KR20130008594A - 손상부 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 줄기세포를 배양함으로써 얻어진 줄기세포 배양상청액을 포함하는, 표적조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료용 조성물 ; 표적조직의 손상부를 수복 또는 회복하기 위한 손상부 치료방법으로서, 상기 손상부 치료용 조성물을, 상기 손상부 치료용 조성물의 표적조직을 갖는 환자에게, 상기 표적조직의 손상부를 수복하기 위해 치료상 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 손상부 치료방법 ; 상기 손상부 치료용 조성물을, 뇌경색 환자에게, 뇌의 손상부를 수복하기 위해 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 뇌경색의 치료방법 ; 상기 손상부 치료용 조성물을, 중추신경계질환치료용 조성물로서 중추신경계질환환자에게 치료상 유효량 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계질환의 치료방법을 제공한다.

Description

손상부 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATMENT OF DAMAGED PART}

본 발명은 손상부 치료용 조성물 및 이것을 이용한 치료방법에 관한 것이다.

종래의 의료에서는 치료가 어려운 질병에 대한 범용적인 대체기술로서, 줄기세포를 이용한 재생 의료가 주목받아 왔다.

줄기세포를 이용한 재생 의료는, 모든 난치병의 새로운 임상 플랫폼에 있어서 유망한 툴(tool)이다. 배아 줄기세포(ES세포), 유도 다능성 줄기세포(iPS세포) 및 체성 줄기세포를 비롯한 각종 줄기세포가 보고되고 있다. 체성 줄기세포 중 특히 골수, 지방조직, 피부, 탯줄, 태반 등의 각종 조직으로부터 단리되는 간엽계 줄기세포(MSC)가 피부재생에 있어서의 임상적 응용에 이용되어 오고 있다. 그러나, 골수 천자(穿刺)는 도너에게 있어 침습성과 통증성을 수반한 수법이다. 더욱이, 골수 줄기세포(BMSC)의 수, 증식 및 분화능은 연령의 진행에 따라 저하된다.

재생 의료의 적용이 가능하거나 또는 기대되는 질병은 많으며, 임상응용을 위한 수많은 연구가 이루어져 오고 있다. 신경질환, 특히 척수손상 등의 난치성 신경질환은, 재생 의료에 의한 치료가 기대되는 질환 중 하나이다.

인간 태아나 ES세포에서 유래하는 신경줄기세포를 이용한 난치성 신경질환의 이식치료(예컨대, 일본 특허공개공보 제2002-281962호)가 현실성이 있는 연구과제로서 인식되고 있으나, 윤리성이나 안전성에 있어서 큰 문제를 안고 있어 실용적인 「줄기세포원」에 대해서는 지금도 모색중인 상태이다(예컨대, Keirstead et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience (2005) vol.25(19) pp.4694; Okano et al. Neural stem cells and regeneration of injured spinal cord. Kidney international (2005),Vol.68, pp.1927-1931); Okada et al. Spatiotemporal recapitulation of central nervous system development by murine embryonic stem cell derived neural stem and progenitor cells. Stem Cells (2008) vol.26(12) pp.3086-3098).

생체 내 줄기세포로서 골수나 지방에서 유래하는 줄기세포가 있으나(예컨대, 국제공개 제02/086108호 팜플렛), 이러한 줄기세포에는 몇 가지 단점, 즉, (1) 연령의 증가와 함께 채취가능한 줄기세포 수가 감소하는 점, (2) 연령의 증가에 있어서의 유전자 변이의 축적에 의해 이식 줄기세포의 안전성을 확보하기 어렵다는 점, (3) 세포증식능이 낮다는 점, (4) 줄기세포의 채취에는 심한 생체침습을 동반한다는 점(예컨대, Gronthos et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA (2000) vol.97(25) pp.13625-13630; Miura et al. SHED : stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences (2003) Vol.100,5807-5812） 등의 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 난치성 신경질환 치료용의 줄기세포 리소스의 개발이 중요하다.

의료폐기물인 사람의 탈락유치 치수 줄기세포(stem cells from exfoliated deciduous teeth; SHED)나 사랑니에서 유래하는 영구치 치수 줄기세포(dental pulp stem cells; DPSC)는, BMSC와 같은 자기복제능 및 다분화능을 갖는 신규 줄기세포집단으로서 동정(同定)되었다.

이러한 세포는 신경계보에 가까운 성상을 나타내는 신경능선에서 유래하는 세포집단으로서, 신경세포로의 분화유도에 높은 반응성을 나타낸다(예컨대, Miura et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences (2003) Vol.100,5807-5812；Arthur et al. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells (2008) vol.26(7) pp.1787-1795）. SHED나 DPSC는, 자기 유래의 조직 줄기세포이기 때문에, 이식에 있어서의 안전성이 높고, 윤리적 문제도 매우 적다.

그러나, 종래의 SHED나 DPSC의 연구에 있어서는, 단편적인 신경세포계보의 분석이나, 신경분화가 유도된 SHED나 DPSC를 설치류에 이식하여 생착을 관찰한 것 이상의 지견은 밝혀지지 않고 있다(예컨대, Arthur et al. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells (2008) vol.26(7) pp.1787-1795；Huang et al. Putative dental pulp - derived stem / STROmal cells promote proliferation and differentiation of endogenous neural cells in the hippocampus of mice. Stem Cells (2008) vol.26(10) pp.2654-2663）.

더욱이, DPSC는 신경계 질환, 심장병 등의 전신성 질환용 세포에 기초한 치료에 사용될 가능성이 있다는 점과, 허혈성 질환을 경감시킨다는 것이 보고된 바 있다(Arthur et al. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells (2008) vol.26(7) pp.1787-1795；Gandia C, Arminan A, Garcia-Verdugo JM, et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells 2008;26:638-645.；Iohara K, Zheng L, Wake H, et al. A novel stem cell source for vasculogenesis in schemia : subfraction of side population cells from dental pulp. Stem Cells 2008;26:2408-2418.）.

또한, 최근의 연구에서 MSC가 피부 수복에 기여할 수 있음이 보고되었다. 더욱이, 각종 성장인자의 외적 응용에 의한 창상의 치유가 광범위하게 연구되고 있다. 그러나, 성장인자를 1회 투여, 복수 회 투여에 의해 사용하는 것 또는 상승 효과를 기대하며 복수의 인자와 병용하는 것의 결과는, 아직 임상적으로 확인된 바 없다.

또, 태양에 과다하게 노출된 노령 집단의 처치는 약용 화장품 및 피부과의에게 있어 커다란 관심사이며, 주름 등 광(光)으로 인해 노화된 피부의 일부 증상을 처치하기 위해 각종 비침습성 처치와 국소적 약용화장품이 사용되어 오고 있다(Chung JH, Youn SH, Kwon OS, Cho KH, Youn JI, Eun HC. Regulations of collagen synthesis by ascorbic acid, transforming growth factor-beta and interferongamma in human dermal fibroblasts cultured in three-dimensional collagen gel are photoaging - and aging - independent. J Dermatol Sci 1997;15:188-200.；Fitzpatrick RE, Rostan EF. Reversal of photodamage with topical growth factors : a pilot study. J Cosmet Laser Ther 2003;5:25-34).

노화의 원인 중 하나인 단파장 자외선(UVB)에 대한 노출은, 진피에 있어서, 사람의 피부섬유아세포(HDF)에 의한 콜라게나제 생산을 자극하며, 콜라게나제 유전자의 발현을 상향조절하는 것으로 알려져 있다. 이는, 콜라겐의 분해와 피부의 주름 및 황변으로서 나타나는 변성 탄성조직의 침착을 유도하는 것으로 여겨지고 있다.

이전의 연구에 있어서 MSC는, 혈관내피 성장인자(VEGF), 줄기세포 성장인자(HGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β) 등의 각종 사이토카인을 생산하는 것으로 보고된 바 있다. 근년 들어 사이토카인의 생산 및 분비가 MSC의 중요한 기능으로서 보고되고 있으며, MSC의 다양한 약리학적 작용이 특히 피부생물학에 있어서 실증되고 있다（Jettanacheawchankit S, Sasithanasate S, Sangvanich P, Banlunara W, Thunyakitpisal P. Acemannan stimulates gingival fibroblast proliferation; expressions of keratinocyte growth factor-1, vascular endothelial growth factor, and type I collagen ; and wound healing. J Pharmacol Sci.2009 Apr;109(4):525-531；Miura et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences (2003) Vol.100,5807-5812；Safavi SM, Kazemi B, Esmaeili M, Fallah A, Modarresi A, Mir M. Effects of low-level He- Ne laser irradiation on the gene expression of IL-1beta, TNF - alpha , IFN - gamma , TGF - beta , bFGF , and PDGF in rat's gingiva. Lasers MED Sci.2008 Jul;23(3):331-335；Saygun I, Karacay S, Serdar M, Ural AU, Sencimen M, Kurtis B, Effects of laser irradiation on the release of basic fibroblast growth factor ( bFGF ), insulin like growth factor-1(IGF-1), and receptor of IGF -1( IGFBP3 ) from gingival fibroblasts, Lasers MED Sci.2008 Apr;23(2):211-215）. 예컨대, MSC는 다양한 성장인자의 생산을 통해 피부치유효과를 갖는 것이 보고된 바 있다(Minoru Ueda, The Use of fibroblasts, The Biochemical Society,11-15,2007, 참조). 이들 성장인자는 HDF를 활성화하고 HDF의 증식/이동을 증가시켜 HDF로부터의 콜라겐 분비를 매개했다. MSC의 분비 인자가 HDF를 산화 스트레스로부터 보호하는 것으로 나타남에 따라, MSC의 항산화 효과도 실증되었다. 국소적 성장인자의 사용은, 얼굴의 광노화에 대한 수복을 자극하여 새로운 콜라겐합성, 상피 비후 및 눈에 띄는 주름이 감소된 보다 매끄러운 피부의 임상적 외관을 가져왔다(He H, Yu J, Liu Y, et al. Effects of FGF2 and TGFbeta1 on the differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Cell Biol Int 2008;32:827-834；Robey PG. Stem cells near the century mark. J Clin Invest 2000;105:1489-1491.).

그러나, SHED나 DPSC와 같은 치수 줄기세포를 이용하여 어떠한 의학적 응용이 가능할지는 아직 밝혀지지 않았으며, 구체적인 대상질환도 전혀 알려져 있지 않다.

본 발명의 과제는, 치수 줄기세포를 이용한 신규 치료수단을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 이하의 양태를 포함한다.

[1] 줄기세포를 배양함으로써 얻어진 줄기세포 배양상청액(stem cell-conditioned medium)을 포함하는, 표적조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료용 조성물.

[2] 상기 줄기세포를 포함하지 않는 [1]에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[3] 상기 줄기세포의 배양상청액이, 적어도 2개의 사이토카인을 포함하는 [1] 또는 [2]에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[4] 상기 줄기세포의 배양상청액이, 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 사이토카인을 포함하는, [1]～[3] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[5] 상기 줄기세포가 체성 줄기세포인 [1]～[4] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[6] 상기 줄기세포가, 간엽계 줄기세포에서 유래하는 [1]～[5] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[7] 상기 줄기세포가 치수(齒髓) 줄기세포인 [1]～[6] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[8] 혈청을 포함하지 않는 [1]～[7] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[9] 상기 손상부 치료가, 피부, 치주조직 내지는 뼈의 손상의 치료, 뇌경색치료, 또는 중추신경계질환 치료인 [1]～[8] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[10] 상기 손상부 치료가 중추신경계질환의 치료이며, 상기 중추신경계질환이, 척수손상, 신경변성질환, 신경세포의 변성 또는 탈락, 및 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 질환 내지 병태인 [1]～[9] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물.

[11] 이하의 단계 (1)～(3)을 포함하는, [1]～[10] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물의 제조방법 :

(1) 치수세포로부터 접착성 세포를 선별하는 단계 ;

(2) 상기 접착성 세포를 배양하는 단계 ;

(3) 배양상청액을 회수하는 단계.

[12] 이하의 단계 (4)를 더욱 포함하는, [11]에 기재된 제조방법 :

(4) 회수한 배양상청액에 대하여, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염 및 보존으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 처리를 수행하는 단계.

[13] 이하의 단계 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 더욱 포함하는, [11] 또는 [12]에 기재된 제조방법 :

(a) 회수한 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계 ; 및

(b) 회수한 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스(apoptosis) 억제 작용의 유무를 확인하는 단계.

[14] 표적조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료방법으로서, [1]～[10] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물을, 상기 손상부 치료용 조성물의 표적조직을 갖는 환자에게, 상기 표적조직의 손상부를 수복하기 위해 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 손상부 치료방법.

[15] 상기 손상부의 수복이 내인성 줄기세포의 능력에 근거하여 달성되도록 투여되는 [14]에 기재된 손상부 치료방법.

[16] 상기 손상부 치료용 조성물을, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 문맥내 투여, 피내(皮內) 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 복강내 투여 및 비강내 투여로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 투여방법에 의해 투여하는, [14] 또는 [15]에 기재된 손상부 치료방법.

[17] [1]～[10] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물을, 뇌경색 환자에게, 뇌의 손상부를 수복하기 위해 치료상 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 뇌경색의 치료방법.

[18] 상기 손상부 치료용 조성물이, 비강내 투여에 의해 투여되는 [17]에 기재된 뇌경색의 치료방법.

[19] [1]～[10] 중 어느 하나에 기재된 손상부 치료용 조성물을, 중추신경계질환치료용 조성물로서 중추신경계질환 환자에게 치료상 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계질환의 치료방법.

[20] 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여와 동시에 또는 투여 후에, 치수 줄기세포를 상기 중추신경계질환 환자에게 투여하는, [19]에 기재된 치료방법.

[21] 상기 치수 줄기세포가, 채취 후에 분화 유도 처리를 하지 않은 미분화형 치수 줄기세포, 또는 채취 후에 신경계 세포로 분화 유도한 분화 유도형 치수 줄기세포인 [20]에 기재된 치료방법.

[22] 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여 후에, 신경계 세포로 분화 유도한 다능성 줄기세포를 상기 중추신경계질환 환자에게 투여하는, [19]～[21] 중 어느 하나에 기재된 치료방법.

[23] 조제한 치수 줄기세포의 배양상청액이, 상기 청구항 19～청구항 22 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환치료방법에 이용되는 중추신경계질환치료용 조성물의 유효성분으로서 유효한지 여부를 판단하는 방법으로서, 이하의 단계 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 방법 :

(a) 상기 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계 ; 및

(b) 상기 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용의 유무를 확인하는 단계.

본 발명에 따르면, 치수 줄기세포를 이용한 신규 치료수단, 즉, 손상부 치료용 조성물 및 그 제조방법과, 손상부 치료용 조성물을 이용한 손상부 치료방법을 제공할 수 있다.

