JP6860915B2 - 培養上清を生産する方法 - Google Patents
培養上清を生産する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6860915B2 JP6860915B2 JP2017210143A JP2017210143A JP6860915B2 JP 6860915 B2 JP6860915 B2 JP 6860915B2 JP 2017210143 A JP2017210143 A JP 2017210143A JP 2017210143 A JP2017210143 A JP 2017210143A JP 6860915 B2 JP6860915 B2 JP 6860915B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- culture
- cells
- human protein
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 title claims description 66
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 73
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 45
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 42
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 42
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 101000652133 Homo sapiens STE20-like serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 101000601460 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase Nek4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100030571 STE20-like serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 claims description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 12
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 11
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 11
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- -1 MesenCult Substances 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 210000004490 abdominal subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940105990 diglycerin Drugs 0.000 description 1
- GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N diglycerol Chemical compound OCC(O)COCC(O)CO GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000010944 ethyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003087 methylethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- IVZYVKMTNRHOHN-UHFFFAOYSA-H tetrasodium;difluorotin;phosphonato phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].F[Sn]F.[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O IVZYVKMTNRHOHN-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(1)非ヒトタンパク質を含む培地で細胞を培養する第一培養工程、
第一の非ヒトタンパク質不含培地で細胞を30分〜120時間培養する第二培養工程、
第二培養工程後に得られる培養上清を除去する除去工程、
細胞をさらに第二の非ヒトタンパク質不含培地で培養する第三培養工程、及び
第三培養工程後に得られる培養上清を回収する回収工程、
を含む、培養上清を生産する方法。
(2)第三培養工程が、12時間〜120時間行われる、(1)に記載の方法。
(3)除去工程後、第三培養工程前に、バッファー、生理食塩水、又は非ヒトタンパク質不含培地による洗浄工程をさらに含む、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)非ヒトタンパク質が、血清又は血漿である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)血清が、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、ウシ血清、及びウマ血清からなる群から選択される、(4)に記載の方法。
(6)回収工程で回収される培養上清が、血清を含まない、(5)に記載の方法。
(7)第一の非ヒトタンパク質不含培地及び第二の非ヒトタンパク質不含培地が、同一であるか又は異なる、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)第一の非ヒトタンパク質不含培地及び第二の非ヒトタンパク質不含培地が、基本培地、基本培地にヒトタンパク質を加えた培地、MesenCult、StemPro MSC、BMN211、StemMACS、MSC NutriStem XF、Xuri NSC、Prime-XV、StemXVivo、Human Mesenchymal-XF Expansion Medium、stemgro、STK2、PLTMax、ProculAD、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF、MesenGro、及びMSC-T4からなる群から選択される、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)第一の非ヒトタンパク質不含培地が、基本培地にヒトタンパク質を加えた培地、MesenCult、StemPro MSC、BMN211、StemMACS、MSC NutriStem XF、Xuri NSC、Prime-XV、StemXVivo、Human Mesenchymal-XF Expansion Medium、stemgro、STK2、PLTMax、ProculAD、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF、MesenGro、及びMSC-T4からなる群から選択され、第二の非ヒトタンパク質不含培地が、基本培地である、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)基本培地が、EMEM培地、DMEM培地、IMDM培地、GMEM培地、ハムF10培地、ハムF12培地、RPMI1640培地、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、(8)又は(9)に記載の方法。
