CN111513060A - 用于低温条件保持细胞活性的保存液及保存方法 - Google Patents
用于低温条件保持细胞活性的保存液及保存方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一类用于低温条件保持细胞活性的保存液及保存方法。保存液的成分为优化的维持细胞低温条件下保持活性的配方组成；保存液pH值为7.2‑7.6；保存温度为0‑6℃。成分中不含有对细胞产生毒性和造成基因表达改变的成分，安全环保。同时保存方法中无需冻存和复苏等过程，细胞全程处于保持活性状态，简单易用，方便细胞的储存和运输。本发明可有效实现人和动物多种类型的细胞低温存储，低温条件下可保持细胞的活性，经验证可用于人血液细胞、培养细胞、组织样本消化解离细胞的低温保存与运输。保存后的细胞可用于基因检测相关研究或其他细胞保存等相关应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于低温条件下保持人或动物细胞活性的保存液；此外，本发明还涉及使用该保存液的保存方法。
背景技术
随着基因检测技术的相关研究的逐步深入和临床应用的普及，如何安全、有效保存生物样本成为关键。其中研究最为广泛的细胞样本，例如临床血液细胞、组织消化解离的细胞和培养细胞等，从采集到实验室检测，存在着时间和空间的距离，如何保证细胞样本在储存和运输过程中维持细胞活性及基因表达的稳定，将决定实验结果是否准确有效。尤其是目前基因检测领域中的研究热点单细胞测序技术及ATAC-seq（一种研究染色质可及性的分子生物学方法）等，对于细胞样本的保存有着更高的要求，例如要求细胞活性一般不低于80 %，从而避免细胞死亡后造成的核酸降解、基因信息的丢失。同时基于细胞的相关临床治疗和基础研究，例如CAR-T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）、干细胞等，都对于细胞的保存和运输提出了巨大的需求。
目前细胞样本一般采用超低温冻存的方式，细胞置于细胞培养基、二甲亚砜和血清等成分组成的冻存液中，经过梯度降温后，保存在-80℃或液氮中。这些步骤操作复杂，极易造成细胞的死亡。对于基因相关检测和研究的细胞样本，这一冻存的过程易造成基因信息的丢失及细胞种群的缺失。而对于干细胞等，冻存液中的成分及冻存复苏过程易造成干细胞的分化。细胞样本的储存和运输过程中难以长期保持冻存的温度或细胞正常生长的适宜温度（37℃）。而在37℃条件是并且此时细胞处于增殖生长状态，一方面需要大量的培养基维持生存，另一方面基因的表达也存在改变的风险，例如造成干细胞的分化。在低温条件下，例如0-4℃，此时细胞的新陈代谢明显下降，不再增殖，接近冻存是细胞的状态。然而低温条件下，细胞内外溶液易产生冰晶，从而对细胞膜造成损伤。因此需要将细胞保存在适当的保存液中可以达到保持细胞活性，保持基因表达稳定的效果。例如器官移植使用的保存液，可保持器官的活性和移植后的生理功能。但目前器官移植使用的保存液等对于细胞的保存并不适用。一方面器官保存液中包含激素成分，例如地塞米松、胰岛素、前列腺素等会对保存的细胞产生刺激，从而对细胞基因水平上的产生影响，造成基因表达的改变，影响下游基因检测和研究，或影响干细胞的分化。另一方面由于细胞样本与器官存在着胞外渗透压、离子通透性和细胞种类的差异。因此亟待针对性的设计、开发用于细胞样本的保存试剂，在低温条件（0-4℃）下保持细胞的存活率，并且不改变细胞的基因表达，解决细胞样本的保存与运输。
目前大部分用于细胞的保存与运输过程都是采用超低温冻存的方式，-80℃超低温冻存和液氮的冻存方式。不易于样本的采集和运输。同时冻存和复苏过程，易造成细胞的死亡和对细胞基因表达造成影响。
中国发明专利申请CN107183012A公开了一种人体干细胞的冷冻液及冷冻存储方法，是采用超低温冷冻（-80℃）和液氮的保存方式。而对于冻存的保存方式，文献报道了超低温冻存的样本用于单细胞测序实验检测会造成转录组的完整性和细胞群类异质性的降低。而复苏的操作容易造成组织细胞的死亡，影响后续的实验检测。且该专利申请人体干细胞的冷冻液中的必要成分DMSO在非冷冻条件下（例如，0-6℃下）会对细胞产生毒性。
中国发明专利申请CN201811329711.8公开了一种细胞保存液及使用细胞保存液保存细胞的方法。保存液成分中包含甲醇成分，虽然可以对细胞的结构形态进行固定，但此时细胞处于死亡状态，不能保持细胞的活性，易造成核酸的降解。同时死亡后的细胞在保存液中处于细胞膜通透状态，会造成胞内核酸游离到体系外，引起基因信息的丢失。无法应用到单细胞测序实验等。
同时一些细胞冻存液成分中包含二甲基亚砜、甘油等成分，在低温或常温条件下，会产生一定的细胞毒性。冻存液中含有的动物源蛋白会对影响细胞的基因表达影响，影响基因检测相关研究和干细胞的分化等。
