CN117098838A - 一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制造方法 - Google Patents

一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制造方法，尤其是被分离并以特定方式繁殖的间充质干细胞，以及其用途。本发明具体涉及符合下列条件的间充质干细胞(MSC)的培养：a.提取自至少两个健康供体，其中供体不同于待治疗受试者，即同种异体；b.基本上没有衰老细胞；c.没有所述物种特有的病原体；d.具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CD llb、CD31、CD79α和CD19阴性；e.在繁殖期间，MSC的累积群体倍增值(即CPD值)优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；f.MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右，以及MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右；g.细胞数为105～5x107个。

Description

一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制造方法
技术领域
本发明涉及一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制造方法，尤其是被分离并以特定方式繁殖的间充质干细胞，以及其用途。
背景技术
关节炎症——亦称骨关节炎——是一种疾病，可能发生在任何年龄段的人和动物身上。由于关节软骨磨损和韧带逐渐减弱，这种疾病在老年人群中(狗通常在7岁以后)最为常见。
EP2504426(B1)(STEMPEUTICS RES PVT LTD[IN])涉及可供临床应用的间充质干细胞(MSC)的分离、采集和进一步繁殖的方法。该方法涉及一种包括间充质干细胞、勃脉力A、血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)和任选药学上可接受的添加剂的组合物的制作。该方法的关键是使MSC繁殖到适当数量，以制备供临床应用的产品。本文件对提取自人骨髓的MSC的繁殖进行了描述。在繁殖期间，影响MSC各种分化能力的标记不影响选择。在MSC繁殖期间，细胞未进行病原体筛选。
根据EP1276486(B8)说明书中所述的方法，该方法包括将MSC注射到关节以实现关节中软骨组织的再生。该说明书公开了将同种异体MSC用于制作一种用来改善动物关节的药物组合物。所述组合物用于治疗动物关节受损及改善关节组织。该说明书描述了提取自山羊骨髓的MSC的一般用途，且除了繁殖之外，MSC不受任何特定的、基于标记的选择的约束。
在P1500218匈牙利专利申请中，描述了一种用于治疗关节损伤，优选给定哺乳动物物种个体关节发育不良的组合物。所述制剂包括通过分离和繁殖相关程序提取自优选未被诊断出发育不良且在给定情况下未被诊断患有已知疾病的供体个体的同种异体MSC，以及阴离子、非硫酸化糖胺聚糖，优选透明质酸浓度为0.1-1wt％。MSC提取自供体的内脏脂肪组织。在MSC繁殖期间，细胞未进行病原体筛选。在繁殖期间，MSC不受任何特定的、基于标记的选择的约束。此外，为改善骨关节炎(OA)的症状而在关节内注射中应用透明质酸并未被授权用于每一物种，因此，我们旨在实现不含透明质酸的MSC产品。
Annalisa Guercio等人(Annalisa Guercio等人，《国际细胞生物学》，36(2)，(2012)，189-194)对提取自狗自身脂肪组织的MSC在患有肱桡关节慢性炎症的狗身上的应用进行了描述。因此，所述出版物描述了一种自体AD-MSC疗法，治疗过程中需将提取自待治疗受试者的干细胞重新注射到该受试者身上。在重新注射前，细胞须先进行微生物污染、分化能力和基因表达标记的筛选。然而，本文件未提及任何基于特定血小板反应蛋白-1细胞因子(THBS1)产生或犬尿氨酸代谢产物产生的选择步骤。
Kriston-Pàl等人(Kriston-Pàl等人，《加拿大兽医研究杂志》，2017，81；73-78)对已被选择用于治疗目的的AD-MSC进行了描述，旨在研究MSC的透明质酸溶液对患有关节炎症的狗的肘关节再生的效果。研究未对MSC的再生效果与特定犬尿氨酸代谢产物和/或血小板反应蛋白-1细胞因子水平之间的关系进行描述。透明质酸在某些个体身上的应用是不允许的；因此，需要研发一种不含透明质酸、但疗效良好的组合物。
Maumus等人(Maumus等人，《免疫学前沿》，2017(8)，1638)旨在通过分泌组分析，研究THBS1细胞因子水平在ASC细胞的软骨保护和抗炎作用中是否起到一定作用。尽管对THBS1细胞因子的作用已有广泛研究，但本文件未提及由于GADD45和CEBPb及其靶蛋白MMP13表达减少而对肥大软骨细胞的抑制，亦未提及犬尿氨酸代谢产物产生的作用。
上述现有技术文件中公开的信息通过援引纳入本文中，特别是关于繁殖的应用定义和方法的描述方面。
骨关节炎(关节炎症)是一种多因素疾病，即并非由单一因素而是由若干不同因素造成的疾病。虽有遗传倾向，但也可能是由以前的创伤或伤害引起。这种疾病还可能由包括关节在内的骨骼发育障碍(髋关节或肘关节发育不良)或关节软骨的异常磨损造成。肥胖会增加患有这种疾病的风险，且肥胖会使关节负荷过重，从而加重病情。通常受到影响的是髋关节、膝关节或肘关节。
这种疾病主要(尽管不完全如此)由遗传引起，是一种遗传病，而不一定是由受伤导致。因此，为提供最佳治疗，也应考虑这一点，并且为获取相应疗效的MSC，确保同种异体来源很重要。
获取同种异体MSC的另一个因素是无需为此而进行微创介入；必须从选择接受介入的个体身上取出组织并作为废物处理。
众所周知，此种疾病可用间充质干细胞(MSC)进行治疗，但疗效可能会有所不同。
本发明的目的是消除以往解决方案的缺点，并且研发一种用于治疗受试者骨关节炎、使患有骨关节炎的受试者的软骨组织再生、从而摆脱跛行、恢复健康的含MSC组合物。
发明总览
技术问题
因此，另外还需有一种应用提取自脂肪组织的同种异体MSC的方法和组合物，以便能够简单、有效地治疗骨关节炎(即关节退变)，因为在满足某些条件的情况下，MSC的分化可被定向，从而更有效地治疗疾病。另外一个重要的方面是提取自同种异体MSC的最终产物的应用应尽可能安全，这在现有技术中所述的文件中未予适当公开。
本发明的有益疗效
出人意料地，发明人发现，通过已知方法获取并经几个步骤繁殖后选择的AD-MSC，在MSC分化过程中可以将形成的增生性软骨细胞表型有效抑制在适当浓度，这是一种促进异常关节组织修复的方法。
出人意料地，发明人发现，产生一定量犬尿氨酸代谢产物和THBS1细胞因子的AD-MSC，可以在MSC分化过程中有效抑制增生性软骨细胞表型的形成。
减少增生性软骨细胞表型的形成将促进更快修复，因为较大比例的植入MSC可分化为健康的软骨细胞，从而使软骨组织得到快速且有效的修复。
因此，我们的创造性发现是：用于治疗骨关节炎的MSC分离株中存在的特定水平的犬尿氨酸和THBS1负责MSC的分化和再生效果。