도 1은 헤어리스 마우스를 이용한 실험 계획을 설명하는 도면이다. 주름은 UVB조사에 의해 유도했다.
도 2는 각종 세포 타입에 있어서의 형태, 면역분석 및 증식율을 나타낸다. (A-C)는 (A) BMSC, (B) DPSC 및 (C) SHED를 각각 나타내며(×40), (D-F)는 줄기세포 마커인 STRO-1의 면역 형광 염색 이미지를 나타낸다. (D) BMSC, (E) DPSC 및 (F) SHED 는, STRO-1 양성(녹색)이었다. DAPI는 핵을 시각화하기 위해 사용했다(청색). (G) SHED, DPSCs 및 BMSC의 증식율을 BrdU를 이용해 평가했다. 막대(bar) : 표준편차. 유의차 : *P < 0.05.
도 3은 SH-CM 주입 후의 레플리카(replica) 분석에 의한 주름의 평가를 나타내는 도면으로서, (A)는 처리그룹, (B)는 100%, SH-CM 처리그룹이다.
도 4는 SH-CM 및 SHED 주입그룹의 통상 수준에 있어서의 주름의 개선을 나타내는 도면이다.
도 5는 헤마톡실린-에오진 염색 이미지를 나타낸 도면으로서, (A)는 SH-CM 처리그룹, (B)는 SHED 주입그룹을 나타낸다.
도 6은 진피의 두께를 비교한 그래프이다.
도 7은 SH-CM의 HDF의 증식에 있어서의 영향을 나타내는 도면이다.
도 8은 콜라겐 타입 I 및 MMP1에 대한 SH-CM의 영향을 나타낸 웨스턴 블로팅 분석의 도면이다.
도 9는 본 발명의 조성물을 이용한 골 재생의 메카니즘을 개념적으로 설명한 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예 3에 관한 실험 방법의 개요를 설명한 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예 3에서 이용한 BIC값의 계산을 설명하는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예 3의 결과를 나타내는 염색 이미지이다.
도 13은 본 발명의 실시예 3의 결과를 설명하는 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예 3의 결과를 설명하는 사진이다.
도 15는 본 발명의 실시예 3의 임상예의 결과를 설명하는 X선 사진 이미지이다.
도 16은 본 발명의 실시예 4의 실험 모델을 설명하는 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예 4에서 이용된 처치 양식을 설명하는 사진이다.
도 18은 본 발명의 실시예 4에서 이용된 처치 양식을 설명하는 사진이다.
도 19는 본 발명의 실시예 4에서 이용된 처치 양식을 설명하는 도면이다.
도 20은 본 발명의 실시예 4의 결과로서 얻어진 시멘트질의 재생 상태를 설명하는 염색 이미지로서, 상단은 GF를 이용했을 경우의 도면, 하단은 PRP를 이용했을 경우의 사진을 각각 나타낸다.
도 21은 본 발명의 실시예 4의 결과를 나타내는 그래프이다(N₂-NC).
도 22는 본 발명의 실시예 4의 결과를 나타내는 그래프이다(N₁-JE).
도 23은 본 발명의 실시예 4의 임상예에 있어서의 전처리를 설명하는 사진이다.
도 24는 본 발명의 실시예 4의 임상예에 있어서의 처리 방법을 설명하는 사진이다.
도 25는 본 발명의 실시예 4에 있어서의 임상예의 결과를 나타내는 사진이다.
도 26은 본 발명의 실시예 5에 관한 뇌경색의 유도를 설명하는 도면이다.
도 27은 본 발명의 실시예 5에 있어서의 제 I 그룹, 제 Ⅱ 그룹 및 제 Ⅲ 그룹의 비강투여 개시 후의 장해 스코어의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 28은 본 발명의 실시예 5에 있어서의 제 I 그룹, 제 Ⅱ 그룹 및 제 Ⅲ 그룹의 비강투여 개시 후 16일째의 경색 용적을 설명하는 그래프이다.
도 29는 배양상청액의 조제법을 설명하는 개념도이다. hSHED :사람의 유치 치수 줄기세포, hDPSC : 영구치 치수 줄기세포, hBMSC : 사람의 골수 간엽계 줄기세포, hFibroblast : 사람의 섬유아세포.
도 30은 신경돌기 신장실험의 결과를 나타내는 사진이다(위상차 현미경 이미지).
도 31은 신경돌기 신장실험의 결과로서, 신경돌기가 확인되는 세포의 비율(좌측)과 신경돌기의 길이(우측)를 나타낸 그래프이다.
도 32는 신경돌기 신장실험의 결과를 나타내는 사진이다(위상차 현미경 이미지).
도 33은 신경돌기 신장실험의 결과로서, 신경돌기가 확인되는 세포의 비율(좌측)과 신경돌기의 길이(우측)를 나타낸 그래프이다.
도 34는 아폽토시스 억제실험(TUNEL법)의 결과를 나타내는 사진이다.
도 35는 아폽토시스 억제실험(TUNEL법)의 결과이며, 치수 줄기세포의 배양상청액에 의한 아폽토시스 억제효과를 통계 처리한 그래프로서, 좌측은 CSPG 존재 하에서의 아폽토시스 억제효과가 확인된 그래프, 우측은 MAG존재 하에서의 아폽토시스 억제 효과가 확인된 그래프이다.
도 36은 척수 압좌손상 동물 모델을 이용한 실험의 결과를 나타내는 그래프로서, SHED-CM : 치수 줄기세포 배양상청액 투여그룹, BMSC-CM : 골수간엽계 줄기세포 배양상청액 투여그룹, 대조군 : PBS투여그룹을 각각 나타낸다.
도 37은 척수압좌 손상모델 동물을 이용한 실험의 결과를 나타내며, 대조군과 SHED-CM 그룹의 척수의 상태 (상)와 척수의 중량의 비교(하)를 나타낸다.
도 38은 척수압좌 손상모델 동물을 이용한 실험의 결과를 나타내며, SHED-CM :치수 줄기세포 배양상청액 투여그룹, 대조군 : PBS투여그룹을 나타낸다.
도 39는 척수압좌 손상모델 동물을 이용한 실험의 결과를 나타내며, SHED-CM : 치수 줄기세포 배양상청액 투여그룹, 대조군 : PBS투여그룹을 나타낸다.

<손상부 치료용 조성물>

본 발명의 손상부 치료용 조성물은, 줄기세포를 배양함으로써 얻어진 줄기세포 배양상청액을 포함하는, 표적조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료용 조성물이다.

또한, 본 발명의 손상부 치료방법은, 표적조직의 손상부를 수복 또는 회복시키기 위한 손상부 치료방법으로서, 상기 손상부 치료용 조성물을, 상기 손상부 치료용 조성물의 표적조직을 갖는 환자에게, 상기 표적조직의 손상부를 수복하기 위해 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 손상부 치료방법이다.

본 발명의 발명자들은, 인간 유치 치수 줄기세포(SHED)에서 유래하는 성장인자와 인간 피부섬유아세포(HDF)의 관계를, 창상의 치유에 대한 SHED의 적용이 추론으로서 남아 있을 때 최초로 연구하였다. SHED는 콜라겐 합성을 높임으로써, 그리고 HDF의 증식 및 이동 활성을 활성화함으로써, HDF에 영향을 준다. 이는, SHED 또는 SHED 유래의 세포상청(SH-CM)이 광노화의 치료에 사용될 수 있음을 시사하는 것이다. 결과는, SHED 및 SH-CM이 광노화의 치료에 구조적으로 적합해야 함을 시사한다. 주로, 분비된 성장인자 또는 세포외 매트릭스 단백질과 함께, SHED는 HDF의 창상의 치유 능력을 증강시키는 데 기여한다. 각 성장인자에 대한 중화 항체를 이용한 새로운 메카니즘의 연구는, 창상의 치유 과정에 있어서의 SHED의 가용성 인자의 역할을 명확히 하는 것이다. 또한, 유치는 어릴 때 자연스럽게 빠져, 통상적으로는 그대로 폐기된다. 따라서, 유치 치수 줄기세포를 이용하는 것은, 채취에 따른 침습성의 문제는 물론, 이용시의 윤리적인 문제도 없다는 큰 이점이 있다.

본 발명에 따르면, 줄기세포를 배양하여 얻어진 줄기세포 배양상청액을 손상부 치료용 조성물의 유효성분으로서 이용한다. 해당 줄기세포 배양상청액은, 사이토카인 혼합물이 포함되어 있기 때문에, 손상부에 적용되면, 손상부에 있어서의 세포를 증식시키며, 그 결과, 손상부를 갖는 조직을 수복시킬 수가 있다. 본 발명의 일형태에서는, 본 발명에서 사용되는 줄기세포 배양상청액 내의 사이토카인의 혼합물이 표적조직의 내인성 줄기세포에 대한 유도 신호로서 작용함에 따라, 상기 내인성 줄기세포가 분화되어 증식될 수 있는 것으로 추론할 수 있다. 그 결과, 표적조직의 손상부에서의 세포의 증식 및 세포외 매트릭스의 생성 등이 이루어질 수 있다. 이러한 점으로부터, 손상부를 갖는 조직은, 표적조직의 내인성 줄기세포의 이러한 재생능에 기초하여 수복가능한 것으로 생각된다.

예컨대, 피부재생에 관계된 복수의 성장인자가 MSC로부터 분비됨으로써, SHED 및 SHED 유래의 성장인자가 UVB 유도성 광손상을 회복시킬 수 있다. 이에, 8주간의 UVB 조사(照射) 조치에 의해 헤어리스 마우스에 대해 주름을 유도하여, SHED 및 그 세포상청의 피하 주사에 의한 항 주름효과를 조사하였다. 또한, 배양 HDF에 있어서의 SH-CM을 더욱 이용함으로써, 파라크린(paracrine) 경로를 통한 주름 형성을 개선하는 메카니즘을 조사하였다.

본 발명에 있어서 「손상부」란, 조직에 물리적 또는 생리적으로 결함이 생겨 본래의 기능을 발휘할 수 없게 된 조직상의 부위를 의미하며, 외상뿐만 아니라, 조직의 물리적 또는 생리적 결함에 기인하는 상해부, 장해부 또는 질환부도 포함하는 개념으로서 이용된다.

본 발명에 있어서 「수복」이란, 표적조직에 있어서의 손상에 의해 잃은 기능의 일부 또는 전부가, 손상시에 있어서의 손상부의 기능과 비교할 때 유지 또는 회복되어 있는 것을 의미하며, 조직의 기능이 회복되는 것뿐만 아니라, 기능적인 조직으로서 재생하는 것도 광범위하게 포함한다. 기능이 유지 또는 회복되어 있는 것의 평가에 대해서는, 손상된 조직에 있어서 다르지만, 외관, 대상이 되는 기능의 정도를 평가하기 위해 통상적으로 이용되는 검정 등에 기초하여 수행하면 된다.

본 발명에 이용되는 체성 줄기세포의 예로서는, 진피계, 소화계, 골수계, 신경계 등에서 유래하는 줄기세포가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 진피계의 체성 줄기세포의 예로서는, 상피줄기세포, 모포줄기세포 등이 포함된다. 소화계의 체성 줄기세포의 예로서는 췌장(전반의) 줄기세포, 간 줄기세포 등이 포함된다. 골수계의 체성 줄기세포의 예로서는, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포 등이 포함된다. 신경계의 체성 줄기세포의 예로서는, 신경 줄기세포, 망막 줄기세포 등이 포함된다. 본 발명에 이용되는 체성 줄기세포는, 목적하는 처치를 달성할 수 있는 것이라면 천연의 것이어도 무방하고 유전자 변형된 것이어도 무방하다.

줄기세포의 기원은, 외배엽, 내배엽 또는 중배엽으로 분류된다. 외배엽 기원의 줄기세포는 주로 뇌에 존재하고, 신경줄기세포가 포함된다. 내배엽 기원의 줄기세포는 주로 골수에 존재하며, 혈관줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포 등이 포함된다. 중배엽 기원의 줄기세포는 주로 장기에 존재하며, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포 등이 포함된다.

본 발명에서는, 간엽계에서 유래될 수 있는 어떠한 체성 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하며, 치수에서 유래하는 체성 줄기세포를 이용하는 것이 보다 바람직하고, 인간의 탈락한 유치에서 유래하는 체성 줄기세포를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 간엽계 유래의 체성 줄기세포는, 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β)-1 및 -3, TGF-α, KGF, HBEGF, SPARC 등의 각종 사이토카인을 생산할 수 있다. 본 발명에서는, 줄기세포 배양상청액이 적어도 2개의 사이토카인을 포함하는 것이 바람직하고, 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF) 및 형질전환 성장인자-베타(TGF-β)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 조합을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 이용되는 사이토카인의 혼합물은, 줄기세포 배양상청액의 일부로서 또는 줄기세포 배양상청액으로부터 단리된 사이토카인의 혼합물로서 사용될 수 있다. 줄기세포 배양상청액으로부터 단리된 사이토카인의 혼합물 중, 사이토카인의 일부를 하나 또는 복수의 공지된 대응되는 사이토카인으로 치환하여도 무방하다.

본 발명에 이용되는 줄기세포 배양상청액은, 거부를 회피하기 위하여, 표적조직을 갖는 같은 개체에서 유래하는 체성 줄기세포의 배양으로부터 얻어지는 것이 바람직하다. 표적조직은, 줄기세포 배양상청액을 얻기 위해 이용되는 체성 줄기세포가 유래하는 조직과 같아도 되고 달라도 무방하다.

본 발명에 이용되는 줄기세포 배양상청액은, 체성 줄기세포의 배양으로부터 얻어지는 줄기세포 배양상청액으로 한정되지 않으며, 배아 줄기세포(ES세포), 유도 다능성 줄기세포(iPS세포), 배성 암종세포(EC세포) 등의 배양으로부터 얻어진 줄기세포 배양상청액이 포함되어 있어도 무방하다.

체성 줄기세포의 배양상청액은, 체성 줄기세포를 배양하여 얻어지는 배양액이며, 세포 그 자체를 포함하지 않는다. 따라서, 예컨대 배양 후에 세포성분을 분리 제거함으로써, 본 발명에 사용가능한 배양상청액을 얻을 수 있다. 각종 처리(예컨대, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염, 보존 등)를 적절히 실시한 배양상청액을 이용하도록 하여도 무방하다.

줄기세포 배양상청액을 얻기 위한 줄기세포는, 통상법에 의해 선별가능하며, 세포의 크기나 형태에 기초하여 또는 접착성 세포로서 선별가능하다. 치수 줄기세포의 경우에는 후술하는 바와 같이, 탈락한 유치나 영구치로부터 채취한 치수세포로부터, 접착성 세포 또는 그 계대세포로서 선별할 수 있다. 후술하는 중추신경계질환 치료용 조성물의 제조방법은, 상기 손상부 치료용 조성물의 제조방법으로서도 바람직하게 적용될 수 있다. 치수 줄기세포 배양상청액으로는, 선별된 줄기세포를 배양하여 얻어진 배양상청액을 이용할 수 있다. 그 밖의 줄기세포를 이용할 경우에는, 목적으로 하는 줄기세포를 포함할 수 있는 조직으로부터, 마찬가지로 하여 줄기세포를 얻음으로써 줄기세포 배양상청액을 얻을 수가 있다.

한편, 「줄기세포의 배양상청액」은, 줄기세포를 배양하여 얻어지는 세포 그 자체를 포함하지 않는 배양액으로 정의된다. 본 발명의 조성물은 「줄기세포의 배양상청액」을 유효성분으로서 포함하는 것이며, 그 일 양태에서는 조성물 전체로서도 세포(세포의 종류는 불문함)를 포함하지 않는다. 해당 양태의 조성물은 이러한 특징에 의해, 줄기세포 자체는 물론, 줄기세포를 포함하는 각종 조성물과도 명확히 구별된다. 이러한 양태의 전형적인 예는, 줄기세포를 포함하지 않으며, 줄기세포의 배양상청액만으로 구성된 조성물이다.

줄기세포의 배양액에는 기본배지, 혹은 기본배지에 혈청 등을 첨가한 것 등을 사용할 수 있다. 단, 혈청을 포함하지 않는 「치수 줄기세포의 배양상청액」을 조제하기 위해서는, 전 과정을 통해 혹은 최후 또는 최후로부터 수 회의 계대 배양에 대하여 무혈청 배지를 사용하면 좋다. 한편, 기본 배지로서는 DMEM 외에, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium : IMDM)(GIBCO사 등), 햄 F12 배지(HamF12)(SIGMA사, GIBCO사 등), RPMI1640 배지 등을 이용할 수 있다. 2종 이상의 기본 배지를 병용하는 것으로 하여도 무방하다. 혼합 배지의 일례로서, IMDM과 HamF12을 등량 혼합한 배지(예컨대 상품명 : IMDM/HamF12(GIBCO사)로서 시판됨)를 들 수 있다. 또한, 배지에 첨가가능한 성분의 예로서, 혈청(우태아혈청, 인간 혈청, 양혈청 등), 혈청대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등), 소 혈청 알부민(BSA), 항생 물질, 각종 비타민, 각종 미네랄을 들 수 있다.

줄기세포의 배양에는, 통상적으로 이용되는 조건을 그대로 적용할 수 있다. 줄기세포 배양상청액의 제조방법에 대해서는, 줄기세포의 종류에 따라 줄기세포의 단리 및 선별 공정을 적절히 조정하는 것 이외에는, 후술하는 중추신경계질환 치료용 조성물의 제조방법과 마찬가지로 하면 된다. 줄기세포의 종류에 따른 줄기세포의 단리 및 선별은, 당업자라면 적절히 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서의 표적조직은 특별히 한정되지 않으며, 그 예로서는 피부, 뼈, 치주조직, 뇌 등이 포함된다. 본 발명의 조성물은, 이러한 표적조직의 수복에 유효하다. 예로서, 본 발명의 조성물을 이용한 골 재생 메카니즘의 개념도를 도 9에 나타낸다.

본 발명의 조성물은 또한, 조직의 손상에 관련된 질환의 치료에 유효하다. 이러한 질환의 예로서는, 뇌경색, 치주병, 척수손상, 피부궤양, 골다공증 등을 들 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 조성물은, 뇌경색, 치주병, 척수손상, 피부궤양, 골다공증 등의 치료용 조성물이며, 체성 줄기세포를 배양함으로써 얻어지는 줄기세포 배양상청액을 포함하는 것이다. 예컨대, 본 발명의 손상부 치료용 조성물은, 피부, 치주조직 내지는 뼈의 손상의 치료, 뇌경색의 치료, 또는 중추신경계질환의 치료 등 손상부의 치료를 위한 조성물로서 이용된다. 상기 손상부 치료용 조성물의 투여량은, 치료상 유효한 양이면 된다. 상기 손상부 치료용 조성물은, 줄기세포 배양상청액을 유효성분으로 하기 때문에, 치료에 이용될 때는 상기 손상부 치료용 조성물의 투여량을 적절히 조정하면 되며, 후술하는 바와 같이 유효성분을 농축하여 이용하여도 무방하다.

적용되는 피검체의 상태에 따라, 기대되는 치료효과가 유지된다는 것을 조건으로 하여, 본 발명의 조성물에 다른 성분을 추가적으로 사용하는 것도 방해되지 않는다. 본 발명에 있어서 추가적으로 사용될 수 있는 성분의 일례는 이하와 같다.

(i) 생체 흡수성 재료

유기계 생체 흡수성 재료로서 히알루론산, 콜라겐, 피브리노겐(Fibrinogen) (예컨대 볼 힐(등록상표)) 등을 사용할 수 있다.

(ii) 겔화 재료

겔화 재료는, 생체 친화성이 높은 것을 이용하는 것이 바람직하며, 히알루론산, 콜라겐 또는 피브린 글루(fibrin glue) 등을 이용할 수 있다. 히알루론산, 콜라겐으로서는 각종의 것을 선택하여 이용할 수 있지만, 본 발명의 조성물의 적용 목적(적용 조직)에 적합한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 이용되는 콜라겐은 가용성(산가용성 콜라겐, 알칼리 가용성 콜라겐, 효소가용성 콜라겐 등)인 것이 바람직하다.

