JPWO2018143378A1 - 歯髄組織由来細胞から歯髄幹細胞を調製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
間葉系幹細胞に分類される幹細胞の一つとして歯髄組織由来の歯髄幹細胞が知られている。特に、歯髄幹細胞のうち、乳歯由来の歯髄幹細胞は、様々な疾患モデルにおいてその治療効果が実証されている(非特許文献1〜5)。このような治療効果の事実から、再生医療に用いられる幹細胞の供給源として、歯髄幹細胞が注目されている。
したがって、臨床での幹細胞治療を考慮に入れた場合、単離した幹細胞が保持する幹細胞特性の程度が、治療効果を左右する非常に重要なファクターと見なされる(非特許文献7)。
また、ヒト骨髄間葉系幹細胞や歯髄幹細胞は、CD146が発現することが報告されている(Shi and Gronthos, 2003)。CD146(別名MUC18, MCAM)は、ヒトメラノーマ細胞で同定された113 kDaの細胞接着分子であり(Lehmann et al., 1987)、乳歯幹細胞も細胞表面で発現することが明らかとなっている(非特許文献2)。CD146陽性ヒト骨髄間葉系幹細胞や歯髄幹細胞は血管周囲に多く観察され、幹細胞ニッチ形成との関連が示唆されている(Shi and Gronthos, 2003)。また、CD146の発現低下が細胞老化を促進することが報告された(Jin et al., 2016)ことからも、CD146は間葉系幹細胞の初期のマーカーと考えられうる。
また、骨髄間葉系幹細胞で発現が明らかとなっている多能性幹細胞のマーカーとしてSSEA-4が知られている(Gang et al., 2007)。SSEA-4は、乳歯幹細胞の細胞表面で発現が報告されている(Yamaza et al., 2010)。SSEA-4 (stage specific antigen-4)は奇形がん腫細胞より同定された細胞表面分子であり(Kannagi et al., 1983)、ES細胞やiPS細胞の多能性幹細胞の初期マーカーとして知られている(Henderson et al., 2002; Takahashi et al., 2007)。よって、SSEA-4を発現する間葉系幹細胞亜集団は、非常に原始的(primitive)な集団と考えられている。
例えば、上記に列挙するような分子の発現が亢進している歯髄幹細胞を得ることができれば、優れた幹細胞特性を有する歯髄幹細胞を提供することが可能となる。
なお、特許文献1には、上述のように、SSEA-3およびCD105陽性の多能性幹細胞を得る方法を記載しているが、得られた多能性幹細胞はCD146陰性の細胞であることが記載されている。
本発明は、一態様において、
〔1〕歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法であって、
(a)前記歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、前記歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、
(b)前記工程(a)により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13%(V/V)で血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも1日培養する工程と、
(c)前記工程(b)の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程と
を含む、歯髄幹細胞の調製方法に関する。
〔2〕上記〔1〕に記載の方法であって、
前記工程(c)が、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態、かつ、低栄養状態で培養する工程であることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔3〕上記〔1〕または〔2〕に記載の方法であって、
前記工程(a)の前に、前記歯髄細胞を、培養ディッシュ上で、他の細胞と接着しないように播種する工程を含み、これにより単一細胞に由来する細胞コロニーを形成させることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔4〕上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(a)および(b)に用いる血清がFBSであることを特徴とする。
〔5〕上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(a)および/または(b)に用いる培養液が、10〜13% (V/V)で血清を含む培養液であり、SSEA-4の発現が亢進した歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔6〕上記〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(a)の前に、前記歯髄組織を酵素処理することにより前記歯髄細胞を調製する工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔7〕上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(a)の後であって、かつ、前記工程(b)の前に、(a’)培養液を交換するための洗浄工程をさらに含むことを特徴とする。