此外，分离MSC的质量亦取决于其所产生的细胞因子谱，及倍增时间(PD，群体倍增值)在繁殖期间确定。前者确保不同制作批次的制剂由质量相似的MSC组成，而后者则通过将最终群体重复值(CPD，累积群体倍增值)保持在12以下，实现安全、非致瘤性制剂的制作。控制CPD值的重要性在于避免和过滤掉在分化过程中容易朝不利方向增殖的肿瘤样MSC。
其还促进产品的安全使用，即我们检测出狗身上存在26种病原体，但我们仅将经证实无病原体的MSC用于最终产品。
附图简述
本发明的主题包括具备以下特征的同种异体MSC：
-提取自至少两个不同于待治疗个体的健康供体；
-形态健康、基本上没有衰老细胞；
-无病原体；
-具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性；
-在繁殖期间，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；
-MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右；MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右。
本发明的主题还包括含以下MSC的组合物：
a)具备下列特征的同种异体MSC：
-提取自至少两个不同于待治疗个体的健康供体；
-形态健康、基本上没有衰老细胞；
-无病原体；
-具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性；
-在繁殖期间，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；
-MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右；MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右；以及
b)一种或多种药学上可接受的添加剂。
理想情况下，一种或多种药学上可接受的添加剂为冷冻保护剂，优选为含DMSO的汉克平衡盐溶液(HBSS)。
理想情况下，同种异体MSC数为105～108，在所述组合物中优选为105～5x107。
理想情况下，MSC提取自属于同一物种的两个单独供体，优选为3～15个，更优选为4～8个，最优选为5～7个。
非常有利的是，所述组合物是一种平衡制剂，其中含有选取自单独供体的MSC，且所述MSC的混合方式为：将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到最终产品，并且将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到最终产品，如此便可获得不同扩增周期中产生的犬尿氨酸总量和THBS1细胞因子总量相似的平衡MSC混合物。
本发明的对象还涉及用于治疗需治疗受试者骨关节炎的同种异体MSC，其中同种异体MSC具备下列特征：
-提取自至少两个健康供体，其中供体与需治疗个体不同；
-形态健康、基本上没有衰老细胞；
-无病原体；
-具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性；
-繁殖过程中，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；
-MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右；MSC的THBSI细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右。
本发明的对象还涉及用于治疗需治疗受试者骨关节炎的含同种异体MSC组合物。
MSC优选提取自属于同一物种的两个单独供体，优选为3～15个，更优选为4～8个，最优选为5～7个。
理想情况下，MSC提取自从常规卵巢子宫切除术中切除的腹部脂肪组织中分离出来的血管基质组分(SVF)。
理想情况下，用于治疗单个关节的MSC数为105～108，优选为105～5x107。
理想情况下，MSC或组合物在关节内注射或采取植入形式。
根据优选实施例，受试者为非人类哺乳动物。根据更优选的实施例，受试者为草食、肉食或杂食动物。根据优选实施例，受试者为家畜。根据优选实施例，受试者为犬科动物、猫科动物、马科动物、反刍动物或猪类动物，例如狗、马、猫、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼等。最理想的情况下，受试者为狗。
本发明的对象还涉及用于治疗受试者骨关节炎的MSC的制备方法，其中包括下列步骤：
a)将血管基质组分(SVF)从至少两个不同于待治疗受试者、但属于同一物种的健康供体中分离出来；
b)配备分别获取自每一分离组分(优选通过胶原酶消化获取)的MSC；
c)分别将所获取的MSC进行沉淀，并优选将其重悬于平衡盐水缓冲液(例如汉克缓冲液)中；
d)分别繁殖重悬后的MSC，优选至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P1细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性但呈CD45、CD34、CD14、CD1lb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右的繁殖MSC；
e)解冻部分选定的P1细胞库，并进一步繁殖MSC，以至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P2细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性但呈CD45、CD34、CD14、CD1lb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右，MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右；MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右的繁殖MSC；并且
f)重复步骤e)，直至MSC数达到105～108，优选为105～5x107，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右。
理想情况下，将MSC悬浮于含5％DMSO的汉克缓冲液中，并冷冻储存。
理想情况下，MSC提取自属于同一物种但不同于待治疗个体的两个单独供体，优选为3～15个，更优选为4～8个，最优选为5～7个。
理想情况下，MSC提取自从常规卵巢子宫切除术中切除的腹部脂肪组织中分离出来的血管基质组分(SVF)。
本发明的对象还涉及一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制作方法，其中包括下列步骤：
a)将血管基质组分(SVF)从至少两个不同于待治疗受试者但属于同一物种的健康供体中分离出来；
