CN103060264A - 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽。所述干细胞培养基适合于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。该培养基能让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能。采用该干细胞培养基与普通培养基相比，不仅能更快速扩增不同来源的干细胞，延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。

Description

一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法。
背景技术
诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制及探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。
干细胞尽量含量甚微，但广泛分布于哺乳动物的各个组织器官，这些组织或器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤等。大量研究表明，这些低含量的干细胞可在体外通过适当的方法进行进一步扩增，最常规的一种培养干细胞的培养基就是添加有胎牛血清的培养基。然而，采用这种培养基培养的干细胞，不仅生长比较缓慢，而且传递次数超过5代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低，牛血清批次存在潜在的不重复性也大大影响了其规模化；另一方面，牛血清相对于人是异源性的东西，从而限制了其在临床上的应用。因此，探索快速扩增干细胞而又不影响其潜能的培养条件及其培养基组成的优化组合是非常重要的研究内容。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，旨在解决采用现有添加有牛血清的培养基培养干细胞存在生长缓慢且细胞潜能会传代次数的增加而大大降低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺；
所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、 干细胞因子、转铁蛋白和人血清白蛋白；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E；
所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物；
所述盐类包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠；
所述干细胞培养基还包括抗氧化剂、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。
所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下组分：
丙氨酸       0.01~0.25mM
精氨酸       0.4~10 mM
天冬酰胺     0.11~2.75 mM
天冬氨酸     0.03~0.75 mM
半胱氨酸     0.03~0.75 mM
谷氨酸       0.03~0.75 mM
甘氨酸       0.05~1.25 mM
组氨酸       0.03~0.75 mM
异亮氨酸     0.5~12.5 mM
亮氨酸       0.24~6 mM
赖氨酸       0.2~5 mM
甲硫氨酸     0.12~3 mM
苯丙氨酸     0.21~5.25 mM
脯氨酸       0.004~0.1 mM
丝氨酸       0.15~3.5 mM
苏氨酸       0.06~1.5 mM
色氨酸       0.02~0.5 mM
酪氨酸       0.03~0.75 mM
缬氨酸       0.28~7 mM
谷氨酰胺     0.8~20 mM
表皮生长因子            1-10 mg/L
纤维细胞生长因子1       1-10 mg/L
纤维细胞生长因子2       1-10 mg/L
胰岛素样生长因子1       1-10 mg/L
白细胞因子               1-10 mg/L
血小板衍生生长因子       1-10 mg/L
胎盘生长因子             1-10 mg/L
干细胞因子               1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子     1-10 mg/L
胰岛素           1~25 mg/L
转铁蛋白         4~100 mg/L
人血清白蛋白     0.02~0.5 g/L
生物素            6~150mM
氯化胆碱         12~300mM
叶酸             1.2~30mM
辅酶Q10         0.2~5mM
地塞米松         2~50 nM
D-泛酸钠         1~25mM
肌醇             14~350mM
烟酰胺           4~100mM
吡哆醇盐酸盐     0.03~0.75mM
核黄素           0.11~2.75mM
盐酸硫氨         0.11~2.75mM
维生素B12       0.1~2.5mM
腐胺二盐酸盐     0.1~2.5mM
维生素C         2~50 mg/L
