CN109897821A - 一种牙髓干细胞分离及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牙髓干细胞分离及培养方法，包括以下步骤：牙髓组织的分离、用质量体积浓度均为0.05‑0.5％的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合酶对牙髓组织进行酶解、牙髓干细胞原代培养、在培养基中添加细胞生长因子、谷氨酰胺、复合维生素、胰岛素、银耳多糖、川党参提取物、铁皮石斛提取物等多种营养成分。本发明具有以下优点：牙髓组织消化更彻底，获得的牙髓干细胞总数更多；增加了牙髓干细胞获得总数，提高了牙髓干细胞的细胞活率，同时缩短其传代时间，大大缩短了牙髓干细胞分离培养的周期。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓干细胞分离培养方法。
背景技术
近年来，牙源性干细胞作为组织工程的种子细胞，引起了广泛的关注与重视，其不仅可用于口腔组织的再生，也适用于非口腔组织如骨和神经等组织的再生。牙源性干细胞不仅具有优越的干细胞特性，还可以从医疗废弃物(如正畸牙、智齿等)中高效获得。
研究发现，牙髓衍生细胞具有与骨髓间充质细胞相似的功能，其可以在体内修复再生牙髓牙本质复合体。将牙髓衍生细胞与骨髓间充质干细胞相比较发现，在牙髓中细胞增生和形成克隆细胞的速度显著的高于骨髓。牙髓干细胞具有一定的向牙体组织、脂肪组织和肌肉组织分化的潜能。依据这些特点，牙髓干细胞被归列为多能成体干细胞，其在牙髓再生和其他组织再生的治疗用途方面也得到了更多的关注。
因此，有效地从牙髓中分离干细胞的方法变得极其重要，目前牙髓干细胞的分离方法主要有组织培养法，酶解法和酶解组织培养法。而酶解法和酶解组织培养法主要使用I型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的混合酶酶解，其酶解时间较长，且消化不完全，得到牙髓干细胞总数量少；同时，原代细胞传代耗时较长，传代细胞活率较低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法。该方法得到的牙髓干细胞数量多，且细胞活力强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从牙齿样本的髓腔中抽取牙髓，用缓冲液清洗；
(2)向上述清洗后的牙髓组织中加入2-35倍体积的混合酶，进行酶解；所述混合酶为质量体积浓度均为0.05-0.5％的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合液；37℃，酶解至牙髓组织完全消化不见后，离心去除上清液，得到酶解后的牙髓细胞；
(3)向上述酶解后的牙髓细胞中加入磷酸缓冲液，吹打均匀后，过网筛，去除未消化完全的组织块，离心去除上清液，离心后的沉淀既是牙髓干细胞；
(4)向上述离心后的沉淀中加入培养基，进行原代培养；所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为α-MEM培养基；所述添加物包括细胞生长因子、谷氨酰胺、复合维生素、胰岛素、硫辛酸、丙二醇、氯化钠、银耳多糖、川党参提取物、铁皮石斛提取物。
(5)待牙髓干细胞传代至2代，每2天换液一次，当细胞汇合度为85％～90％时，用胰酶进行消化。
优选地，所述步骤(2)中的混合酶为质量体积浓度均为0.2％的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合液。
优选地，所述步骤(2)中酶解时间为4-8h。
优选地，所述步骤(2)、(3)中离心条件为50-200rpm，离心5-10min。
优选地，所述步骤(4)中所述原代培养采用以下方法：将所得牙髓干细胞接种至培养基进行细胞培养，每2天换液一次，当细胞汇合度为70％～80％时进行传代培养。
优选地，所述步骤(4)中细胞培养基的添加物包括：细胞生长因子1-10mg/L、谷氨酰胺2-8g/L、复合维生素2-5g/L、胰岛素5-20g/L、硫辛酸3-10g/L、丙二醇1-5g/L、氯化钠2-6g/L、银耳多糖13-20g/L、川党参提取物6-18g/L、铁皮石斛提取物5-10g/L。
优选地，所述步骤(4)中细胞培养基的添加物包括：细胞生长因子5mg/L、谷氨酰胺4g/L、复合维生素3g/L、胰岛素10g/L、硫辛酸6g/L、丙二醇3g/L、氯化钠4g/L、银耳多糖16g/L、川党参提取物12g/L、铁皮石斛提取物8g/L。
优选地，所述川党参提取物或铁皮石斛提取物采用以下方法制得：将川党参或铁皮石斛研磨过筛，然后注入乙醇溶液真空浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥、粉碎，即得川党参提取物或铁皮石斛干细胞提取物。
优选地，所述细胞生长因子为EGF表皮生长因子。
优选地，所述步骤(5)中传代细胞胰酶质量体积浓度为0.01-0.025％，消化时间为1-2min。
本发明的有益效果：本发明选用Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合酶对牙髓组织进行消化，与I型胶原酶酶解或I型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的混合酶相比，牙髓组织消化更彻底，获得的牙髓干细胞总数更多。同时，本发明在细胞培养基中添加了多种营养成，如细胞生长因子，能加快细胞的生长；铁皮石斛提取物能提高细胞活率等。因此，本发明能提高牙髓干细胞获得总数，同时缩短其传代时间，大大缩短了牙髓干细胞分离培养的周期。