b)分别配备获取自每一分离组分(优选通过胶原酶消化法获取)的MSC；
c)分别将所获取的MSC进行沉淀，并优选将其重悬于平衡盐水缓冲液(例如汉克缓冲液)中；
d)分别繁殖重悬后的MSC，优选至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P1细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性但呈CD45、CD34、CD14、CD11b、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右的培养MSC；
e)解冻部分选定的P1细胞库，并进一步繁殖MSC，以至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P2细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性但呈CD45、CD34、CD14、CD1lb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右，MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右，MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右的培养MSC；
f)重复步骤e)，直至MSC数达到105～108，优选为105～5x107，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8；
g)将分别选取自每个供体并进行繁殖的MSC进行混合，混合取决于其犬尿氨酸和THBS1细胞因子的产生水平，混合方式为：将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到所述组合物，并且将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到所述组合物，并且
h)将一种或多种药学上可接受的添加剂添加到所述平衡组合物。
理想情况下，将所述平衡组合物悬浮于含5％DMSO的汉克缓冲液中，并冷冻储存。
本文中使用的“干细胞”一词是指一方面能够为了自我维持而进行(在某些情况下，为进行有限数量的)分裂，且同时可生成一种或多种分化细胞类型的未经分化或未完全分化的细胞。
“组织干细胞”一词是指在个体发育(优选到成年)过程中至少部分保持未分化，且能够分化为优选有限数量或类型的组织，优选分化为与其接触的组织或细胞特有的细胞类型的多能干细胞。组织干细胞的作用是确保有机体组织和死亡或老化细胞的更新换代。
本文中使用的“间充质干细胞”(MSC)一词是指具备下列特征的多能(优选为基质，即具有支撑组织起源和/或定位)组织干细胞：i)具有粘附性，并能够附着在表面上，ii)至少能够分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，及iii)呈CD105、CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CD llb、CD79α和CD19阴性。
“形态健康”一词是指基本上没有衰老细胞的年轻、可存活、小型类成纤维细胞，而不同于年轻细胞，衰老细胞在形态上要更大、更扁平一些。衰老细胞较为衰老，其功能已发生改变，不仅功能不正常，而且还会破坏周围细胞的功能。
本文中使用的“无病原体”一词是指繁殖细胞培养物中不含所制成的最终产品一旦注射即可能会造成感染的、任何给定物种特有的活病原体。病原体检测在经PCR分析后通过病原体特异性引物进行，即使是极其微量的病原体，亦可被高效地检测出。
本文中使用的“累积群体倍增值(CPD)”一词是指在培养过程中计算的群体倍增(PD)值的总和。
群体倍增值(PD)根据初始细胞数(X0)和培养结束时确定的细胞数(N)按以下公式计算得出：PD＝3.32(log(N)-log(X0))。MSC的PD值优选为0.5～5，更优选为1～4，最优选为3左右。
本文中使用的“平衡组合物”一词是指一种制剂，其中含有提取自至少两个属同一物种之供体的MSC，且选取自单独供体并进行分离的MSC根据犬尿氨酸和THBS1细胞因子的生产水平进行混合：将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到最终产品，并且将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到最终产品，如此便可获得不同扩增周期中产生的犬尿氨酸总量和THBS1细胞因子总量相似的MSC混合物(即包括日后获取自其他供体的MSC混合物)，从而确保通过独立培养制成的制剂具有相似的软骨再生特征。
本文中使用的“基质”或“支撑组织”等词是指与有机体的给定结构相关或围绕该结构的组织，例如，某个器官或优选为其功能组织(“薄壁组织”)，在力学上支撑结构或器官或优选为薄壁组织中起到一定作用。理想情况下，基质含有或主要含有或包含结缔组织。理想情况下，基质包括或主要包括或包含结缔组织。
“结缔组织”是一种纤维组织，其中至少含有细胞外纤维、无定形细胞间物质(基质)以及纤维嵌入基质中的固定和移动细胞。结缔组织包含有骨组织、肌腱组织、软骨组织和脂肪组织等等。结缔组织支撑并连接内脏，参与骨形成，形成血管壁，连接肌肉和骨骼，并在受伤时取代其他类型的组织。
本文中使用的“脂肪组织”一词是指一种动物结缔组织，主要包含间充质起源的脂肪细胞，其最重要的功能是进行能量储存，保护有机体免受物理效应(寒冷、力学冲击)的影响，为某些器官提供缓冲。脂肪组织可分为两类：黄色(也称为白色)脂肪组织(在能量储存方面发挥重要的作用)和棕色脂肪组织(主要功能是产生体热)。
本文中使用的“脂肪细胞”一词是指专门以脂质空泡中脂肪的形式储存能量的细胞。除存在脂质空泡外，脂肪细胞优选特征在于以下标记的表达：PPARg、aP2和HSL、Adipoq、Cebpa等等。脂肪细胞可以是白色脂肪细胞，其特征在于(例如)扁平细胞核和外周细胞核、大空泡，及分泌脂联素、抵抗素和瘦素，也可以是棕色脂肪细胞，例如多边形脂肪细胞。
本文中使用的“内脏”器官一词是指有机体的内脏，尤其是在腹腔和胸腔内的器官，例如呼吸系统、消化系统、泌尿系统、内部生殖器官、肝脏、心脏或胃。
“内脏脂肪组织”是指与“内脏”器官相关或在某些情况下围绕“内脏”器官的脂肪组织。
本文中使用的“受试者”一词是指给定的动物。理想情况下，说明书中所使用的动物不包括人类。理想情况下，所述动物选自哺乳动物。
犬尿喹啉酸(KYNA)的前体是“犬尿氨酸”(KYN)，是一种色氨酸代谢产物。
血小板反应蛋白-1(简称“THBS1”)是一种THBS1基因编码的蛋白。这种蛋白是一种粘着糖蛋白，介导细胞间和细胞与基质间的相互作用。这种蛋白可与纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、V型和VII型胶原蛋白和α-V/β-1整联蛋白结合。其在血小板聚集和肿瘤发生方面发挥重要作用。
在本申请的附件中，除非另有注明，否则单数形式的词语亦包括其复数含义。同样地，除非另有注明，否则名词前面的不定冠词“a”亦包括其复数形式。