〔8〕上記〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(c)が、前記工程(b)で用いた血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を、新しい培養液に交換せずにそのまま用いて歯髄細胞を培養する工程であることを特徴とする。
〔9〕上記〔8〕に記載の方法であって、
前記工程(b)および(c)の培養時間の合計が、少なくとも168時間であることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔10〕上記〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(a)において、培養ディッシュ上に播種された歯髄細胞が、0.01×106〜0.1×106 cells/mlの濃度で培養液中に含まれることを特徴とする。
また、本発明の歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法は、一実施の形態において、
〔11〕上記〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程(a)の前培養時間が24〜48時間であることを特徴とする。
〔12〕上記〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法により得られた歯髄幹細胞を用いて治療用移植材を製造する工程を含む、治療用移植材の製造方法に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔13〕上記〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法により得られた歯髄幹細胞であって、SSEA-4の発現が亢進している単一の細胞コロニー由来の歯髄幹細胞に関する。
ここで、本発明の歯髄幹細胞は、
〔14〕上記〔13〕に記載の歯髄幹細胞であって、
前記細胞コロニーが、SSEA-4に加えて、さらにCD146またはCD34の発現が亢進したものであることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、
〔15〕上記〔13〕または〔14〕に記載の歯髄幹細胞を含む、治療用移植材に関する。
さらに、本発明の方法は、歯髄幹細胞を効率的に調製可能なことに加えて、歯髄幹細胞の幹細胞特性を亢進した状態で調製することを可能とするものである。
(a)前記歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、前記歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、
(b)前記工程(a)により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13% (V/V)で血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも1日培養する工程と、
(c)前記工程(b)の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程。
なお、本発明の一実施の形態においては、「調製」を「単離」と読み替えることができる。すなわち、一実施の形態として、歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を単離する方法であって、上記工程(a)〜(c)を含む方法も提供する。
歯髄組織からは歯髄細胞を得ることができ、歯髄組織由来の歯髄細胞には歯髄幹細胞が含まれる。歯髄幹細胞は、歯髄から単離できる組織幹細胞の一種である。組織幹細胞は体性幹細胞とも呼ばれ、あらゆる細胞に分化することができる胚性幹細胞に対して、組織幹細胞は分化できる細胞の種類が限られている。
ここで本明細書において、歯髄幹細胞の幹細胞特性というとき、歯髄幹細胞が分化する事なしに、多分化能、および、細胞分裂能を維持する能力をいう。このような歯髄幹細胞の細胞特性は、CD146、SSEA-4、および、CD34からなる群から選択されるいずれか一つの発現が亢進しているか否かにより評価することができる。好ましい一実施の形態において、本発明により得られた歯髄幹細胞は、従来の歯髄幹細胞の単離方法(15%FBS含有培養液を用いたCFU-Fコロニー形成法)により得られた歯髄幹細胞と比較して、SSEA-4の発現が少なくとも亢進している。特に好ましい実施の形態においては、SSEA-4に加えて、さらに、CD146またはCD34の発現が亢進している。具体的には、(i) CD146およびSSEA-4の発現、または、(ii) SSEA-4およびCD34の発現が亢進した歯髄幹細胞を得ることができ、より好ましい実施の形態においては、CD146、SSEA-4、およびCD34の発現が亢進した歯髄幹細胞を得ることができる。
