞に対するアポプトーシス抑制作用の有無を確認するステップ。
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