在说明书中，“包括”一词应理解为事物可能还包含除所列元素以外的其他元素，但无论如何都包含所列元素。“包括”一词涉及“基本包含”的表达，因为后者涉及存在除所列元素以外的其他元素，但该等其他元素不会影响本发明的技术效果。如为“包含”一词，则事物不能包含除所列元素以外的其他元素，除非该等元素微不足道，并隐含地包含在事物内容中。“包括”一词可限于“基本包含”和“包含”的表达。
图1
【图1】1A所示为通过ELISA测定的每个供体繁殖MSC产生的犬尿氨酸代谢产物量。
1B所示为将30ng/ml犬尿氨酸添加到分化MSC、以研究对肥大软骨细胞标记影响的实验。在所述实验中，通过测量其在软骨细胞分化第10天(早期)和第24天(晚期)的相对RNA水平，我们测得了增生性软骨细胞分化的两大调控转录因子(即GADD45和CEBPb因子)及其靶点基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达。
1C所示为上述测量的结果。
图2
【图2】2A所示为通过ELISA测定的每个供体繁殖MSC产生的THBS1细胞因子量。
2B所示为将50ng/ml THBS1细胞因子添加到分化MSC、以研究对肥大软骨细胞标记影响的实验。在所述实验中，通过测量其在软骨细胞分化第10天(早期)和第24天(晚期)的相对RNA水平，我们测得了增生性软骨细胞分化的两大调控转录因子(即GADD45和CEBPb因子)及其靶点基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达。
2C所示为上述测量的结果。
图3
【图3】3A所示为因进行手术并植入不同剂量(细胞数)MSC造成软骨损伤后的跛行程度变化图。该图清楚地表明，施用2x106剂量的平衡制剂对改善跛行的情况效果最好。
3B、3C、3D很好地展示了与安慰剂相比，所选本发明中的MSC是如何使受损软骨组织再生的。
3E所示为在注射根据本发明制成的平衡MSC制剂后，受损软骨组织是如何长出新的软骨组织的。
图4
【图4】所示为根据本发明制成的平衡制剂对改变狗的跛行情况的影响(数据取自【图3】中所述关于安慰剂与靶剂量的实验)。
实施例说明
关节形成于骨端交叉处。骨骼运动是通过覆盖在骨表面的软骨层和填充关节腔的滑液实现的。
如患有骨关节炎，则软骨开始朝更深的软骨层磨损，直至骨表面裸露出来，从而阻碍了骨骼的无摩擦运动。软骨和骨表面可能会有小块脱落，这些小块因在关节腔内运移而造成进一步的炎症和疼痛。由于滑液制备也发生了变化，导致炎症细胞出现在临近血管中。
大多数饲养主都希望动物会哀嚎或呜咽，以便在患有严重的关节炎时可以清楚地表达出来。然而，这样的事几乎从未发生过；饲养主通常只是注意到动物不那么活跃，行动更加缓慢，并且不乐意跑向自己喜欢的球了。再过些时候，便可能难以起身、从沙发上跳起来或下楼梯，或其中一条腿开始出现跛行的情况。以上都是慢性疼痛的症状，可能会因剧烈运动、长时间不活动或寒冷天气而加重。起初，疼痛只是在骨骼运动时会影响肢体，到后期，即使是在休息时也会影响肢体。
根据本发明，采用提取自若干健康供体脂肪组织的同种异体干细胞混合物对患有骨关节炎的受试者进行治疗。提取自脂肪组织的混合干细胞不会遭到受治疗动物的排斥。
根据本发明，同种异体MSC是通过人道程序从内脏脂肪组织中获取的，或从手术废弃组织中获取的；因此，我们从健康动物卵巢切除术中产生的废弃内脏脂肪组织中进行采集。
根据本发明，公开了一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制作方法，其中所述方法包括分别从不同于待治疗受试者且未被诊断患有发育不良(最好未患有已知疾病)的多个(优选为3～15个，更优选为4～8个，最优选为5～7个)供体个体分离间充质干细胞；在培养一个生长周期后通过冷冻生成细胞库；进行病原体检测，继而再培养两个生长周期或(换言之)两代；对繁殖细胞的细胞因子谱进行测定，并在经传代培养后，根据产生的犬尿氨酸代谢产物量和THBS1细胞因子量，按不同比例将各部分提取自供体的繁殖间充质干细胞(MSC)进行混合；然后分配到培养基中，以确保细胞通过冷冻得以长期储存并存活，同时能够在解冻和稀释后将制剂直接注射到受骨关节炎影响的关节部位。
除间充质干细胞外，根据所述方法制成的组合物还含有用作冷冻保护剂和汉克平衡盐溶液(HBSS)的DMSO。
所述制剂在液氮中可以长期(超过12个月)储存。所述组合物利用干冰运送至使用地，并建议在-80℃温度下进行短期储存(优选为0～21天，更优选为1～14天，最优选为2～7天)，在该等条件下细胞将保持活力和软骨再生作用。
我们从优选为5～7个供体的常规卵巢子宫切除术中切除的腹部脂肪组织中分离出血管基质组分(SVF)，并在体外培养至少3代(P)。经过培养，只有脂肪组织源性间充质干细胞存活下来，因此我们获取了含有大量细胞的纯MSC群体。细胞优选通过胶原酶溶液消化后从脂肪组织中释放出来。我们在“平衡盐溶液”中，即在模拟生理条件的溶液中(例如在汉克缓冲液中；溶液量取决于待处理的脂肪组织量)，配置了0.1％～1％的胶原酶溶液。分离后，细胞在适合培养哺乳动物细胞的培养基中培养，例如Eagle最低基础培养基(EMEM)或由Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)[Dulbecco最低基础培养基(EMEM)]，或优选为DMEM/F12细胞培养基(DMEM/F12)。
关于适合本发明的培养基的进一步信息可在例如Sato等人的述评(Sato、J.D.和Kan，M.2001。《哺乳动物细胞培养基》。《细胞生物学实验室指南》。(发表日期：1998年10月))中找到。关于哺乳动物细胞培养方法的详细指南可在Phelan的出版物(Phelan，M.C.2007。《哺乳动物细胞组织培养基本方法》。《细胞生物学实验室指南》。(发表日期：2007年9月1日)和Vinci V.A.等人的出版物(Vinci、Victor A.、Parekh、Sarad R.等人合编：《工业用细胞培养手册：哺乳动物、微生物和植物细胞》；由胡马纳出版社发表于2003年)中找到。
在SVF分离并培养至一代(P1)后，P1细胞在每种情况下经冷冻后生成细胞库(P1细胞库)，且只有那些经我们证实为无病原体的细胞才会得到繁殖，这样就消除了培养的细胞可能成为病原体来源以及传染病由供体个人传染给受治疗动物的风险。解冻后，无病原体P1细胞库分离株至少再繁殖两代(P2和P3)。
出人意料地，我们的实验表明，产生一定量犬尿氨酸代谢产物和THBS1细胞因子的繁殖MSC，可以在MSC分化过程中有效抑制增生性软骨细胞表型的形成，这是由于GADD45和CEBPb及其靶蛋白MMP13表达减少所致。抑制增生性软骨细胞表型的形成最终促进了异常关节组织的修复。所述组合物的疗效要比同样包括同种异体MSC、但不产生适当水平犬尿氨酸和THBS1细胞因子的繁殖MSC细胞分离株的疗效更好。