(iii) 기타

약학적으로 허용되는 다른 성분(예컨대, 담체, 부형제, 붕해제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)을 함유시킬 수도 있다. 부형제로서는 유당, 전분, 솔비톨, D-만니톨, 백당 등을 이용할 수 있다. 붕해제로서는 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 탄산 칼슘 등을 이용할 수 있다. 완충제로서는 인산염, 구연산염, 초산염 등을 이용할 수 있다. 유화제로서는 아라비안 고무(arabic gum), 알긴산나트륨, 트래거캔스 등을 이용할 수 있다. 현탁제로서는 모노 스테아린산 글리세린, 모노 스테아린산 알루미늄, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 라우릴황산 나트륨 등을 이용할 수 있다. 무통화제로서는 벤질 알콜, 클로로부탄올, 솔비톨 등을 이용할 수 있다. 안정제로서는 프로필렌 글리콜, 아스코르브산 등을 이용할 수 있다. 보존제로서는 페놀, 염화벤잘코늄, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸파라벤 등을 이용할 수 있다. 방부제로서는 염화벤잘코늄, 파라 옥시 안식향산, 클로로부탄올 등을 이용할 수 있다. 항생 물질, pH조정제, 성장인자(예컨대, 상피세포성장인자(EGF), 신경성장인자(NGF), 뇌유래 신경영양인자(BDNF)) 등을 함유시키는 것으로 하여도 무방하다.

본 발명의 조성물의 최종적인 형태는 특별히 한정되지 않는다. 형태의 예로서는 액체상(액상, 겔상 등) 및 고체상(분체상, 세립(細粒), 과립상 등)을 들 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 또한 표적조직의 손상부를 수복하는 방법과, 손상된 조직을 치료하는 방법도 포함한다. 이들 방법은, 상기 줄기세포 배양상청액을, 각각 표적조직의 손상부 또는 손상된 조직에 투여하는 것을 포함한다. 이것으로부터, 손상된 부분을 갖는 표적조직을 효율적으로 수복할 수가 있다. 특히, 표적조직이 뇌일 경우, 뇌경색의 치료방법으로서도 바람직하게 적용가능하다.

상기 손상부 치료용 조성물의 투여방법 및 투여경로는, 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 손상부 치료용 조성물은, 비경구투여인 것이 바람직하고, 비경구투여로서는, 전신성 투여여도 국소투여여도 무방하다. 국소투여의 예로는, 표적조직에의 주입, 도포 또는 분무 등을 들 수 있다. 상기 손상부 치료용 조성물의 투여방법의 예로서는, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 문맥내 투여, 피내투여, 피하투여, 근육내 투여, 복강내 투여 및 비강내 투여 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 비강내 투여 등은 침습성이 낮아 바람직하다. 투여 스케줄로서는 예컨대 1일 1회～수회, 2일 1회, 혹은 3일 1회 등을 이용할 수 있다. 투여 스케줄의 작성에 있어서는, 대상(수용체)의 성별, 연령, 체중, 병태 등을 고려할 수 있다.

투여방법의 선택은, 표적으로 하는 조직의 종류, 치료대상이 되는 질환의 종류 등에 기초하여 당업자에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, 표적조직이 머리부에 있는 질환의 치료나 손상조직의 수복 등에는, 혈액뇌관문의 통과를 고려할 필요가 없고 침습성이 낮다는 점에서, 비강내 투여 등을 적용하는 것이 특히 바람직하다. 예컨대, 표적조직이 뇌일 경우에는, 비강내 투여가 바람직하게 적용될 수 있다. 또한, 뇌경색의 치료에 대하여 비강내 투여가 바람직하게 적용될 수 있다.

상기 손상부 치료용 조성물이 투여되는 대상은, 전형적으로는 표적조직에 손상을 입은 인간 환자이지만, 인간 이외의 포유 동물(애완동물, 가축, 실험 동물을 포함함. 구체적으로는 예컨대 마우스, 래트(rat), 마르모트(marmotte), 햄스터, 원숭이, 소, 돼지, 염소, 양, 개, 고양이 등)에 대한 적용도 상정된다.

또 본 발명의 뇌경색의 치료방법은, 상기 줄기세포 배양상청액을 비강내 투여하여 뇌의 손상부를 수복하는 것을 포함한다. 본 치료방법에 따르면, 뇌경색에 의해 손상을 입은 영역을 낮은 침습성으로 또한 효과적으로 회복시킬 수 있다.

<중추신경계질환치료용 조성물>

본 발명의 다른 양태는, 특히 중추신경계질환치료용 조성물 및 중추신경계질환치료방법을 포함한다.

본 발명자들은 상기 배경 하에서 연구를 진행하였다. 그리고, 치수 줄기세포가 신경줄기세포 마커, 분화된 신경세포의 마커, 아스트로사이트(astrocyte) 마커, 및 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 마커 등, 모든 신경계보 마커를 공발현시키는 희귀한 세포집단이라는 점, 치수 줄기세포가 뇌유래 신경영양인자(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor)를 고발현시킨다는 것을 밝히는 동시에, 치수 줄기세포가 신경의 재생을 촉진한다는 것을 동물실험에 의해 실증했다(일본 특허출원 제2010-92585호 참조).

이상과 같이, 지금까지는 치수 줄기세포(SHED, DPSC)의 잠재 능력에 기대하며 세포로서의 유용성을 여러 각도로 검토해 왔다. 연구를 더욱 진전시키는 가운데 본 발명자들은, 지금까지와는 시점을 크게 바꾸어 치수 줄기세포의 배양상청액에 주목하며 각종 실험을 실시하였다. 여기서, 이미 알려진 사실이기는 한데, 말초 신경은 손상 후에 재생되기 쉽지만, 중추 신경(대뇌나 척수)이 재생되는 일은 거의 없다. 중추 신경의 재생이 일어나지 않는 더욱 큰 이유는, 「손상 후의 중추 신경계에 재생 축색의 신장을 저해하는 각종 인자가 존재하기」 때문이다. 지금까지 활성화 아스트로사이트 유래 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸(proteoglycan) (CSPG)이나 미엘린 관련 당단백질(MAG)과 같은 신경재생 저해인자가 동정되고 있다. 이들 저해물질은 세포내 단백 Rho나 ROCK의 활성화에 의해 신경축색의 신장을 저해하며 아폽토시스를 야기한다. 신경재생 저해인자의 존재 하에서도 아폽토시스를 억제하고, 축색의 신장효과를 발휘하는 약제는 발견된 바 없다. 본 발명자들의 분석 결과, 치수 줄기세포의 배양상청액은, 손상된 중추 신경계의 환경(즉, 신경돌기의 신장을 저해하여 아폽토시스를 일으키는 물질이 존재하는 환경)에서도, 신경재생 저해물질의 작용을 억제하여(저해를 해제하여), 신경돌기의 신장을 촉진하며 아폽토시스를 억제한다는, 놀라운 사실이 밝혀졌다. 또한, 척수 손상모델 동물을 이용하여 치수 줄기세포의 배양상청액의 효과를 검증한 바, 치수 줄기세포의 배양상청액의 투여가 하지운동기능의 현저한 개선을 가져왔다. 또, 조직학적 평가결과, 치수 줄기세포의 배양상청액의 투여가 척수의 형태변화 및 신경손상의 확대를 억제하였다. 이와 같이, 치수(齒髓)에 의한 뛰어난 재생·치료 효과가 동물실험에 의해서도 확인되었다.

이상과 같이, 본 발명자들이 예의 검토한 결과, 치수 줄기세포의 배양상청액이 중추 신경계의 재생·치유에 매우 유효하다는 지견이 얻어졌다. 이하에 나타내는 본 발명은 주로 해당 지견에 근거하는 것이다. 한편, 치수 줄기세포의 배양상청액은, 사전 준비나 보존의 측면에 있어서, 치수 줄기세포 자체를 이용하는 경우보다 유리하며, 중추 신경계 질환의 급성기나 아급성기의 치료에 특히 적합하다 할 수 있다. 또한, 세포성분을 포함하지 않으며, 면역거부의 문제를 극복할 수 있다는 점에서도, 치수 줄기세포의 배양상청액의 유용성은 매우 높다.

본 발명의 본 양태는 이하를 포함한다.

[1] 치수 줄기세포의 배양상청액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중추신경계질환 치료용 조성물.

[2] 신경재생 저해물질의 존재 하에서 신경돌기 신장작용을 나타내는, [1]에 기재된 중추신경계질환 치료용 조성물.

[3] 상기 신경재생 저해물질이, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 또는 미엘린관련 당 단백질인, [2]에 기재된 중추신경계질환 치료용 조성물.

[4] 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용을 나타내는, [1]～[3] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환 치료용 조성물.

[5] 치수 줄기세포를 포함하지 않는, [1]～[4] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환 치료용 조성물.

[6] 치수 줄기세포를 조합시켜 이루어지는, [1]～[4] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환 치료용 조성물.

[7] 상기 치수 줄기세포가, 채취 후에 분화 유도 처리를 하지 않은 미분화형 치수 줄기세포인 것을 특징으로 하는, [6]에 기재된 중추신경계질환치료용 조성물.

[8] 혈청을 포함하지 않는, [1]～[7] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환치료용 조성물.

[9] 상기 배양상청액이, 치수세포 내의 접착성 세포 또는 그 계대세포를 배양하여 얻은 배양상청액인, [1]～[9] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환치료용 조성물.

[10] 상기 중추신경계질환이, 척수손상, 근위축성 측색경화증, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 파킨슨병(Parkingson's disease), 진행성 핵상성 마비, 헌팅턴병(Huntington's disease), 다계통위축증, 척수소뇌변성증 등의 신경변성질환, 뇌허혈, 뇌내출혈 또는 뇌경색에 의한 신경세포의 변성·탈락, 및 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 질환 내지 병태인, [1]～[9] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환치료용 조성물.

[11] 이하의 단계 (1)～(3)을 포함하는, 중추신경계질환치료용 조성물의 제조법 :

(1) 치수세포로부터 접착성 세포를 선별하는 단계 ;

(2) 상기 접착성 세포를 배양하는 단계 ;

(3) 배양상청액을 회수하는 단계.

[12] 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하여 단계 (2)를 수행하는, [11]에 기재된 제조법.

[13] 단계 (3)에 있어서, 계대배양 후의 배양상청액이 회수되는, [11] 또는 [12]에 기재된 제조법.

[14] 이하의 단계 (4)를 더욱 포함하는, [11]～[13] 중 어느 한 항에 기재된 제조법 :

(4) 회수한 배양상청액에 대하여, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염 및 보존으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 처리를 수행하는 단계.

[15] 이하의 단계 (a) 및/또는 (b)를 더욱 포함하는, [11]～[14] 중 어느 한 항에 기재된 제조법 :

(a) 회수한 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계 ;

(b) 회수한 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용의 유무를 확인하는 단계.

[16] 상기 중추신경계질환이, 척수손상, 근위축성 측색경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상성 마비, 헌팅턴병, 다계통 위축증, 척수소뇌 변성증 등의 신경변성질환, 뇌허혈, 뇌내출, 또는 뇌경색에 의한 신경세포의 변성·탈락 및 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 질환 내지 병태인, [11]～[15] 중 어느 한 항에 기재된 제조법.

[17] [1]～[10] 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환치료용 조성물을 중추신경계질환환자에게 치료상 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 중추신경계질환의 치료법.

[18] 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여와 동시에 또는 투여 후에, 치수 줄기세포를 상기 중추신경계질환환자에게 투여하는, [17]에 기재된 치료법.

[19] 상기 치수 줄기세포가, 채취 후에 분화 유도 처리를 하지 않은 미분화형 치수 줄기세포, 또는 채취 후에 신경계세포로 분화 유도한 분화 유도형 치수 줄기세포인, [18]에 기재된 치료법.

[20] 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여 후에, 신경계 세포로 분화 유도한 다능성 줄기세포를 상기 중추신경계질환환자에게 투여하는, [17]에 기재된 치료법.

[21] 조제한 치수 줄기세포의 배양상청액이 중추신경계계질환 치료용의 유효성분으로서 유효한지 여부를 판단하는 방법으로서, 이하의 단계 (a) 및/또는 (b)를 포함하는 방법 :

(a) 상기 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계 ;

(b) 상기 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용의 유무를 확인하는 단계.

본 발명의 중추신경계질환치료용 조성물은 치수 줄기세포의 배양상청액을 포함하는 것을 특징으로 한다. 치수 줄기세포는 크게 2종류가 존재한다. 즉, 유치 치수 줄기세포와 영구치 치수 줄기세포가 그것이다. 본 명세서에서는 관례에 따라 유치 치수 줄기세포를 SHED라 약칭하고, 영구치 치수 줄기세포를 DPSC라 약칭한다. SHED의 배양상청액 및 DPSC의 배양상청액 중 어느 것이든, 본 중추신경계질환치료용 조성물을 구성하는 배양상청액으로서 이용가능하다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물을 다음의 특성, 즉 「신경재생 저해물질의 존재 하에서 신경돌기 신장작용을 나타내는 것」에 의해 특징지을 수 있다.

말초 신경계와 달리, 중추 신경계에는 신경재생 저해물질(신경돌기 신장 저해 인자)이 존재한다. 중추신경계질환의 치료 (주로, 신경재생)를 도모함에 있어서 이 점은 중요하므로 고려를 요한다. 상기 특성을 구비한 상기 중추신경계질환치료용 조성물에 따르면, 신경재생 저해물질의 작용을 억제하여 신경의 재생을 촉진할 수 있게 된다. 신경재생 저해물질의 예에는 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸(CSPG) 및 미엘린 관련 당 단백질(MAG)이 있다. 상기 중추신경계질환치료용 조성물이 해당 특성을 구비하는지의 여부는, 예컨대, 신경세포 및 신경재생 저해물질(CSPG 또는 MAG)을 이용한 시험관내 실험(상세한 것은 후술의 실시예를 참조)에 의해 확인할 수 있다(피험(被驗) 조성물과 CSPG 또는 MAG의 공존 하에서 신경세포를 배양했을 경우에 신경돌기의 신장이 관찰되면, 피험 조성물이 해당 특성을 구비하는 것으로 판단할 수 있음).

상기 중추신경계질환치료용 조성물을 다음의 특성, 즉 「신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용을 나타내는 것」에 의해 특징지을 수도 있다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물이 해당 특성을 구비하는지의 여부는, 예컨대, 신경세포를 이용한 시험관내 실험(상세한 것은 후술의 실시예를 참조)에 의해 확인할 수 있다(피험 조성물의 존재 하에서 신경세포를 배양했을 경우에, 아폽토시스에 의한 세포사가 억제되면, 피험 조성물이 해당 특성을 구비하는 것으로 판단할 수 있음). 한편, 상기 중추신경계질환치료용 조성물은 바람직한 양태에 있어서, 해당 특성과 상기 특성(신경재생 저해물질의 존재 하에서 신경돌기 신장작용을 나타내는 것)을 함께 구비한다.

본 양태에 있어서 용어 「치수 줄기세포의 배양상청액」이란, 치수 줄기세포를 배양하여 얻어지는 배양액이며, 세포성분(즉, 치수세포나 치수 줄기세포)을 포함하지 않는다. 따라서, 예컨대 배양 후에 세포성분을 분리 제거함으로써, 본 발명에 사용가능한 배양상청액을 얻을 수 있다. 각종 처리(예컨대, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염, 보존 등)를 적절히 실시한 배양상청액을 이용하도록 하여도 무방하다. 배양상청액의 처리방법의 상세는 후술하도록 한다.

치수 줄기세포는, 치수세포 중의 접착성 세포로서 선별가능하다. 따라서, 탈락한 유치나 영구치로부터 채취한 치수세포 중의 접착성 세포 또는 그 계대 세포를 배양하여 얻어지는 배양상청액을, 「치수 줄기세포의 배양상청액」으로서 이용할 수 있다. 한편, 「치수 줄기세포의 배양상청액」의 조제법의 상세에 대해서는 후술하기로 한다.

상기한 바와 같이, 「치수 줄기세포의 배양상청액」은, 치수 줄기세포를 배양하여 얻어지는, 세포성분을 포함하지 않는 배양액으로 정의된다. 상기 중추신경계질환치료용 조성물은 「치수 줄기세포의 배양상청액」을 유효성분으로서 포함하는 것이지만, 그 일 양태에서는 조성물 전체로서도 세포(세포의 종류는 불문함)를 포함하지 않는다. 해당 양태의 조성물은 이러한 특징에 의해, 치수 줄기세포 자체는 물론, 치수 줄기세포를 포함하는 각종 조성물과 명확히 구별된다. 한편, 본 양태의 전형예는, 치수 줄기세포의 배양상청액만으로 구성된 조성물이다.

한편, 본 양태의 일 실시형태는 「치수 줄기세포의 배양상청액」과 「치수 줄기세포」를 조합시켜 이용한다는 점에 특징을 갖는다. 바람직하게는, 유치 치수 줄기세포(SHED)를 이용한다. 영구치 치수 줄기세포(DPSC)에 비해, 세포의 증식능이 높기 때문이다. 또한, 분화능도 보다 높다고 생각되기 때문이다. 나아가, SHED의 BDNF 발현 수준이 높아(일본 특허출원 제2010-92585호 참조), 보다 높은 치료 효과를 발휘할 수 있다는 것도 SHED를 이용하는 이점 중 하나이다. 더불어 SHED에는 채취가 간단하다는 장점도 있다.

최근, 세포를 이용한 재생 의료의 실현을 위한 연구가 수많은 연구 그룹에 의해 진행되고 있다. 세포를 이용할 경우, 생체로부터 채취한 세포를 배양, 선택, 처리 등에 제공하고, 그 후 회수하여 이식물의 성분으로 한다. 통상적으로, 일련의 조작 과정에서 배양상청액은 폐기 혹은 생리적 완충액 등으로 치환된다. 따라서, 최종적인 이식물은 배양상청액을 적극적으로 포함하는 것은 아니다. 이러한 점에 비추어 볼 때, 치수 줄기세포의 배양상청액을 필수 유효성분으로 한다는 점에서, 「치수 줄기세포의 배양상청액」과 「치수 줄기세포」를 조합시켜 이용하는 해당 양태의 조성물이라 하더라도, 치수 줄기세포 자체의 유용성에 주목하여 치수 줄기세포를 유효 성분으로 사용한 조성물 내지 작용제 등과는, 문언상으로는 물론 실질적으로도 엄중히 구별된다.

