CN114831107B - 一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞和组织低温保存液，包括以下组分：基础溶液、腺苷、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、白杨素、维生素E、牛磺酸、胰岛素。本发明低温保存液成分简单明确、成本低廉，安全性高；用本发明的低温保存液保存的细胞或组织无需冲洗，可直接继续培养、传代或作其它用途，低温保存过程中能有效维持细胞或组织的低代谢状态，且低温保存7天后复苏活率仍然保持在90%以上。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，具体为一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用。
背景技术
随着医疗技术的发展，细胞治疗手段的进步，细胞及组织保存的技术也面临越来越重要的考验，如何安全、有效保存生物样本成为关键。从采集到实验室研究或临床应用，存在着时间和空间的距离，如何保证细胞及组织样本在储存和运输过程中维持其活性及功能特征的稳定，将决定研究或临床应用结果是否准确有效。同时基于细胞的相关临床治疗和基础研究，例如器官移植、组织/细胞移植、CAR-T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）、干细胞等，都对于细胞和离体组织的保存和运输提出了巨大的需求。
原代培养是重要的研究方法，包括贴壁培养、悬浮培养、3D培养等多种方法。但是原代培养的成功率与来源组织样本活性具有极大的相关性。组织离体后，往往需要在短时间内进行处理及培养以提高成功率，一旦样本离体时间超过4小时，就容易导致培养失败或组织细胞活性下降。而目前的细胞或组织保存体系无法较长期地保留细胞与来源组织的活性及其功能，成为原代细胞培养成功的重要障碍。在常温或37℃环境中，细胞内生化反应活跃、代谢旺盛，耗氧高，能耗大，这些生理过程会产生大量氧自由基和脂质过氧化物，引起细胞内环境pH和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。 因此，我们提出一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种细胞和组织低温保存液，包括以下组分：基础溶液、腺苷、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、白杨素、维生素E、牛磺酸、胰岛素。
进一步的，所述基础溶液包括以下组分：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、EDTA、蔗糖。
在上述技术方案中，低温保存液是一种可降低细胞正常生理代谢过程中产生的氧自由基和脂质过氧化物的溶液，使细胞处于低代谢状态，可达到短期保存细胞的目的。
本发明提供了一种可以低温（2-8℃）保存细胞和组织的细胞或组织保存液，成分简单明确，不含任何动物源或人源成分，成本低廉，用本发明的低温保存液保存的细胞及组织无需冲洗复苏，可直接继续培养、传代或作其它用途，低温保存过程中能有效维持细胞和组织的低代谢状态，稳定保护长达5-7天。本发明的细胞低温保存液，在细胞培养通用的磷酸盐缓冲液基础上，设计独特的配方，添加了柠檬酸、EDTA和蔗糖等，可为细胞提供能量，同时维持细胞内渗透压的平衡，防止细胞内水分过量渗入；添加了腺苷，作为ATP合成的前体物质，是细胞维持基本代谢所需的能量底物；添加了白杨素作为抗氧化剂，与一般的抗氧化剂相比，具有更佳的氧自由基清除作用；维生素E按一定配比联合使用，意外地发现，与白杨素等成分联合使用具有较好的氧自由基清除作用，有效提高了细胞活率；添加了组氨酸、甘露醇、谷氨酸可解决细胞在低温环境中代谢所造成的酸中毒；添加了牛磺酸及胰岛素，牛磺酸与细胞膜流动性有关，可增加存储过程中细胞膜的稳定性，牛磺酸及胰岛素的使用可调节细胞糖代谢等生理活动，维持细胞渗透压平衡、钙平衡等。通过上述原料的组合，能够最大程度上维持细胞和组织在低温条件下的状态，提高细胞存活率及组织块的克隆形成率；并通过配方组合的优化，本发明的低温保存液，提高了细胞存活率，延长低温保存时间，与现有商业化产品比较，使用本发明的保存液，可维持间充质干细胞存活7天以上，且细胞活率维持在85%以上。
进一步的，所述腺苷的添加量为0.01～10g/L，所述白杨素的添加量为0.0001～0.005g/L，所述维生素E的添加量为1～50mg/L，所述组氨酸的添加量为0.01～0.5g/L，所述甘露醇的添加量为1～50g/L，所述谷氨酸的添加量为0.005～0.5g/L，所述牛磺酸的添加量为0.02g～2g/L，所述胰岛素的添加量为0.005g/L～0.5g/L。
进一步的，所述磷酸氢二钠的添加量为0.15g～10g/L，所述磷酸二氢钾的添加量为0.02g～2g/L，所述氯化钠的添加量为0.8g～15g/L，所述氯化钾的添加量为0.02g～2g/L，所述柠檬酸的添加量为0.01g～1g/L，所述EDTA的添加量为0.01g～1g/L，所述蔗糖的添加量为0.1g～20g/L。
进一步，作为优选实施方案，所述的基础溶液各成分，所述磷酸氢二钠的添加量为1.15g/L，所述磷酸二氢钾的添加量为0.2g/L，所述氯化钠的添加量为8g/L，所述氯化钾的添加量为0.2g/L，所述柠檬酸的添加量为0.1g/L，所述EDTA的添加量为0.1g/L，所述蔗糖的添加量为10g/L。
进一步，作为优选实施方案，所述剩余成分：所述腺苷的添加量为0.1g/L，所述白杨素的添加量为0.0005g/L，所述维生素E的添加量为0.005g/L，所述组氨酸的添加量为0.1g/L，所述甘露醇的添加量为30g/L，所述谷氨酸的添加量为0.01g/L，所述牛磺酸的添加量为0.2g/L，所述胰岛素的添加量为0.05g/L。
在上述技术方案中，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾均购自Sigma公司，柠檬酸购自阿拉丁（货号：C108871）， EDTA购自sigma公司（货号：03677），蔗糖购自阿拉丁（货号：S112236），腺苷购自阿拉丁（货号：A108806）, 白杨素购自阿拉丁（货号：C110078）,组氨酸购自Sigma公司（货号：H8000），甘露醇购自Sigma公司（货号：V900116），谷氨酸购自Sigma公司（货号：G1251），牛磺酸购自阿拉丁（货号：T103829），胰岛素购自阿拉丁（货号：I302196）；
一种细胞和组织低温保存液，包括以下步骤：
A.称取白杨素粉末加入至氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取维生素E，加入至无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，取注射水，依次加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、EDTA、蔗糖，搅拌溶解，得到基础溶液；
C.称取腺苷、白杨素母液、维生素E母液、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、牛磺酸、胰岛素依次加入步骤B所制基础溶液中，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用过滤器，对步骤C中的MIX溶液进行无菌过滤，得到低温保存液。
一种细胞和组织低温保存液的应用，所述的保存液应用于哺乳动物细胞保存。
一种细胞和组织低温保存液的应用，所述的保存液应用于对离体组织进行原代培养前保存。
如：间充质干细胞及其组织、293T细胞、Vero细胞、肾脏组织、肿瘤组织、肺组织等。
进一步的，将细胞和离体组织完全浸入所述低温保存液中，保存于0～15℃环境。
进一步的，所述环境温度优选为2～8℃。
进一步的，在细胞、组织、器官保存、运输中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明的细胞和组织低温保存液，与市场上现有的低温保存液相比，成分简单明确，成本低廉、且不含血清和蛋白成分，更加安全，稳定保护细胞和组织长达7天以上的时间，且并不影响细胞及组织的性能，应用范围广，对于大部分哺乳动物细胞以及组织的低温保存均适用，用本发明的低温保存液保存的细胞及组织无需冲洗，更易于使用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明中保存前的hUC-MSC细胞的100倍显微成像；
图2是本发明中实施例1所制低温保存液保存的hUC-MSC细胞，接种后第48h生长情况图（100倍显微成像）；
图3是本发明中对照组低温保存液保存的hUC-MSC细胞，接种后第48h生长情况图（100倍显微成像）；
图4是本发明中实施例1与对照组低温保存液保存的hUC-MSC细胞，接种后第0h、24h和48h的细胞活率和细胞数对比图；
图5是本发明中实施例1冻存液与对照组低温保存液保存的脐带组织，铺板后第14天的克隆形成率对比图；
图6是本发明中实施例1冻存液与对照组低温保存液保存的脐带组织，铺板后第14天的细胞数对比图；
图7是本发明中实施例1低温保存液保存的脐带组织，铺板后第14天的生长情况图；
图8是本发明中对照组低温保存液保存的脐带组织，铺板后第14天的生长情况图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、蔗糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例2
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0001g/L的白杨素、1mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.001g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、蔗糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、2μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例3
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、0.10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、蔗糖0.01g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例4
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.01g/L EDTA、20g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.001g、蔗糖2g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例5
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、蔗糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例6