为分配合适条件的细胞，我们对P2或P3阶段产生的某些细胞因子(例如THBS1)、细胞形态、重复时间、MSC表面标记、核型和犬尿氨酸进行了检测。从培养容器中获取五到七个分离株，并根据其犬尿氨酸代谢产物和THBS1细胞因子的产生水平，将细胞进行混合，混合方式为：将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到最终平衡组合物，并且将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到最终平衡组合物，如此便可获得不同扩增周期中产生的犬尿氨酸总量和THBS1细胞因子总量相似的MSC混合物(即包括日后获取自其他供体的MSC混合物)，从而确保通过独立培养制成的制剂具有相似的软骨再生特征。所述细胞混合物用汉克缓冲液清洗。将细胞团块悬浮于含DMSO的汉克缓冲液中，分配到冻存管，并储存于液氮中。单次剂量含有500.000-10.000.000个细胞；这就是我们所说的平衡组合物。我们对最终产品中的内毒素水平进行了测量。
所述组合物可利用干冰运送至使用地。细胞可在干冰中，或在-80℃温度下进行短期储存(优选为0～21天，更优选为1～14天，最优选为2～7天)。冷冻培养基确保细胞制剂即使在长期储存后也能保持活力，并且，能够在解冻后直接进行关节内注射，而无需在使用地将其从细胞中取出(这即便是在普通兽医诊所中亦无法做到)。
所述平衡组合物含有已通过质检的MSC，系提取自优选为五到七种类型的供体，并根据其犬尿氨酸和THBS1细胞因子的产生水平按一定比例进行混合。
患有骨关节炎的狗会因关节疼痛而较少着力于患病腿，表现为走路时跛行。兽医对所述制剂进行了初步检测；在进一步的体内实验过程中，由受治疗动物的饲养主在标准化问卷中对动物状况进行评估；此外，兽医也填写了标准化问卷。测量结果表明，所述平衡组合物可被用于治疗骨关节炎。
实施例
1.供体选择：
已强制接种(狂犬病)疫苗的小型或中型杂交母狗可作为脂肪组织供体。我们确定了宽松年龄上限为2～8岁，严格年龄上限为2～6岁，最佳年龄上限为3岁。脂肪组织获取自常规卵巢子宫切除术产生的废弃物；因此，制造间充质干细胞(MSC)无需进行微创手术。MSC分离株分别取自每个供体制备而成。将脂肪组织置于装有25ml汉克平衡盐溶液(HBSS)的无菌容器中，并(在4-10℃温度下)进行冷却后运送至培养地。
2.MSC分离、繁殖、P1细胞库的生成
a.分离
i.供消化的组织的制备
ii.所述组织在0.2％含胶原酶的HBSS溶液中进行消化。用5％的FCS阻断消化过程，然后进行清洗。清洗后，将细胞团块重悬于DMEM/F12+10％FCS溶液(培养基)中，具体方式为3ml培养基中含有1g脂肪组织。
通过从细胞团块中进行两次独立采样：50μl细胞+450μl DT溶液(800μl0.2％的台盼蓝溶液+200μl蒸馏水)，我们根据平均值计算了细胞数。
可以从优选为5～9g、更优选为6～8g的脂肪组织中，分离出优选为5x106～20x106、更优选为7x106～15x106、最佳为14x106的细胞。
b.分离细胞的繁殖
i.我们在细胞培养箱中培养分离细胞，直至达到70-80％的融合度。取决于供体，上述值优选为在1～10天内，更优选为在2～8天内，最优选为在5天内达到。在繁殖期间使用的完全培养基：
·DMEM/F12(由Dulbecco改良的Eagle培养基/F-12营养培养基)
·10％FCS(胎牛血清)
·50μg/ml青霉素/链霉素
c.P1细胞的采集
从P1细胞培养物中取出培养基，并将细胞采集在离心管中储存。我们从由此获得的细胞悬液中取样，并进行病原体分析以检测出源自供体的病原体。
d.冷冻P1细胞库
用离心机将上述获得的细胞悬液分离，将细胞团块重悬于含10％DMSO的FCS中，分配到冻存管，并在-80℃的温度下储存最多24小时或在液氮中长期储存。因此，我们创建了P1细胞库。
e.P1细胞的质量控制
i.群体倍增值的计算
群体倍增值(PD)根据初始细胞数(X0)和P1培养结束时确定的细胞数(N)按以下公式计算得出：PD＝3.32(logN-logX0)。
MSC的PD值优选为0.5～5，更优选为1～4，最优选为3左右。
ii.检测细胞形态
采集前，先用显微镜观察繁殖细胞并进行分析和记录。我们在培养每一代前都进行此项分析，因为细胞形态可以反馈细胞状况。我们研究了在繁殖期间，培养物中是否会有衰老细胞；它们的形态不同：更大、更扁平。(衰老细胞较为衰老，其功能已发生改变，不仅功能不正常，而且还会破坏周围细胞的功能。)
iii.检测P1细胞中源自供体的病原体
我们在MSC裂解液中配置了26种已知犬类病原体(表1)的稀释系列，并确定了病原体的检测限，即所采用的PCR(聚合酶链反应)检测的灵敏度。方法如下：
我们从MSC裂解液中分离出核酸。
首先，我们确定所采用的PCR(聚合酶链反应)检测的灵敏度，为此从26种已知犬类病原体(即DNA病毒，比如腺病毒科，例如犬腺病毒1型(CAV-1)，比如细小病毒科，例如犬细小病毒(CPV)，比如疱疹病毒科，例如犬疱疹病毒、犬疱疹病毒1型(CaHV-1)、犬甲型疱疹病毒1型、猪疱疹病毒1型(伪狂犬病病毒)、猪疱疹病毒1型(SuHV1)、猪甲型疱疹病毒1型，比如乳头瘤病毒科，例如犬口腔乳头瘤病毒(COPV)、ncbi：人乳头瘤病毒2型；RNA病毒，比如副黏液病毒科，例如犬瘟热麻疹病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)，比如正黏液病毒科，例如犬流感病毒(CIV)，比如弹状病毒科，例如狂犬病病毒(狂犬病毒)，比如冠状病毒科，例如犬冠状病毒CCoV(1型和2型)；细菌，比如支原体科，例如支原体，比如钩端螺旋体科，例如钩端螺旋体血清型：血清型黄疸出血热、Copenhagi、犬热，比如孢子菌科，例如疏螺旋体，比如布鲁氏菌科，例如犬布氏杆菌，比如无形小体科，例如犬艾利希体、嗜吞噬细胞无形体、扁平埃利希体、新立克次氏体、立克次氏体，比如巴尔通氏体科，例如文森巴尔通体/巴尔通氏体病；原生动物门，比如动物门：顶复亚门/巴倍科，例如巴贝西虫，比如脊索动物门：顶复亚门/肉囊虫科，例如巴贝西虫，比如脊索动物门：犬新孢子虫，比如脊索动物门：眼虫门/锥虫科，例如克氏锥虫/锥体虫病，比如脊索动物门：眼虫门/锥虫科，例如利什曼虫，比如线虫动物门/蟠尾丝虫科，例如犬恶丝虫、肠内蛔虫(犬弓蛔虫、狮弓蛔虫、人蛔虫))中分离出核酸，并在MSC裂解液中配置所获得核酸的稀释系列。为确定检测限，我们通过病原体特异性引物进行了PCR，并定义了仍会产生PCR产物的最小核酸浓度。接下来，PCR在提取自不同供体的P1细胞样本中与病原体特异性引物发生反应。结果呈阳性，表明MSC培养物感染了给定病原体。经PCR分析，证明无病原体的MSC得到进一步繁殖。
3.无病原体MSC繁殖至P3代
a.P2代繁殖
解冻后，细胞在培养箱中培养，直至细胞培养物覆盖培养皿底部的90％。细胞培养基每3～4天更换一次。P2代培养期结束后，针对每个供体获取了15x106～45x106个细胞。上述确定的PD值优选为0.5～5，更优选为1～4，最优选为2左右。
如上文所述，还对细胞形态进行了检测。
b.P3代繁殖和质量控制
进行细胞培养，直至细胞培养物覆盖培养皿底部的80％。细胞培养基每3～4天更换一次。
检测细胞形态。
上述确定的PD值优选为0.5～5，更优选为1～4，最优选为2左右。
我们确定了累积群体倍增值(CPD)，该值与在繁殖期间计算的群体倍增值的总和相同。