维生素E         0.05~1.25 mg/L
肝素钠           0.08~2 g/L
D-葡萄糖         3.6~90 mM
还原性谷胱甘肽   0.0002~0.005 mg/L
牛磺酸        0.00144~0.36 g/L
β-巯基乙醇    0.01~0.25mg/L
酚红          1.62~40.5 mg/L
油酸          0.5~12.5 mg/L
亚油酸        0.5~7.5 mg/L
硫辛酸        0.02~0.5 mg/L
脂质混合物    0.2~5 ml/L
胆固醇        1~25 mg/L
乙醇胺        12~300ml/L
碳酸氢钠      2.32~58 mM
氯化钙        0.0168~0.42 mM
氯化钾        0.832~20.8 mM
氯化镁        0.06~1.5 mM
硫酸镁        0.0814~2.035 mM
氯化钠        24.122~603.55 mM
磷酸二氢钠     0.0906~2.265 mM
磷酸氢二钠      0.1~2.5 mM
丙酮酸钠        0.1~2.5 mM 。
所述的干细胞培养基，其中，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下组分：
丙氨酸        0.05 mM
精氨酸        2.00 mM
天冬酰胺      0.55 mM
天冬氨酸      0.4 mM
半胱氨酸      0.15 mM
谷氨酸        0.15 mM
甘氨酸        0.25 mM
组氨酸        0.15 mM
异亮氨酸      2.50 mM
亮氨酸        1.20 mM
赖氨酸        1.00 mM
甲硫氨酸      0.60 mM
苯丙氨酸      1.05 mM
脯氨酸        0.02 mM
丝氨酸        0.70 mM
苏氨酸        0.30 mM
色氨酸        0.10 mM
酪氨酸        0.15 mM
缬氨酸        1.4 mM 
谷氨酰胺      4 mM
表皮生长因子  1-10 mg/L
纤维细胞生长因子1     1-10 mg/L
纤维细胞生长因子2     1-10 mg/L
胰岛素样生长因子1     1-10 mg/L
白细胞因子            1-10 mg/L
血小板衍生生长因子    1-10 mg/L
胎盘生长因子          1-10 mg/L
干细胞因子            1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子  1-10 mg/L
胰岛素          5 mg/L
转铁蛋白       20 mg/L
人血清白蛋白   0.1g/L
生物素         30 mM
氯化胆碱       60 mM
叶酸           6 mM
辅酶Q10       1 mM
地塞米松       10 nM
D-泛酸钠       5 mM
肌醇          70 mM
烟酰胺        20 mM
吡哆醇盐酸盐         0.15 mM 
核黄素               0.55 mM
盐酸硫氨             0.55 mM
维生素B12            0.5 mM
腐胺二盐酸盐         0.5 mM
维生素C             10 mg/L
维生素E             0.25 mg/L
肝素钠               0.4g/L
D-葡萄糖             18 mM
还原性谷胱甘肽       0.001 mg/L
牛磺酸               0.0072 g/L
β-巯基乙醇           0.05 mg/L
酚红                 8.1mg/L
油酸                 2.50 mg/L
亚油酸               1.5 mg/L
硫辛酸               0.1 mg/L
脂质混合物            1 ml/L
胆固醇               5 mg/L
乙醇胺               60 ml/L
碳酸氢钠             11.6 mM
氯化钙               0.084 mM
氯化钾               4.16 mM
氯化镁               0.3 mM
硫酸镁               0.407 mM
氯化钠               120.61 mM
一水磷酸二氢钠       0.453 mM
磷酸氢二钠           0.5 mM
丙酮酸钠             0.5 mM。
一种如上所述的干细胞培养基的应用，其中，将所述干细胞培养基用于培养干细胞。
所述的干细胞培养基的应用，其中，所述干细胞包括但不局限于人与哺乳动物来源的干细胞。
所述的干细胞培养基的应用，其中，所述干细胞从各种组织或器官里分离得到；所述组织与器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤。
一种采用如上所述的干细胞培养基的培养干细胞的方法，其中，在进行培养干细胞前将用于促使干细胞贴壁的材料包被培养皿，依次所述加入所述干细胞培养基和干细胞。
所述的培养干细胞的方法，其中，所述用于促使干细胞贴壁的材料为胶原蛋白、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻表粘连蛋白的一种或多种混合物。