(11)(1)〜(10)のいずれかに記載の方法により生産される、培養上清。
一態様において、本発明は、培養上清を生産する方法に関する。本発明の培養上清の生産方法は、第一培養工程、第二培養工程(本明細書中では、「前培養工程」とも記載する)、除去工程、第三培養工程、及び回収工程を必須工程として含む。また、選択工程として、洗浄工程及び精製工程等の他の工程を含んでもよい。本発明の方法を構成する各工程について、以下詳細に説明する。
本発明の方法は、非ヒトタンパク質を含む培地で細胞を培養する第一培養工程を含む。
本明細書において「非ヒトタンパク質」とは、細胞の増殖、接着、及び分化誘導(又は未分化維持)等を促進するために培地に添加される非ヒト生物に由来するタンパク質を指す。非ヒトタンパク質の例としては、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、及びサル等の哺乳動物、アフリカツメガエル等の両生類、ニワトリ及びダチョウ等の鳥類、昆虫類、線虫、酵母、大腸菌、及び植物からなる群より選択される生物、好ましくは非ヒト哺乳動物のタンパク質が挙げられる。非ヒトタンパク質は、これらの生物から単離されてもよいし、これらの生物に由来するタンパク質の組換え体を、哺乳動物、昆虫、酵母、及び大腸菌等の遺伝子組換え体に発現させて得てもよい。非ヒトタンパク質の具体例として、細胞増殖因子、接着分子、及び分化誘導因子(又は分化抑制因子)、例えば、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF-α)、トランスフォーミング増殖因子−β(TGF-β)、内皮細胞増殖因子(ECGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、及び血小板由来増殖因子(PDGF)、フィブロネクチン、ビトロネクチン、骨形成因子(BMP)等が挙げられる。本明細書において、「非ヒトタンパク質」は、上記非ヒトタンパク質のいずれか一種であってもよいし、複数の非ヒトタンパク質を含む混合物であってもよい。複数の非ヒトタンパク質を含む混合物の例として、血清及び血漿、並びにフィーダー細胞及び組織の培養上清等が挙げられる。血清又は血漿の例としては哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、又はブタの血清又は血漿が挙げられ、好ましくは血清、例えばウシ胎児血清(FBS)、ウシ新生児血清(NBS)、ウシ血清、及びウマ血清、さらに好ましくはウシ胎児血清である。
本発明の方法は、第一の非ヒトタンパク質不含培地で細胞を培養する第二培養工程を含む。
本明細書において、「非ヒトタンパク質不含培地」とは、本明細書に記載の非ヒトタンパク質を含まない、又は実質的に含まない培地を意味する。ここで、「非ヒトタンパク質を実質的に含まない」とは、本発明の効果、例えば後述する回収工程において非ヒトタンパク質の量が低減された培養上清が生産されるという効果を阻害しない程度の非ヒトタンパク質を含むことを意味する。
本発明の方法は、第二培養工程で得られる培養上清を除去する除去工程を含む。
培養上清の除去はデカンテーション及びアスピレーション等の通常の方法で行うことができる。ここで、第三培養工程で用いる第二の非ヒトタンパク質不含培地に混入しないように、第二培養工程の培養上清を完全に除去することが好ましい。
一実施形態において、除去工程の後、第三培養工程の前に、バッファー、生理食塩水、又は非ヒトタンパク質不含培地で細胞を洗浄する工程を含む。洗浄工程により、後述する回収工程において得られる培養上清に含まれる非ヒトタンパク質の量をさらに低減し得る。洗浄工程において用いるバッファー、生理食塩水、又は非ヒトタンパク質不含培地の種類は、洗浄工程が細胞の生存性に過度な影響を与えない限り限定されず、また上記溶液に糖等の添加物を加えたものであってよい。洗浄の回数は、例えば1回、2回、3回、又は4回とすることができる。
本発明の方法は除去工程後、又は洗浄工程後に、細胞をさらに第二の非ヒトタンパク質不含培地で培養する第三培養工程を含む。
本発明の方法は、第三培養工程後に得られる培養上清を回収する回収工程を含む。回収された培養上清は、遠心分離及び/又は膜ろ過等により、細胞や細胞に由来するデブリを除去してもよい。
本発明の方法は、回収工程後に得られた培養上清から、目的の産物をさらに精製する工程を含んでもよい。例えば、目的の産物がタンパク質であれば、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、また、目的の産物がエクソソームであれば、超遠心分離、免疫沈降等により精製することができる。
本発明の方法は、非ヒトタンパク質を含む培地で培養した細胞から、非ヒトタンパク質が低減された培養上清を生産することを可能とする。本明細書において、「非ヒトタンパク質が低減された」とは、本発明の方法の工程、例えば第二培養工程を経ていない培養上清に対して非ヒトタンパク質が低減されていることを意図する。一実施形態において、培養上清は、血清等の非ヒトタンパク質を含まないか、実質的に含まない。
一態様において、本発明は、本明細書に記載の方法により生産される培養上清に関する。本発明の培養上清は、培養を行う細胞の種類や培養条件に応じて、様々な物質を含み得る。例えば、培養上清は、遺伝子組換えを行っていない細胞が分泌する天然のタンパク質及び/又はエクソソームを含んでもよいし、遺伝子組換えを行った細胞が分泌する組換えタンパク質及び/又はエクソソームを含んでもよい。また、第三培養工程において細胞をウイルスに感染させることによって、ウイルスを含む培養上清を得ることもできる。培養上清に含まれるタンパク質の例として、治療用タンパク質、例えば酵素、ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン、増殖因子、抗体等、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
<材料と方法>
(不死化歯髄由来幹細胞からの培養上清の調製)
1)凍結された不死化歯髄由来幹細胞を液体窒素タンクから取り出し解凍し、10%FBSを含むDMEMにて洗浄し、T75フラスコ×1枚に播種し、10%FBSを含むDMEMで培養した。フラスコは全ての工程においてCoatingなしで使用した。
2)7割コンフルエントまで培養し、細胞を0.25%Trypsin-EDTA solutionを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T75フラスコ3枚に播種し、10%FBSを含むDMEMで培養した。