해당 실시형태의 특징은, 「치수 줄기세포의 배양상청액」과 「치수 줄기세포」를 조합시켜 이용하는 것이다. 여기에서의 「조합시켜 이용한다」는 것은, 「치수 줄기세포의 배양상청액」과 「치수 줄기세포」가 병용됨을 의미하는 것이다. 전형적으로는, 「치수 줄기세포의 배양상청액」과 「치수 줄기세포」를 혼합한 배합제로서 상기 중추신경계질환치료용 조성물이 제공되게 된다. 이러한 경우에는, 채취 후에 분화 유도를 하지 않은(환언하면, 미분화 상태를 유지시키고 있는) 치수 줄기세포(본 명세서에서「미분화형 치수 줄기세포」라고도 부름)를 이용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 중추신경계질환치료용 조성물은 강한 신경보호작용을 발휘하기 때문에, 급성기나 아급성기의 중추신경계질환(예컨대 척수손상, 뇌경색 등 심한 신경세포의 탈락·변성을 수반하는 난치성 신경질환)에 대한 적용에 특히 적합하다. 본 실시형태에서 사용하는 치수 줄기세포는, 신경줄기세포 마커인 네스틴(Nestin) 양성, 신경줄기세포 마커인 더블 코르틴(Doublecortin) 양성, 신경세포 마커인 β-Ⅲ튜불린(tublin) 양성, 신경세포 마커인 NeuN 양성, 아스트로사이트 마커인 GFAP 양성, 올리고덴드로사이트 마커인 CNPase 양성이며, 또한 BDNF를 고도로 발현시킨다(일본 특허출원 제2010-92585호 참조).

한편, 예컨대, 「치수 줄기세포의 배양상청액」을 함유하는 제 1 구성요소와, 「치수 줄기세포」를 함유하는 제 2 구성요소로 이루어지는 키트의 형태로 상기 중추신경계질환치료용 조성물을 제공할 수도 있다.

이 경우, 제 1 구성요소를 투여한 치료 대상(통상은 중추신경계질환 환자)에 대하여, 제 1 구성요소의 투여와 동시에 또는 투여 후에 제 2 구성요소가 투여되게 된다. 제 1 구성요소와 제 2 구성요소를 동시에 투여하는 사용법은 급성기나 아급성기의 중추신경계질환에 대한 적용에 특히 적합하다. 급성기나 아급성기에 적용되었을 경우에 높은 치료 효과가 발휘되도록, 제 2 구성요소의 유효성분으로서 미분화형 치수 줄기세포를 이용하는 것이 바람직하다.

한편, 여기에서의 「동시」는 엄밀한 동시성을 요구하는 것은 아니다. 따라서, 양 요소를 혼합한 후에 대상에 투여하는 등, 양 요소의 투여가 시간차가 없는 조건 하에서 실시되는 경우는 물론, 한 쪽의 투여 후 신속하게 다른 쪽을 투여하는 등, 양 요소의 투여가 실질적인 시간차가 없는 조건 하에서 실시되는 경우도 여기에서의 「동시」의 개념에 포함된다.

급성기 또는 아급성기에 제 1 구성요소를 투여하고, 그 후(예컨대 3일～1주 후)에 제 2 구성요소를 투여하는 사용법에 따르면, 연속적이며 또한 종합적인 치료 효과를 기대할 수 있다. 해당 사용법이 예정될 경우에는, 제 2 구성요소의 유효성분으로서, 신경계 세포로 분화 유도한 치수 줄기세포(본 명세서에서는 「분화 유도형 치수 줄기세포」라고도 부름)를 이용하는 것이 바람직하다. 여기에서의 용어 「신경계 세포」는, 운동 뉴런, 도파민 생산 세포, 각종 중추 신경세포, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 슈반세포(Schwann cell)를 포함한다. 어떠한 신경계 세포로 분화 유도한 치수 줄기세포를 이용할지는, 치료 대상의 질환·병태를 고려하여 결정할 수 있다. 예컨대, 척수손상의 치료용이면 성숙형 신경세포나 올리고덴드로사이트 또는 슈반세포로 분화 유도한 치수 줄기세포를 제 2 구성요소로 사용하면 좋다. 이하, 신경계 세포로의 분화 유도법의 예를 나타내기로 한다.

도파민 생산 신경세포로의 분화 유도에는 이하의 2공정으로 이루어지는 방법을 이용할 수 있다. 제 1 공정에서는, 폴리-L-리신으로 코팅된 접시를 이용하여, 예컨대 12.5 U/ml 니스타틴(Nystatin), N2 보충물, 20ng/ml bFGF 및 20ng/ml EGF를 포함한 DMED 배지에서 치수 줄기세포를 2～3일간 배양한다. 이 공정에 의해, 치수 줄기세포는 신경줄기세포로 분화 유도된다. 제 2 공정에서는, 제 1 공정 후의 세포를 예컨대 B27 보충물, 1mM db-cAMP, 0.5mM IBMX, 200μM 아스코르브산 및 50ng/ml BDNF를 포함하는 Neurobasal^TM배지에서 6～7일간 배양한다. 유도된 도파민 생산 신경세포는, 티로신 히드록실라제에 대한 항체를 이용하여 면역염색으로 확인할 수 있다. 이상의 방법 외에, bFGF 존재 하에서 배양한 후에 부유 응집 배양계로 배양하는 방법(Studer, L. et al.: Nat. Neurosci.,1:290-295,1998), bFGF 및 글리아 세포의 배양상청액의 존재 하에서 배양하는 방법(Daadi, M. M. and Weiss, S. J.: Neuroscience,19:4484-4497,1999.), FGF8, Shh, bFGF 및 아스코르브산 등을 이용한 방법(Lee, S. H. et al.: Nat. Biotechnol.,18:675-679,2000.), 골수간질세포와 공배양하는 방법(Kawasaki, H. et al.: Neuron,28:31-40,2000.) 등, 신경줄기세포 또는 배아 줄기세포를 도파민 생산 신경세포로 분화 유도시키는 방법으로서 보고된 각종 방법을 필요에 따라 적당히 수정한 뒤에 이용하여도 무방하다.

아스트로사이트로의 분화 유도에는 이하의 2공정으로 이루어지는 방법을 이용할 수 있다. 제 1 공정에서는, 폴리-L-오르니틴과 피브로넥틴으로 ２중 코팅한 접시를 이용하여, 예컨대 N2 보충물 및 10ng/ml bFGF를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 치수 줄기세포를 4일간 배양한다. 제 2 공정에서는, 80ng/ml LIF, 80ng/ml BMP2을 더욱 첨가한 배지에서 3일간 배양한다. 분화 유도된 아스트로사이트는, GFAP에 대한 항체를 이용한 면역염색으로 확인할 수 있다.

올리고덴드로사이트로의 분화 유도에는 이하의 2공정으로 이루어지는 방법을 이용할 수 있다. 아스트로사이트로의 분화 유도와 마찬가지로 제 1 공정에서는, 폴리-L-오르니틴과 피브로넥틴으로 ２중 코팅한 접시를 이용하여, 예컨대 N2 보충물, 10ng/ml bFGF 및 0.5% FCS를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 치수 줄기세포를 4일간 배양한다. 이 공정에 의해 치수 줄기세포는 올리고덴드로사이트 전구 세포로 유도된다. 이어지는 제 2 공정에서는 20ng/ml T3(Triiodothyronine), 20ng/ml T4(Thyroxine) 및 N2 보충물을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 4일간 배양한다. 분화 유도된 올리고덴드로사이트는 O4에 대한 항체를 이용하여 확인할 수 있다.

제 2 구성요소의 성분으로서, 분화 유도형 치수 줄기세포에 추가하여 또는 대신하여, 신경계 세포로 분화 유도한 다능성(多能性) 줄기세포를 이용할 수도 있다. 다능성 줄기세포의 예로는 유도 다능성 줄기세포(iPS세포) 및 배아 줄기세포(ES세포)가 있다. 「유도 다능성 줄기세포(iPS세포)」란, 초기화 인자의 도입 등에 의해 체세포를 리프로그래밍함으로써 제작되는, 다능성(다분화능)과 증식능을 갖는 세포이다. 유도 다능성 줄기세포는 ES세포에 가까운 성질을 나타낸다. iPS세포는, 지금까지 보고된 각종 iPS세포 제작법에 의해 제작할 수 있다. 또한, 앞으로 개발될 iPS세포 제작법을 적용하는 것도 당연히 상정된다.

iPS세포 제작법의 가장 기본적인 수법은, 전사인자인 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 4인자를, 바이러스를 이용하여 세포에 도입하는 방법이다(Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4),663-676,2006; Takahashi, K, et al: Cell 131(5),861-72,2007). 인간 iPS세포에 대해서는 Oct4, Sox2, Lin28 및 Nonog의 4인자의 도입에 의한 수립이 보고된 바 있다(Yu J, et al: Science 318(5858),1917-1920,2007). c-Myc을 제외한 3인자(Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.26(1),101-106,2008), Oct3/4 및 Klf4의 2인자(Kim J B, et al: Nature 454(7204),646-650,2008), 혹은 Oct3/4만(Kim J B, et al: Cell 136(3),411-419,2009) 도입함에 따른 iPS세포의 수립도 보고된 바 있다. 또한, 유전자의 발현산물인 단백질을 세포에 도입하는 수법(Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4,381-384,2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4,472-476,2009)도 보고된 바 있다. 한편, 히스톤메틸기 전이 효소 G9a에 대한 저해제 BIX-01294나 히스톤 탈(脫)아세틸화 효소 저해제 발프로산(VPA) 혹은 BayK8644 등을 사용함으로써 제작효율의 향상이나 도입되는 인자의 저감 등이 가능하다는 보고도 있다(Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol.26(7),795-797,2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol.26(11),1269-1275,2008; Silva J, et al: PLoS. Biol.6(10), e 253,2008). 유전자도입법에 대해서도 검토가 진척되어, 레트로바이러스 외에 렌티바이러스(Lentivirus)(Yu J, et al: Science 318(5858),1917-1920,2007), 아데노바이러스(adenovirus)(Stadtfeld M, et al: Science 322(5903),945-949,2008), 플라스미드(Okita K, et al: Science 322(5903),949-953,2008), 트랜스포존(transposon) 벡터(Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458,766-770,2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458,771-775,2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6,363-369,2009), 혹은 에피솜 벡터(episomal vector)(Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324,797-801,2009)를 트랜스펙션에 이용한 기술이 개발되고 있다.

iPS세포로의 형질전환, 즉 초기화(리프로그래밍)가 발생한 세포는 Fbxo15, Nanog, Oct/4, Fgf-4, Esg-1 및 Cript 등의 다능성 줄기세포 마커(미분화 마커)의 발현 등을 지표로 하여 선택할 수 있다. 선택된 세포를 iPS세포로서 회수한다.

한편, 여러 종류의 ES세포가 공적 기관에 의해 제공되거나 혹은 시판되고 있다. 마우스 ES세포의 예로서, ES-E14TG2a세포(ATCC), ES-D3세포 등(ATCC), H1세포(리켄(理硏) 바이오리소스센터, 츠쿠바시, 일본), B6G-2세포(리켄 바이오리소스센터, 츠쿠바시, 일본), R1세포(Samuel Lunenfeld Research Institute, 토론토, 캐나다), 마우스 ES세포(129SV, 카탈로그 번호 R-CMTI-1-15, R-CMTI-1A) (다이닛폰 스미토모세이야쿠 가부시키가이샤, 오사카, 일본), 마우스 ES세포(C57/BL6, 카탈로그 번호 R-CMTI-2A(다이닛폰 스미토모세이야쿠 가부시키가이샤, 오사카, 일본)를 들 수 있다. 원숭이 ES세포에 대해서는, 교토대학 재생의과학연구소 부속 줄기세포 의학연구 센터 등으로부터 입수가능하다. 인간 ES세포에 대해서는 교토대학 재생의과학 연구소 부속 줄기세포 의학연구센터, WiCell Research Institute(매디슨, 미국), ES Cell International Pte Ltd(싱가폴) 등으로부터 입수가능하다. ES세포의 수립 방법은 확립되어 있으며, 일부에 대해서는 루틴(routine)화도 되어 있기 때문에, 통상법에 따라 스스로 원하는 ES세포를 수립하는 것도 가능하다. 예컨대 마우스 ES세포의 수립 방법에 대해서는 문헌[Nagy. A. et al. eds.: Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press,2003, 실험의학 별책 배양세포 실험 핸드북(요도샤)] 등을 참조할 수 있다. 원숭이 ES세포의 수립방법이라면 문헌[Suemori H, Tada T, Torii R, et al., Dev Dyn 222,273-279,2001] 등을 참조할 수 있다. 인간 ES세포의 수립방법이라면 문헌[Wassarman, P.M. et al.: Methods in Enzymology, Vol.365(2003)] 등을 참조할 수 있다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물은 혈청을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 혈청을 포함하지 않음으로써 그 안전성이 높아진다. 예컨대, 혈청을 포함하지 않는 배지(무혈청 배지)에서 치수 줄기세포를 배양함으로써, 혈청을 포함하지 않는 배양상청액을 조제할 수 있다. 1회 또는 복수 회의 계대배양을 수행하는 것으로 하고, 최후 또는 최후부터 수 회의 계대배양을 무혈청 배지에서 수행하는 방법에 의해서도, 혈청을 포함하지 않는 배양상청액을 얻을 수 있다. 한편, 회수한 배양상청액으로부터 투석이나 칼럼에 의한 용매치환 등을 이용하여 혈청을 제거하는 방법에 의해서도, 혈청을 포함하지 않는 배양상청액을 얻을 수가 있다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물은 중추신경계(뇌나 척수) 질환의 치료에 이용된다. 상기 중추신경계질환치료용 조성물을 적용할 수 있는 중추신경계질환을 예시하면, 척수손상, 신경변성질환(근위축성 측색경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상성 마비, 헌팅턴병, 다계통위축증, 척수소뇌변성증 등), 뇌허혈이나 뇌내출혈 등에 수반되는 뇌경색에 의한 신경세포의 변성·탈락, 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환을 들 수 있다. 상기 중추신경계질환치료용 조성물을 적용하면, 신경돌기 신장작용 및/또는 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용에 의해, 중추 신경조직의 재생·치유가 촉진된다. 이러한 메카니즘에 기초한 치료가 유효한 질환 내지 병태이면, 그 종류나 원인(예컨대, 외상이나 뇌경색 등에 의한 1차적 원인, 감염, 종양 등에 의한 ２차적 원인) 등의 여하에 관계없이, 본 발명의 대상질환이 될 수 있다.

척수손상은 외부로부터의 충격이나 척수종양 또는 탈장(hernia) 등의 내적요인에 의해 척수가 손상된 상태를 말한다. 손상의 정도에 따라 완전형(척수가 도중에 완전히 절단된 상태)와 불완전형(척수가 손상 또는 압박을 받고 있지만 척수의 기능이 부분적으로 유지되어 있는 상태)로 나뉜다. 현재의 의료기술로는 척수손상을 완전히 회복시킬 수는 없어, 새로운 치료법의 확립이 절실히 요망되고 있다. 척수손상은, 재생의료의 적용이 기대되는 질병 중 하나로서, 골수, 신경줄기세포, 배아 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 등의 사용이 검토되고 있다. 그러나, 여러가지 문제때문에 결정적인 치료기술의 실현에는 이르지 못하고 있다. 상기 중추신경계질환치료용 조성물은, 이러한 상황에서 높은 치료효과를 기대할 수 있는 치료법을 제공하는 것이어서, 그 의의·가치는 매우 높다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물이 적용가능한 다른 질병·병태는, 급성기나 아급성기의 뇌허혈, 뇌내출혈 등에 의한 신경세포의 변성·탈락에 의해 발생하는 뇌경색이나, 주산기(周産期)의 저산소 허혈이 원인이 되어 발생하는 신생아 뇌질환인 뇌실 주위 백질 연화증 등이다. 뇌허혈이란 뇌내의 혈액이 부족하여, 뇌에 충분한 산소나 영양이 공급되지 않는 상태이다. 뇌허혈은 신경세포사, 뇌부종을 야기하여 뇌경색의 원인이 된다. 본 발명의 조성물은, 이러한 뇌허혈 등에 기인하는 신경세포의 파괴 또는 이에 따른 각종 질환의 치료에도 적용될 수 있다.

파킨슨병, 척수소뇌변성증, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다계통위축증, 진행성핵상청 마비는, 대뇌, 중뇌 및 소뇌영역에 있어서의 영역 특이적인 신경세포의 탈락변이에 의해 야기되는 난치성 신경질환이다. 상기 중추신경계질환치료용 조성물은 이들 질환에 있어서의 신경세포의 변성·탈락을 억제함으로써 치료 효과를 발휘할 수 있다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물은 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환에도 적용가능하다. 망막에는 크게 5종류의 신경세포, 즉, 시세포(추체세포, 간체세포) 쌍극세포, 수평세포, 아마크린세포 및 신경절세포가 존재한다. 망막에 존재하는 이들 신경세포(1종 또는 2종 이상)의 장해가 원인이 되는 망막질환뿐만 아니라, 이들 신경세포(1종 또는 2종이상)의 장해를 나타내는 병태인 망막질환(외상성 망막박리, 망막열공, 망막진탕증, 시신경관골절, 당뇨병망막증, 노인성 황반변성, 망막색소변성증, 녹내장, 맥락막 결손(Choroideremia), 레베르 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 추체 디스토로피(dystrophy), 가족성 드루젠(familial drusen), 중심원형 맥락막 이상증(central areolar choroidal atrophy), 상염색체 우성 시신경 위축 등)에 있어서의 신경세포사와 탈락을 상기 중추신경계질환치료용 조성물이 억제함으로써, 치료효과를 발휘할 수 있다.