なお、本明細書において、SSEA-4などの表面抗原の発現が亢進しているとは、本発明の方法により得られる細胞群または細胞コロニーと、従来の方法(15%FBS含有培養液を用いたCFU-Fコロニー形成法)により得られる細胞群または細胞コロニーとにおいて特定の分子の発現を比較した際に、有意に発現の上昇を示すことを意味する。
ここで、「歯髄細胞」とは、歯髄組織より採取された歯髄細胞であって、歯髄組織より酵素処理等により回収して得られたものを使用することができる。歯髄組織より回収した歯髄細胞を凍結保存しておき、解凍により得られた歯髄細胞であってもよい。または、上述のように、歯髄組織自体を凍結保存しておき、解凍後に酵素処理等を行い回収した歯髄細胞であってもよい。好ましくは、歯髄組織より酵素処理等により回収して直ぐの歯髄細胞を用いる実施形態である。すなわち、本発明の好ましい一実施の形態としては、工程(a)において用いる歯髄細胞は、継代培養を行っていない細胞である。また歯髄組織より採取された歯髄細胞は、歯髄組織を酵素処理した後に70μmセルストレーナーなどの濾過工程により夾雑物が除かれ、細胞が選別されているものが好ましい。この工程により以降の培養における付着細胞の選別が可能または容易となり、最終的な歯髄幹細胞の効率的な単離に寄与できる。
また、本明細書において、「血清を含む培養液」というとき、培養液は間葉系幹細胞や歯髄細胞、歯髄幹細胞の培養に使用される公知の基本培地を用いることができる。このような基本培地としては、以下に限定されないが、例えば、alpha-MEMなどを用いることができる。基本培地には、得られる歯髄幹細胞の幹細胞特性の亢進を阻害しない限りにおいて、血清の他、抗生物質やグルタミン酸、アスコルビン酸などを含むことができる。
本明細書において、「歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる」とは、歯髄組織より回収した歯髄細胞を、培養液を含む培養ディッシュ上に播種して培養することにより、培養ディッシュ上に歯髄細胞を接着させることをいう。歯髄細胞が培養ディッシュ上に接着した状態となるためには、例えば、約3〜48時間、培養液中で培養することにより達成することができる。より好ましくは、約24〜48時間(48時間前後)の培養である。培養時間が短いと、付着細胞数が少なくなり、一方で培養時間が長いと、幹細胞以外の細胞も付着の可能性が生じる点において好ましくない。しかしながら、培養ディッシュ上に播種した歯髄細胞が培養ディッシュ上に接着する限りにおいて、時間は上記の範囲に限定されず、用いる歯髄細胞の状態や使用するディッシュ、培地などにより当業者は適宜好ましい時間を設定することができる。
工程(a)の前培養は、37℃、5% CO2条件下で行うことができる。
歯髄細胞を互いの細胞同士接着せずに、一細胞ごとに培養ディッシュ上に播種する方法は公知であり、当業者は適宜実施することができる。なお、具体的な一実施の形態としては、例えば、直径100 mmの培養ディッシュに対して、約0.1×106個の濃度で播種する形態を挙げることができる。また、当業者であれば、使用するディッシュ等により適宜濃度を調製して実施することができる。
ここで、工程(b)に用いる血清を含む培養液は、7〜13% (V/V)の範囲の血清濃度を含む培養液であることが好ましく、10%〜13% (V/V)の範囲の血清濃度を含む培養液であることがより好ましく、約10% (V/V)の範囲の血清濃度を含む培養液がさらに好ましい。培養液中の7〜13% (V/V)の血清濃度とすることで、培養後に得られるコロニー形成数、単離細胞数を向上させることができ、または、それらに加えて、幹細胞特性が亢進した歯髄幹細胞を得ることを可能とする。また、工程(b)に用いる血清を含む培養液は、工程(a)の培養に用いた培養液を捨て、新たに添加することで置換することができる。
または、工程(b)は、幹細胞用無血清培地を用いて培養を行うことができる。ここで、本発明に用いられる幹細胞用無血清培地とは、幹細胞の増殖性および幹細胞特性を維持できる培地である。幹細胞用無血清培地は、市販のものを用いることができ、特に間葉系幹細胞用の無血清培地であることが好ましい。このような幹細胞用無血清培地としては、以下に限定されないが、例えば、EXPREP MSC Medium(株式会社バイオミメティックスシンパシーズ)、STK2(登録商標)間葉系幹細胞用無血清培地(DSファーマバイオメディカル株式会社)、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF(Promo Cell)、Stemgro(登録商標) hMSC Medium (Corning)、MesenCult-SF、MesenCult-XF、MesenCult-ACF(STEMCELL Technologies)、TheraPEAK MSCGM-CD Mesenchymal Stem Cell Medium, Chemically Defined(Lonza)、PRIME-XV(登録商標) MSC