3)7割コンフルエントまで培養し、細胞を0.25%Trypsin-EDTA solutionを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T75フラスコ9枚に播種し、10%FBSを含むDMEMで培養した。
4)7割コンフルエントまで培養し、細胞を0.25%Trypsin-EDTA solutionを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T75フラスコ27枚に播種し、10%FBSを含むDMEM又はFBSを含まない無血清培地(MesenCult培地(StemCell)、StemPro MSC培地(ThermoFisher SCIENTIFIC)、BMN211培地(日水製薬)、StemMACS培地(Miltenyi Biotec)、MSC NutriStem培地(Biological Industries)、又はXuri MSC培地(GE Healthcare))で3日間培養した。
5)9割コンフルエントまで培養し、培養液を除去し、PBSにて各フラスコに付着している細胞を10mL、20mL、30mL、40mLと段階的に液量を増やして計4回洗浄した。
6)FBSを含まないDMEM培地をそれぞれのフラスコに加え、48時間培養した。
7)培養液を回収し、高速遠心にてデブリを除去し、培養上清液をセラムチューブに1mLずつ分注した。一部の培養上清を用いてELISA法によるウシアルブミン残存試験を実施した。ウシアルブミン残存試験は、Bovine Albumin ELISA Kit(Bethyl Laboratories)を用いて行った。測定方法は、キットに付属の説明書に従って実施した。簡単に記載すると、検量線用のアルブミン標準液を所定の濃度に調製後、96wellプレートのウェルに100μLずつ添加した。また、対象となる培養上清を96wellプレートのウェルに100μLずつ添加した。室温で1時間インキュベート後、プレートを付属の洗浄液で4回洗浄し、anti-albumin Detection Antibody溶液を100μLずつ添加した。室温でさらに1時間インキュベート後、プレートを付属の洗浄液で4回洗浄した。ここへ、100μLのHRP Solution Cを添加し、室温で30分間インキュベート後、プレートを付属の洗浄液で4回洗浄した。ここへ、100μLのTMB Substrate Solutionを添加し、室温、および遮光下で30分間インキュベートした。ここへ、100μLのStop Solutionを添加し、450nmの吸光度を測定した。得られた吸光度から、培養上清中のウシアルブミン量を算出した。
1)吸引腹部皮下脂肪より、コラゲナーゼTypeIを用いて細胞を分散し、ゲンタシンを含むFBSを含むMesenCult培地 (StemCell)に懸濁しT-25フラスコに播種した。培養にはMesenCult培地のキットに付属のAttachment SubstrateでCoatingしたフラスコを使用した。
2)2日に1回培地交換を行った。
3)7割コンフルエントまで細胞を培養し、細胞をAccutase(Life Technologies)を使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ2枚に播種し、FBSを含むMesenCult培地で培養を行った。ゲンタシンはこの時点から除去され、以降使用しなかった。また、以降で使用するフラスコはCoatingなしで使用した。
4)7割コンフルエントまで細胞を培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、バンバンカー(リンフォテック)を用いて液体窒素へ凍結保存した。
5)凍結した細胞を1本解凍し、PBSにて洗浄をして、T-75フラスコに播種し、FBSを含むMesenCult培地を用いて培養した。
6)7割コンフルエントまで培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ3枚に播種し、FBSを含むMesenCult培地で培養した。
7)7割コンフルエントまで培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ12枚に播種し、FBSを含むMesenCult培地で培養した。
8)7割コンフルエントまで培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ24枚に播種し、FBSを含まないMesenCult培地)で3日間培養した。
9)培養液を除去し、PBSにて各フラスコに付着している細胞を20mL、30mL、40mL、50mLと段階的に液量を増やして計4回洗浄した。
10)FBSを含まないDMEM培地をそれぞれのフラスコに加え、48時間培養した。
11)培養液を回収し、高速遠心にてデブリを除去し、培養上清液をセラムチューブに1mLずつ分注した。一部の培養上清液を用いてELISA法によりウシアルブミン残存試験を実施した。ELISA法の詳細は、不死化歯髄由来幹細胞について記載したのと同様である。
1)抜歯した乳歯(または永久歯)よりピンセットで歯髄を取り出し、Accutaseにて細胞を分散し、ペニシリン・ストレプトマイシンを含む、T-25フラスコに播種し、FBSを含むMesenCult培地で培養した。フラスコはMesenCult培地のキットに付属のAttachment SubstrateでCoatingしたフラスコを使用した。
2)2日に1回培地交換した。
3)7割コンフルエントまで培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ1枚に播種し、FBSを含むMesenCult培地で培養した。ペニシリン・ストレプトマイシンはこの時点から除去され、以降使用しなかった。また、以降で使用するフラスコはCoatingなしで使用した。
4)7割コンフルエントまで培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ3枚とT75フラスコ2枚に播種し、FBSを含むMesenCult培地で培養した。
5)7割コンフルエントまで培養し、大フラスコ3枚の細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ12枚にFBSを含むMesenCult培地で播種した。
6)7割コンフルエントまで培養し、細胞をAccutaseを使用して剥離し、PBS洗浄をして、T150フラスコ24枚に播種し、FBSを含まないMesenCult培地で3日間培養した。
7)培養液を除去し、PBSにて各フラスコに付着している細胞を20mL、30mL、40mL、50mLと段階的に液量を増やして計4回洗浄した。
8)FBSを含まないDMEM培地をそれぞれのフラスコに加え、48時間培養した。
9)培養液を回収し、高速遠心にてデブリを除去し、培養上清液をセラムチューブに1mLずつ分注する。一部の培養上清を用いてELISA法によりウシアルブミン残存試験を実施した。ELISA法の詳細は、不死化歯髄由来幹細胞について記載したのと同様である。