附图说明
图1为本发明牙髓干细胞状态图，其中A是实施例9的牙髓干细胞的形态(P2，100倍)，B是实施例10的牙髓干细胞的形态(P2，100倍)；
图2是实施例10的牙髓干细胞油红O染色检测成脂分化图(400倍)；
图3是实施例10的牙髓干细胞茜素红染色检测成骨分化图(40倍)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。
实施例1
(1)提取牙髓组织：选用健康大白兔为实验对象，雌雄随机，兔龄6个月。大白兔在局麻的状态下拔出一颗磨牙，转移至预冷高浓度双抗中(双抗：链霉素及青霉素)，浸泡10min，进行消毒，用PBS液反复冲洗3次，然后破牙冠，从牙齿样本的髓腔中抽取牙髓，把牙髓组织剪成0.4×0.4mm的块状。
(2)将上述牙髓组织中置于2倍体积的混合酶，进行酶解；所述混合酶为质量体积浓度均为0.05％的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合液；37℃，消化4h，消化至牙髓组织完全消化不见后，200rpm，离心5min去除上清液，得到酶解后的牙髓细胞。
(3)向上述酶解后的牙髓细胞中加入磷酸缓冲液，吹打均匀后，过100μm网筛，去除未消化完全的组织块，50rpm，离心10min去除上清液，离心后的沉淀既是牙髓干细胞。
(4)将向上述离心后的沉淀加入到培养基，进行原代培养，将所得牙髓干细胞接种至培养基进行细胞培养，每2天换液一次，当细胞汇合度为70％～80％时进行传代培养；
所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为α-MEM培养基；所述添加物包括EGF表皮生长因子1mg/L、谷氨酰胺2g/L、复合维生素2g/L、胰岛素5g/L、硫辛酸3g/L、丙二醇1g/L、氯化钠2g/L、银耳多糖13g/L、川党参提取物6g/L、铁皮石斛提取物5g/L。
(5)牙髓干细胞传代到第2代，汇合度在85～90％时，用PBS清洗两遍后，加入3mL0.25％胰酶，消化时间2min；加入5mL含5％FBS的培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。把细胞悬液转移至50mL离心管中，500g离心5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20mL的生理盐水重悬细胞，500g离心5min，弃上清液，即得牙髓干细胞。
实施例2
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)向上述清洗后的牙髓组织中加入10倍体积的混合酶。
实施例3
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)向上述清洗后的牙髓组织中加入20倍体积的混合酶。
实施例4
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)向上述清洗后的牙髓组织中加入30倍体积的混合酶。
实施例5
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)向上述清洗后的牙髓组织中加入35倍体积的混合酶。
实施例6
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)混合酶中Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的质量体积浓度均为0.2％。
实施例7
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)混合酶中Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的质量体积浓度均为0.5％。
实施例8
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)酶解时间为8h。
实施例9
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(4)培养基中添加物包括：EGF表皮生长因子5mg/L、谷氨酰胺4g/L、复合维生素3g/L、胰岛素10g/L、硫辛酸6g/L、丙二醇3g/L、氯化钠4g/L、银耳多糖16g/L、川党参提取物12g/L、铁皮石斛提取物8g/L。
实施例10
本实施例与实施例1的唯一区别为：所述步骤(4)培养基中添加物包括：EGF表皮生长因子10mg/L、谷氨酰胺8g/L、复合维生素5g/L、胰岛素20g/L、硫辛酸10g/L、丙二醇5g/L、氯化钠6g/L、银耳多糖20g/L、川党参提取物18g/L、铁皮石斛提取物10g/L。
对比例1
对比例1与实施例1的唯一区别为：所述步骤(2)进行酶解使用的是质量体积浓度均为0.05％的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和胰酶的混合液。
对比例2
对比例2与实施例1的唯一区别为：培养基为α-MEM培养基。
对比例3
对比例3与实施例1的唯一区别为：培养基为DMEM培养基。
对比例4
对比例4与实施例1的唯一区别为：培养基中不添加川党参提取物和铁皮石斛提取物。
将实施例1-10和对比例1-4制备的牙髓干细胞进行检测
1、细胞活率检测
检测实施例1-10和对比例1-4的活细胞数量、总细胞数量以及细胞汇合度达到80％所需要的时间，每组试验重复3次，取平均值，计算细胞活率，计算公式为：
细胞活率＝(活细胞数量/总细胞数量)×100％。结果如下表所示：
表1细胞活率检测结果
由上表可知，与对比例1相比本发明选用的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合酶对牙髓组织进行消化，获得细胞总数较多，说明Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶对牙髓组织消化得更彻底；与对比例2、3相比，由于本发明的细胞培养基中添加了多种营养成分，有利于细胞的生长，因此，获得的活细胞总数更多；与对比例4相比，由于本发明的培养基中添加了川党参提取物、铁皮石斛提取物等中药成分，提高了干细胞的活性，因此缩短了干细胞的传代时间，同时节省了整个牙髓干细胞分离培养的时间，降低了由于牙髓干细胞分离培养周期较长而产生其他污染的风险。由上表可见实施例10获得的细胞总数和活细胞数量最多，其细胞活率最高，且细胞汇合度达到80％所需要的时间最短，因此，实施例10为本发明的最佳实施例。
2、牙髓干细胞形态对比
将实施例9、10制备的牙髓干细胞对其直径和活力进行检测和观察，结果如图1所示，获得的细胞大小均匀，遮光性强，呈长梭型，鲜少见到分枝状细胞，符合干细胞的形态特征，说明了牙髓干细胞并没有出现体积变大等异常现象，活性较强。
3、牙髓干细胞体外分化为成骨细胞、脂肪细胞的潜能
将本发明实施例10的牙髓干细胞传代扩增至P6代，使用LONZA的成脂，成骨检测试剂盒对P6代牙髓干细胞进行分化检测。
检测结果表明，本发明实施例10的牙髓干细胞能有效的分化成脂肪细胞，从图2可见有较多被油红O染色的脂滴，证明分离获得的牙髓干细胞有较好的成脂分化能力。从图3可见有较多被茜素红染色的钙结节，证明分离获得的牙髓干细胞有较好的成骨分化能力。因此，本发明分离培养牙髓干细胞体外方法可以有效的保持牙髓干细胞的多向分化能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从牙齿样本的髓腔中抽取牙髓，用缓冲液清洗；
(2)向上述清洗后的牙髓组织中加入2-35倍体积的混合酶，进行酶解；所述混合酶为质量体积浓度均为0.05-0.5％的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合液；37℃，酶解至牙髓组织完全消化不见后，离心去除上清液，得到酶解后的牙髓细胞；
(3)向上述酶解后的牙髓细胞中加入磷酸缓冲液，吹打均匀后，过网筛，去除未消化完全的组织块，离心去除上清液，离心后的沉淀既是牙髓干细胞；
(4)向上述离心后的沉淀中加入培养基，进行原代培养；所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为α-MEM培养基；所述添加物包括细胞生长因子、谷氨酰胺、复合维生素、胰岛素、硫辛酸、丙二醇、氯化钠、银耳多糖、川党参提取物、铁皮石斛提取物。
(5)待牙髓干细胞传代至2代，每2天换液一次，当细胞汇合度为85％～90％时，用胰酶进行消化。
2.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的混合酶为质量体积浓度均为0.2％的Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶和胰酶的混合液。
3.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶解时间为4-8h。
4.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中离心条件为50-200rpm，离心5-10min。
5.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述原代培养采用以下方法：将所得牙髓干细胞接种至培养基进行细胞培养，每2天换液一次，当细胞汇合度为70％～80％时进行传代培养。
6.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中细胞培养基的添加物包括：细胞生长因子1-10mg/L、谷氨酰胺2-8g/L、复合维生素2-5g/L、胰岛素5-20g/L、硫辛酸3-10g/L、丙二醇1-5g/L、氯化钠2-6g/L、银耳多糖13-20g/L、川党参提取物6-18g/L、铁皮石斛提取物5-10g/L。
7.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中细胞培养基的添加物包括：细胞生长因子5mg/L、谷氨酰胺4g/L、复合维生素3g/L、胰岛素10g/L、硫辛酸6g/L、丙二醇3g/L、氯化钠4g/L、银耳多糖16g/L、川党参提取物12g/L、铁皮石斛提取物8g/L。
8.如权利要求1、6、7任一项所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述川党参提取物或铁皮石斛提取物采用以下方法制得：将川党参或铁皮石斛研磨过筛，然后注入乙醇溶液真空浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥、粉碎，即得川党参提取物或铁皮石斛干细胞提取物。
9.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述细胞生长因子为EGF表皮生长因子。
10.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤(5)中传代细胞胰酶质量体积浓度为0.01-0.025％，消化时间为1-2min。
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