Expansion XSFM、PRIME-XV(登録商標) MSC Expansion SFM(Irvine Scientific)、MSC NutriStem(登録商標)XF(Biological industries)、StemXVivo Xeno-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivo Serum-Free Human MSC Expansion Media(R&D Systems)、StemMACS MSC Expansion Media kit XF, Human(Miltenyi Biotec)、MesenPRO MSC SFM、MesenPRO MSC SFM XenoFree(Gibco)、FibroGRO Xeno-Free Human Fibroblast Expansion Medium(Merck)、PL SOLUTION、PL SOLUTION GMP grade(PL BioScience)などを挙げることができる。
また、工程(b)における、血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を用いた歯髄細胞の培養は、少なくとも1日(24時間)行うことができる。工程(b)の培養期間は、幹細胞を調製できる限りにおいて特に限定されないが、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日とすることができる。
ここで、(b)の工程で用いた血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を、交換せずにそのまま工程(c)の培養に用いて連続的に培養を行うこともできる。このとき、用いた血清濃度等にも依るが、工程(b)の培養開始時点から約3日、4日程度で、培養液は、「低血清状態」および/または「低栄養状態」になると考える。
なお、工程(b)の培養は、37℃、5% CO2条件下で行うことができる。
ここで、「低血清状態」とは、培養液中に含まれる血清の濃度が低く、血清の作用のうち特に、歯髄幹細胞以外の培養細胞に対する細胞増殖作用を実質的に有さず、歯髄幹細胞の幹細胞特性を維持もしくは亢進可能な程度の血清濃度しか含まない状態をいう。このような低血清状態での培養としては、以下の形態に限定されないが、例えば、血清を含む培養液を交換せずに、3日以上培養に用いた培養液でそのまま培養する形態(以下に制限されないが、例えば15%(V/V)FBS含有培地10ml中で0.1×106個の細胞を少なくとも3日以上培養した培養液で継続して培養する形態など)や、血清を含まない培養液を用いて培養する形態が含まれる。また、幹細胞用無血清培地を用いて細胞を培養した場合には、「無血清状態」となる。
また、工程(c)の培養は、歯髄幹細胞の付着コロニーが得られる限りにおいて以下に限定されないが、例えば、少なくとも3日間行うことができる。工程(c)の培養は、37℃、5% CO2条件下で行うことができる。
上記のような工程(c)の培養を行うことで、培養ディッシュ上に、歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させることができる。
ここで、「低栄養状態」とは、栄養飢餓状態に耐性のない細胞を死滅させることが可能である一方、栄養飢餓状態に耐性のある歯髄幹細胞を生存させて、歯髄幹細胞の割合を高めることが可能な状態をいう。
工程(c)において、「低血清状態または無血清状態」かつ「低栄養状態」で歯髄細胞を培養する際には、以下の形態に限定されないが、例えば、培養液を交換せずに、3日以上細胞培養に用いた培養液で培養する形態(以下に制限されないが、例えば15%(V/V)FBS含有培地10ml中で0.1×106個の細胞を少なくとも3日以上培養した培養液で継続して培養する形態など)や、血清および糖などの栄養成分を含まない、もしくは、低濃度で含む培養液(生理的等張緩衝塩溶液など)を用いて培養する形態が含まれる。このように、「低血清状態」に加えて、「低栄養状態」で歯髄細胞を培養することにより、最終的に得られる歯髄幹細胞の割合を向上させることができる点において好ましい。
本発明の一実施の形態としては、「前記工程(c)が、前記工程(b)で用いた血清を含む培養液を、新しい培養液に交換をせずにそのまま歯髄細胞を培養する」ことを含む。このような実施の形態によれば、培地交換の作業を不要とし、簡便に歯髄幹細胞の調製・単離を行うことができる点において好ましい。また、このとき工程(b)および(c)の培養は、歯髄幹細胞を調製できる限りにおいて制限されないが、例えば、約1週間(168時間)を目安に行うことができる。また、一実施の形態として、この培養期間は少なくとも168時間以上とすることができる。
本発明の一実施の形態においては、「工程(a)の後であって、かつ、工程(b)の前に、(a’)培養液を交換するための洗浄工程」、または、「工程(b)の後であって、かつ、工程(c)の前に、(b’)培養液を交換するための洗浄工程」の少なくとも一つの工程をさらに含むことができる。「工程(a)の後であって、かつ、工程(b)の前に、(a’)培養液を交換するための洗浄工程」を行うことで接着細胞をより効率的に選別できる。