有益效果：本发明所提供的干细胞培养基，不含血清，适合于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。该培养基能让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能。采用该干细胞培养基与普通培养基相比，不仅能更快速扩增不同来源的干细胞，延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。
附图说明
图1a为本发明实施例1中采用本发明干细胞培养基与常规培养基培养ADSC的干细胞扩增速度的检测结果示意图。
图1b为本发明实施例1中采用本发明干细胞培养基与常规培养基培养BMSC的干细胞扩增速度的检测结果示意图。
图1c为本发明实施例1中采用本发明干细胞培养基与常规培养基培养UMBSC的干细胞扩增速度的检测结果示意图。
图2为本发明实施例2中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成软骨细胞潜能的检测结果示意图。
图3为本发明实施例3中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成脂肪细胞潜能的检测结果示意图。
图4为本发明实施例4中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成神经细胞潜能的检测结果示意图。
图5为本发明实施例5中经过本发明干细胞培养基与常规培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC体外分化成视网膜上皮细胞潜能的检测结果示意图。
图6为本发明实施例6中经过本发明干细胞培养基培养的ADSC、BMSC和UMBSC移植之后对感光细胞退行性视网膜模型的保护作用的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的干细胞培养基中不含血清，其配方涉及到添加氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽，细胞培养方法涉及到促进细胞贴壁材料的使用。该方法与普通培养基相比，不仅能更快速扩增不同来源的干细胞，延长了传代次数，而且又能很好的保持干细胞的潜能性。所述干细胞培养基适合用于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。
具体地，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺；
所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1（FGF1）、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素（insulin）、胰岛素样生长因子1（IGF1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、胎盘生长因子（PGF）、白血病抑制因子（LIF）、 干细胞因子（SCF）、转铁蛋白（transferrin）和人血清白蛋白（HSA）；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E；
所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物（Lipid mixture）（Sigma，L5416）；
所述微量元素包括绿化钴、亚硒酸钠、氯化镍、氯化锰、乙二胺四乙酸钠盐、七钼酸铵、氯化铝、硫酸铬钾、硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁或硫酸锌； 
其他小分子物质包括抗氧化剂（b-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽）、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。
进一步地，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下组分：
成分 浓度或量
Ala (丙氨酸) 0.01~0.25mM
Arg (精氨酸) 0.4~10 mM
Asn（天冬酰胺） 0.11~2.75 mM
Asp（天冬氨酸） 0.08~2 mM
Cys （半胱氨酸） 0.03~0.75 mM
Glu（谷氨酸） 0.03~0.75 mM
Gly（甘氨酸） 0.05~1.25 mM
His（组氨酸） 0.03~0.75 mM
Ile（异亮氨酸） 0.5~12.5 mM
Leu（亮氨酸） 0.24~6 mM
Lys（赖氨酸） 0.2~5 mM
Met（甲硫氨酸） 0.12~3 mM
Phe（苯丙氨酸） 0.21~5.25 mM
Pro（脯氨酸） 0.004~0.1 mM
Ser（丝氨酸） 0.15~3.5 mM
Thr（苏氨酸） 0.06~1.5 mM
Trp（色氨酸） 0.02~0.5 mM
Tyr（酪氨酸） 0.03~0.75 mM
Val（缬氨酸） 0.28~7 mM
Gln （谷氨酰胺） 0.8~20 mM
表皮生长因子（EGF） 1-10 mg/L
纤维细胞生长因子1 （FGF1） 1-10 mg/L
纤维细胞生长因子2 （FGF2） 1-10 mg/L
胰岛素样生长因子1（IGF1） 1-10 mg/L
白细胞因子因子（LIF） 1-10 mg/L
血小板衍生生长因子（PDGF） 1-10 mg/L
胎盘生长因子（PGF） 1-10 mg/L