在繁殖期间，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右。
我们通过细胞表面标记检测了群体的纯度：
它们呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CD llb、CD31、CD79α和CD19阴性。
我们对MSC分离株能否朝软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞方向分化进行了检测。
我们确定了细胞因子谱，为此我们从P3细胞的上层清液中进行了取样。采用ELISA方法(酶联免疫吸附测定法)来检测下列细胞因子的产生量：血小板反应蛋白-1(THBS1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞因子(SCF)、转化生长因子β(TGFβ)、白细胞介素1受体拮抗剂(ILlRa)、白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素13(IL-13)。在进行两到三次独立繁殖期间，我们采用提取自5至7个供体的MSC进行测量；我们确定了在我们的制造条件下MSC产生哪些细胞因子，并设置所产生的细胞因子量的上限和下限。此外，我们在细胞因子产生期间定期测试上述值，并采用优选选取自上述供体且产生的细胞因子量在设置范围内的MSC分离株，即上述值就我们在给定制造条件下产生相同质量的MSC提供反馈。
我们测量了细胞所产生的犬尿氨酸量和THBS1量，且基于此，我们确定了组成所述制剂的MSC分离株在最终分配中所占的比例。为此，我们从细胞培养基中进行了取样，并在添加埃利希试剂后，对反应混合物的颜色变化进行了监测。ELISA方法亦可用于测量。测量值在细胞采集后被归一化至细胞数，并且我们将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的MSC中的较少量细胞添加到混合物，并将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的MSC中的较大量细胞添加到混合物。
最终平衡MSC组合物具备下列特征：
a.同种异体(非其自身的)；
b.提取自至少两个不同于待治疗受试者的健康供体；
c.形态健康、基本上没有衰老细胞；
d.无病原体；
e.具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CD llb、CD31、CD79α和CD19阴性；
f.在繁殖期间，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8；
g.MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右，MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右；
h.MSC细胞培养物的混合物取决于其犬尿氨酸和THBS1细胞因子的产生水平，即细胞的混合方式为，将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到所述平衡制剂，并将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到所述平衡制剂；
i.细胞数为100.000-50.000.000个；
j.细胞悬浮于冷冻培养基(含5％DMSO的汉克溶液(HBSS))中。
本发明的对象还涉及用于治疗需治疗受试者骨关节炎的含MSC组合物。
最终产品中含5％DMSO的汉克缓冲液确保细胞在长期储存后仍保持活力，且与此同时，经稀释后，可直接注射到关节内，这已经由体内实验结果证实。所述MSC平衡制剂利用干冰运送至使用地，且若不立即注射，则在-80℃温度下进行储存。
所述平衡组合物优选为在-80℃温度下储存0～21天内，更优选为1～14天内，最优选为2～7天内使用。
狗在接受-80℃温度下储存5天的MSC治疗后可以很好地耐受，且所述组合物经证实有疗效。
产品解冻后即可在37℃温度下使用，还可辅以所需量的37℃PBS溶液并进行混合后使用。细胞悬液经注射针吸入注射器后，缓慢注射到患病关节内。
犬尿氨酸和THBS1细胞因子对分化MSC的影响
表1显示了下述实验的结果，即在经7天分化后，将30ng/ml犬尿氨酸(KYNA)或50ng/ml THBS1细胞因子添加到分化MSC 5天，然后通过下一代测序，研究上述治疗对分化软骨细胞的影响的实验。因治疗而发生的转录变化通过“GO法分析”进行汇总。实验结果表明，犬尿氨酸和THBS1细胞因子治疗极大地影响了细胞分裂及几种与软骨形成有关的关键方法。根据上述结果，我们研究了犬尿氨酸或THBS1细胞因子治疗对有利于软骨细胞分化的关键基因的影响。
【表1】转录组分析结果
MSC对抑制软骨细胞分化过程中肥厚性基因表达的功效
经分析，我们证明了选定的特异性MSC在将软骨细胞改变为向关节再生表型分化方面的功效。在分析过程中，我们首先通过ELISA方法对提取自8个独立供体的犬AD-MSC在经3代培养后产生的犬尿氨酸水平进行了量化。上述分析结果如【图1】所示，表明产生的犬尿氨酸量为0～80ng/ml，且每一代之间的差异为30ng/ml。为确定MSC产生的犬尿氨酸水平是否足以促进犬MSC的软骨形成及评估对肥大软骨细胞标记的影响，我们开展了下述实验(【图1】)，即在第7天将30ng/ml犬尿氨酸添加到分化犬MSC，并通过测定其在软骨细胞分化第10天(早期)和第24天(晚期)的相对RNA水平，测量增生性软骨细胞分化的两大调控转录因子(即GADD45和CEBPb因子)及其靶点基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达。【图1】所示结果表明，添加30ng/ml犬尿氨酸能够减少GADD45和CEBPb及其靶蛋白MMP13的表达，从而抑制增生性软骨细胞表型的形成。
在另一项分析中，我们通过ELISA方法对提取自8个独立供体的AD-MSC在经3代培养后产生的THBS1细胞因子水平进行了量化。上述分析结果如【图2】所示，表明产生的THBS1细胞因子量为50ng/ml以上，且每一代之间的差异很小。为检测MSC产生的THBS1细胞因子水平是否足以促进犬MSC的软骨形成及评估对肥大软骨细胞标记的影响，我们开展了如【图2】所示的实验。在分析过程中，我们在第7天将50ng/ml THBS1细胞因子添加到分化犬MSC，并通过测定其在软骨细胞分化第10天(早期)和第24天(晚期)的相对RNA水平，测量增生性软骨细胞分化的两大调控转录因子(即GADD45和CEBPb因子)及其靶点基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达。【图2】所示结果表明，添加50ng/ml THBS1细胞因子足以减少GADD45和CEBPb及其靶蛋白MMP13的表达，从而抑制增生性软骨细胞表型的形成。
MSC对治疗狗的诱导性骨关节炎的再生效果：
我们通过下述步骤证实了上述选定的含AD-MSC的平衡组合物对狗的骨关节炎的疗效。首先，我们在实验条件下检测了所述平衡制剂对诱导骨关节炎的再生效果，然后，我们监测了所饲养狗的软骨自然磨损的愈合情况。