治療用移植材に含まれる歯髄幹細胞は、本発明の歯髄幹細胞の調製方法により調製された歯髄幹細胞をそのまま含んでもよいし、所望の治療用途に適した状態とするため当該歯髄幹細胞をさらに特定の条件下で培養、分化誘導等した歯髄幹細胞を含んでもよい。歯髄細胞または歯髄幹細胞を治療用途の移植材等に調製する方法としては、以下に限定されないが、例えば、国際公開第2014/185470号に記載の神経損傷の治療用移植材の製造方法などを参考にして実施することもできる。
治療用移植材は、対象とする部位に注射器等により注入してもよいし、対象とする部位を切開して、直接配置してもよく、対象の疾患や部位に応じて好ましい形態で使用することができる。また、治療用移植材は、免疫抑制剤や他の医薬と併用して使用してもよい。
ドナーの異なるヒト抜去乳歯3本を準備した。ヒト抜去乳歯は、株式会社セルテクノロジー(旧株式会社再生医療推進機構)より供与された。採取した歯髄組織は、alpha-MEM中でメス(Kai Medical社製、Surgical Brade No.23)にて細断した。細断した歯髄組織を4%ディスパーゼ(合同酒精)3mLと3%コラゲナーゼ(Worthington Biochemicals)3mLの混合酵素液(ともに滅菌PBSにて溶解)(計6mL)にて37℃、60分間、酵素処理した。酵素処理の後、15%FBS(Equitech-Bio社製、SFBM30-2301)含有alpha-MEM(Life Technology社製)を6mL添加し、十分に混和した後、酵素処理液を70μmセルストレーナー(BD Bisoscience社製)で濾過し、夾雑物を取り除いた。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和した。得られた溶液中の細胞は、細胞数を計測した後、下記のようにFBS濃度を変えた3種の培養液を用いて、前培養を含む二段階の培養方法により培養を行った。なお、培養液中のFBS濃度は、二段階の培養方法の間で、同一の濃度とした。
その結果、1週間の培養を行うことで、培養ディッシュに付着した細胞から、コロニーの形成を顕微鏡下で確認することができた。得られた付着コロニーについて、以後の試験でコロニー形成数や細胞数の確認を試みた。
上記実施例1の培養により得られた付着コロニーについて、下記のように、CFU-F解析を行った。
具体的には、実施例1の培養後、培養液を捨て、3mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。培養ディッシュをPBS緩衝4%パラフォルムアルデヒド(pH7.4)にて、室温、15分間固定処理を行った。固定処理の後、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、PBS緩衝0.5%トルイジンブルー液で、室温、2晩染色処理を行った。染色工程の後、蒸留水で洗浄後、室温で乾燥を行った。また、培養ディッシュ中の付着コロニーを、スライドスキャナを用いてスキャニングし、付着コロニー数を計測した。
次に、各FBS濃度で二段階培養した際の、培養ディッシュ内に形成したCFU-Fコロニーに含まれる細胞数への影響を確認するため、以下の試験を行った。
上記実施例1の培養により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、洗浄に用いたPBSを捨て、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTAを含む混合溶液(ナカライテスク)1 mL加え、37℃、5分間、酵素処理を行った。4 mLの5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。このとき、FBS含有alpha-MEM培地中のFBS濃度は、培養に用いた濃度と一致させた。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。以下、5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地を用いたそれぞれの群を、5% FBS群、10% FBS群、または、15% FBS群という。その結果を図1C及び図1Dに示す。
図1Cは、培養ディッシュ1枚に含まれる細胞数の計測結果を示す。培養ティディッシュ上の細胞の総数を計測したところ、図1Cに示すように、10%FBS濃度の培養液を用いた単離群が、5%、または、15% FBS濃度の培養液を用いた群のいずれに対しても、有意に細胞数が多かった(p=0.0004 vs. 15%FBS群;p=0.000004vs. 5% FBS群)(図1C)。
図1Dは、上記で計測した培養ディッシュ上の細胞の総数をコロニー数で割った値を示す。その結果、15% FBS群、または、10% FBS群では、ほぼ同等の細胞数が得られた(図1D)。一方、5% FBS群では、15% FBS群または10% FBS群と比較すると、細胞数は有意に少なかった(p=0.0006 vs. 15%FBS群;p=0.000003vs. 10% FBS群)。