初代歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞及び不死化歯髄由来幹細胞を用いて、10%FBSを含むDMEM又はFBSを含まない血清不含培地で前培養した後に、血清不含DMEM培地に交換した後に、培養上清を回収し、含まれるウシアルブミン濃度を測定した結果を図1に示す。図1に示される通り、前培養を血清不含培地で行い、次に血清不含DMEM培地で培養した場合には、培養上清中にウシ胎児血清由来のアルブミンが検出されなかった。
<材料と方法>
実施例1と同様に調製した初代歯髄由来幹細胞を継代培養後、T25フラスコへ播種した。PBSで洗浄後、Accutaseにより酵素処理を行い、10%FBSを含むDMEM(DMEM+10%FBS)、MesenCult、DMEM、又はPrime-XVで懸濁し、播種した。播種後4、6、及び12時間後にPBS洗浄を行い、DMEMを添加し、48時間培養した。48時間培養後、DMEMを回収し、高速遠心後、上清を回収して、培養上清とした。続いて、培養上清中のウシアルブミン濃度を実施例1と同様に測定した。
結果を図3に示す。図3から示される通り、DMEM+10%FBSでは4h〜12hの前培養の後、DMEMによる最終培養後の上清にウシ胎児血清由来のBSAが検出された。一方、前培養に血清不含培地(MesenCult培地、DMEM培地、又はPrime-XV培地)を用いた場合には、前培養の時間に関わらず、最終培養後の上清にウシ胎児血清由来のBSAが検出されなかった。
Claims (5)
- 非ヒトタンパク質を含む培地で細胞を培養する第一培養工程、
第一の非ヒトタンパク質不含培地で細胞を30分〜120時間培養する第二培養工程、
第二培養工程後に得られる培養上清を除去する除去工程、
細胞をさらに第二の非ヒトタンパク質不含培地で培養する第三培養工程、及び
第三培養工程後に得られる培養上清を回収する回収工程、
を含み、
前記細胞が、哺乳動物に由来する細胞であり、
非ヒトタンパク質が、血清又は血漿であり、
第一の非ヒトタンパク質不含培地が、基本培地にヒトタンパク質を加えた培地、MesenCult、StemPro MSC、BMN211、StemMACS、MSC NutriStem XF、Xuri NSC、Prime-XV、StemXVivo、Human Mesenchymal-XF Expansion Medium、stemgro、STK2、PLTMax、ProculAD、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF、MesenGro、及びMSC-T4からなる群から選択され、
第二の非ヒトタンパク質不含培地が、基本培地であり、
基本培地が、EMEM培地、DMEM培地、IMDM培地、GMEM培地、ハムF10培地、ハムF12培地、RPMI1640培地、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
ヒトタンパク質が、細胞増殖因子、接着分子、分化誘導因子、又は分化抑制因子である、
培養上清を生産する方法。 - 第三培養工程が、12時間〜120時間行われる、請求項1に記載の方法。
- 除去工程後、第三培養工程前にバッファー、生理食塩水、又は非ヒトタンパク質不含培地による洗浄工程をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 血清が、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、ウシ血清、及びウマ血清からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 回収工程で回収される培養上清が、血清を含まない、請求項4に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017210143A JP6860915B2 (ja) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | 培養上清を生産する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017210143A JP6860915B2 (ja) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | 培養上清を生産する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019080526A JP2019080526A (ja) | 2019-05-30 |
JP6860915B2 true JP6860915B2 (ja) | 2021-04-21 |
Family
ID=66669276
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017210143A Active JP6860915B2 (ja) | 2017-10-31 | 2017-10-31 | 培養上清を生産する方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6860915B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7468955B1 (ja) | 2023-10-17 | 2024-04-16 | セルプロジャパン株式会社 | 細胞の培養上清を生産する方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05207874A (ja) * | 1992-01-28 | 1993-08-20 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 無血清培地 |
JPH05207875A (ja) * | 1992-01-28 | 1993-08-20 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 無血清培地 |
JP4268384B2 (ja) * | 2002-08-07 | 2009-05-27 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 日本脳炎ウイルス抗原及びその製造方法 |
JP2009045019A (ja) * | 2007-08-21 | 2009-03-05 | Toray Ind Inc | タンパク質の製造方法 |
JP2009273427A (ja) * | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトfshの製造方法 |
KR20130008594A (ko) * | 2010-03-26 | 2013-01-22 | 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 나고야 다이가쿠 | 손상부 치료용 조성물 |
JP2014039503A (ja) * | 2012-08-23 | 2014-03-06 | Tosoh Corp | 動物細胞の培養方法 |
JP6327647B2 (ja) * | 2013-02-13 | 2018-05-23 | 国立大学法人徳島大学 | 炎症性疾患の予防又は治療用組成物 |