干细胞因子（SCF） 1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子（VEGF） 1-10 mg/L
胰岛素（insulin） 1~25 mg/L
转铁蛋白（transferrin） 4~100 mg/L
人血清白蛋白（HSA） 0.02~0.5 g/L
生物素（biotin） 6~150mM
氯化胆碱 （Choline chloride） 12~300mM
叶酸（Folic acid） 1.2~30mM
辅酶Q10（Coenzyme Q10） 0.2~5mM
地塞米松（dexamethasone） 2~50 nM
D-泛酸钠（Na pantotenate） 1~25mM
肌醇 （i-Inositol） 14~350mM
烟酰胺（Niacinamide） 4~100mM
吡哆醇盐酸盐 （Pyridoxine hydrochloride） 0.03~0.75mM
核黄素（Riboflavin） 0.11~2.75mM
盐酸硫氨（Thiamine hydrochloride） 0.11~2.75mM
维生素B12 （Vitamin B12） 0.1~2.5mM
腐胺二盐酸盐 （Putresicine.2HCl） 0.1~2.5mM
维生素C （Vitamin C） 2~50 mg/L
维生素E （Vitamin E） 0.05~1.25 mg/L
肝素钠（Heparin sodium） 0.08~2 g/L
D-葡萄糖（D-Glucose） 3.6~90 mM
还原性谷胱甘肽（Reduced Glutathione） 0.0002~0.005 mg/L
牛磺酸（Taurine） 0.00144~0.36 g/L
β-巯基乙醇（BME） 0.01~0.25mg/L
酚红（Phenol red） 1.62~40.5 mg/L
油酸（Oleic acid） 0.5~12.5 mg/L
亚油酸（Linoleic acid） 0.5~7.5 mg/L
硫辛酸（Lipoic acid） 0.02~0.5 mg/L
脂质混合物（Lipid mixture）（Sigma，L5416） 0.2~5 ml/L
胆固醇（Cholesterol） 1~25 mg/L
乙醇胺 （Ethanolamine） 12~300ml/L
碳酸氢钠 （NaHCO3） 2.32~58 mM
氯化钙（CaCl2） 0.0168~0.42 mM
氯化钾（KCl） 0.832~20.8 mM
氯化镁（MgCl2） 0.06~1.5 mM
硫酸镁（MgSO4） 0.0814~2.035 mM
氯化钠（NaCl） 24.122~603.55 mM
磷酸二氢钠（一水）（NaH2PO4.H2O） 0.0906~2.265 mM
磷酸氢二钠（Na2HPO4） 0.1~2.5 mM
丙酮酸钠（Sodium pyruvate） 0.1~2.5 mM
本发明所提供的培养基适合用于快速培养人及哺乳动物组织来源的干细胞，包括但不局限于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。该培养基能让细胞的扩增速度提高3-5倍，但又不影响其分化的潜能。
经本发明所提供的培养基培养的干细胞像常规培养基培养的干细胞一样能很好的分化成其功能细胞，其功能细胞包括但不局限于脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜感光细胞。一方面，经本发明所描述的培养基培养的干细胞像常规培养基培养过的干细胞一样，细胞移植后对退行性组织或器官具有很好的保护作用；另一方面，经本发明所描述的培养基培养过的干细胞像常规培养基培养的干细胞一样，经移植后可以恢复原有的功能。
本发明中还提供的干细胞培养基的应用，将所述干细胞培养基用于培养干细胞，所述干细胞包括但不局限于人与哺乳动物（如小鼠、大鼠、兔）来源的干细胞，所述干细胞可以从各种组织或器官里分离到。组织与器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤。
当采用本发明所提供的干细胞培养基培养干细胞时，由于本发明培养基中不含有能使干细胞贴壁生长的物质，因此，在培养干细胞以前需要使用促使干细胞贴壁材料，如胶原蛋白、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻表粘连蛋白的一种或多种混合物。因为带血清的培养基里含有这些东西，所以不需要加；而本发明不带血清的干细胞培养基不含这些东西，所以需要在培养干细胞前，将所述贴壁材料包被培养皿，之后才依次加本发明干细胞培养基和干细胞，然后按照常规培养方法进行培养干细胞。
以下通过实施例对本发明做进一步说明书，在实施例1~6中，所采用的干细胞培养基以1升计算，包括以下组分：
成分 浓度或量
Ala (丙氨酸)  0.05 mM
Arg (精氨酸) 2.00 mM
Asn（天冬酰胺） 0.55 mM
Asp（天冬氨酸） 0.4 mM
Cys （半胱氨酸） 0.15 mM
Glu（谷氨酸） 0.15 mM
Gly（甘氨酸） 0.25 mM
His（组氨酸） 0.15 mM
Ile（异亮氨酸） 2.50 mM
Leu（亮氨酸） 1.20 mM
Lys（赖氨酸） 1.00 mM
Met（甲硫氨酸） 0.60 mM
Phe（苯丙氨酸） 1.05 mM
Pro（脯氨酸） 0.02 mM
Ser（丝氨酸） 0.70 mM
Thr（苏氨酸） 0.30 mM
Trp（色氨酸） 0.10 mM
Tyr（酪氨酸） 0.15 mM
Val（缬氨酸） 1.4 mM
Gln （谷氨酰胺） 4 mM
表皮生长因子（EGF） 1-10 mg/L
纤维细胞生长因子1 （FGF1） 1-10 mg/L
纤维细胞生长因子2 （FGF2） 1-10 mg/L
胰岛素样生长因子1（IGF1） 1-10 mg/L
白细胞因子（LIF） 1-10 mg/L
血小板衍生生长因子（PDGF） 1-10 mg/L
胎盘生长因子（PGF） 1-10 mg/L
干细胞因子（SCF） 1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子（VEGF） 1-10 mg/L
胰岛素（insulin） 5 mg/L
转铁蛋白（transferrin） 20 mg/L
人血清白蛋白（HSA） 0.1g/L
生物素（biotin） 30 mM
氯化胆碱 （Choline chloride） 60 mM
叶酸（Folic acid） 6 mM
辅酶Q10（Coenzyme Q10） 1 mM
地塞米松（dexamethasone） 10nM
D-泛酸钠（Na pantotenate） 5 mM
肌醇 （i-Inositol） 70 mM
烟酰胺（Niacinamide） 20 mM
吡哆醇盐酸盐 （Pyridoxine hydrochloride） 0.15 mM
核黄素（Riboflavin） 0.55 mM
盐酸硫氨（Thiamine hydrochloride） 0.55 mM
维生素B12 （Vitamin B12） 0.5 mM
腐胺二盐酸盐 （Putresicine.2HCl） 0.5 mM
维生素C （Vitamin C） 10 mg/L
维生素E （Vitamin E） 0.25 mg/L
肝素钠（Heparin sodium） 0.4g/L
D-葡萄糖（D-Glucose） 18 mM
还原性谷胱甘肽（Reduced Glutathione） 0.001 mg/L
牛磺酸（Taurine） 0.0072 g/L
β-巯基乙醇（BME） 0.05 mg/L
酚红（Phenol red） 8.1mg/L
油酸（Oleic acid） 2.50 mg/L
亚油酸（Linoleic acid） 1.5 mg/L
硫辛酸（Lipoic acid） 0.1 mg/L
脂质混合物（Lipid mixture）（Sigma，L5416） 1 ml/L
胆固醇（Cholesterol） 5 mg/L
乙醇胺 （Ethanolamine） 60 ml/L
碳酸氢钠 （NaHCO3） 11.6 mM
氯化钙（CaCl2） 0.084 mM
氯化钾（KCl） 4.16 mM
氯化镁（MgCl2） 0.3 mM
硫酸镁（MgSO4） 0.407 mM
氯化钠（NaCl） 120.61 mM
磷酸二氢钠（一水）（NaH2PO4.H2O） 0.453 mM
磷酸氢二钠（Na2HPO4） 0.5 mM
丙酮酸钠（Sodium pyruvate） 0.5 mM
实施例1. 对干细胞增殖的加速作用
培养干细胞的常规培养基配方为：DMEM/F12 基本培养基，10% 胎牛血清（FBS）。为比较本发明所描述的培养基与为检查本发明所描述的培养基对人干细胞培养的扩增速度的影响，本实施例中选用了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC) 做体外细胞培养实验。细胞接种密度控制在10-20%之间，接种前培养皿用细胞贴壁材料室温处理2小时或4℃保温过夜，接种后加入培养基培养（37℃，5% CO2）。每隔 12 小时通过 MTT 法测一次细胞密度。检测结果如图1~图3所示，经本发明描述的培养基培养的干细胞（实心柱形）比经常规血清培养基培养的细胞（空心柱形）表现出更快的扩增速度，数据为三次独立实验的平均值±SEM （P<0.001）。研究结果表明，采用本发明所描述的干细胞培养基对干细胞的扩增速度与常规的血清培养基相比，达到100% 细胞密度的时间大大缩短。 
实施例2. 增殖后间充质干细胞体外分为成软骨细胞的潜能分析
为检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增10代后对其分化潜能的影响，本实施例中按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增之后的成软骨细胞分化实验（Estes BT et al. Nat Protoc 2010; 5: 1294–1311；Awad HA  et al., Biomaterials. 2004 Jul;25(16):3211-22; Cheng NC et al., Tissue Eng Part A. 2009 Feb;15(2):231-41）。待干细胞长到合适密度（细胞密度20-80%），加入成软骨诱导培养基（1% FBS的DMEM/F12培养基，10 mg/L TGF-β1，50 nM 维生素C，6.25 mg/L 胰岛素，1% 双抗），每天换一次液，总共诱导2-3周。诱导成功之后进行阿尔新蓝染色。所采用的1%阿尔新蓝配方：称取0.1g阿尔新蓝，溶于10ml 3%冰醋酸溶液，待沉淀溶解后，用0.22 mm的滤器过滤后再使用。具体染色方法是，吸去细胞培养基后用PBS洗一遍；再加入4% 多聚甲醛溶液固定30 分钟后用PBS洗2-3遍；加入新配的1% 阿尔新蓝染液染色40 分钟，用PBS洗3次（每次2分钟），置显微镜下观察。对软骨细胞染色后统计阳性细胞的数量。统计结果如图2所示，经本发明描述的培养基培养的干细胞（实心柱形）与经常规血清培养基培养的干细胞细胞（空心柱形）分化成软骨细胞的比率均在90% 左右，因此表现出相似的成软骨细胞的能力。数据为三次独立实验的平均值±SEM。结果表明，干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成软骨细胞的效率与常规干细胞培养基培养后的成软骨细胞的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成软骨细胞的潜能。
实施例3.成脂肪细胞的潜能分析
为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增10代后对其分化潜能的影响，本实施例中按文献所描述的脂肪来源的干细胞（ADSC）成脂诱导及油红O染色方法我们测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增之后成脂肪细胞的分化实验（Yu G et al., Methods in Molecular Biology, 2011, Volume 702, Part 3, 193-200; Bunnell BA et al., Methods. Volume 45, Issue 2, June 2008, Pages 115–120; Gimble JM &  Guilak F. Cytotherapy. 2003,Vol.5, No.5,Pages 362-369)。具体的方法是，待干细胞密度为80% 左右换成成脂培养基进行诱导，成脂培养基的配方为：1% FBS的DMEM/F12培养基、1 mM 地塞米松、200 mM 吲哚美辛、0.5 nM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤( IBMX)、10 mg/ml胰岛素。两天换一次液，诱导两周后进行油红O染色。油红O染色液由油红O 配置而成，油红O储存液：称取0.5 g油红O加入到100 ml异丙醇中，0.22 mm过滤；油红O工作液：吸取6ml油红O储存液加入到4 ml蒸馏水中，混合均匀即可。具体方法是，成脂诱导成功后吸去培养基并用PBS洗2遍；加入新配置的油红O染色液染色1小时；去掉染色液，用PBS洗3遍，每次2 min，用显微镜观察。对脂肪细胞染色后统计阳性细胞的数量。统计结果如图3所示，经本发明描述的培养基培养的干细胞（实心柱形）与经常规血清培养基培养的干细胞细胞（空心柱形）分化成软骨细胞的比率均在80-90% 之间，因此表现出相似的成脂肪细胞的能力。数据为三次独立实验的平均值±SEM。结果表明干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成脂肪细胞的效率与常规血清干细胞培养基培养后的成脂肪细胞的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成脂肪细胞的潜能。
实施例4.成神经细胞的潜能分析
为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对其分化潜能的影响，本实施例中按文献所描述测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增10代之后成神经细胞的分化实验 （Wu H et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Aug 21;104(34):13821-6.）。具体地，细胞接种植后待达到70%～80%细胞密度时, 加入诱导分化的培养基, 即 DMEM/F12、10% FBS、1～2 mM BME, 24 h 后吸去培养基, PBS 洗 2 次, 换成 DMEM、1～4 mM BME, 处理1～5 h, 吸去培养基, 换成 N2 培养基、20ng bFGF 继续培养。DMEM/F12：N2添加剂比例为1：1。向神经细胞诱导分化 30 min 到10d直接在培养皿上进行免疫细胞化学检查。需检查的神经元特异标志物有神经元特异性烯醇化酶( NSE) 和神经微丝（NF）。首先，0. 01 mol/ L PBS 洗去培养液， 4%的多聚甲醛固定15 min；PBS 洗3 次，每次5 min; 0. 25% Triton X-100 处理15 min；PBS 洗3 次, 每次5 min；含有1%羊血清的一抗37℃处理1. 5 h, 4℃ 过夜；PBS洗3 次, 每次5 min；FITC 结合的兔抗鼠 IgG 二抗；37℃孵育1 h; PBS 洗3 次, 每次5 min；荧光染色直接在荧光显微镜下观察、照相; ABC 法染色按说明书进行。对神经细胞标志物染色后统计阳性细胞的数量。统计结果如图 4所示，经本发明描述的培养基培养的干细胞（实心柱形）与经常规血清培养基培养的干细胞细胞（空心柱形）分化成神经细胞的比率均在60-70% 左右，因此表现出相似的成神经的能力。数据为三次独立实验的平均值±SEM（P<0.001）。结果表明干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成神经细细胞的效率与常规血清干细胞培养基培养后的成神经细胞的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成神经细胞的潜能。
实施例5. 成视网膜上皮细胞的潜能分析
为进一步检查干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对其分化潜能的影响，本实施例中按文献所描述测定了按文献所描述的方法测定了脂肪、骨髓间以及脐带三种组织器官来源的人干细胞 (ADSC, BMSC, UMBSC)扩增10代之后视网膜上皮细胞（RPE）的分化实验（Osakada F et al.，Nat Biotechnol. 2008 Feb;26(2):215-24.）。对RPE细胞标志物染色后统计阳性细胞的数量。统计结果如图5所示，经本发明描述的培养基培养的干细胞（实心柱形）与经常规血清培养基培养的干细胞细胞（空心柱形）分化成RPE细胞的比率均在55-70% 之间，因此表现出相似的成RPE细胞的能力。结果表明干细胞经本发明所描述的培养基培养之后，成RPE细胞的效率与常规血清干细胞培养基的效率相媲美，因此本发明所描述的培养基培养的干细胞能保持其分化成RPE细胞的潜能。