上記実施例1に記載の培養方法により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTAの混合溶液(ナカライテスク)1 mL 加え、37℃、5分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1mLのalpha-MEMで十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。15%、10%、または、5% FBS含有alpha-MEM培養液200 mLを含む96-wellプレートに対して、1 well当たり10×103個の濃度となるように有核細胞を播種した。培養は、37℃、5%CO2条件下で培養を行った。培養開始後1日目に、Brd-U試薬(Roche社製)を添加した。Brd-U試薬添加から24時間経過後、Cell Proliferation ELISA(Roche社製)を用いて培養細胞を処理し、マイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を解析した。
次に、10% FBS含有培養液下で細胞増殖解析のための培養を行ったところ、10% FBS前培養群が最も高い細胞増殖能を示した。10% FBS前培養群は15% FBS前培養群と比較して有意に(p=0.006 vs. 15% FBS群)細胞増殖能が上昇していた。一方、5% FBS前培養群とは差が認められなかった(図2B)。
また、5%FBS含有培養液で細胞増殖解析のための培養を行った試験では、10%FBS前培養群が最も高い細胞増殖能を示したが、5% FBS全培養群、または15%FBS全培養群との有意差は認められなかった(図2C)。
さらに、前培養およびコロニー形成に用いたFBS濃度と同一のFBS濃度で増殖能解析のための培養を行ったところ、10%FBS群が最も高い細胞増殖能を示した。10% FBS群は15% FBS群と比較して有意に(p=0.006 vs. 15%FBS群)細胞増殖能が上昇していた。一方、5% FBS単離群とは差が認められなかった(図2D)。
上記実施例1の培養により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1 mM EDTAの混合溶液(ナカライテスク)1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。4 mLの5%、10%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地(前培養およびコロニー形成に用いたものと同一のFBS濃度を使用)を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEM で十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。次に、直径100 mmの培養ディッシュに対して、0.1×106個の濃度となるように有核細胞を播種した。各単離群は、単離時に用いた培養液と同一のFBS濃度を有する培養液10 mL を用いて、37℃、5% CO2の条件下で培養を行った。培養中は、3日毎に培地交換を行った。培養開始後10日目に細胞を培養ディッシュより剥離、回収した。具体的には、下記のように行った。培養後の培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを3回洗浄し、その後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTAの混合溶液(ナカライテスク)1 mL 加え、37℃、5分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和することにより細胞を回収した。回収した細胞は、FACS用チューブ(BD Bioscience)に0.1×106cells/100 micro-L PBSとなるように分注した。分注後、CD146、CD105、CD73、CD90、CD29、SSEA-4、HLA-DR、CD34、CD45、および、CD14に対する蛍光標識抗体(Biolegend)1 micro-g/mLを氷上で45分反応させ免疫染色を行い、フローサイトメータであるFACS Verseにて解析を行った。
多能性幹細胞のマーカーであるSSEA-4は各FBS濃度群とも陽性を示した。15% FBS群では35.06±0.12%、10% FBS群では42.23±0.23%、5% FBS濃度単離群では26.00±0.27%であり、各FBS濃度群の間で違いが認められ、10%FBS群は他のFBS濃度群と比較して有意にSSEA-4の発現が上昇(p=0.000001 vs. 15% FBS 群, 10% FBS群)していた(図3B)。
従って、CFU-F コロニー形成を基盤とした単離法で得る乳歯歯髄組織由来の細胞は、間葉系幹細胞に属する細胞であると見なされる。5% FBS培地単離群でも同様の表現型が観察された。
また、本試験では、いずれのFBS濃度による単離細胞群においても、CD146の発現が認められた。興味あることに、10%FBS単離群が他の濃度の単離群と比べて有意に増加していた。従って、15%および5% FBS単離群と比較して、10% FBS単離乳歯幹細胞群は、早期の幹細胞をより多く含む可能性が示唆される。
また、本研究では、SSEA-4の発現が、他の濃度の単離群と比べて10% FBS 単離群において有意に増加していた。従って、10% FBS含有培地で単離することにより、従来の方法(15% FBS 使用)より、原始的で、幹細胞特性の亢進した乳歯幹細胞群を単離する事が可能と示唆される。
(実施例6.歯髄細胞単離およびCFU-Fコロニー形成法)
ドナーの異なるヒト抜去乳歯3本を準備した。ヒト抜去乳歯は、株式会社セルテクノロジーより供与された。採取した歯髄組織は、alpha-MEM中でメス(Kai Medical社製、Surgical Brade No.23)にて細断した。細断した歯髄組織を4% ディスパーゼ(合同酒精、typeII)3 mLと3% コラゲナーゼ(Worthington Biochemicals)3 mLの混合酵素液(ともに滅菌PBSにて溶解)(計6 mL)にて37℃、60分間、酵素処理した。酵素処理の後、15% FBS(Equitech-Bio社製、SFBM30-2301)含有alpha-MEM(Life Technology社製)を6 mL添加し、十分に混和した後、酵素処理液を70 μmセルストレーナー(BD Bisoscience社製)で濾過し、夾雑物を取り除いた。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1 mLのalpha-MEMで十分に混和した。得られた溶液中の細胞は、細胞数を計測した後、下記のようにFBS濃度を変えた5種の培養液を用いて、前培養を含む二段階の培養方法により培養を行った。なお、培養液中のFBS濃度は、二段階の培養方法の間で、同一の濃度とした。
その結果、1週間の培養を行うことで、培養ディッシュに付着していた細胞から、コロニーの形成を顕微鏡下で確認することができた。得られた付着コロニーについて、以後の試験でコロニー形成数や細胞数の確認を試みた。
上記実施例6の培養により得られた付着コロニーについて、下記のように、CFU-F解析を行った。
具体的には、実施例6の培養後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、当該洗浄工程を3回繰り返した。培養ディッシュをPBS緩衝4% パラフォルムアルデヒド(pH7.4)にて、室温、15分間固定処理を行った。固定処理の後、3mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄し、洗浄工程を3回繰り返した。洗浄工程の後、PBS緩衝0.5% トルイジンブルー液で、室温、2晩染色処理を行った。染色工程の後、蒸留水で洗浄後、室温で乾燥を行った。また、培養ディッシュ中の付着コロニーを、スライドスキャナを用いてスキャニングし、付着コロニー数を計測した。
上記実施例6に記載の培養方法により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1 mM EDTAの混合溶液(ナカライテスク)1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEM で十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。15% FBS含有alpha-MEM培養液、または、前培養に用いたFBS濃度と同じ濃度のFBS含有alpha-MEM培養液200 mLを含む96-wellプレートに対して、1 well当たり10×103個の濃度となるように有核細胞を播種した。培養は、37℃、5% CO2条件下で培養を行った。培養開始後1 日目に、Brd-U試薬(Roche社製)を添加した。Brd-U 試薬添加から24時間経過後、Cell Proliferation ELISA(Roche 社製を用いて培養細胞を処理し、マイクロプレートリーダーを用いて細胞増殖を解析した。
この結果は、従来の15% 濃度や5% 濃度を用いた単離方法より13%、10%、7% FBS濃度を用いた単離方法が優れた細胞増殖能を付与できることを示す。
上記実施例6の培養により付着コロニーが形成されたことを確認した後、培養液を捨て、3 mL滅菌PBSで培養ディッシュを洗浄した。当該洗浄工程は3回繰り返した。洗浄工程の後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1 mM EDTAの混合溶液(ナカライテスク)1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。4 mLの5%、7%、10%、13%、または、15% FBS含有alpha-MEM培地(前培養およびコロニー形成に用いたものと同一のFBS濃度を使用)を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行った。遠心処理後、上清を捨て、1 mLのalpha-MEM で十分に混和した。その後、細胞数の計測を行った。次に、直径100mm の培養ディッシュに対して、0.1×106個の濃度となるように有核細胞を播種した。各単離群は、コロニー形成時に用いた培養液と同一のFBS濃度を有する培養液10 mL を用いて、37℃、5%CO2の条件下で培養を行った。培養中は、3日毎に培地交換を行った。培養開始後10日目に細胞を培養ディッシュより剥離、回収した。細胞の剥離および回収は、具体的には下記のように行った。培養後の培養液を捨て、3mL滅菌PBSで培養ディッシュを3回洗浄し、その後、2.5g (W/V)トリプシンおよび1mM EDTA 溶液(ナカライテスク)1 mL 加え、37℃、5 分間、酵素処理を行った。酵素処理の後、4 mLの15% FBS含有alpha-MEM培地を加え、懸濁した。その後、2,000 rpm、4℃にて遠心処理を行い、上清を捨て、1mLのalpha-MEMで十分に混和することにより細胞を回収した。回収した細胞は、FACS用チューブ(BD Bioscience)に0.1×106cells/100micro-L PBSとなるように分注した。分注後、SSEA-4に対する蛍光標識抗体(Biolegend)1 micro-g/mLを氷上で45分反応させ免疫染色を行い、フローサイトメーターであるFACS Verseにて解析を行った。なお、標的表面抗原として、SSEA-4の抗原を解析対象とした。
Claims (15)
- 歯髄組織より採取した歯髄細胞から歯髄幹細胞を調製する方法であって、
(a)前記歯髄細胞を、7〜13%(V/V)で血清を含む培養液を用いて前培養する工程であって、前記歯髄細胞を培養ディッシュ上に付着させる工程と、
(b)前記工程(a)により培養ディッシュ上に付着した歯髄細胞を、7〜13%(V/V)で血清を含む培養液、または、幹細胞用無血清培地を用いて少なくとも1日培養する工程と、
(c)前記工程(b)の後に、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態で培養する工程と
を含む、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記工程(c)が、前記歯髄細胞を、低血清状態または無血清状態、かつ、低栄養状態で培養する工程である、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1または2に記載の方法であって、
前記工程(a)の前に、前記歯髄細胞を、培養ディッシュ上で、他の細胞と接着しないように播種する工程を含み、これにより一細胞に由来する細胞コロニーを形成させる、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(a)および(b)に用いる血清がFBSである、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(a)および/または(b)に用いる培養液が、10〜13%(V/V)で血清を含む培養液である、SSEA-4の発現が亢進した歯髄幹細胞を含む細胞コロニーを形成させる、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(a)の前に、前記歯髄組織を酵素処理することにより前記歯髄細胞を調製する工程をさらに含む、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(a)の後であって、かつ、前記工程(b)の前に、(a’)培養液を交換するための洗浄工程をさらに含む、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(c)が、前記工程(b)で用いた血清を含む培養液または幹細胞用無血清培地を、新しい培養液に交換せずにそのまま用いて歯髄細胞を培養する工程である、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項8に記載の方法であって、
前記工程(b)および(c)の培養時間の合計が、少なくとも168時間である、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(a)において、培養ディッシュ上に播種された歯髄細胞が、0.01×106〜0.1×106cells/mlの濃度で培養液中に含まれる、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程(a)の前培養時間が24〜48時間である、歯髄幹細胞の調製方法。 - 請求項1〜11のいずれか一項に記載の調製方法により調製した歯髄幹細胞を用いて治療用移植材を製造する工程を含む、治療用移植材の製造方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により得られた歯髄幹細胞であって、SSEA-4の発現が亢進している単一の細胞コロニー由来の歯髄幹細胞。
- 請求項13に記載の歯髄幹細胞であって、
前記細胞コロニーが、SSEA-4に加えて、さらにCD146またはCD34の発現が亢進したものである、歯髄幹細胞。 - 請求項13または14に記載の歯髄幹細胞を含む、治療用移植材。
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