为研究所述平衡组合物对人工诱导骨关节炎的治疗效果，我们第一天就对影响膝关节内侧髁整个宽度的直径4mm的单侧软骨缺损进行了人工诱导。并于术后第7天进行了移植。每组给一只狗注射含MSC的平衡制剂；对照组动物通过MSC载体进行治疗。一旦动物接受MSC治疗，即在接下来的三周内被监测，并每日记录跛行程度。在研究过程中，我们对体重、进食量和血液学值的变化情况进行了跟踪。
总之，小猎犬对于使用MSC治疗其膝关节可以很好地耐受。研究剂量经证实对治疗人工诱导软骨缺损有疗效。由两个人在相互独立的基础上对动物状况进行日常评估。评估结果如【图3】所示。【图3】所示还包括组织学分析结果。使用根据本发明制成的平衡MSC制剂对狗的人工诱导骨关节炎进行治疗，促使了有关软骨细胞的分化及新的软骨组织在受伤处的再生。
此外，根据饲养主和兽医的观察进行兽医公认症状的评估：走路和小跑时出现跛行，触摸和按压疼，活动范围，功能性能力，需借助消炎药/止痛药，无症状期评分1到5分，并可借此监测跛行程度。所示方法有几大优势。所述方法的主要优势在于，患有骨关节炎的狗会较少着力于患病腿，表现为走路时跛行，因此可以很容易地监测出变化。兽医对所述平衡制剂进行了初步检测，并在进一步体内检测过程中，由饲养主基于标准化问卷对受治疗的狗的状况进行评估。所述方法得出相对值，表明走路时对患病腿的着力是如何因治疗而发生变化的，通过治疗可以实现软骨再生，从而减少关节疼痛，进而更多地着力于患病腿。
除上述实施例外，本发明还可通过保护范围内的其他步骤实现。
MSC对治疗马的骨关节炎的再生效果：
通过上述方法，并监测马的软骨自然磨损的愈合情况，我们证实了所选本发明中含AD-MSC的平衡制剂对马的骨关节炎的疗效。
对于移植来说，每组给一匹马进行含MSC的平衡制剂的关节内注射；对照组个体通过MSC载体进行治疗。一旦动物接受MSC治疗，即在接下来的三周内被监测，并每日记录跛行程度。
总之，马对于使用本发明中的MSC治疗其膝关节可以很好地耐受。研究剂量经证实对治疗跛行有疗效。由两个人在相互独立的基础上对动物状况进行日常评估。
此外，根据饲养主和兽医的观察进行兽医公认症状的评估：走路和小跑时出现跛行，触摸和按压疼，活动范围，功能性能力，需借助消炎药/止痛药，无症状期评分1到5分，并可借此监测跛行程度。所示方法有几大优势。所述方法的主要优势在于，患有骨关节炎的马会较少着力于患病腿，表现为走路时跛行，因此可以很容易地监测出变化。兽医对所述平衡制剂进行了初步检测，并在进一步体内检测过程中，由饲养主基于标准化问卷对受治疗的马的状况进行评估。后一种方法得出相对值，表明走路时对患病腿的着力是如何因治疗而发生变化的，通过治疗可以实现软骨再生，从而减少关节疼痛，进而更多地着力于患病腿。结果表明，使用本发明中的平衡MSC制剂进行治疗，导致了软骨组织在受伤软骨部位的再生，并在经治疗后，跛行明显好转，甚至消失。
比较分析
将本发明中的组合物与现有技术中的其他MSC组合物进行比较的结果表明，前者对骨关节炎的疗效更好。在以往出版物中公开的MSC数量在所有情况下都要高一个数量级。并且基于对跛行的研究，它们的疗效低于本发明中的组合物的疗效(例如Kriston-Pal等人，2017)。在使用本发明中的组合物进行治疗的情况下，可以明显察觉出软骨组织的再生，但这样的再生水平在以往的文件中却从未报告过。根据我们的研究，通过给狗注射现有技术中的组合物后，跛行程度几乎没有好转，而在使用本发明中的组合物的情况下，跛行程度得到了几个数量级的改善，多数情况下，狗的步态经治疗后都能恢复。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.间充质干细胞(MSC)的细胞培养物的特征在于：
a.提取自至少两个健康供体(同种异体)；
b.形态健康、基本上没有衰老细胞；
c.无所述物种特有的病原体；
d.具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性；
e.在繁殖期间，所述MSC的累积群体倍增值(即CPD值)优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；
f.MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右；MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，优选为50ng/ml左右；
g.细胞数为105～5x107个。
2.根据权利要求1所述的MSC培养物的特征在于，所述MSC培养物是选取自单独供体并进行繁殖的MSC的混合物，其中所述混合物含有产生约50ng/ml犬尿氨酸和约80ng/mlTHBS1细胞因子且产生的量不到所述混合物的50％的分离MSC，以及产生约30ng/ml犬尿氨酸和约50ng/mlTHBS1细胞因子且产生的量超过所述混合物的50％的分离MSC。
3.根据权利要求1或2所述的MSC培养物的特征在于，所述受试者为犬科动物、猫科动物、马科动物、反刍动物或猪类动物，优选为狗、马、猫、牛、猪、绵羊、山羊，最优选为狗或马。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的MSC细胞培养物的特征在于，所述细胞培养物为细胞悬液，还包括冷冻培养基，优选为含5％DMSO的汉克缓冲溶液。
5.平衡MSC组合物包括根据权利要求1至3中任一权利要求所述的MSC培养物，及一种或多种药学上可接受的添加剂。
6.一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制作方法的特征在于，其包括下列步骤：
a)将血管基质组分(SVF)从至少两个不同于待治疗受试者但属于同一物种的健康供体中分离出来；
b)配备分别获取自每一分离组分(优选通过胶原酶消化法获取)的间充质干细胞(即MSC)；
c)分别将所获取的MSC进行沉淀，并优选将其重悬于平衡盐水缓冲液(例如汉克缓冲液)中；
d)分别繁殖重悬后的MSC，优选至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P1细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右的繁殖MSC；
e)达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P2细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性但呈CD45、CD34、CD14、CD1lb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右，且MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml、优选为30ng/ml左右，且MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml、优选为50ng/ml左右的繁殖MSC；