기대되는 치료효과가 유지되는 것을 조건으로 하여, 본 발명의 조성물에 다른 성분을 추가적으로 사용하는 것을 방해하지 않는다. 본 발명에 있어서 추가적으로 사용될 수 있는 성분을 이하에 열거한다.

(i) 생체 흡수성 재료

유기계 생체흡수성 재료로서 히알루론산, 콜라겐, 피브리노겐(Fibrinogen) (예컨대 볼힐 (등록상표)) 등을 사용할 수 있다.

(ii) 겔화 재료

겔화 재료는, 생체친화성이 높은 것을 이용하는 것이 바람직하며, 히알루론산, 콜라겐 또는 피브린 글루(fibrin glue) 등을 이용할 수 있다. 히알루론산, 콜라겐으로서는 각종의 것을 선택하여 이용할 수 있는데, 본 발명의 조성물의 적용 목적(적용 조직)에 적합한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 이용되는 콜라겐은 가용성(산가용성 콜라겐, 알칼리 가용성 콜라겐, 효소가용성 콜라겐 등)인 것이 바람직하다.

(iii) 기타

약학적으로 허용되는 다른 성분(예컨대, 담체, 부형제, 붕해제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)을 함유시킬 수도 있다. 부형제로서는 유당, 전분, 솔비톨, D-만니톨, 백당 등을 이용할 수 있다. 붕해제로서는 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 탄산 칼슘 등을 이용할 수 있다. 완충제로서는 인산염, 구연산염, 초산염 등을 이용할 수 있다. 유화제로서는 아라비안 고무, 알긴산나트륨, 트래거캔스 등을 이용할 수 있다. 현탁제로서는 모노 스테아린산 글리세린, 모노 스테아린산 알루미늄, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 라우릴황산 나트륨 등을 이용할 수 있다. 무통화제로서는 벤질 알콜, 클로로부탄올, 솔비톨 등을 이용할 수 있다. 안정제로서는 프로필렌 글리콜, 아스코르브산 등을 이용할 수 있다. 보존제로서는 페놀, 염화벤잘코늄, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸파라벤 등을 이용할 수 있다. 방부제로서는 염화벤잘코늄, 파라옥시안식향산, 클로로부탄올 등을 이용할 수 있다. 항생 물질, pH 조정제, 성장인자(예컨대 신경성장인자(NGF), 뇌유래 신경영양인자(BDNF)) 등을 함유시키는 것으로 하여도 무방하다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물의 최종적인 형태는 특별히 한정되지 않는다. 형태의 예로는 액체상(액상, 겔상 등) 및 고체상(분체상, 세립, 과립상 등)을 들 수 있다.

상기 중추신경계질환치료용 조성물의 제조방법은 특별히 한정되지 않지만, 이하의 단계 (1)～(3), 즉, (1) 치수세포로부터 접착성 세포를 선별하는 단계, (2) 상기 접착성 세포를 배양하는 단계, (3) 배양상청액을 회수하는 단계를 포함하는 제조방법인 것이 바람직하다. 이하, 단계마다 설명한다.

단계 (1)에서는, 치수세포 중에서 접착성 세포인 치수 줄기세포를 선별한다. 이하에서 치수세포는, 사전에 생체로부터 단리하는 등에 의해 준비하면 된다. 본 선별 단계는, 치수세포의 준비를 포함하는 것이어도 무방하다. 치수세포의 준비로부터 치수 줄기세포의 선별에 이르기까지의 일련의 조작 순서의 구체예를 나타낸다.

(a) 치수의 채취

자연스럽게 탈락한 유치(또는 발치한 유치, 혹은 영구치)를 클로로헥시딘 또는 이소딘(isodine) 용액으로 소독한 후, 치관부를 분할하여 치과용 리머에 의해 치수조직을 회수한다.

(b) 효소처리

채취한 치수조직을 기본 배지(10%소혈청·항생물질함유 둘베코 변형 이글(eagle) 배지)에 현탁하고, 2㎎/ml의 콜라게나제 및 디스파제로 37℃, 1시간 처리한다. 5분간의 원심분리(5000회전/분)에 의해 효소처리 후의 치수세포를 회수한다. 셀 스트레이너에 의한 세포선별은 SHED나 DPSC의 신경줄기세포 분획의 회수 효율을 저하시키므로 원칙적으로 사용하지 않는다.

(c) 접착성 세포의 선별

세포를 4cc 기본 배지에서 재현탁하여, 직경 6cm의 접착성 세포배양용 접시에 시딩(seed)한다. 배양액(예컨대, 10% FCS 함유 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))을 첨가한 후, 5% CO₂, 37℃로 조정한 인큐베이터에서 2주 정도 배양한다. 배양액을 제거한 후, PBS 등으로 세포를 1회 또는 수회 세척한다. 이러한 조작(배양액의 제거 및 세포의 세척) 대신에, 콜로니를 형성한 접착성 세포(치수 줄기세포)를 회수하는 것으로 하여도 무방하다. 이 경우에는 예컨대, 0.05% 트립신(trypsin)·EDTA로 5분간, 37℃에서 처리하고, 접시로부터 박리된 세포를 회수한다.

단계 (1)에 이어지는 단계 (2)에서는, 선별한 접착성 세포를 배양한다. 예컨대, 세포를 접착성 세포배양용 접시에 시딩하고, 5% CO₂, 37℃로 조정한 인큐베이터에서 배양한다. 필요에 따라 계대배양을 수행한다. 예컨대, 육안으로 관찰하여 서브컨플루언스(subconfluence)(배양 용기 표면의 약 70%를 세포가 차지하는 상태) 또는 컨플루언스에 이르렀을 때 세포를 배양 용기로부터 박리하여 회수하고, 다시 배양액을 채운 배양 용기에 시딩한다. 계대 배양을 반복 수행하여도 무방하다. 예컨대 계대 배양을 1～8회 수행하여, 필요한 세포 수(예컨대 약 1×10⁷개/ml)까지 증식시킨다. 한편, 배양 용기로부터의 세포의 박리는, 트립신 처리 등 통상법으로 실시할 수 있다. 이상의 배양 후에, 세포를 회수하여 보존하는 것으로 하여도 무방하다(보존 조건은 예컨대 -198℃). 여러 도너로부터 회수한 세포를 치수 줄기세포 뱅크(bank)의 형태로 보존하도록 하여도 무방하다.

배양액에는 기본 배지, 혹은 기본 배지에 혈청 등을 첨가한 것 등을 사용할 수 있다. 단, 혈청을 포함하지 않는 「치수 줄기세포의 배양상청액」을 조제하기 위해서는, 전 과정을 통해 혹은 최후 또는 최후로부터 수 회의 계대 배양에 대해서는 무혈청 배지를 사용하는 것이 좋다. 한편, 기본 배지로서는 DMEM 외에, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium : IMDM)(GIBCO사 등), 햄 F12 배지(HamF12)(SIGMA사, GIBCO사 등), RPMI1640 배지 등을 이용할 수 있다. 2종 이상의 기본 배지를 병용하는 것으로 하여도 무방하다. 혼합 배지의 일례로서, IMDM과 HamF12를 등량 혼합한 배지(예컨대 상품명 : IMDM/HamF12(GIBCO사)로서 시판됨)를 들 수 있다. 또한, 배지에 첨가가능한 성분의 예로서, 혈청(우태아혈청, 인간 혈청, 양혈청 등), 혈청 대체물(Knockout serum replacement(KSR) 등), 소혈청 알부민(BSA), 항생물질, 각종 비타민, 각종 미네랄을 들 수 있다.

단계 (2)에 이어지는 단계 (3)에서는, 상기의 방법으로 선별·배양한 치수 줄기세포의 배양상청액을 회수한다. 예컨대, 스포이드나 피펫 등으로 배양액을 흡인하여 회수할 수 있다. 회수한 배양상청액은 그대로 혹은 하나 이상의 처리를 거친 후에 본 발명의 조성물의 유효성분으로서 사용된다. 여기에서의 처리로서, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염, 보존(예컨대, 4℃, -80℃)을 예시할 수 있다. 한편, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 치수 줄기세포의 배양상청액은, 복잡한 고도의 정제를 하지 않아도, 소기의 작용(신경돌기 신장작용 및 아폽토시스 억제작용)을 나타내었다. 이는, 중추신경계질환에 유효한 본 발명의 조성물을 간편한 공정으로 제조할 수 있음을 의미한다. 복잡한 정제 공정을 필요로 하지 않는다는 것은, 정제에 따른 활성의 저하를 회피할 수 있다는 점에서도 유리하다.

배양상청액의 품질을 확인하기 위하여, 회수한 배양상청액에 대해 이하의 단계 (a) 또는 단계 (b), 또는 이들 단계 모두를 수행하는 것으로 하여도 무방하다.

(a) 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계.

(b) 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용의 유무를 확인하는 단계.

단계 (a)에 있어서 긍정적인 결과가 얻어진 배양상청액에 대해서는, 신경돌기 신장작용에 의한 양호한 치료 효과를 기대할 수 있다. 마찬가지로 단계 (b)에 있어서 긍정적인 결과가 얻어진 배양상청액에 대해서는, 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용에 의한 양호한 치료 효과를 기대할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (a)와 단계 (b)의 양자를 수행하여, 어느 단계에서나 긍정적인 결과가 나타난 배양상청액을 본 발명의 조성물의 유효성분으로서 이용한다. 단계 (a) 및 (b)에 있어서의 확인방법에 대해서는 상술한 바와 같다(본 발명의 제 1 양태 란). 한편, 단계 (a) 및 (b)에 따르면, 회수 내지 조제되거나, 혹은 보존되어 있던 배양상청액의 품질을 확인할 수도 있다. 따라서, 이들 단계는, 치수 줄기세포의 배양상청액의 품질판단법(즉, 중추 신경계 질환치료용의 유효성분으로서의 적합성을 판단하는 수단)으로서, 그 자체는 높은 유용성 및 가치가 인정된다.

<줄기세포 배양상청액의 농축방법>

본 발명에 포함되는 손상부 치료용 조성물 및 중추신경계질환의 치료용 조성물에 대해서는, 줄기세포 배양상청액에 포함되는 생리활성물질을 제제화하는 것이 가능하다. 이로써, 예컨대 신경재생 활성물질을 제제화할 수 있게 된다. 제제화를 위한 세포배양상청액의 농축방법으로서는, 이 목적을 위해 통상적으로 행해지고 있는 방법을 적용할 수 있다. 농축방법의 예로서는, 예컨대, 이하의 2가지 방법을 들 수 있다.

1. 스핀 칼럼(spin column) 농축법

배양상청액을 Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(밀리포어사 제품)을 이용하여 농축한다(최대 75배 농축). 구체적인 조작 순서는 다음과 같다.

(i) 배양상청액(최대 15ml)을 Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K에 투입하고, ×4000g로 약 60분간 원심하여 200㎕까지 농축한다.

(ii) 상기 튜브에 배양상청액과 동량의 멸균 PBS를 투입하고, 다시 ×4000g로 약 60분간 원심하여, 베이스 용액을 PBS로 치환한다.

(iii) 얻어진 용액 200㎕을 마이크로 테스트 튜브에 회수하여, 농축 줄기세포 배양상청액으로 한다.

2. 에탄올 침전 농축법

배양상청액을 에탄올 침전법을 이용하여 농축한다(최대 10배 농축). 구체적인 조작 순서는 다음과 같다.

(i) 배양상청액 5ml에 대하여 100% 에탄올 45ml을 첨가하고 혼합하여 -20℃에서 60분간 방치한다.

(ii) 4℃, ×15000g으로 15분간 원심한다.

(iii) 상청액을 제거하고, 90% 에탄올 10ml을 첨가하여 잘 교반한다.

(iv) 4℃, ×15000g로 5분간 원심한다.

(v) 상청액을 제거하여, 얻어진 펠릿(pellet)을 멸균수 500㎕에 용해하고 마이크로 테스트 튜브에 회수하여, 농축 줄기세포 배양상청액으로 한다.

<줄기세포 배양상청액의 동결 건조 방법>

또, 본 발명의 조성물에 있어서의 줄기세포 배양상청액은, 동결 건조할 수도 있다. 이로써, 양호한 보존 안정성을 얻을 수 있다. 줄기세포 배양상청액의 동결 건조 방법으로서는, 이러한 목적을 위해 통상적으로 행해지는 방법을 적용할 수 있다. 동결 건조 방법의 예로서는, 예컨대, 이하의 방법을 들 수 있다.

(i) 상기 방법으로 얻어진 줄기세포 배양상청액 또는 농축 줄기세포 배양상청액을 -80℃에서 2시간~반일간 동결한다.

(ii) 동결 후, 샘플 튜브의 뚜껑을 개방하고, 동결 건조기에 세팅한다.

(iii) 1～2일간 동결 건조를 수행한다.

(iv) 얻어진 샘플을 동결 건조 줄기세포 배양상청액으로 한다(-80℃에서 보존 가능).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 중추신경계질환치료용 조성물을 중추신경계질환 환자에게 치료상 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는, 중추신경계질환의 치료법이 제공된다. 목적으로 하는 조직에 전달되는 한, 본 발명의 조성물의 투여경로는 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 국소투여에 의해 적용된다. 국소투여의 예로서, 목적조직에 대한 주입 또는 도포를 들 수 있다. 정맥내 주사, 동맥내 주사, 문맥내 주사, 피내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 또는 복강내 주사에 의해 본 발명의 조성물을 투여하는 것으로 하여도 무방하다. 투여 스케줄로서는 예컨대 1일 1회～수회, 2일 1회, 혹은 3일 1회 등을 이용할 수 있다. 투여 스케줄의 작성에 있어서는, 대상(수용체)의 성별, 연령, 체중, 병태 등을 고려할 수 있다. 본 발명의 조성물이 투여되는 대상은, 전형적으로는 중추 신경계 질환에 걸린 인간 환자이지만, 인간 이외의 포유 동물(애완 동물, 가축, 실험 동물을 포함하며, 구체적으로는 예컨대 마우스, 래트, 마르모트, 햄스터, 원숭이, 소, 돼지, 염소, 양, 개, 고양이 등)에 대한 적용도 상정된다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 효과를 최대한 살릴 수 있도록, 급성기 또는 아급성기의 대상에 대하여 본 발명의 조성물을 투여한다.

본 발명의 일 실시형태에서는, 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여와 동시에 또는 투여 후에 치수 줄기세포를 동일 대상에 투여하여, 복합적 내지는 연속적인 효과를 발휘하도록 하여도 무방하다. 여기서의 치수 줄기세포로서, 채취 후에 분화 유도 처리를 하지 않은 미분화형 치수 줄기세포 또는 채취 후에 신경계 세포로 분화 유도한 분화 유도형 치수 줄기세포를 이용할 수 있다. 단, 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여와 동시에 치수 줄기세포를 투여할 경우에는, 높은 치료 효과가 발휘되도록 미분화형 치수 줄기세포를 투여하는 것이 바람직하다. 한편, 상기 중추신경계질환치료용 조성물의 투여 후에 치수 줄기세포를 투여할 경우에는, 신경계 세포로 분화 유도한 치수 줄기세포를 사용하면 좋다. 분화 유도형 치수 줄기세포에 추가하여 또는 대신하여, 신경계 세포로 분화 유도한 다능성 줄기세포(예컨대 iPS세포나 ES세포)를 이용하는 것으로 하여도 무방하다.

이하에 본 발명의 실시예에 대해 설명하겠으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또 실시예 중의 %는, 특별히 단정짓지 않는 한 중량(질량) 기준이다.

실시예

(실시예 1)

<재료 및 방법>

(1) 피검체 및 세포배양

8명의 환자의 임상적으로 건강한 발치된 유치 및 영구치로부터 인간 치수조직을 얻었다. 본 실험 프로토콜은 나고야 대학 윤리위원회의 승인을 받은 것이다. SHED 및 DPSC을, Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:13625-30 또는 Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:5807-12에 보고되어 있는 바와 같이 하여 단리 및 배양하였다.

간결하게는, 치수를 천천히 취하여 3mg/mL의 Ｉ형 콜라게나제 및 4mg/mL의 디스파제의 용액 속에서 37℃ 1시간 분해시켰다. 70mm의 세포 스트레이너(Falcon; BD Labware, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 여과한 후, 20%의 간엽계 세포성장 보충물(Lonza Inc, Walkersville, MD) 및 항생 물질(100U/mL의 페니실린, 100mg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin), 및 0.25mg/mL의 암포테리신B ; GIBCO사 제품)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM ; GIBCO, Rockville, MD) 내에서 37℃, 5% CO₂하에서 세포를 배양하였다. 1차 배양 후, 약 1×10⁴세포/㎠로 세포를 계대 배양했다. 1～3회 계대한 세포를 실험에 이용하였다. 인간BMMSC은 론자사(Lonza Inc)로부터 구입하였고, 제조자의 취급 설명서에 따라 배양했다.

(2) 세포증식의 분석

BrdU 염색 키트를 제조자(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 취급 설명서에 따라 이용하여 브로모데옥시우리딘(BrdU)을 12시간 유입시켜, SHED, DPSC 및 BMSC의 증식 속도를 평가했다(각 그룹에 대해 n=3). 실험은 5회 반복했다. 1원 분산 분석 후에 Tukey-Kramer test에 의해 통계적 유의차를 평가했다.

STRO-1의 면역형광을 위해 SHED, DPSC 및 BMSC를, 3% 파라포름알데하이드로 고정한 후, 인산 완충 생리식염수로 2회 세정하고, 100mM의 글리신으로 20분간 처리했다. 그 다음에, 세포를 0.2%의 Triton-X (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 30분간 투과 처리한 후, 5%의 당나귀혈청 및 0.5%의 소혈청 알부민의 혼합물 속에서 20분간 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 1차 항체인 마우스 항-인간 STRO-1항체(1 : 100 ; R&D, Minneapolis, MN)와 함께 1시간 인큐베이션하고, ２차 항체인 염소 항마우스 면역 글로불린 M-FITC 항체(1 : 500 ; Southern Biotech, Birmingham, AL)와 함께 30분간 인큐베이션하며, DAPI를 이용한 벡터 실드(Vectashield)를 이용하여 (Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA) 탑재하였다.

(3) 동물실험(도 1)

5주령의 암컷 헤어리스 마우스(Hos ; HR-1)는 SLC사(SLC Inc．일본, 시즈오카)로부터 제공되었다. 모든 마우스를, 기후제어된 구역(22±1℃, 습도 50%)에 12/12h의 명암사이클로 수용하였다. 동물은 물 및 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있으며, 매일 관찰되었다. UVB 방사장치 RMX-3W(Handok Biotech, Seoul, Korea)를 이용하여 마우스의 등에 1주일에 5회, 8주간 조사(照射)하였다. 10개의 도시바(東芝)제 SE램프로 이루어진 열(列)을, UVB용의 필터 처리를 하지 않고 이용하였다(방사 피크는 312nm 부근이며, 290～320nm의 조사가 UVB 전량의 55%에 상당함). 램프로부터 동물의 등까지의 거리는 89cm로 하였다. 노출 중에, 동물은 케이지 내부를 자유롭게 움직일 수 있었다. 조사선량은, 최초 2주간은 1MED(최소 홍반량 ; 60mJ/㎠), 3주째는 2MED(120mJ/㎠), 4주째는 3MED(180mJ/㎠), 5～8주째는 4MED(240mJ/㎠)로 하였다. 전체 UVB선량은 약 115MED(6.9J/㎠)였다. 주름 유도 후 5주간, 마우스의 한정적인 영역에 SH-CM(100%)을 피하 주사하였다. 양성 대조로서 PBS현탁SHED(4×10⁵)을 직접 진피에 주사하고, 음성 대조로서 PBS만으로 진피를 처치했다.

(4) SH-CM의 조제

SHED(4×10⁵ 세포)를 DMEM/F12(Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY) 무혈청 배지 내에서 배양했다. 배양 72시간 후에 SHED의 배양상청액을 회수하고, 300×g으로 5분간 원심하여, 0.22mm의 시린지(syringe) 필터를 이용해 여과했다.

(5) 피부 레플리카(replica) 및 화상분석

주름 유도시 및 주사 1주일 후에, 실리콘계 인상재(印象材)인 플렉스 타임(Flex time 1 ; Heraeus Kulzer, New York, NY)을 이용하여 등의 피부표면의 네거티브형 레플리카를 얻었다. 같은 피부영역으로부터 주름의 레플리카를 얻기 위해 유성 마커 펜으로 피부에 마킹하였다. 피부에 SH-CM 및 SHED를 마지막으로 주사하고 나서 5주일 후에, 마킹한 영역으로부터 인상(印象)을 취하였다. 측정하기 용이하도록 모든 레플리카를 1cm 사방으로 자르고, 같은 인상재를 이용하여 각 레플리카의 뒤를 평탄한 면으로 가공했다. 208°의 각도로 빛을 대고, CCD카메라를 이용하여 레플리카로부터 화상을 도입하였다. 네거티브형 레플리카의 화상을, 주름분석장치인 스킨 비지오미터(skin visiometer) SV 600(Courage & Khazaka, Cologne, Germany)을 이용하여 관찰했다. 피부의 주름의 평가에 이용된 파라미터는 수, 깊이, 면적이다.

(6) 조직학

등의 피부(1cm×1cm)를 10% 포르말린 중성 완충 용액으로 고정하고, 폴리에스테르 왁스 속에 매립시켜, 6mm의 절편을 제작했다. 절편을 헤마톡실린과 에오신(H&E)에 노출하여 마슨 3색 염색(Masson's trichrome staining)을 수행하였다.

(7) HDF 배양 및 UVB 조사선량

10%의 소태아혈청, 100U/ml의 페니실린 및 100mg/ml의 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 내에서, 5% CO₂ 하, 37℃에서 HDF를 배양했다. 무혈청 배지에서 24시간 기아시킨 후, 세포를 PBS로 세척하고, 3～4방울의 PBS와 함께 UVB에 노출시켰다. UVB조사는, UV광원(Waldmann, Schwenningen, Germany)을 이용하여 수행하였다. 조사 후 바로 PBS를 흡인하여 완전 배지로 치환하였다. UVB 조사선량은, 50～250mJ/㎠의 범위에서 시험하였고, 최종적으로 이후의 실험용으로 70mJ/㎠로 고정했다.

(8) 세포 증식 검정

HDF를 96웰 플레이트 내에 5×10³ 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, CCK-8키트 (Dojindo, Gaithersburg, MD)를 이용하여 HDF의 증식을 측정했다. 무혈청 배지에서 24시간 기아시킨 후, SH-CM과 함께 또는 SH-CM없이 세포를 24시간 연속 배양하고, UVB(70mJ/㎠)에 90초간 노출시켰다. 그 다음에, UVB 조사 세포를 완전배지 내에서 24시간 배양하여 회수했다. HDF를 10mL의 CCK-8 용액에 넣고, 3시간 인큐베이션했다. 마이크로 플레이트 리더(TECAN, Grodig, Austria)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정했다. 각 웰의 OD값을, 비교가능한 표준곡선에 근거하여 상대적 세포 수로 변환하였다.

(9) 웨스턴 블롯 분석

HDF(2×10⁴세포/웰)를 24웰 플레이트에 시딩하고, 상기한 바와 같이 전처리하였다. 그 다음에, 세포를 RIPA 완충액(50mM의 Tris-HCl, 0.15M의 NaCl, 1mM의 EDTA, 1%의 Triton X-100, 1%의 SDS, 50mM의 NaF, 1mM의 Na₃VO₄, 5mM의 디티오트레이톨, 1mg/ml의 류펩틴(leupeptin), 및 20mg/ml의 PMSF, pH 7.4) 내에서 용해시켰다. 단백질 50마이크로그램을 8% SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 전기영동에 의해 분리했다. 단백질을 PVDF막으로 이동시켰다. 이 막을, Ｉ형 콜라겐에 대한 항체(Santa Cruz, Saint Louis, MO), 매트릭스 메탈로 프로테나아제(matrix metalloproteinase)1(MMP-1)에 대한 항체(Calbiochem, Darmstadt, Germany)와 함께 인큐베이션했다. 이어서, 막을 세척하고, 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션된 항염소 IgG항체(1 : 10,000, Santa Cruz, Saint Louis, MO)와 함께 인큐베이션했다. 블롯을 면역 글로불린 웨스턴 시약과 반응시켜, X선 필름에 노출시켰다.

<결과>

(1) SHED, DPSC 및 BMSC의 특징 분석

SHED 및 DPSC은 BMSC과 같은 섬유아세포의 형태를 나타냈다(도 2A～C). 면역형광의 분석으로부터, SHED, DPSC 및 BMSC이 STRO-1양성세포를 포함하는 것으로 나타났다(도 2D～F). SHED의 증식 속도는 DPSC 및 BMSC보다 유의적으로 빨랐다(도 2G).

(2) UV에 의해 유도된 주름의 SH-CM에 의한 경감

UV 노출 기간동안 마우스의 피부의 잔주름을 관찰했다. 그러나, 처치중에, SH-CM 처치그룹 및 SHED 주사그룹은 PBS 그룹보다 주름이 적은 것 같았다(각 그룹에 대해 n=8). 레플리카(replica)의 분석에 있어서, 도 3 및 도 4는, UVB조사에 의해 유도된 잔주름이 SH-CM의 반복 처치에 의해 경감되었음을 나타낸다. SHED주사그룹도 SH-CH그룹과 같은 경향을 나타내었다. 본 발명자들이 스킨 비지오미터 SV 600로 레플리카(replica)의 주름의 파라미터를 측정한 바, 천연 수준(100%)의 SH-CM을 주사했을 때 주름의 전체 파라미터가 유의적으로 저하되었다. 그러나, SHED 처치된 피부는 SH-CM 그룹보다 높은 유효성을 나타냈다.

(3) 조직학적 관찰

UVB조사 헤어리스 마우스는 피부 부속기에 있어 커다란 변화를 나타내었으며, UVB조사 헤어리스 마우스에 있어서의 진피의 두께에 대한 SH-CM의 영향을 조사했다. 도 5는, H&E 염색에 의한 헤어리스 마우스의 피부의 진피 두께의 조직학적 측정을 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 섬유가 염색되어 있으며, SH-CM 처리그룹(A)과 SHED 주입그룹(B)에 있어서 현저히 높았다. 진피두께의 측정으로부터, SHED 주사그룹 및 SH-CM 처치그룹에 있어서 유의적인 증가가 나타났다(도 6). 더욱이, 교원섬유다발의 현저한 증가가 양쪽 그룹에서 관찰되었으나, 이는 대조그룹에서는 관찰되지 않았다(도 5).

(4) SH-CM에 의한 HDF의 증식 촉진

SHED에 의한 피부 주름의 개선에 관해 파라크린 메카니즘(paracrine mechanism)을 조사하기 위하여, SH-CM과 함께 1차 배양한 HDF로 세포 증식 검정을 수행하였다. UVB조사는 HDF의 증식을 유의적으로 저하시켰지만, SH-CM에 의한 전처리는 HDF에 대하여 보호 효과를 나타내었다(도 7). SH-CM은 다양한 성장인자를 포함하며, 성장인자의 고유한 특성이 정지 세포의 유사 분열을 개시시키는 능력일 경우, 본 실험에서의 SH-CM에 의한 증식 촉진은 SHED로부터 분비된 성장인자가 매개하는 것일 수 있다.

(5) Ｉ형 콜라겐 및 MMP1의 발현

SH-CM 처치한 헤어리스 마우스에 있어서 진피 중의 콜라겐 함유량이 유의적으로 증가된 것으로부터, SH-CM처리 후의 HDF중에 있어서의 I형 콜라겐 및 MMP1의 단백질 발현을 조사했다(도 8). UVB 조사는 명백히 I형 콜라겐의 발현을 저하시키고, MMP1의 발현을 유도하였다. 그러나, I형 콜라겐의 발현은 SH-CM 전처리 후에 유의적으로 증가하였고, 한편, MMP1의 발현은 SH-CM 전처리 후에 저하되어 있었다. 이들 결과는, SH-CM 처치한 헤어리스 마우스의 진피 중의 콜라겐 함유량 증가가 진피 섬유아세포 내에 있어서의 콜라겐 합성의 자극 및 콜라겐 분해의 억제에 의해 초래된 것임을 나타낸다.

고찰

SHED의 특징을, 조직 공학 및 재생 의료에서 표준적인 줄기세포원으로 간주되고 있는 DPSC 및 BMSC와 비교했다. 그 결과, SHED는 높은 증식능을 가지며, 세포외 매트릭스에 의해 강화되는 것으로 나타났다. 이는, 줄기세포에 근거한 치료에 있어서, SHED는 유용한 공급원임을 시사하고 있다. STRO-1 양성세포가 SHED, DPSC 및 BMMSC 내에서 확인되었다. STRO-1은, 높은 성장·분화능을 갖는 우세한 비율의 뼈 줄기세포를 포함하는 골수세포의 아집단 및 콜로니 형성 단위의 섬유 아세포집단 상에 존재하는 트립신 내성 세포표면항원을 인식하는 것이 알려져 있다. 높은 증식능은 생후 체성 줄기세포의 가장 중요한 특징 중 하나이다. BrdU를 이용한 증식 연구에 의해, SHED, DPSC 및 BMSC 중에서 SHED가 가장 높은 집단비율을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이전에 SHED는, 이러한 경로에 관련된 FGF, TGF-b, CTGF, NGF, BMP 등의 복수의 성장인자를 높은 수준으로 발현하는 것이 마이크로 어레이 분석에 의해 보고된 바 있다(S. Nakamura, Y.Yamada et al. Stem Cell Proliferation Pathways Comparison between Human Exfoliated Deciduous Teeth and Dental Pulp Stem Cells by Gene Expression Profile from Promising Dental Pulp, JOE, Vol.35,(11),1536-1542,2009）. FGF2는, 조직 재생 및 창상의 치유중에 많은 종류의 세포의 증식을 촉진하며, 세포외 매트릭스의 생성을 제어하는 작용을 하는 사이토카인으로서 보고된 바 있다.

VEGF, KGF, FGF 등의 파라크린 인자는 피부재생에 이용될 수 있으며, 이는, 줄기세포 이식도 「세포에 근거하는」 사이토카인 요법임을 시사하고 있다. 중요한 점은, HDF에 대한 UVB의 네거티브적 영향을 회피하기 위하여, 성장인자를 포함한 배양상청액이 이용될 수 있다는 점이다. 줄기세포요법의 효과 중 적어도 일부를 매개하는 파라크린 효과라는 개념은, 이전의 데이터와 모순되지 않는다. 세포에 근거하는 사이토카인 요법은 창상의 치유에 있어 이점을 가져온다. SHED유래 성장인자에 의한 각질세포 분화는, 창상 폐쇄에 있어서의 재상피화에 기여할 수 있다. 더욱이, SHED유래 성장인자는, 창상의 치유, 조직 재구축 및 피부이식편의 형성에 있어 이점을 가져온다.

광 노화는, 피부 창상과의 병리학적 유사점을 갖는 복잡한 프로세스이다. MSC는 이러한 프로세스 내에서 중요한 역할을 하며, 각질세포, 지방세포 및 비만 세포와 상호작용한다. 또한, MSC는, 진피유두층의 섬유상의 I형 및 Ⅲ형 콜라겐이 유의적으로 감소되어 있는 세포외 매트릭스 단백질원이기도 하며, 그 감소가 광노화의 임상적 중증도와 깊게 관련되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 감소는, MMP의 작용을 통한 프로콜라겐 생합성의 저하 및 효소적 분해의 증가의 조합에 의한 것이다. Fisher 등은, 생체내 UV조사가 인간 피부 속의 MMP합성을 유도함을 나타내었다[Phipps RP, Borrello MA, Blieden TM. Fibroblast heterogeneity in the periodontium and other tissues, J Periodontal Res.1997 Jan;32(1 Pt 2):159-165；Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J, Kang S, et al. Molecular basis of sun - induced premature skin ageing and retinoid antagonism. Nature 1996;379:335-339]. MMP 패밀리 내에서, MMP1, MMP13, 및 막형 MMP14는 콜라겐 분해 작용을 나타내고, MMP2 및 MMP9은 진정한 엘라스타제인 것으로 보고되어 있다. MMP가 매개하는 콜라겐 및 엘라스틴의 파괴에 의해, 광 노화된 피부에서 발생하는 결합 조직 손상의 대부분이 설명된다(Tsukahara K, Nakagawa H, Moriwaki S, Takema Y, Fujimura T, Imokawa G. Inhibition of ultraviolet-B-induced wrinkle formation by an elastase - inhibiting herbal extract : implication for the mechanism underlying elastase - associated wrinkles. Int J Dermatol 2006;45:460-468).

본 연구에서, SH-CM이 HDF 내에서 UVB에 의해 유도되는 Ｉ형 콜라겐의 감소를 억제할 뿐만 아니라, UVB에 의해 유도되는 MMP1의 발현도 저하시키는 것으로 발견되었다. 창상의 치유 및 광손상으로부터의 피부의 재생은, 복잡하지만 질서있는 프로세스이며, 사이토카인 및 성장인자에 의해 조직화되어 있다. 이에, 이들 데이터를 본 연구에 조합시키면, 국소적 사이토카인 방출이, SH-CM 전달 후에 보이는 유익한 SHED 재생효과를 매개하는 중요한 인자일 수 있음이 시사된다. SHED의 국소적 전달은, 순환하고 있는 줄기전구세포를 상해영역으로 복귀시키는 것에 의해서도 치유에 기여할 수 있다.

결론적으로, 진피 창상의 치유에 대한 SHED의 응용이 추측의 영역에 머물러 있던 상태에서, SHED 유래 성장인자와 HDF 사이의 상호작용이 처음으로 검토되었다. SHED는, 콜라겐 합성의 증가, HDF의 증식 및 이동의 활성화에 의해 HDF에 영향을 준다. 이러한 점에서, SHED 또는 SH-CM이 광 노화 및 창상의 치유를 위한 처치에 이용될 수 있을 것으로 시사된다. 본 결과는, SHED가 MSC보다 성질적으로 진피 창상의 치유에 보다 적합하다는 것도 시사하고 있다. 주로 분비형 성장인자 또는 ECM 단백질과 함께, SHED는 HDF의 창상 치유 가능성의 증가에 기여한다.