US20200270570A1 (en) * | 2016-01-28 | 2020-08-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Wnt compositions and methods for serum-free synthesis |
-
2017
- 2017-10-31 JP JP2017210143A patent/JP6860915B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019080526A (ja) | 2019-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Santos et al. | Three-dimensional spheroid cell culture of umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells leads to enhanced paracrine induction of wound healing | |
JP7108537B2 (ja) | Cd201、cd46、cd56、cd147及びcd165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法 | |
JP6995752B2 (ja) | 細胞拡大培養方法及び治療用組成物 | |
US20120121545A1 (en) | Pharmaceutical Composition For Bone Disease Treatment Or Countering Inflammation, Comprising Cartilage Stem Cells As An Active Principle | |
JP6944165B2 (ja) | 間葉系幹細胞用培地 | |
JP6648259B2 (ja) | 向上された臍帯由来付着型幹細胞、その製造方法及びその用途 | |
CN111202751A (zh) | 间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用 | |
JP6860915B2 (ja) | 培養上清を生産する方法 | |
KR20140070794A (ko) | 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 조성물 | |
Takeda et al. | Osteogenic potential of human bone marrow–derived mesenchymal stromal cells cultured in autologous serum: A preliminary study | |
Yun et al. | Improved culture procedure for bovine muscle satellite cells for cultured meat | |
KR101555568B1 (ko) | 트레할로스 함유 세포 세정용액을 이용한 접착세포의 세정 방법 | |
WO2014200025A1 (ja) | 毛包形成用の組成物の品質管理方法 | |
Zhang et al. | Subchondral bone derived mesenchymal stem cells display enhanced osteo-chondrogenic differentiation, self-renewal and proliferation potentials | |
US20210180018A1 (en) | Composition for promoting stem cell differentiation, comprising progenitor cell culture solution and multilayer graphene film, and use thereof | |
JP2013247927A (ja) | 米糠由来の細胞増殖促進剤 | |
US20160333318A1 (en) | Method for the isolation, purification and amplification of renal progenitors cd133+cd24+ from the urine of patients suffering from renal diseases | |
US20240010986A1 (en) | Early mesenchymal stem cells with reduced aging and preserved stem cell ability, and culturing method therefor | |
KR101163840B1 (ko) | 난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물 | |
JP2023094881A (ja) | 培養上清を生産する方法 | |
WO2021060460A1 (ja) | 生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤 | |
Lan et al. | Isolation and culture of lamellar keratinocyte from bovine hoof | |
CN117098838A (zh) | 一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制造方法 | |
Chaudhary et al. | Mesenchymal stem cells (MSCs) from the mouse bone marrow show differential expression of interferon regulatory factors IRF-1 and IRF-2 | |
CN117547553A (zh) | Cd83+、cd83+pd-l1+间充质干细胞及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190617 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200219 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200417 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200908 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201029 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210316 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210322 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6860915 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |