CN105378065A - 神经损伤治疗用移植材料的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供对于因神经损伤而引起的功能障碍具有高恢复效果的移植材料的、有效且重复再现性良好的制造方法。本发明提供神经损伤治疗用移植材料的制造方法等，该方法包括步骤：在实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞。

Description

神经损伤治疗用移植材料的制造方法

技术领域

本发明涉及一种利用牙髓干细胞而制造神经损伤治疗用移植材料的方法等。

背景技术

脊髓是末梢组织与脑之间传导运动、知觉信息的通路，如果受到损伤，则会导致运动麻痹或知觉障碍等严重的肢体障碍。不仅是有效的治疗方法，就连部分功能重建都非常困难。近年来，其研究在世界上积极开展着，但至今仍未研发出治疗的根本方法。

我国(日本)约有10万人脊髓损伤患者，每年新增的损伤患者达5000人左右。集中在20岁前后和60岁前后，主要是壮年层为中心，在驾车或运动中因事故而受到损伤、或老年人因受到轻微撞击而脊椎骨折等引起。一旦失去的身体功能难以恢复，患者从那以后生活会受到很多限制。

近年来，有研究指出移植人牙髓干细胞，显著恢复伴随大鼠脊髓损伤的运动障碍(非专利文献1)，但是要求重复再现性更好、能够获得高恢复效果的神经损伤的治疗方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：SakaiK.等人,JClinInvest122:80-90

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供对于因神经损伤而引起的功能障碍具有高恢复效果的移植材料的、有效且重复再现性良好的制造方法。

技术方案

本发明的发明者们为了解决上述课题做了反复研究，其结果确认出如果在现有的培养基中以较高浓度加入FGF2，培养牙髓干细胞，将培养物移植于脊髓损伤模型，则与现有的方法比较，运动功能的恢复效果得到显著提高，进一步地，如果使用表现出特定的基因表达模式的牙髓干细胞，则能够获得再现性良好的恢复效果，由此完成了本发明。

即，本发明涉及以下[1]～[27]。

[1]一种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞。

[2]如上述[1]所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的培养基。

[3]如上述[2]所述的方法，所述培养基中的血清浓度小于15重量％。

[4]如上述[1]所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的培养基。

[5]如上述[1]至[4]中任意一项所述的方法，所述培养基中的FGF2浓度为5ng/ml以上。

[6]如上述[5]所述的方法，所述培养基中的FGF2浓度为7ng/ml以上。

[7]如上述[1]至[6]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

[8]如上述[1]至[7]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

[9]如上述[1]至[8]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

[10]如上述[1]至[9]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

[11]如上述[1]至[6]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞群：表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

[12]如上述[1]至[6]、以及[11]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞。

[13]如上述[1]至[6]以及[11]至[12]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。

[14]如上述[1]至[6]以及[11]至[13]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。

[15]如上述[1]至[14]中任意一项所述的方法，所述神经损伤包括：脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

[16]一种神经损伤治疗用移植材料，包括：牙髓干细胞以及实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基。

[17]如上述[16]所述的神经损伤治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的培养基。

[18]如上述[17]所述的治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的培养基。

[19]如上述[16]至[18]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞是与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

[20]如上述[16]至[19]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

[21]如上述[16]至[20]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

[22]如上述[16]至[21]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

[23]如上述[16]至[22]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述神经损伤包括：脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

[24]一种神经损伤的治疗方法，包括工序：将根据上述[1]至[15]中任意一项所述的方法制造的神经损伤治疗用移植材料、或上述[16]至[23]中任意一项所述的治疗用移植材料，移植于神经损伤部位。

[25]如上述[24]所述的方法，所述神经损伤包括：脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

[26]一种用于制造神经损伤治疗用移植材料的试剂盒，包括：培养基和FGF2。

[27]一种方法，从牙髓干细胞的多个细胞群中选择神经损伤治疗用移植材料的材料，该方法选择具有以下(i)至(iv)中的至少一种特性的牙髓干细胞：

(i)表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，高5倍以上；

(ii)从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，高5倍以上；

(iii)表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，低5倍以上；

(iv)从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，低5倍以上。

有益效果

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料，能够通过以下简便的方法而得到：在培养牙髓干细胞时，在培养基中加入FGF2。通过移植该移植材料，能够获得高运动功能的恢复效果。

牙髓干细胞是能够从年幼、年轻的人大量获得的废弃物，还可以长期冷冻保存，因此容易获得，如果使用来源于患者自己的牙髓干细胞，则还不容易发生移植时的免疫排斥问题。并且，因为是组织干细胞，所以增殖会受限制，与多功能干细胞比较，认为癌变问题也较少。

附图说明

图1示出将实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中培养的移植材料(DP31F)、根据现有方法的移植材料(DP31O)以及对照移植材料(control：对照)移植于大鼠脊髓全切模型，根据BBB评分检测运动功能的恢复的结果。

图2示出将实质不含FGF2的培养基中培养的移植材料(DP31S)、实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中培养的移植材料(DP31F)以及对照移植材料(对照)移植于大鼠脊髓全切模型，根据BBB评分检测运动功能的恢复的结果。

图3示出将实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中培养的移植材料(DP31F、DP74F、DP264F)移植于大鼠脊髓全切模型，根据BBB评分检测运动功能的恢复的结果。

具体实施方式

[神经损伤治疗用移植材料的制造方法]

本发明所涉及的用于治疗神经损伤的移植材料的制造方法的一种方式，包括工序：在实质不含有FGF2以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞。

在本说明书中，“牙髓干细胞”是指一种能够从牙髓分离的组织干细胞。组织干细胞又称为成体干细胞(somaticstemcell)，相对于能够分化成所有的细胞的胚胎肝细胞，组织干细胞能够分化的细胞种类有限。

牙髓干细胞从乳牙以及恒牙均可以得到，可以从作为现有的医疗废弃物处理的智齿或乳牙等拔出的牙齿的牙髓获得。牙髓干细胞的制备以及保存可以根据本领域技术人员公知的方法(例如，akeda,T.等人:J.Dent.Res.,87:676-681,2008；Tamaokietal.,JDentRes.201089:773-778)进行。

牙髓干细胞是与骨髓间充质干细胞一样存在于硬组织中的间充质干细胞，可以使用与骨髓间充质干细胞同样的方法(例如，记载于“实验医学别册修订培养细胞实验手册第8章人骨髓间充质干细胞”2009年1月1日发行(羊土社)的方法)进行继代培养，但是具有例如分裂寿命长，不分化脂肪细胞等不同于从骨髓分离的细胞的特征。

如此，牙髓干细胞容易获得，并且培养方法以及保存方法已经确立，因此可以期待作为移植材料的原材料在再生医疗中使用。牙髓干细胞从拔除的牙齿获得后，根据需要培养而增殖到一定量，可以长期冷冻保存，因此也可以制造用于保存从很多人分离的牙髓干细胞的牙髓干细胞库。

牙髓干细胞，例如可以以表面抗原STRO-1表征。除此以外，也可以将Nestin、SOX10、SOX11等神经嵴细胞标记为标志，识别牙髓干细胞。

已知，牙髓干细胞相比于骨髓间充质干细胞具有更高的增殖能力。并且，还已知，如果与磷酸钙或羟基磷灰石一同移植于小鼠，则产生牙本质。

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法，可以使用来源于移植对象的细胞、或者来源于移植对象以外的人的细胞。例如，可以从移植对象者的乳牙或智齿等分离牙髓干细胞，培养，冷冻保存，在需要时解冻而使用。并且，从牙髓干细胞库选择人白血球抗原(humanleukocyteantigen；HLA)一致的牙髓干细胞，使用于神经损伤治疗用移植材料的制造中。

在本说明书中，“神经损伤”是指中枢以及末梢的神经损伤，具体而言，包括脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经障碍等，但不限于此。本发明的移植材料，只要通过移植能够获得治疗效果，则可以适用于任何神经损伤。治疗效果，不仅包括治愈疾病的效果，而且还包括伴随疾病的至少一种症状得到改善的效果、以及抑制或延缓疾病发展的效果等。

本说明书中，移植对象不限于人，可以是其他的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猴、羊、牛、马)。

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法中，将牙髓干细胞培养于实质不含碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)以外的生长因子的培养基。

本说明书中，“实质不含FGF2以外的生长因子的培养基”，是指有目的地(purposely)添加的生长因子仅有FGF2。作为这种培养基，例如可以举出：包含血清的基本培养基中作为生长因子仅添加FGF2的培养基；不包含血清的基本培养基中仅添加FGF2的培养基；包含血清的基本培养基中仅添加FGF2的培养基；作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加FGF2的培养基；作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，仅添加FGF2的培养基。

在本说明书中“基本培养基”，是指仅包含低分子量的已知成分的培养基，作为基本培养基的非限定性例子，已知的包括：BME(BasalmediumEagle's：伊格尔(氏)基础培养基)、MEM(Minimumessentialmedium：最低必需培养基)、DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium：达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基)等伊格尔(氏)培养基(Eagle'smedium)；RPMI1630、RPMI1640等RPMI(RoswellParkMemorialInstitue)培养基；Fischer's培养基(Fischer'smedium)；F10培养基、F12培养基等Ham's培养基(Ham'smedium)、MCDB104、107、131、151、153、170、202等MCDB培养基；RITC80-7，可以适宜选择。

本说明书中的“血清”是指凝固血液后的上清，换言之，从血液去除细胞成分和凝固蛋白的剩余物。本发明中所使用的血清，可以是来源于任意动物的血清，例如可以举出人血清、胎牛血清、马血清等。本发明所涉及的治疗用植物材料移植于人体时，优选为人血清。

由于血清中含有各种生长因子，故“含血清的基本培养基”中会包含这些生长因子，但是包含血清中所含的量的、FGF2以外的生长因子的培养基，属于说明书中的“实质不含FGF2以外的生长因子的培养基”。优选地，培养基中的血清少于15重量％、少于13重量％、少于10重量％、少于8重量％、少于5重量％等。

本说明书中“生长因子”是指被称为生长因子或增殖因子的各种蛋白，例如可以举出表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、血小板来源增殖因素(PDGF)、神经生长因子(NGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)白细胞介素等。

本说明书中“作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基”是指不进行分化诱导，而维持分化能力的状态下，培养增殖间充质干细胞的市售的培养基，例如可以举出MSCGM培养基(LONZA公司)、间充质干细胞増殖培养基(TakaraBio株式会社)、间充质干细胞增殖培养基DXF(TakaraBio株式会社)、Stemline(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(Sigma-Aldrich公司)、MF-medium(商标)间充质干细胞增殖培养基(ToyoboLifeScience)、BDMosaic(商标)人间充质干细胞用无血清培养试剂盒(BDBioScience)，但不限于此。这些市售培养基中也包括没有公开成分的培养基，并且也包括以低浓度含血清的培养基，但是只要是向这些培养基有意地(purposely)添加的生长因子仅为FGF2，属于本发明中的“实质不含FGF2以外的生长因子的培养基”。此时，血清优选为少于15％、少于13％、少于10％、少于8％、少于5％等。

本说明书中，FGF2是指碱性成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor；FGF)，又称为bFGF或HBGF-2。

作为FGF2而言，可以将市售的商品经过适宜稀释等而使用。为了用于移植材料，优选为利用适宜的膜(membrane)过滤，确认对细菌、真菌、支原体等呈隐性的FGF2。FGF2的浓度只要是所得到的移植材料具有充分的脊髓损伤治疗效果，没有特别限定，例如可以是5ng/ml以上、7ng/ml以上。

本说明书中，称为“作为生长因子仅添加FGF2的培养基”时，只要没有添加FGF2以外的生长因子，可以添加其他的蛋白等。

作为加入到培养基的物质，例如可以举出胰岛素、胰高血糖素、催乳素、甲状腺素、生长激素、促卵泡激素(FSH)、黄体生成激素(LH)、促甲状腺激素、雌二醇、糖皮质激素等激素；血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、脂蛋白等结合蛋白；胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白等细胞粘附因子；前列腺素、磷脂、不饱脂肪酸等脂质；各种低分子量化合物等，这些可以任意单独使用，或者可以任意组合使用。对于这些物质的浓度而言，本领域技术人员可以适宜选择。

本发明所涉及的脊髓损伤治疗用移植材料的制造方法所使用的培养基中，除此以外，可以适宜添加对细胞培养有益的物质。这些物质例如可以举出用于保持稳定的pH的缓冲剂(HEPES等)、pH指示剂的酚红、抗菌物质(例如青霉素G、链霉素、两性霉素B、庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、米诺环素、gentacin等)、氨基酸、维生素、脂质、碳水化合物、核酸、无机盐、有机酸盐、矿物质等，但是不限于此。

本发明所涉及的脊髓损伤治疗用移植材料的制造方法所使用的培养基，可以通过将必要成分溶于水、缓冲液、市售培养基等，由此进行配制。

培养基配制中所使用的水，优选使用符合注射用纯水标准的超纯水。

培养基的配制，也在高标准洁净室或净化工作台通过无菌操作进行，培养基的分装中，优选使用都能去除支原体的孔径在0.1μm以下的无菌过滤器。

培养基的保存容器，相比于内壁易附着蛋白质的玻璃制容器，更优选为由聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚合物等制成的塑料容器。

对配制的培养基还可以进行各种品质评价试验(包括测定pH或渗透压等的理化试验；确认细菌、真菌、支原体等污染的微生物试验；确认肝炎病毒、HIV等污染的病毒试验；内毒素浓度测定；细胞增殖或生理功能等生物活性试验等)。

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法中，还优选在上述的培养基中，继代培养2次、3次、4次、5次或6次以上牙髓干细胞。

培养方法除了在实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中培养以外，没有特别限制，本领域技术人员根据培养的细胞的种类，可以选择各种条件(温度、湿度、CO₂浓度、pH、培养基的更换频率等)。

对于培养期间而言，本领域技术人员可以根据细胞的种类、培养基的组分而适宜选择，例如可以基于细胞的形状或增殖的速度，判断细胞成为移植适宜的状态。作为移植适宜的状态，例如可以举出变为细长形的细胞、或增殖速率低下的细胞，但不限于此。

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法中的细胞的培养，可以以单层静置培养、旋转培养、微载体培养、悬浮培养、回转培养、球形聚集培养(spheroidculture)、凝胶培养、三维载体培养等任意方法进行。

单层静置培养，是指贴在培养容器壁上以单层状态培养的方法。培养容器可以使用玻璃制或塑料制容器。塑料容器可以使用表面被处理成具适宜亲水性的容器，根据细胞的种类或实验目的，也可以涂覆胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶(matrigel)等细胞外基质。作为涂覆材料可以使用通过UV照射交联的胶原、或加热处理胶原而得到的明胶。

旋转培养，是指将培养容器放入旋转的金属槽筒进行培养的方法。通过使用瓶型培养容器等，还可以进行大规模培养。

微载体培养，是指使用珠状载体，将细胞贴在其表面，搅拌含微珠子的培养基，以悬浮状培养的方法。适合大规模培养。

悬浮培养，是指将细胞悬浮于培养基的状态培养的方法。可以通过搅拌培养基而将粘着细胞强制悬浮培养。与单层培养比较，能够回收较多的细胞。

回转培养，是指使培养容器在水平面上回转运动而培养的方法。也作为悬浮培养的一种方法而被利用，但也为了利用由于回转使悬浮物集中于中部的性质而形成细胞团块(spheroids)。

球形聚集培养，是指使细胞悬浮，处于相互缓慢接触的状态，通过相互粘附而形成聚球体的方法。球形聚集培养的细胞，功能高表达的较多。

凝胶培养，是指将细胞埋入于胶原凝胶、软琼脂、合成聚合物等凝胶中进行培养的方法。适合三维培养。

三维载体培养，是指为了提高培养的细胞的功能表达，利用载体以能够高密度且立体增殖细胞，进行培养的方法。作为载体，一般是多孔聚合物或珠子(beads)，为了能够实现高密度细胞的营养、空气更换，使用根据生物反应器的循环系统。

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法，加之上述的培养工序，作为移植材料的制造方法还可以进行各种适宜的工序。例如还可以进行如下工序：将培养工序中获得的培养物与透明质酸、胶原凝胶、纤维蛋白原、软琼脂、合成聚合物等高粘性的物质混合，调节流动性。通过赋予适宜的流动性，能够使移植材料固着在损伤部位。

与胶原凝胶、软琼脂、合成聚合物等凝胶混合后，培养一定期间，也可以进行三维培养。

作为本说明书中所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，可以选择使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞。

本说明书中“与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞”是指，对记载于表1的基因群的表达，检测基因表达模式(geneexpressionpattern)时，与牙髓干细胞的平均比较，记载于表1的基因群中的10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、或98％以上的种类的基因的表达量，分别高5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞。

本说明书中“牙髓干细胞的基因的表达量的平均”是指2个以上的任意数量的牙髓干细胞中的基因的表达量的平均。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，可以使用如下的牙髓干细胞：与牙髓干细胞中的平均表达量比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、以及Cbln2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、14种以上、15种以上、16种以上、17种以上、18种以上、19种以上、20种以上、或者21种基因的表达，分别高5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞。

并且，作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，也可以选择使用两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞的细胞群。

也就是说，可以选择使用如下的牙髓干细胞的细胞群：记载于表1的基因群中，10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、或98％以上的种类的基因的表达量，与其他的细胞群比较，分别高5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，也可以使用如下的牙髓干细胞的细胞群：两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、以及Cbln2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、14种以上、15种以上、16种以上、17种以上、18种以上、19种以上、20种以上、或者21种基因的表达量，与其他细胞群比较，分别高5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

本说明书中“两种以上的牙髓干细胞的细胞群”可以举出：例如2个以上个体来源的牙髓干细胞的细胞群、从一个个体时隔一定时间取得的细胞群、以及从同一个个体的其他牙齿来源的细胞群。细胞群可以是从一个细胞增殖的细胞株，也可以是培养同一个个体来源的多个细胞而获得的细胞群。

本说明书中的基因表达的种类和其量，不限于此，可以通过本领域技术人员公知的技术而测定，包括：Northern印迹、原位杂交，RNA酶保护测定法以及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术。

作为本说明书中所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，可以使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞。

本说明书中“与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞”是指，对记载于表2的基因群的表达，测定基因表达模式(geneexpressionpattern)时，与牙髓干细胞中的平均表达量比较，记载于表2的基因群中的10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、或98％以上的种类的基因的表达量，分别低5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞。

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

[表14]

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，可以使用如下的牙髓干细胞：与牙髓干细胞中的平均表达量比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、以及HTATSF1P2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、或者14种基因的表达，分别低5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，也可以选择使用两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞的细胞群。

也就是说，可以选择使用如下的牙髓干细胞的细胞群：记载于表2的基因群中，10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、或98％以上的种类的基因的表达量，与其他的细胞群比较，分别低5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，也可以使用如下的牙髓干细胞的细胞群：两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、以及HTATSF1P2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、或者14种基因的表达，与其他细胞群比较，分别低5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

通过本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法获得的治疗用移植材料的效果，例如可以利用疾病模型动物，通过以下方法进行评价。

大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型可以通过公知的方法制造，但以下示出具体例。将野生型大鼠在麻醉下，直肠温度维持37±0.5℃，切开颈部，暴露右侧颈动脉的分叉部，剥离颈内、颈外动脉。然后，利用用硅层将头端制圆的4-0尼龙细线，从颈外动脉，通过颈内动脉而到达大脑中动脉(MCA)的前端，进行固定，由此阻断右侧大脑中动脉区域的血流，以处于缺血状态。缺血一小时后，将尼龙细线向大脑中动脉外侧拔出，进行再灌注。

再灌注后，第48小时时，从尾静脉给与有效量的本发明所涉及的治疗用移植材料(牙髓干细胞)。或者，也可以向引起梗塞的病患部位局部给药有效量的本发明所涉及的治疗用移植材料(牙髓干细胞)。

运动功能的恢复通过BBB评分(BassoDM等人,JNeurotrauma.1995Feb；12(1):1-21)进行评价。

[神经损伤治疗用移植材料]

本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料，根据上述的本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法而制造，包括牙髓干细胞和实质不含FGF2以外的生长因子的培养基。“牙髓干细胞”以及“实质不含FGF2以外的生长因子的培养基”，如同上述。移植材料可以包含胶原凝胶、软琼脂、合成聚合物等凝胶，也可以通过适当的胶凝剂或增稠剂而调节粘性。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料所使用的牙髓干细胞，可以使用与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞。“与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞”，如同上述。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料所使用的牙髓干细胞，可以使用与牙髓干细胞中的平均表达量比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、以及Cbln2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、14种以上、15种以上、16种以上、17种以上、18种以上、19种以上、20种以上、或者21种基因的表达，与其他细胞群比较，分别高5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞，可以是使用该牙髓干细胞的移植材料。

作为本说明书中所涉及的神经损伤治疗用移植材料所使用的牙髓干细胞，也可以选择使用两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞的细胞群。“两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，表1的基因群的基因表达高的牙髓干细胞的细胞群”，如同上述。

作为本说明书中所涉及的神经损伤治疗用移植材料所使用的牙髓干细胞是，在两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg、以及Cbln2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、14种以上、15种以上、16种以上、17种以上、18种以上、19种以上、20种以上、或者21种基因的表达，与其他的细胞群比较，分别高于5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

作为本说明书中所涉及的神经损伤治疗用移植材料所使用的牙髓干细胞，也可以使用与牙髓干细胞中的平均表达量比较，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞。

“与牙髓干细胞中的平均表达量比较，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞”，如同上述。

作为本说明书中所涉及的神经损伤治疗用移植材料所使用的牙髓干细胞，可以使用与牙髓干细胞中的平均表达量比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、以及HTATSF1P2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、或者14种基因的表达，分别低5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，包括使用两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞的移植材料。

“两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，表2的基因群的基因表达低的牙髓干细胞”如同上述。

作为本说明书所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造中所使用的牙髓干细胞，也可以使用如下的牙髓干细胞的细胞群：在两种以上的牙髓干细胞的细胞群中，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、以及HTATSF1P2构成的群中选择的1种以上、2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、6种以上、7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、13种以上、或者14种基因的表达，与其他细胞群比较，分别低5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、95倍以上、或者100倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

[神经损伤的治疗方法]

本发明还包括神经损伤的治疗方法，包括将上述的神经损伤治疗用移植材料向神经损伤部位移植的工序。

神经损伤治疗用移植材料，可以通过注射器等而注入到神经损伤部位。并且，也可以切开损伤部位，配置移植材料。移植材料包含非患者自身的细胞(他家细胞)时，可以同时给药环孢霉素等免疫抑制剂。只要能够获得神经损伤治疗效果，也可以与其他医药一起使用。

对于给药量以及给药次数而言，本领域技术人员可以适宜决定。

神经损伤的治疗方法的对象不限于人，可以是其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猴、羊、牛、马)。

以下，示出本说明书的人脑梗塞的治疗方法的例子，但是治疗方法不限于此。

向人脑梗塞患者，将根据上述的本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料的制造方法而制造的治疗用移植材料、或本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料，使用微量注射泵(syringepump)从末梢静脉以2ml/分钟的注射速度进行静脉注射，给药有效量的牙髓干细胞。

[神经损伤治疗用移植材料的制造用试剂盒]

本发明还包括神经损伤治疗用移植材料的制造用试剂盒。该试剂盒包含全部或部分的用于培养牙髓干细胞的培养基或其他成分、以及FGF2。作为用于培养牙髓干细胞的培养基，可以举出基本培养基或间充质干细胞培养用培养基。FGF2可以与培养基分开，也可以已混合在一起。并且，培养基可以仅包含全部或部分必需成分，而超纯水等实验室常备的材料可以由使用者准备，由此只要经过混合就能配制本发明的培养基。

本发明的试剂盒，可以是用于实验室的实验的试剂盒，也可以是用于大规模培养的试剂盒。除了培养液，还可以具有培养容器、病毒过滤器、培养容器的涂覆材料、各种试剂、缓冲液、使用说明书等。

本说明书中所引用的所有的专利文献以及非专利文献所公开的内容通过参照而整体加入于本说明书。

实施例

以下，根据实施例而详细说明本发明，但是本发明不受这些实施例的任何限制。本领域技术人员在不脱离本发明的内容的基础上，可以对本发明进行各种方式的变更，这种变更也包含于本发明的范围。

实施例1.牙髓干细胞的培养方法的不同而导致的脊髓全切模型的运动 功能恢复效果的影响1

1.实验方法

1-1.动物以及材料

Wistar大鼠(7周龄，雌性)购自于日本SLC公司，麻醉剂戊巴比妥(somnopentyl)购自于共立制药株式会社。实施动物实验前，基于动物实验的安全福利的相关规定，根据规定的格式制定了动物实验计划书，得到了岐阜药科大学动物饲养动物实验委员会的批准。

1-2.细胞培养

从拔出的牙齿，诱导牙髓干细胞，培养增殖的方法是按照已公开的方法(Tamaoki等人,JDentRes.201089:773-778)进行的。准备了以下细胞：将继代培养至8代的牙髓干细胞，用MSCGM培养基(LONZA)继代培养2-5次的细胞(DP310)；以及将相同的细胞用含有10ng/ml的FGF2和10％FCS的α-MEM培养基(Sigma公司)继代培养5-6次的牙髓干细胞(DP31F)。

1-3.利用全切模型的实验方法

脊髓全切模型的制备

向7周龄的雌性Wistar大鼠，将戊巴比妥按体重40mg/kg的用量向腹腔内给药，麻醉后，在第10胸椎处沿正中线切开背部2cm，剥离脂肪和肌肉组织使脊柱露出。去除椎弓，用锋利的刀具将第10胸髓(T10)横向切断。止血后，向切断部位的嘴侧残端与尾侧残端的间隙，注入达到10⁶细胞/10μl的、分别悬浮于培养基中的上述培养的牙髓干细胞。然后，将背部肌肉以及皮肤缝合。手术后，确认脊髓切断同一侧的后肢麻痹，按照通常的饲养方法饲养而用于实验。另外，将环孢霉素作为免疫抑制剂，每天以10mg/kg的用量向腹腔内注射。

2.结果

运动功能的恢复通过BBB评分(BassoDM等人,JNeurotrauma.1995Feb；12(1):1-21)进行评价(图1)。

即使不进行细胞移植，而仅向损伤部位注射PBS或培养上清液，2周后，完全麻痹的后肢恢复到1个或2个关节可以轻微活动的程度。但是，即使观察到7周以后，也没有发现更进一步的运动功能的恢复(BBB评分＝1)。

另一方面，如图1所示，在移植了DP310的组中，损伤3周后，一半的个体(14只中的7只)能够很好的活动2个关节，损伤4周以后，即使实验组全体与对照组比较，均显示出显著较高的运动功能(BBB评分＝3.5)。并且，移植了DP31F的组中，损伤后1周期间，后肢的1个关节可以轻微活动，第2周后，与对照组以及移植了DP310的组相比，显示出显著较高的运动功能(BBB评分＝6.5)。其中，一半的个体(13只中的7只)恢复到能够用麻痹的腿支撑体重的程度。

实施例2.牙髓干细胞的培养方法的不同而导致的脊髓全切模型的运动 功能恢复效果的影响2

1.实验方法

1-1.动物以及材料

与实施例1相同的方法准备实验动物。

1-2.细胞培养

从拔出的牙齿，诱导牙髓干细胞，培养增殖的方法是按照已公开的方法(Tamaoki等人,JDentRes.201089:773-778)进行的。准备了以下细胞：将用MSCBM培养基(LONZA)继代培养至12代的牙髓干细胞，用含有10％FCS的α-MEM培养基(Sigma公司)继代培养7-8次后的牙髓干细胞(DP31S)；以及用含有10ng/ml的FGF2和10％FCS的α-MEM培养基继代培养7-8次的牙髓干细胞(DP31F)。

1-3.利用全切模型的实验方法

制备与实施例1相同的脊髓全切模型。

2.结果

与实施例1相同，运动功能的恢复通过BBB评分(BassoDM等人,JNeurotrauma.1995Feb；12(1):1-21)进行评价(图2)。

没有移植细胞的组(对照)以及移植了用不含有FGF2而含有10％FCS的α-MEM培养基培养的牙髓干细胞(DP31S)的组中，几乎没有观察到后肢的运动功能的恢复，平均达到1个关节活动的程度(分别为，BBS评分＝1.9±0.2，n＝45；BBS评分＝1.9±0.2，n＝14)。

另一方面，移植了用含有FGF2和10％FCS的α-MEM培养基培养的牙髓干细胞(DP31F)的组中，能够观察到显著的运动功能的恢复效果，平均达到3个关节全部均能够活动的程度(BBS评分＝5.0±0.7，n＝28)。

实施例3.牙髓干细胞的供者(donor)的不同而导致的脊髓全切模型的 运动功能恢复效果的影响

1.实验方法

1-1.动物以及材料

与实施例1相同的方法准备实验动物。

1-2.细胞培养

从由3名不同的供者(DP31、DP74以及DP264)拔出的牙齿，诱导牙髓干细胞，培养增殖的方法是按照已公开的方法(Tamaoki等人,JDentRes.201089:773-778)进行的。准备了以下细胞：用含有10ng/ml的FGF2和10％FCS的α-MEM培养基继代培养7-8次的、来自3名不同的供者的牙髓干细胞(DP31F、DP74F和DP264F)。

1-3.利用全切模型的实验方法

制备与实施例1相同的脊髓全切模型。

2.结果

与实施例1相同，运动功能的恢复通过BBB评分(BassoDM等人,JNeurotrauma.1995Feb；12(1):1-21)进行评价(图3)。

与DP31F、DP74F的移植组相比(BBB评分＝4.1±0.7，n＝12)，DP264F的移植组中，没有观察到运动功能的恢复效果(BBB评分＝1.1±0.2，n＝14)。

实验例1.牙髓干细胞的培养方法的不同对神经系统细胞的分化标记的 表达的影响

1.实验方法

将移植了实施例1的牙髓干细胞DP310的大鼠、以及移植了实施例2的牙髓干细胞DP31F的大鼠，分别在移植7周后，含有4％多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲溶液(pH7.3)经心灌流固定，摘出脊髓组织。

根据常规方法，将摘出的脊髓组织，浸泡在20％的蔗糖溶液中，用OCT包埋剂包埋后，恒冷箱切片。将切出的切片贴在载玻片上，浸泡于含有0.3％trironX100(注册商标)的Tris-HCl(pH7.4)中，待抗体的细胞膜渗透性升高后，用含有2％BlockAce(DSPharma生物制剂公司)的PBS，在室温下进行30分钟封闭。使用抗人类细胞核抗原(HumanNuclearantigen)抗体(Millipore公司(MAB1281))、抗Tuj1抗体(CellSignalingtechnology公司，#5568)、抗髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein：MBP)抗体(Millipore公司(AB980))、抗CNPase抗体(Sigma公司(C5922))、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein：GFAP)抗体(Dako社(Z0334))、抗生长相关蛋白43(growthasscciatedprotein43：GAP43)抗体(Chemicon公司(MAB347))、抗绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein：GFP)抗体(Chemicon公司(AB3080))，作为一次抗体，进行免疫染色。

人类细胞核抗原(HumanNuclearantigen)是人类细胞的标记，CNPase是未成熟少突胶质细胞(oligodendrocyte)标记，GFAP是未成熟星形胶质细胞(astrocyte)标记。另外，利用逆转录病毒载体(retroviralvector)，以使移植细胞表达GFP基因。

2.结果

经鉴定，移植的牙髓干细胞为GFP或人类细胞核抗原阳性。移植前的DP310中，均表达所有的能够在未成熟神经系统细胞中观察到的标记(即，Tuj1(未成熟神经细胞标记)、GFAP、CNPase以及Nestin(干细胞标记))，与此相比，脊髓组织中的DP310中，几乎所有的细胞均为Tuj1和GFAP阴性、CNPase阳性。另一方面，脊髓组织中的DP31F中，一定比例的细胞为Tuj1和MBP阳性，而几乎所有的细胞均为GFAP阴性细胞(不确定Tuj1以及MBP阳性细胞是否是相同的细胞)。

因此，得到以下启示：被移植的DP310可能向少突胶质细胞分化，而DP31F可能向含有神经细胞或少突胶质细胞的细胞群分化。

根据上述结果，得到以下启示：用FGF2处理过的牙髓干细胞，更具体而言，用MSCGM培养的细胞，获得以下特性。

(i)向损伤的脊髓移植后，变为特异性地分化为神经细胞的细胞。

(ii)虽然分化能力受到限制(即，特异性地分化为神经细胞)，但是仍维持增殖能力。

这些特性表明，用FGF2处理过的牙髓干细胞可以用于神经损伤的治疗。

实验例2.全局基因表达(globalgeneexpression)分析

1.实验方法

将来自2名供者(DP31和DP264)的牙髓干细胞用MSCBM培养基培养。用RNeasyPlusMini试剂盒(Qiagen公司)从上述牙髓干细胞中提取总RNA。用Agilent2100芯片分析系统(Agilent2100Bioanalyzer)(AgilentTechnologies公司)将RNA定量后，用LowInputQuickAmpLabeling试剂盒(AgilentTechnologies公司)，根据附带的说明书，将250mg的RNA逆转录为cDNA，扩增，用Cy3-labeledCTP标记。然后，将该cDNA纯化后，用ND-1000分光光度计(NanoDropTechnologies公司)将cDNA定量，在WholeHumanGenome4×44K低聚糖DNA微阵列(AgilentTechnologies公司)上杂交。杂交后，用基因表达洗涤试剂盒(GeneExpressionWashPack)(AgilentTechnologies公司)连续洗涤阵列。杂交的阵列的荧光成像用AgilentDNA微阵列芯片扫描仪(AgilentTechnologies公司)制作，用Agilent特征提取软件ver.10.7.3.1.(AgilentTechnologies公司)分析荧光强度。各样品分别分析一次。用GeneSpringGX11.5(AgilentTechnologies公司)分析基因表达水平。

2.结果

与DP31比较，在DP264中，基因表达水平高5倍以上的基因记载在表1，而基因表达水平低5倍以上的基因记载在表2。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞，

作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

2.一种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞，

作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

3.一种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞，

作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群使用以下细胞：表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞。

4.一种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基中培养牙髓干细胞，

作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群，使用以下细胞：表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

6.如权利要求5所述的方法，所述培养基中的血清浓度小于15重量％。

7.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

8.如权利要求1至7中任意一项所述的方法，所述培养基中的碱性成纤维细胞生长因子浓度为5ng/ml以上。

9.如权利要求8所述的方法，所述培养基中的碱性成纤维细胞生长因子浓度为7ng/ml以上。

10.如权利要求1至9中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

11.如权利要求1至10中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

12.如权利要求1至9中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞。

13.如权利要求1至9、以及12中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2、以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。

14.如权利要求1至13中任意一项所述的方法，所述神经损伤是脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

15.一种神经损伤治疗用移植材料，包括：

实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基；

与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

16.一种神经损伤治疗用移植材料，包括：

实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基；

与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

17.如权利要求15或16所述的神经损伤治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

18.如权利要求15或16所述的治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

19.如权利要求15至18中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

20.如权利要求15至19中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的平均比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

21.如权利要求15至20中任意一项所述的治疗用移植材料，所述神经损伤是脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

22.一种神经损伤的治疗方法，包括工序：将根据权利要求1至14中任意一项所述的方法制造的神经损伤治疗用移植材料、或权利要求15至21中任意一项所述的治疗用移植材料，移植于神经损伤部位。

23.如权利要求22所述的方法，所述神经损伤是脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

24.一种试剂盒，用于制造如权利要求15至21中任意一项所述的神经损伤治疗用移植材料。

25.一种方法，从牙髓干细胞的多个细胞群中选择神经损伤治疗用移植材料的材料，该方法选择具有以下(i)至(iv)中的至少一种特性的牙髓干细胞：

(i)表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，高5倍以上；

(ii)从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，高5倍以上；

(iii)表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，低5倍以上；

(iv)从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，低5倍以上。

Claims (27)

1.一种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

3.如权利要求2所述的方法，所述培养基中的血清浓度小于15重量％。

4.如权利要求1所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的方法，所述培养基中的碱性成纤维细胞生长因子浓度为5ng/ml以上。

6.如权利要求5所述的方法，所述培养基中的碱性成纤维细胞生长因子浓度为7ng/ml以上。

7.如权利要求1至6中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

8.如权利要求1至7中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

9.如权利要求1至8中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

10.如权利要求1至9中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

11.如权利要求1至6中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞群：表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞的细胞群。

12.如权利要求1至6、以及11中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞。

13.如权利要求1至6以及11至12中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。

14.如权利要求1至6以及11至13中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。

15.如权利要求1至14中任意一项所述的方法，所述神经损伤是脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

16.一种神经损伤治疗用移植材料，包括：牙髓干细胞以及实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基。

17.如权利要求16所述的神经损伤治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

18.如权利要求17所述的治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子的培养基。

19.如权利要求16至18中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞是与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

20.如权利要求16至19中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量高5倍以上的牙髓干细胞。

21.如权利要求16至20中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

22.如权利要求16至21中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。

23.如权利要求16至22中任意一项所述的治疗用移植材料，所述神经损伤是脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

24.一种神经损伤的治疗方法，包括工序：将根据权利要求1至15中任意一项所述的方法制造的神经损伤治疗用移植材料、或权利要求16至23中任意一项所述的治疗用移植材料，移植于神经损伤部位。

25.如权利要求24所述的方法，所述神经损伤是脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。

26.一种用于制造神经损伤治疗用移植材料的试剂盒，包括：培养基和碱性成纤维细胞生长因子。

27.一种方法，从牙髓干细胞的多个细胞群中选择神经损伤治疗用移植材料的材料，该方法选择具有以下(i)至(iv)中的至少一种特性的牙髓干细胞：

(i)表1的基因群中10％以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，高5倍以上；

(ii)从由MYO1G、RBMY2FP、FILIP1、C1orf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、Znf708、Dct、Slc15a1、Zhddc22、Adam20、Gnao1、Csn2、Semg2、Dnah1、Ctag1a、Lrrc19、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，高5倍以上；

(iii)表2的基因群中10％以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，低5倍以上；

(iv)从由Gafa3、Lmf1、Fam13a、Gkn1、Gpr112、Sult1c4、Slc35f4、Gstt1、Gpr27、Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，低5倍以上。