实施例6. 增殖后干细胞对细胞退行性模型的保护作用
为检测干细胞经本发明所描述的培养基扩增后对退行性疾病的治疗作用，本实施例中选用了视网膜感光细胞退行性视网膜疾病小鼠模型（rd1）（Bowes C et al., Nature. 1990 Oct 18;347(6294):677-80.），将10代扩增后的脂肪、骨髓以及脐带三种组织器官来源的人干细胞(ADSC, BMSC或UMBSC)扩增之后植入视网膜之后，组织学检测感光细胞的数量，以确定其对视网膜感光细胞的保护作用。具体结果如图6所示，Rd1小鼠经干细胞治疗1个月之后感光细胞的数量由原来不到5%的数量提高到40%以上，因此干细胞经本发明所描述的培养基培养之后保护退行性细胞的能力仍然维持。数据为三次独立实验的平均值±SEM（P<0.001）。研究表明，经干细胞细胞移植之后感光细胞退化明显变慢，而且经本发明所描述的培养基扩增后的干细胞在对视网膜细胞的保护作用。
综上所述，经本发明所提供的干细胞培养基培养之后的干细胞与在经常规培养基培养的干细胞一样，在适当的条件下可以分化成功能细胞，功能细胞包括但不局限于脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、心肌细胞、视网膜色素细胞以及视网膜感光细胞。而且，细胞移植后对退行性组织或器官模型之后具有很好的保护作用，退行性组织或器官模型包括但不局限于具有遗传突变修饰的视网膜退行性模型。而且从检测结果可以看出，本发明所提供的不含血清的干细胞培养基较常规培养基相比更适合用于培养干细胞。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽；
其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺；
所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、 干细胞因子、转铁蛋白和人血清白蛋白；
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E；
所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物；
所述盐类包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠；
所述干细胞培养基还包括抗氧化剂、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下组分：
丙氨酸       0.01~0.25mM
精氨酸       0.4~10 mM
天冬酰胺     0.11~2.75 mM
天冬氨酸     0.03~0.75 mM
半胱氨酸     0.03~0.75 mM
谷氨酸       0.03~0.75 mM
甘氨酸       0.05~1.25 mM
组氨酸       0.03~0.75 mM
异亮氨酸     0.5~12.5 mM
亮氨酸       0.24~6 mM
赖氨酸       0.2~5 mM
甲硫氨酸     0.12~3 mM
苯丙氨酸     0.21~5.25 mM
脯氨酸       0.004~0.1 mM
丝氨酸       0.15~3.5 mM
苏氨酸       0.06~1.5 mM
色氨酸       0.02~0.5 mM
酪氨酸       0.03~0.75 mM
缬氨酸       0.28~7 mM
谷氨酰胺     0.8~20 mM
表皮生长因子            1-10 mg/L
纤维细胞生长因子1       1-10 mg/L
纤维细胞生长因子2       1-10 mg/L
胰岛素样生长因子1       1-10 mg/L
白细胞因子               1-10 mg/L
血小板衍生生长因子       1-10 mg/L
胎盘生长因子             1-10 mg/L
干细胞因子               1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子     1-10 mg/L
胰岛素           1~25 mg/L
转铁蛋白         4~100 mg/L
人血清白蛋白     0.02~0.5 g/L
生物素            6~150mM
氯化胆碱         12~300mM
叶酸             1.2~30mM
辅酶Q10         0.2~5mM
地塞米松         2~50 nM
D-泛酸钠         1~25mM
肌醇             14~350mM
烟酰胺           4~100mM
吡哆醇盐酸盐     0.03~0.75mM
核黄素           0.11~2.75mM
盐酸硫氨         0.11~2.75mM
维生素B12       0.1~2.5mM
腐胺二盐酸盐     0.1~2.5mM
维生素C         2~50 mg/L
维生素E         0.05~1.25 mg/L
肝素钠           0.08~2 g/L
D-葡萄糖         3.6~90 mM
还原性谷胱甘肽   0.0002~0.005 mg/L
牛磺酸        0.00144~0.36 g/L
β-巯基乙醇    0.01~0.25mg/L
酚红          1.62~40.5 mg/L