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、蔗糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例7
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、蔗糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例8
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.2g/L的牛磺酸、0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L EDTA、10g/L蔗糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、EDTA 0.01g、蔗糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.02g的牛磺酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
实施例9
一种细胞和组织的低温保存液，包括以下组分：基础溶液、0.1g/L的腺苷、0.0005g/L的白杨素、5mg/L的维生素E、0.1g/L的组氨酸、30g/L的甘露醇、0.01g/L的谷氨酸、 0.05g/L的胰岛素；
其中，基础溶液包含1.15g/L磷酸氢二钠、0.2g/L磷酸二氢钾、8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L柠檬酸、0.1g/L EDTA、10g/L葡萄糖。
该低温保存液的制备方法包括以下步骤：以100mL为例，
A. 称取白杨素粉末0.005g加入至10mL的0.1M氢氧化钠溶液中，配制成白杨素母液；
量取500mg的维生素E，加入至10mL无水乙醇中，配制成维生素E母液；
B.在无菌环境条件下，向烧杯中加入100mL注射水，称取磷酸氢二钠0.115g、磷酸二氢钾0.02g、氯化钠0.8g、氯化钾0.02g、柠檬酸0.01g、EDTA 0.01g、葡萄糖1g依次加入注射水中，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到上述所述的基础溶液；
C.向上述基础溶液中依次加入0.01g的腺苷、100μL的白杨素母液、10μL的维生素E母液、0.01g组氨酸、3g的甘露醇、0.001g的谷氨酸、0.005g的胰岛素，充分涡旋至完全溶解，得到MIX溶液；
D.采用0.2μm过滤器，对上述MIX溶液进行无菌过滤，即得到一种细胞和组织低温保存液。
对照组
对照组中的低温保存液为商品化低温保存液（Stemcell HypoThermosol® FRS货号：07935）。
一种细胞和组织的低温保存液在脐带间充质干细胞（hUC-MSC）中的应用，包括以下步骤：
S1.收集细胞：消化处于指数生长期的脐带间充质干细胞（hUC-MSC）
S2.低温保存细胞：将步骤S1中收获的hUC-MSC细胞，分别用实施例1中得到的低温保存液和对照组中的低温保存液，以1×106/管的密度重悬后，移入冻存管内，并置于4℃冰箱内保存（两组低温保存液各保存3管）；
S3.细胞接种：5天后，从4℃冰箱内取出2组低温保存液保存的细胞，先取部分细胞记录0h细胞活率和细胞数（如图4），后将细胞连同低温保存液直接接种于10cm培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；
S4.24h后拍照记录细胞形态（如图2、图3），并消化细胞进行取样计数，记录第24h的细胞活率和细胞数（如图4），然后将细胞继续接种至培养板中培养；
S5.继续培养24h后再进行拍照，记录细胞形态（如图2、图3），并消化细胞进行计数，记录第48h的细胞活率和细胞数（如图4）。
一种细胞和组织的低温保存液在脐带组织中的应用，包括以下步骤：
S1.组织处理：获取脐带组织后，对脐带组织进行清洗后，将脐带组织剪成3cm左右的小段，剔除血管，分离出华通氏胶后，将其剪成3mm×3mm的碎块；
S2.低温保存组织碎块：将步骤S1中剪碎完成的组织碎块，分别用实施例1中得到的低温保存液和对照组中的低温保存液，保持组织碎块（g）：低温保存液（mL）=1:2，并移入冻存管内，置于4℃冰箱内保存；
S3.组织块铺板：5天后，取出4℃冰箱内低温保存的组织碎块，并将组织块铺置于的细胞培养板中，加入一定体积的MSC无血清培养基(Excell Bio OptiVitro®MSC增生无血清培养基)，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；
S4.组织块培养至第14h时，拍照记录细胞形态（如图5、图6），计算克隆形成率，并消化细胞进行计数（如图7、图8）；
所述克隆形成率为培养板中长出细胞的组织块数量与未长出细胞的组织块数量总和之比；
所述一定体积的MSC无血清培养基为始终保持组织块为贴壁状态的培养基体积。
对比例1
与实施例1相比，白杨素添加量为0g/L，即未添加白杨素成分，其余配制步骤、组分配比与实施例1相同，得到低温保存液；
参照实施例1中的在hUC-MSC细胞保存中的应用步骤，进行试验。
对比例2
与实施例1相比，白杨素添加量为0.001g/L，其余配制步骤、组分配比与实施例1相同，得到低温保存液。
对比例3
与实施例1相比，维生素E的添加量为60mg/L，其余配制步骤、组分配比与实施例1相同，得到低温保存液。
对比例4
与实施例1相比，牛磺酸的添加量为3g/L，其余配制步骤、组分配比与实施例1相同，得到低温保存液。
对比例5
与实施例1相比，胰岛素的添加量为1g/L，其余配制步骤、组分配比与实施例1相同，得到低温保存液。
对比例6
与实施例1相比，蔗糖的添加量为21g/L，其余配制步骤、组分配比与实施例1相同，得到低温保存液。