f)重复步骤e)，直至MSC数达到105～108，优选为105～5x107，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；
g)将分别获取自每个供体并进行繁殖的MSC进行随意混合，其中所述混合物含有产生约50ng/ml犬尿氨酸和约80ng/mlTHBS1细胞因子且产生的量不到所述混合物的50％的分离MSC，以及产生约30ng/ml犬尿氨酸和约50ng/mlTHBS1细胞因子且产生的量超过所述混合物的50％的分离MSC；并且
h)将含5％DMSO的汉克溶液(HBSS)添加到所述平衡组合物。
7.根据权利要求6所述的方法的特征在于，将MSC从优选为3～15个、更优选为4～8个及最优选为5～7个单独的健康受试者的脂肪组织中分离出来。
8.根据权利要求6或7所述的方法的特征在于，脂肪组织是非人类受试者进行卵巢子宫切除术产生的废弃物。
9.根据权利要求6至8中任一权利要求所述的方法的特征在于，受试者为犬科动物、猫科动物、马科动物、反刍动物或猪类动物，优选为狗、马、猫、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼，最优选为狗或马。
10.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的细胞培养物或根据权利要求5所述的平衡组合物用于治疗受试者的骨关节炎。

Claims (10)

1.间充质干细胞(MSC)的细胞培养物的特征在于：
a.提取自至少两个健康供体，其中供体不同于待治疗受试者，即同种异体；
b.形态健康、基本上没有衰老细胞；
c.无所述物种特有的病原体；
d.具备MSC的主要特征，即呈CD105和CD73阳性，但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性；
e.在繁殖期间，所述MSC的累积群体倍增值(即CPD值)优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8左右；
f.MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml，优选为30ng/ml左右；MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml，
优选为50ng/ml左右；
g.细胞数为105～5x107个。
2.根据权利要求1所述的MSC细胞培养物的特征在于，MSC细胞培养物是选取自单独供体并进行繁殖的MSC的混合物，且混合取决于其犬尿氨酸和THBS1细胞因子的产生水平，即细胞的混合方式为：将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到最终细胞培养物，并将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到最终细胞培养物。
3.根据权利要求1或2所述的MSC细胞培养物的特征在于，所述受试者为犬科动物、猫科动物、马科动物、反刍动物或猪类动物，优选为狗、马、猫、牛、猪、绵羊、山羊，最优选为狗或马。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的MSC细胞培养物的特征在于，细胞培养物在冷冻培养基中制备，优选为悬浮于含5％DMSO的汉克缓冲溶液中。
5.平衡MSC组合物的特征在于，其包括根据权利要求1至3中任一权利要求所述的MSC细胞培养物，其中所述MSC细胞培养物是选取自单独供体并进行繁殖的MSC的混合物，且混合取决于其犬尿氨酸和THBS1细胞因子的产生水平，即细胞的混合方式为，将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到所述平衡制剂，并将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到所述平衡制剂，并通过悬浮于含5％DMSO的汉克缓冲溶液中制备而成。
6.一种用于治疗受试者骨关节炎的组合物的制作方法的特征在于，其包括下列步骤：
a)将血管基质组分(SVF)从至少两个不同于待治疗受试者但属于同一物种的健康供体中分离出来；
b)配备分别获取自每一分离组分(优选通过胶原酶消化法获取)的间充质干细胞(即MSC)；
c)分别将所获取的MSC进行沉淀，并优选将其重悬于平衡盐水缓冲液(例如汉克缓冲液)中；
d)分别繁殖重悬后的MSC，优选至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P1细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性、但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右的繁殖MSC；
e)解冻部分独立的P1细胞库，进一步繁殖MSC，以至少达到70％、80％或90％的融合度，然后分别将其冷冻以生成P2细胞库，但在冷冻前，须选择并保留经证实无病原体、形态健康且基于对其细胞表面标记的分析，为呈CD105、CD73阳性、但不携带造血干细胞和祖细胞特有的表面标记，且优选不携带血细胞谱系特有的表面标记，即MSC优选呈CD45、CD34、CD14、CDllb、CD31、CD79α和CD19阴性，且培养期间的PD值优选为0.5～5、更优选为1～4、最优选为3左右，且MSC的犬尿氨酸代谢产物的产生水平为30～50ng/ml、优选为30ng/ml左右，且MSC的THBS1细胞因子的产生水平为50～80ng/ml、优选为50ng/ml左右的培养MSC；
f)重复步骤e)，直至MSC数达到105～108，优选为105～5x107，MSC的CPD值优选为3～14，更优选为2～12，最优选为8；
g)将分别获取自每个供体并进行繁殖的MSC进行随意混合，混合取决于其犬尿氨酸和THBS1细胞因子的产生水平，混合方式为：将产生较多犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较少量细胞分配到所述制剂，并将产生较少犬尿氨酸和THBS1细胞因子的分离MSC中的较大量细胞分配到所述制剂；并且
h)将含5％DMSO的汉克溶液(HBSS)添加到所述平衡组合物。
7.根据权利要求6所述的方法的特征在于，从优选为3～15个、更优选为4～8个及最优选为5～7个单独的健康受试者的脂肪组织中分离出来。
8.根据权利要求6或7所述的方法的特征在于，脂肪组织是卵巢子宫切除术产生的废弃物。
9.根据权利要求6至8中任一权利要求所述的方法的特征在于，受试者为犬科动物、猫科动物、马科动物、反刍动物或猪类动物，优选为狗、马、猫、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼，最优选为狗或马。
10.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的细胞培养物或根据权利要求5所述的平衡组合物用于治疗受试者的骨关节炎。
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