(실시예 2)

(1) 성장인자 혼합물(분말)의 조제

무한증식 인간 간엽계 줄기세포(MSC ; Ronza Co., Ltd, USA)를 성장인자(GF) 혼합물의 조제에 이용했다. 10% FSC 함유 DMEM을 이용하여 세포를 2～8계대 배양하고, 배양접시 내의 세포 컨플루언스(confluence)가 80%인 단계에서 상청(배양 배지 : CM)을 샘플링하여 에탄올에 첨가했다(CM : 에탄올 = 1 : 9). 상기 CM을, -20℃에서 60분간 인큐베이션한 후, 스핀(4℃, 1500rpm, 15분간)하여 농축했다. 남은 CM을 90% 에탄올 내의 -20℃에서 세척한 후, 다시 스핀하였다.

이 농축된 CM을 동결 건조함으로써, 성장인자 분말을 얻었다.

(2) 분말 속의 성장인자

분말 속의 각 성장인자를 웨스턴 블로팅법으로 분석하였다. 검출된 성장인자는 이하와 같다 : PDGF, VEGF, IGF, KGF, HGF 및 TGF.

(실시예 3)

<성장인자에 의한 뼈재생의 실험 연구>

(1) 방법

개의 아래턱뼈 속에, 직경 10mm, 깊이 10mm의 4개의 원통형의 결손을 형성했다.

각 결손의 중심에 티탄 임플란트(직경 3.75mm)를 삽입했다.

임플란트 주변의 공간에 이하와 같은 이식 재료를 채워 넣었다 : (1)PRP, (2) 100% GF, (3) MSC(1×1,000,000) 및 (4) 빈 결손(empty defect)(대조) (도 10).

(2) 결과

8주 후 개를 안락사시켜 임플란트가 부착된 아래턱뼈를 해부했다. 조직학적 표본을 제작하고, 광학현미경 및 화상분석장치를 이용하여 BIC(뼈-임플란트 접촉부(Bone-Implant Contact))를 계산했다(도 11).

＊ BIC = 임플란트 표면과 접촉하는 뼈부분의 전체 길이 / 임플란트 표면의 전체 길이 × 100 (%)

MSC(65.0)과 GF(58.6) 사이의 BIC에 있어서 유의적인 차이는 없었고, 각 BIC값은 대조(26.4) 및 PRP(44.2)보다 훨씬 높았다(도 12 및 13).

(3) 결론

결론적으로, 간엽계 줄기세포에서 유래하는 성장인자는, 뼈 재생에 관하여 살아있는 줄기세포와 같은 능력을 갖는다.

임상예 : 56y, 남성

위턱뼈의 큰 어금니(대구치) 영역에 2개의 임플란트를 설치하여 상악동 거상술(sinus lift procedure)을 실시하였다. 100% 세포 베이스의 GF와 b-TCP(β-트리칼슘 포스페이트) 과립을 부비강에 이식했다. 8주 후, 이식 부분은 새로운 뼈로 채워져 있었으며, X선 관찰에 의해, 임플란트와 뼈 사이의 골결합이 확인되었다(도 14 및 15).

(실시예 4)

<성장인자에 의한 치주조직 재생의 실험 연구>

(1) 방법

개의 아랫턱뼈의 어금니 중 원위 부분에 2벽성의 치주결손을 제작했다(도 16). 각 개의 결손을 이하의 방법 또는 순서로 처치했다(도 17 및 18).

1) 잇몸박리소파수술(FO, 대조)

2) GTR법

3) MSC(1×100,000)

4) GF(100%)

(2) 결과

수술로부터 8주 후, 어금니 및 잇몸이 붙어 있는 개의 아랫턱뼈를 해부하여, 그 조직학적 표본을 작성했다. 조직학적 관찰에 의해, 광학현미경을 이용하여 포켓의 깊이(N₁-JE : 상피의 하방 성장의 길이) 및 새롭게 형성된 시멘트질의 길이(N₂-NC)를 평가했다(도 19). 이들 파라미터는, 치주병의 개선 평가에 유용했다. 새로운 시멘트질의 길이는, GTR 및 대조보다 GF 및 MSC에서 훨씬 길었다. 더욱이, GF그룹 및 MSC그룹은, GTR그룹 및 대조그룹에 비해 포켓의 깊이가 현저히 개선되어 있었다(도 20～22).

(3) 결론

MSC유래 성장인자는, 치주조직의 재생에 관하여 MSC 자체와 같은 능력을 갖는다.

증례 보고 : 64y - 여성

우측 아래 송곳니의 내측 부분에 깊이 7mm의 깊은 치주결손이 보였다. 100% GF와 아테로콜라겐(aterocollagen) 스폰지를 결손부에 채웠다(도 23, 24). 16주 후 새롭게 형성된 치주조직에 의해 결손은 임상적으로 수복된 것 같았다(도 25).

상기한 바와 같이 사이토카인요법은, 안전성, 안정성, 조작의 용이성, 보존 용이성, 수송 용이성 및 저비용이라는 점에서 줄기세포요법을 능가하는 이점을 갖는다.

(실시예 5)

뇌경색에 대한 치료 효과의 확인

뇌허혈 모델

모든 동물실험에 대하여 동물실험 위원회(나고야 대학 의학부)의 승인을 받았다. 300～400g의 다 자란 수컷 스프래그 다우리 래트(Sprague Dawley rat)(일본, 시즈오카의 닛폰 SLC 가부시키가이샤)를 이용하였다. 동물을 맨 먼저 5% 이소플루란(isoflurane) (Abbott Laboratories, North Chicago)으로 마취하고, 1.5% 이소플루란을 포함하는 70% N₂O와 30% O₂의 혼합물을 이용하여 마취 하에 유지시켰다. 가열 패드 상에서 직장온도를 37℃±0.5℃로 유지했다. 영구 국소 뇌허혈에 의해, 국소 뇌허혈을 유발했다(pMCHO)(0일째)(도 26). 화염 가열에 의해 선단을 둥글게 한 4-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사(Shirakawa, Tokyo, Japan) 및 실리콘(KE-200, Shin-Etsu Chemical, Tokyo, Japan)을, MCA의 기원이 막힐 때까지 외경동맥으로부터 내경동맥 속으로 진행시켰다. 폐색(閉塞) 후, 레이저-도플러 혈류계(Omega FLO-N1 : Omega Wave Inc, Tokyo, Japan)를 이용하여 MCA영역의 국소 뇌혈류를 측정했다. 반응은, 국소 뇌혈류의 감소가 70%를 넘는 경우에만 양성인 것으로 간주하고 포함시켰다.

SH-CM의 비강내 투여

pMCAO의 72시간 후(3일째), 래트를 다시 5% 이소플루란(Abbott Laboratories, North Chicago)으로 마취하고, 1.5% 이소플루란을 포함하는 70% N₂O와 30% O₂의 혼합물을 이용하여 마취 하에 유지시켰다. 가열패드 상에서 직장온도를 37℃±0.5℃로 유지했다. 동물을 무작위로 3그룹으로 나누어, SHED유래 배양상청액(SH-CM)을 비강내 투여하거나(n=1, 16일째, 도살=1)(I그룹), 생리식염수의 인산완충액(PBS)을 비강내 투여하거나(n=1, 16일째, 도살=1) (Ⅱ그룹), pMCAO조작만 수행하였다(n=5, 16일째, 도살=5)(Ⅲ그룹). SH-CM은 실시예 1과 마찬가지로 조제하여 본 실험에 이용하였다. 래트를 위를 향하게 하여 4cm×4cm의 감은 거즈로 머리를 받치고, 해밀턴 마이크로 시린지를 이용하여 후각경로로 래트 1마리당 합계 100㎕를 한 번에 10㎕씩, 콧구멍을 교대로 바꾸면서 2분의 투여 간격으로 투여했다. 이러한 수순 중 입 및 반대측의 비강은 닫아두었다. 비강내 투여를 3일째～15일째까지 매일 수행하였다.

운동 장해의 평가

표준화된 운동 장해 척도에 경미한 변경을 추가하여 이용하여 1, 3, 6, 9, 12 및 15일째에 래트를 블라인드 테스트하였다. 이하의 파라미터의 각각에 대하여 래트에 1포인트를 부가했다 : 꼬리를 잡고 순간적으로 늘어뜨렸을 때 일격에 대한 반대측 앞다리의 굴곡, 테이블로부터 잡아당겼을 때의 반대측 뒷다리의 신장, 및 저항에 대한 마비측으로의 회전. 또한, 걸으려고 했을 때의 마비측으로의 선회운동에 대하여 1포인트를 부가하였고, 직경 50cm의 원으로부터 10초 이내에 걸어 나올 수 없었을 경우에는 1포인트를 부가하였으며, 원을 20초 이내에 나올 수 없었을 경우에는 2포인트를 부가하였고, 원을 60초 이내에 나올 수 없었을 경우에는 3포인트를 부가했다. 더욱이, 테이블에 위에서 눌렀을 때, 횡방향으로 (laterally) 눌렀을 때, 그리고 옆으로 (sideways) 눌렀을 때에, 래트가 마비된 앞다리를 펼 수 없었을 경우, 각각 1포인트를 부가했다. 운동 장해 척도는, 각 동물시점에 대해 3회 평가하였다.

경색 체적의 평가

16일째의 샘플로부터 얻어진 동결 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. Image J(ML, 미국 국립위생연구소)를 이용하여 두께 20mm, 1.00mm 간격의 12개의 관상(冠狀) 절편에 있어서의 각 경색 면적을 구했다. 이들 12개의 관상 절편은 전체 경색 영역을 망라하고 있었다. 경색 면적을 합계하여, 이들 면적에 절편간 거리(1.00mm)를 곱함으로써, 국소 경색 체적을 계산하고, 그 후, 뇌수종의 치료를 수행하였다.

결과

운동 기능의 평가

빠른 단계에서는 모든 그룹(I그룹, Ⅱ그룹 및 Ⅲ그룹)이 운동 기능에 대하여 높은 스코어를 나타내었다(스코어는, 1일째가 8 ; 9 ; 8.2±0.45, 3일째가 8 ; 9 ; 8.6±0.89). 6일째에, 6일 후의 I그룹에 있어서의 운동 장해의 점진적 향상이 Ⅱ그룹 및 Ⅲ그룹에 비해 현저해졌으며(6 ; 9 ; 8.2±0.84), 9일째에는 Ⅱ그룹 및 Ⅲ그룹에 비해 보다 현저해졌다(5 ; 8 ; 8.8±1.0)(도 27). I그룹에서는 12일째(4) 및 15일째(3)에 있어서 지속적 개선이 기록되었으며, Ⅱ그룹 및 Ⅲ그룹에서는 15일째에 있어서 운동장해의 지속적 손상(8을 초과하는 스코어)이 관찰되었다(9 ; 8.25±0.96).

경색 체적의 감소

경색 체적은 16일째에 Ⅱ그룹 및 Ⅲ그룹(16일째, 192.7㎣, n=1 ; 16일째, 222.7㎣, n=1)에 비해 I그룹(16일째, 54.3㎣, n=1)에서 유의적으로 감소되어 있었다(도 28). 이러한 결과는, SH-CM의 비강내 투여가 재생을 촉진하였음을 시사하고 있다.

이와 같이, 사이토카인 요법에 대하여 뇌경색 영역에 대한 양호한 회복 효과가 확인되어, 뇌경색의 치료에 유용함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 다른 복수의 래트에 있어서도 확인되었다.

또한, 사이토카인 요법에서는, 비강내 투여를 선택함으로써 침습성이 낮고, 혈관뇌관문을 통과하여 허혈부위에 직접 효과를 발휘함을 알 수 있었다. 더욱이, 유치 줄기세포의 배양상청액에는 각종 영양인자가 포함되어 있는 것으로 생각되기 때문에, 영양인자의 단독투여보다 신속한 회복이 기대된다.

(실시예 6)

1. 치수 줄기세포의 배양상청액의 조제

이하의 순서에 따라 치수 줄기세포(SHED 및 DPSC)의 배양상청액을 조제하여(도 29 참조), 신경 재생 효과의 검증 실험에 이용하였다.

(i) 치수 줄기세포를 혈청(10% FBS) 함유 배지에서, 배양 접시가 70～80% 컨플루언스가 될 때까지 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양한다.

(ii) 70～80% 컨플루언스가 되면 PBS로 배양 접시를 2회 세척하고, 무혈청(0%FBS) 배지로 배지를 교환한다.

(iii) 48시간, 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양한다.

(iv) 48시간 경과한 무혈청 배지를 원심관에 회수한다.

(v) 회수한 무혈청 배지를 1500회전으로 4～5분 원심분리하여, 사세포 등의 불순물을 침전시킨다.

(vi) 원심분리한 원심관으로부터 불순물을 흡인하지 않도록, 상청액을 새로운 원심관에 회수한다.

(vii) 회수한 상청액을 4℃, 15000회전으로 1분간 원심분리하여, 다시 불순물을 침전시킨다.

(viii) 원심분리한 원심관으로부터 불순물을 흡인하지 않도록 상청액을 다시 새로운 원심관에 회수한다.

(ix) 얻어진 상청액을 치수 줄기세포 배양상청액으로 한다.

2. 시험관내 분석에 이용하는 신경계 세포

신경계 세포로서 PC12 세포를 사용했다. 해당 세포는, 무한증식 래트 부신 갈색 세포종 세포이다. 신경영양인자 중 하나인 NGF(신경 성장 인자)를 첨가함으로써 신경축색 유사돌기를 신장하고, 신경세포 유사세포(neuron-like cells)로 분화하는 것으로 알려져 있어, 여러 시험관내 실험에 있어서의 신경계 실험의 모델 세포로서 이용되고 있다.

3. 치수 줄기세포의 배양상청액의 신경돌기 신장효과 및 아폽토시스 억제 효과(신경재생 저해물질을 이용한 신경돌기 신장실험, 아폽토시스 유도실험)

치수 줄기세포의 배양상청액의 신경돌기 신장효과 및 아폽토시스 억제효과를, 신경재생 저해물질(신경돌기 신장 저해인자)의 존재 하 및 비존재 하에서 조사했다. 신경재생 저해물질로서 CSPG 및 MAG을 이용하였다. 실험 조작 순서는 이하와 같다.

(1) 신경돌기 신장실험

(i) 세포배양용 웰(폴리-L-리신 코팅)에 신경재생 저해물질(CSPG 또는 MAG)을 24시간, 37℃의 조건으로 코팅한다.

(ii) PC12 세포를 신경재생 저해물질 코팅 플레이트에 시딩하고, 치수 줄기세포의 배양상청액으로 24시간 배양한다. 비교 대조그룹으로서는, 무혈청 배지, 섬유아세포의 배양상청액, 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액을 이용한다.

(iii) PC12 세포의 신경돌기 신장을 위상차 현미경 사진으로 평가한다.

(2) 아폽토시스 유도실험

P12 세포를 신경재생 저해물질 코팅 플레이트에 시딩하고, 치수 줄기세포의 배양상청액으로 24시간 배양한다. 세포의 아폽토시스를 TUNEL법으로 평가한다. 비교 대조그룹으로서는, 무혈청 배지, 섬유아세포의 배양상청액, 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액을 이용한다.

신경재생 저해물질(CSPG, MAG) 코팅 플레이트에 있어서, 치수 줄기세포의 배양상청액은 다른 대조그룹에 비해, 강한 신경돌기 신장효과(도 30～33) 및 아폽토시스 억제효과(도 34, 35)를 나타내었다. 또한, 치수 줄기세포의 배양상청액은, PC12세포의 신경세포 유사세포 분화에 필수가 되는 NGF를 첨가하지 않아도(즉, 치수 줄기세포의 배양상청액 단독으로) 강한 신경돌기 신장효과를 나타내었다.

즉, 도 30에 나타낸 바와 같이, 신경재생 저해물질 CSPG로 코팅한 접시 위에서도, PC12 신경유사세포를 치수 줄기세포의 배양상청액으로 배양(24시간)하면, 신경돌기가 신장한다(치수 줄기세포의 배양상청액이 돌기신장작용을 나타냄. 도 30 참조). 골수간엽계 줄기세포나 피부유래 섬유아세포의 배양상청액, 혹은 ROCK의 활성화를 저해하는 Y27632를 단독으로 첨가하여도 이러한 신장작용은 확인되지 않는다.

또한, 도 31에 나타낸 바와 같이, 신경재생 저해물질 CSPG이 존재하는 조건이어도, 치수 줄기세포의 배양상청액은, 신경돌기의 신장을 나타내는 세포의 비율을 높이며, 보다 긴 돌기의 형성을 촉진한다.

한편, 도 32에 나타낸 바와 같이, 신경재생 저해물질 MAG로 코팅한 접시상에서도, PC12 신경유사세포를 치수 줄기세포의 배양상청액으로 배양(24시간)하면, 신경돌기가 신장한다(치수 줄기세포의 배양상청액이 돌기 신장작용을 나타냄). 골수간엽계 줄기세포나 피부유래 섬유아세포의 배양상청액, 혹은 ROCK의 활성화를 저해하는 Y27632을 단독으로 첨가하여도 이러한 신장작용은 확인되지 않는다.

도 33에 나타낸 바와 같이, 신경재생 저해물질 MAG이 존재하는 조건이어도, 치수 줄기세포의 배양상청액은, 신경돌기의 신장을 나타내는 세포의 비율을 높이며, 보다 긴 돌기의 형성을 촉진한다.

도 34 및 도 35에 나타낸 바와 같이, 신경재생 저해물질 MAG이나 CSPG로 코팅한 접시 상에서 PC12 신경유사세포를 24시간 배양하면, 거의 모든 세포가 아폽토시스를 일으킨다. 치수 줄기세포의 배양상청액은, 이러한 아폽토시스를 거의 완전히 억제한다.