实验
取实施例1-12、对照组、对比例1-6中得到的低温保存液，同时测试加入上述3组低温液保存的hUC-MSC细胞，于4℃冰箱中放置5天、7天和10天，取出接种，并记录其细胞活率，结果见下表：
| 组别 | D5 | D7 | D10 |
| 实施例1 | 95.6% | 91.8% | 82.3% |
| 实施例2 | 92.6% | 84.8% | 74.1% |
| 实施例3 | 85.0% | 72.3% | 67.8% |
| 实施例4 | 90.6% | 78.5% | 70.3% |
| 实施例5 | 92.1% | 88.3% | 73.0% |
| 实施例6 | 83.7% | 62.1% | 55.7% |
| 实施例7 | 80.1% | 75.7% | 50.5% |
| 实施例8 | 90.8% | 82.4% | 65.0% |
| 实施例9 | 93.3% | 71.8% | 55.4% |
| 对照组 | 88.2% | 75.4% | 68.4% |
| 对比例1 | 70.1% | 48.9% | 20.8% |
| 对比例2 | 68.9% | 45.2% | 0% |
| 对比例3 | 58.3% | 28.0% | 0% |
| 对比例4 | 21.0% | 0% | 0% |
| 对比例5 | 0% | 0% | 0% |
| 对比例6 | 79.8% | 64.7% | 42.2% |
根据上表中的数据，可以清楚得到以下结论：
与对比例相比，实施例1利用本发明提供的细胞和组织低温保存液，独特的配方组合设计获得了更佳的保存效果，保存的细胞和组织，存活率明显提高：细胞在保存7天后，细胞活率仍然在90％以上，且明显优于对照组商品化低温保存液；组织在保存7天后，仍可分离出原代干细胞系。
细胞冻存效果与细胞和组织低温保存液的成分设计、剂量浓度、成分相互作用密切相关，如在实施例1的成分组合及剂量浓度下，实现了较高效率的细胞保存；实施例2-6分别对单个或多个物料的多种浓度进行了申请范围内的剂量调整测试，对比例1-6分别对多种物料进行了超范围的剂量测试，与实施例1相比，在不同剂量浓度条件下，产生的细胞保存效果波动较大，个别物料的大剂量或超剂量使用极大的降低了细胞冻存的效果，进一步证实细胞和组织低温保存液的成分组合设计及剂量浓度的重要性。
由图片2-8可知，实施例1利用本发明提供的细胞和组织低温保存液保存的细胞能很好的维持细胞及组织的活性以及原有的形态及功能特性。
这充分说明了本发明提供的细胞和组织低温保存液优势在于：成分明确，安全有效，保存的细胞活率高、收获率高，形态佳，且保存时间长。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程方法物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程方法物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种间充质干细胞低温保存液，其特征在于：包括以下组分：基础溶液、腺苷、组氨酸、甘露醇、谷氨酸、白杨素、维生素E、牛磺酸、胰岛素；
所述基础溶液包括以下组分：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、柠檬酸、EDTA、蔗糖；
所述腺苷的添加量为0.01～10g/L，所述白杨素的添加量为0.0001～0.005g/L，所述维生素E的添加量为1～50mg/L，所述组氨酸的添加量为0.005～0.5g/L，所述甘露醇的添加量为1～50g/L，所述谷氨酸的添加量为0.005～0.5g/L，所述牛磺酸的添加量为0.02g～2g/L，所述胰岛素的添加量为0.005g/L～0.5g/L；
所述磷酸氢二钠的添加量为0.15g～10g/L，所述磷酸二氢钾的添加量为0.02g～2g/L，所述氯化钠的添加量为0.8g～15g/L，所述氯化钾的添加量为0.02g～2g/L，所述柠檬酸的添加量为0.01g～1g/L，所述EDTA的添加量为0.01g～1g/L，所述蔗糖的添加量为0.1g～20g/L。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞低温保存液，其特征在于：所述腺苷的添加量为0.1g/L，所述白杨素的添加量为0.0005g/L，所述维生素E的添加量为0.005g/L，所述组氨酸的添加量为0.1g/L，所述甘露醇的添加量为30g/L，所述谷氨酸的添加量为0.01g/L，所述牛磺酸的添加量为0.2g/L，所述胰岛素的添加量为0.05g/L。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞低温保存液，其特征在于：所述磷酸氢二钠的添加量为1.15g/L，所述磷酸二氢钾的添加量为0.2g/L，所述氯化钠的添加量为8g/L，所述氯化钾的添加量为0.2g/L，所述柠檬酸的添加量为0.1g/L，所述EDTA的添加量为0.1g/L，所述蔗糖的添加量为10g/L。
4.一种间充质干细胞低温保存液的应用，其特征在于：根据权利要求1-3中任意一项所述的保存液应用于间充质干细胞的低温保存与运输。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090033701A (ko) * | 2007-10-01 | 2009-04-06 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 동결보관된 조직 유래 세포의 일차배양 방법 |
| CN101919381A (zh) * | 2010-09-06 | 2010-12-22 | 南方医科大学珠江医院 | 一种生物人工肝用肝细胞的保存液及其制备方法 |