油酸          0.5~12.5 mg/L
亚油酸        0.5~7.5 mg/L
硫辛酸        0.02~0.5 mg/L
脂质混合物    0.2~5 ml/L
胆固醇        1~25 mg/L
乙醇胺        12~300ml/L
碳酸氢钠      2.32~58 mM
氯化钙        0.0168~0.42 mM
氯化钾        0.832~20.8 mM
氯化镁        0.06~1.5 mM
硫酸镁        0.0814~2.035 mM
氯化钠        24.122~603.55 mM
一水磷酸二氢钠     0.0906~2.265 mM
磷酸氢二钠      0.1~2.5 mM
丙酮酸钠        0.1~2.5 mM 。
3.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基以1升计算，包括以下组分：
丙氨酸        0.05 mM
精氨酸        2.00 mM
天冬酰胺      0.55 mM
天冬氨酸      0.4 mM
半胱氨酸      0.15 mM
谷氨酸        0.15 mM
甘氨酸        0.25 mM
组氨酸        0.15 mM
异亮氨酸      2.50 mM
亮氨酸        1.20 mM
赖氨酸        1.00 mM
甲硫氨酸      0.60 mM
苯丙氨酸      1.05 mM
脯氨酸        0.02 mM
丝氨酸        0.70 mM
苏氨酸        0.30 mM
色氨酸        0.10 mM
酪氨酸        0.15 mM
缬氨酸        1.4 mM 
谷氨酰胺      4 mM
表皮生长因子  1-10 mg/L
纤维细胞生长因子1     1-10 mg/L
纤维细胞生长因子2     1-10 mg/L
胰岛素样生长因子1     1-10 mg/L
白细胞因子            1-10 mg/L
血小板衍生生长因子    1-10 mg/L
胎盘生长因子          1-10 mg/L
干细胞因子            1-10 mg/L
血管内皮细胞生长因子  1-10 mg/L
胰岛素          5 mg/L
转铁蛋白       20 mg/L
人血清白蛋白   0.1g/L
生物素         30 mM
氯化胆碱       60 mM
叶酸           6 mM
辅酶Q10       1 mM
地塞米松       10 nM
D-泛酸钠       5 mM
肌醇          70 mM
烟酰胺        20 mM
吡哆醇盐酸盐         0.15 mM 
核黄素               0.55 mM
盐酸硫氨             0.55 mM
维生素B12            0.5 mM
腐胺二盐酸盐         0.5 mM
维生素C             10 mg/L
维生素E             0.25 mg/L
肝素钠               0.4g/L
D-葡萄糖             18 mM
还原性谷胱甘肽       0.001 mg/L
牛磺酸               0.0072 g/L
β-巯基乙醇           0.05 mg/L
酚红                 8.1mg/L
油酸                 2.50 mg/L
亚油酸               1.5 mg/L
硫辛酸               0.1 mg/L
脂质混合物            1 ml/L
胆固醇               5 mg/L
乙醇胺               60 ml/L
碳酸氢钠             11.6 mM
氯化钙               0.084 mM
氯化钾               4.16 mM
氯化镁               0.3 mM
硫酸镁               0.407 mM
氯化钠               120.61 mM
一水磷酸二氢钠       0.453 mM
磷酸氢二钠           0.5 mM
丙酮酸钠             0.5 mM。
4.一种如权利要求1所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，将所述干细胞培养基用于培养干细胞。
5.根据权利要求4所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞包括但不局限于人与哺乳动物来源的干细胞。
6.根据权利要求4所述的干细胞培养基的应用，其特征在于，所述干细胞从各种组织或器官里分离得到；所述组织与器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤。
7.一种采用如权利要求1所述的干细胞培养基的培养干细胞的方法，其特征在于，在进行培养干细胞前将用于促使干细胞贴壁的材料包被培养皿，依次所述加入所述干细胞培养基和干细胞。
8.根据权利要求7所述的培养干细胞的方法，其特征在于，所述用于促使干细胞贴壁的材料为胶原蛋白、明胶、多聚赖氨酸、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻表粘连蛋白的一种或多种混合物。
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