한편, 도 30에 있어서의 각 기호는 다음의 것을 나타낸다. PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL+NGF : 폴리-L-리신 코팅 및 NGF(신경 성장 인자) 첨가, PLL/CSPG : 폴리-L-리신 코팅 및 CSPG코팅, PLL/CSPG Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 Y27632첨가, PLL/CSPG SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG 코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양.

도 31의 각 기호는 다음의 것을 의미한다. PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL+NGF : 폴리-L-리신 코팅 및 NGF(신경 성장 인자)첨가, PLL/CSPG : 폴리-L-리신 코팅 및 CSPG코팅, PLL/CSPG+NGF : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 NGF첨가, PLL/CSPG+SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+NGF+SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅, NGF첨가 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+NGF+DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅, NGF첨가 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+NGF+BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅, NGF첨가 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+NGF+Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅, NGF첨가 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 Y27632첨가, PLL/CSPG+NGF+Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅, NGF첨가 및 Y27632첨가.

도 32에 있어서 각 기호는 다음의 것을 나타낸다. PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL+NGF : 폴리-L-리신 코팅 및 NGF(신경 성장 인자)첨가, PLL/MAG : 폴리-L-리신 코팅 및 MAG코팅, PLL/MAG Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 Y27632첨가, PLL/MAG SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG 코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양.

도 33에 있어서 각 기호는 다음의 것을 나타낸다. PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL+NGF : 폴리-L-리신 코팅 및 NGF(신경 성장 인자)첨가, PLL/MAG : 폴리-L-리신 코팅 및 MAG코팅, PLL/MAG+NGF : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 NGF첨가, PLL/MAG+SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+NGF+SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅, NGF첨가 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+NGF+DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅, NGF첨가 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양,PLL/MAG+NGF+BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅, NGF첨가 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+Fibro-CM:폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+NGF+Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅, NGF첨가 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG+Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 Y27632첨가, PLL/MAG+NGF+Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅, NGF첨가 및 Y27632첨가.

도 34에 있어서의 각 기호는 다음의 것을 나타낸다. PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL/CSPG : 폴리-L-리신 코팅 및 CSPG코팅, PLL/CSPG SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 Y27632첨가, PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL/MAG : 폴리-L-리신 코팅 및 MAG코팅, PLL/MAG SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 Y27632첨가.

도 35에 있어서의 각 기호는 다음의 것을 나타낸다. PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL/CSPG : 폴리-L-리신 코팅 및 CSPG코팅, PLL/CSPG SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/CSPG+Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, CSPG코팅 및 Y27632첨가, PLL : 폴리-L-리신 코팅, PLL/MAG : 폴리-L-리신 코팅 및 MAG코팅, PLL/MAG SHED-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 SHED의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG DPSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 DPSC의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG BMSC-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 골수간엽계 줄기세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG Fibro-CM : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 섬유아세포의 배양상청액에 의한 배양, PLL/MAG Y27632 : 폴리-L-리신 코팅, MAG코팅 및 Y27632첨가.

이상과 같이, 치수 줄기세포의 배양상청액이 신경재생 저해물질의 작용을 억제하고, 신경돌기의 신장을 촉진하여 아폽토시스를 억제한다는, 놀라운 사실이 밝혀졌다. 바꿔 말하면 중추 신경계의 재생 내지 중추신경계질환의 치료에 대하여, 치수 줄기세포의 배양상청액이 매우 유효한 것으로 판명되었다.

4. 척수 손상 모델 동물을 이용한 검증

(1) 배양상청액 투여에 의한 하지운동기능의 개선

8주령 암컷SD래트를 펜토바르비탈 소듐에 의한 전신마취 하에 제 10 흉추를 절제하고, 경막 외부로부터 IH임팩터를 이용하여 200kDyn의 힘으로 압좌 손상을 가하여, 척수 압좌손상 모델로 하였다. 압좌 손상을 가한 직후부터, 치수 줄기세포 배양상청액(SHED-CM), 골수 간엽계 줄기세포 배양상청액(BMSC-CM) 혹은 PBS(대조군)를 주입한 완전 매립식(implantable) 마이크로 인퓨전 펌프에 연결한 실리콘 튜브를 제12흉추 아래의 거미막 밑 공간으로부터 삽입하여, 손상부 바로 위에서 유출되도록 설치했다. 24㎕/일(日)의 유속으로, 도살까지의 8주간 지속적으로 투여하여, 1주마다 하지운동기능을 평가하였다. 평가에는 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) 스코어(Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma.,1995:12:1-21.)를 이용하였다.

<BBB스코어>

0. 고관절·무릎 관절·족관절을 전혀 움직이지 못한다.

1. 1～2 관절을 약간 움직인다.

2. 1관절만 펼 수 있다.

3. 2관절만 펼 수 있다.

4. 3관절 모두 조금 움직이게 한다.

5. 2관절을 조금 움직이고, 1관절은 펼 수 있다.

6. 1관절을 조금 움직이고, 2관절은 펼 수 있다.

7. 3관절 모두 펼 수 있다.

8. 체중까지는 지지할 수 없지만, 족저부를 땅에 대고 길 수 있다.

9. 때로 하지로 체중을 지지하고, 기거나 걷거나 한다.

10. 때때로 (5～50%）체중을 지지하여 걸을 수 있지만, 상하지의 협조성은 없다.

11. 자주 (50～100%）체중을 지지하여 걸을 수 있지만, 상하지의 협조성은 없다.

12. 때때로 (5～50%）체중을 지지하여 걷고, 때때로 (5～50%）상하지의 협조성이 확인된다.

13. 자주 (50～100%）체중을 지지하여 걷고, 자주 (50～100%）상하지의 협조성이 확인된다.

14. 자주 족저부로 체중을 지지하며, 상하지의 협조성이 확인된다 / 항상 족저부로 체중을 지지하지만, 양발의 방향은 외회전(external rotation)하고 있다(근력이 약하기 때문).

15. 상하지의 협조성이 확인되며, 때때로 (5～50%）발뒤꿈치를 들고 걷는다. 단 발목은 외회전하고 있다.

16. 상하지의 협조성이 확인되며, 자주 (50～100%）발뒤꿈치를 들고 걷는다. 때로 발의 위치는 중간 위치이다.

17. 상하지의 협조성이 확인되며, 자주 (50～100%）발뒤꿈치를 들고 걷는다. 발의 위치는 중간 위치이다.

18. 상하지의 협조성이 확인되며, 발뒤꿈치를 들고 걷는다. 발의 위치는 중간 위치이다.

19. 상하지의 협조성이 확인되며, 발뒤꿈치를 들고 걷는다. 발의 위치는 중간 위치이다. 꼬리는 내리고 있다.

20. 상하지의 협조성이 확인되며, 발뒤꿈치를 들고 걷는다. 발의 위치는 중간 위치이다. 꼬리를 올리고 있다.

21. 상하지의 협조성이 확인되며, 발뒤꿈치를 들고 걷는다. 발의 위치는 중간 위치이다. 꼬리를 올리고, 체중을 지지할 수 있다.

하지운동기능의 개선효과를 BBB스코어로 비교하였다. 그 평가 결과를 도 36에 나타낸다. 치수 줄기세포 배양상청액을 투여한 그룹(SHED-CM)은, 스코어 15(상하지의 협조성이 확인되며, 때때로 (5～50%）발뒤꿈치를 들고 걷는다. 단 발목은 외회전하고 있다)라는, 하지운동기능의 경이적인 개선·회복을 나타내었다. 골수 간엽계 줄기세포 배양상청액(BMSC-CM)을 투여한 그룹도 어느 정도의 개선은 나타내었지만, 그 개선 효과는 SHED-CM 그룹에 훨씬 미치지 못한다.

(2) 8주 후의 척수 형태 변화

SHEM-CM(또는 BMSC-CM 내지는 PBS) 투여 개시로부터 8주째에 래트를 파라포름알데히드로 관류 고정하였다. 이어서, 손상부로부터 머리꼬리쪽 5mm에서 척수를 절단하여 꺼냈다. Sham 그룹, 대조군, BMSC-CM 그룹, SHED-CM 그룹에서 그 중량을 비교했다.

투여 개시로부터 8주째에 척수의 형태변화를 검토하였다. 꺼낸 척수의 상태를 도 37 상측에 나타낸다. 또한, 척수의 중량(질량)의 비교를 도 37 하측에 나타낸다. SHED-CM 처리그룹에서는 손상 부위(epicenter)보다 꼬리측 척수(caudal)의 위축이 억제되었다(도 37 상측). 즉, SHED-CM의 투여로 손상된 척수의 형태변화가 억제되었다. 이러한 결과에 부함하여, SHEM-CM 그룹에서는 척수의 중량도 증가하였다(도 37 하측).

(3) 8주 후의 척수신경축색

SHEM-CM(또는 PBS) 투여 개시로부터 8주째에 래트를 파라포름알데히드로 관류 고정하였다. 손상부로부터 머리꼬리쪽 5mm에서 척수를 절단하고 꺼냈다. 그 다음에, 척수를 O.C.T컴파운드로 동결 매립시켜, 척수 동결 절편 슬라이드를 제작했다. 척수 동결 절편 슬라이드를 세로토닌(5-HT)에 대한 항체와, 신경축색에 대한 항체 Neurofilament-M(NF-M)로 면역염색을 수행하였다.

투여개시로부터 8주째에 손상 부위 및 그 근방을 조직학적으로 검토했다. 면역염색의 결과를 도 38에 나타낸다. SHED-CM의 지속적인 미량 투여로, 손상 부위보다 꼬리측에서 총 신경섬유(NF-M)의 수가 유지되었다. 뇌줄기의 솔기핵(raphe nuclei)으로부터 척수로 튀어나온 세로토닌 섬유의 수도 유지되어 있었다. SHED-CM의 투여로 신경섬유의 소실이 억제되어, 상위·뇌줄기에서 생산된 신경전달물질인 세로토닌이 손상 부위보다 하위로 수송되는 것으로 밝혀졌다.

(4) 배양상청액에 의한 아폽토시스 억제실험

대조군, SHED-CM 그룹을 척수 압좌 손상 후 24시간 및 1주간 파라포름알데히드로 관류 고정했다. 손상부로부터 머리꼬리쪽 5mm에서 척수를 절단하여 꺼냈다. 꺼낸 척수를 O.C.T 컴파운드로 동결 매립시켜, 척수동결 절편 슬라이드를 제작했다. 척수 동결 절편 슬라이드를 단편화된 DNA에 특이적으로 반응하는 TUNEL, 아스트로사이트 특이적 항체 GFAP, 신경세포 특이적 항체 NeuN, 올리고덴드로사이트 특이적 항체 CNPase로 각각 ２중 면역염색을 수행하고, 신경세포, 글리아 세포(glia cells)의 세포사를 비교 검토하였다.

척수압좌손상 후 24시간 및 1주간의 시점에서 손상 부위 및 그 근방에 있어서의 신경세포사를 평가했다. 결과를 도 39에 나타낸다. SHED-CM의 지속적인 미량 투여는 신경손상 직후에 발생하는 아스트로사이트, 신경, 올리고덴드로사이트의 아폽토시스 세포사를 억제했다. 척수손상에서는 손상 후 1주 후에, 보다 확대된 영역에서 올리고덴드로사이트의 아폽토시스 죽음이 관찰된다(２차 손상의 확대). SHED-CM은 이러한 아폽토시스 죽음도 억제함으로써 신경손상의 확대를 억제하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 점으로부터, 본 발명에 관한 중추신경계질환치료용 조성물을 적용할 수 있는 질환으로서, 척수손상, 근위축성 측색경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상청 마비, 헌팅턴병, 다계통위축증 또는 척수소뇌변성증 등의 신경변성질환, 뇌허혈, 뇌경색 또는 뇌내출혈 등에 의한 신경세포의 변성·탈락, 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환이 상정된다.

따라서, 본 발명에 따르면, 줄기세포를 배양함으로써 얻어진 사이토카인의 혼합물을 포함하는 줄기세포 배양상청액을 이용하므로, 표적조직의 내인성 줄기세포를 분화시키고 또한 증식시킬 수 있다. 그 결과, 손상부에서의 세포의 증식과, 세포외 매트릭스의 생성 등에 의해, 표적조직의 수복 및 재생을 수행할 수 있다.

본 발명은, 상기한 발명의 실시형태 및 실시예의 설명으로 한정되는 것은 결코 아니다. 특허청구의 범위의 기재를 벗어나지 않으면서, 당업자가 용이하게 생각해낼 수 있는 범위에서의 각종 변형 양태도 본 발명에 포함된다.

2010년 3월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/317,713호, 2010년 11월 5일에 출원된 미국 가출원 제61/410,370호, 2010년 12월 1일에 출원된 일본 특허출원 제2010-267962호, 2011년 1월 31일에 출원된 미국 가출원 제61/437,697호 및, 2011년 2월 23일에 출원된 일본 특허출원 제2011-037028호의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원 및 기술규격은, 개개의 문헌, 특허출원 및 기술규격이 참조에 의해 도입되는 것이 구체적이면서도 개별적으로 기재된 경우와 같은 정도로, 본 명세서 내에 원용되어 도입된다.

Claims (23)

1. 줄기세포를 배양함으로써 얻어진 줄기세포 배양상청액(stem cell-conditioned medium)을 포함하는, 표적조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   줄기세포를 포함하지 않는 손상부 치료용 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   줄기세포의 배양상청액이 적어도 2개의 사이토카인을 포함하는 손상부 치료용 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   줄기세포의 배양상청액이 혈관내피 성장인자(VEGF), 간세포 성장인자(HGF), 인슐린유사성장인자(IGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 사이토카인을 포함하는 손상부 치료용 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
   줄기세포가 체성(somatic) 줄기세포인 손상부 치료용 조성물.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
   줄기세포가 간엽계(mesenchymal) 줄기세포에서 유래하는 손상부 치료용 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
   줄기세포가 치수(dental pulp) 줄기세포인 손상부 치료용 조성물.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
   어떠한 혈청도 포함하지 않는 손상부 치료용 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
   손상부 치료가 피부, 치주조직 내지는 뼈의 손상의 치료, 뇌경색(cerebral infarction)치료, 또는 중추신경계(CNS)질환 치료인 손상부 치료용 조성물.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    손상부 치료가 중추신경계질환의 치료이며, 상기 중추신경계질환이 척수손상(spinal cord injury), 신경변성질환(neurodegenerative disorder), 신경세포의 변성 또는 탈락(degeneration or loss of neuronal cell), 및 신경세포의 장해를 수반하는 망막질환(retinal disease)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 질환 내지 병태인 손상부 치료용 조성물.
11. 이하의 단계 (1)～(3)을 포함하는, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 손상부 치료용 조성물의 제조방법 :
    (1) 치수세포로부터 접착성 세포를 선별하는 단계 ;
    (2) 상기 접착성 세포를 배양하는 단계 ;
    (3) 배양상청액을 회수하는 단계.
12. 제 11항에 있어서,
    이하의 단계 (4)를 더욱 포함하는, 제조방법 :
    (4) 회수한 배양상청액에 대하여, 원심분리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염 및 보존으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 처리를 수행하는 단계.
13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    이하의 단계 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 더욱 포함하는, 제조방법 :
    (a) 회수한 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계 ; 및
    (b) 회수한 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스(apoptosis) 억제 작용의 유무를 확인하는 단계.
14. 표적조직의 손상부를 수복하기 위한 손상부 치료방법으로서,
    제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 손상부 치료용 조성물을, 상기 손상부 치료용 조성물에 대한 표적조직을 갖는 환자에게, 상기 표적조직의 손상부를 수복하기 위해 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 손상부 치료방법.
15. 제 14항에 있어서,
    손상부의 수복이 내인성 줄기세포의 능력에 근거하여 달성되는 것인 손상부 치료방법.
16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서,
    손상부 치료용 조성물을 정맥내 투여, 동맥내 투여, 문맥내 투여, 피내투여, 피하투여, 근육내 투여, 복강내 투여 및 비강내 투여로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 투여방법에 의해 투여하는, 손상부 치료방법.
17. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 손상부 치료용 조성물을, 뇌경색 환자에게, 뇌의 손상부를 수복하기 위해 치료상 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 뇌경색의 치료방법.
18. 제 17항에 있어서,
    손상부 치료용 조성물이 비강내 투여에 의해 투여되는 뇌경색의 치료방법.
19. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 손상부 치료용 조성물을, 중추신경계질환치료용 조성물로서 중추신경계질환 환자에게 치료상 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계질환의 치료방법.
20. 제 19항에 있어서,
    중추신경계질환치료용 조성물의 투여와 동시에 또는 투여 후에, 치수 줄기세포를 상기 중추신경계질환 환자에게 투여하는, 치료방법.
21. 제 20항에 있어서,
    치수 줄기세포가, 채취 후에 분화 유도 처리를 하지 않은 미분화형 치수 줄기세포, 또는 채취 후에 신경계세포로 분화 유도한 분화 유도형 치수 줄기세포인, 치료방법.
22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
    중추신경계질환치료용 조성물의 투여 후에, 신경계세포로 분화 유도한 다능성 줄기세포를 상기 중추신경계질환환자에게 투여하는, 치료방법.
23. 조제한 치수 줄기세포의 배양상청액이, 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 기재된 중추신경계질환치료방법에 이용되는 중추신경계질환치료용 조성물의 유효성분으로서 유효한지 여부를 판단하는 방법으로서, 이하의 단계 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 방법 :
    (a) 상기 배양상청액에 대하여, 신경재생 저해물질의 존재 하에서의 신경돌기 신장작용의 유무를 확인하는 단계 ; 및,
    (b) 상기 배양상청액에 대하여, 신경세포에 대한 아폽토시스 억제작용의 유무를 확인하는 단계.

Images