| CN103060264A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-24 | 上海市第十人民医院 | 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
| CN105284787A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-02-03 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 骨髓间充质干细胞的保存试剂及其应用 |
| CN109619089A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-16 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法 |
| KR20190118031A (ko) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | 건국대학교 산학협력단 | 소변 유래 세포로부터의 조혈모 세포주 분화 및 미발달 몸체 형성을 촉진시키는 방법 |
| CN110669733A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-01-10 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途 |
| JP2021000027A (ja) * | 2019-06-21 | 2021-01-07 | 帝人株式会社 | 医療用細胞凍結保存液 |
| CN113005082A (zh) * | 2019-12-20 | 2021-06-22 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种t细胞无血清培养基及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5232844A (en) * | 1990-05-15 | 1993-08-03 | New York Blood Center | Photodynamic inactivation of viruses in cell-containing compositions |
| US9321995B2 (en) * | 2012-12-20 | 2016-04-26 | Suzhou Biowisetech Co., Ltd. | Stem cell culture medium and its applications as well as a stem cell culture method |
-
2022
- 2022-04-11 CN CN202210375209.0A patent/CN114831107B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090033701A (ko) * | 2007-10-01 | 2009-04-06 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 동결보관된 조직 유래 세포의 일차배양 방법 |
| CN101919381A (zh) * | 2010-09-06 | 2010-12-22 | 南方医科大学珠江医院 | 一种生物人工肝用肝细胞的保存液及其制备方法 |
| CN103060264A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-24 | 上海市第十人民医院 | 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
| CN105284787A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-02-03 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 骨髓间充质干细胞的保存试剂及其应用 |
| KR20190118031A (ko) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | 건국대학교 산학협력단 | 소변 유래 세포로부터의 조혈모 세포주 분화 및 미발달 몸체 형성을 촉진시키는 방법 |
| CN109619089A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-16 | 湖南赛诺生物科技股份有限公司 | 一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法 |
| JP2021000027A (ja) * | 2019-06-21 | 2021-01-07 | 帝人株式会社 | 医療用細胞凍結保存液 |
| CN110669733A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-01-10 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 白杨素在人造血干细胞体外扩增中的用途 |
| CN113005082A (zh) * | 2019-12-20 | 2021-06-22 | 依科赛生物科技（太仓）有限公司 | 一种t细胞无血清培养基及其应用 |
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