因此，亟需研发一种新的用于细胞低温保存的保存液及保存方法，以保持细胞的活性，避免细胞基因表达的改变。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一，为了解决细胞样本采集后保存与运输，低温条件下保持细胞的活性，无需冻存复苏等步骤，不添加造成细胞基因表达改变的成分。本发明提供了一种用于低温条件保持细胞活性的保存液。该保存液采用低温保存的方式（0-6℃），可以降低细胞的新陈代谢速率，维持细胞活性的同时可以降低细胞基因表达的改变，使细胞保持在初始的状态。但是低温条件细胞内外溶液中的水分易形成冰晶，对细胞膜造成破坏。同时长时间的低温保存会引起细胞的自由基的产生和细胞凋亡通路的激活等。因此需要相应的低温保存介质维持细胞内外渗透压、细胞膜稳定性、避免溶液中冰晶的生成、维持细胞基本的生理代谢所需的物质及抗氧化和抗细胞凋亡等。同时保存介质中不能含有对细胞有毒性和会引起细胞基因表达改变的成分。
本发明要解决的技术之二是提供使用该保存液的保存方法。
本发明要解决的技术问题之三是提供该保存液的用途。
在本发明的第一方面，提供了一类保存液，用于细胞的低温保存（0-6℃），所述保存液包括如下成分分别为：2-4 g/L氢氧化钠、1-6 g/L氢氧化钾，3-5 g/L磷酸二氢钠、1-2g/L 磷酸二氢钾、0.4-0.6 g/L 碳酸氢钠、0.8-1.2 g/L 氯化钾、5-6 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的任意一种或几种，0.6-1.2 g/L无水硫酸镁和/或0.6-1.2 g/L 氯化镁，30-40 g/L乳糖酸、15-20 g/L棉子糖、0.5-1 g/L葡萄糖、6-7 g/L蔗糖、3-4 g/L 甘露糖中的任意一种或几种，50-60 g/L羟乙基淀粉和/或50-60 g/L葡聚糖， 1-2 g/L腺苷、0.8-2 g/L谷胱甘肽、0.2-0.5 g/L维生素E 、0.2-0.4 g/L别嘌呤醇中的任意一种或几种；所述保存液的pH值为7.2-7.6。
所述氢氧化钠、氢氧化钾，磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的任意一种或几种作为离子缓冲液成分是可以维持细胞渗透压的盐离子浓度和维持生理环境pH稳定的缓冲液成分，保持溶液的pH范围在7.2-7.6。
所述无水硫酸镁和/或氯化镁保存液中提供Mg2+，有助于维持细胞膜的稳定性。
所述乳糖酸、棉子糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖中的任意一种或几种成分可以为细胞提供能量，提高细胞膜磷脂双分子层的稳定性，维持细胞内外渗透压，防止细胞溶胀。
羟乙基淀粉和/或葡聚糖可以避免低温保存条件下细胞内外溶液产生冰晶的成分，从而避免对细胞膜造成的损伤和溶液的冻结造成细胞的死亡。同时有助于维持细胞膜的稳定性。
所述腺苷、谷胱甘肽、维生素E、别嘌呤醇中的任意一种或几种为细胞合成代谢提提供营养补充，维持细胞的正常生理代谢，同时具有抗氧化、抗凋亡功能，可以有效清除细胞代谢过程中产生的自由基，维持细胞内的氧化还原环境，有效防止低温保存过程中细胞的凋亡，从而避免保存过程中细胞内核酸的降解。
在本发明的第二方面，本发明还提供一种所述的保存液保存细胞的方法，包括如下步骤：将分离的细胞重悬于所述保存液中，0-6℃低温保存。
在本发明的第三方面，本发明提供了所述保存液在细胞的0-6℃低温保存和运输中的应用。所述细胞来源于动物（小鼠和大鼠等）或人的细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一类细胞样本保存液的成分组成及样本保存方法，用以在低温条件下维持细胞的活性，同时不引入改变细胞的基因表达的成分。区别于传统的超低温冻存（-80℃），本发明所述保存液及其保存方法可有效实现人和动物细胞的低温存储（0-6℃），低温条件下可保持细胞的活性，可用于细胞的保存和运输。操作步骤简单，无需梯度降温、超低温冻存和复苏过程，保存液成分中不含有对细胞产生毒性的二甲基亚砜（DMSO）和易引起细胞基因表达改变的动物源蛋白，可用于基因检测和研究等相关实验。
利用本发明分别保存了人血细胞、培养细胞和组织消化解离的细胞等。按照本发明提供的保存液及保存方式，可以在96小时内保存细胞的存活率在85%以上。保存效果优于商品化保存试剂。
本发明提供细胞保存液成分及优化的保存方式可以保持细胞的活性，可用于多种类型的细胞低温保存。不引入易对细胞基因表达造成影响的化学、生物成分和操作流程，保存液成分安全环保，保存方式简单易用，有效解决了细胞样本的保存与运输。保存后的细胞可用于基因检测研究、单细胞测序、免疫细胞和干细胞的储运，确保相关实验结果的准确性。
附图说明
图1 为实施例4中保存液A保存的人外周血单个核细胞（PBMC），分别保存24小时和72小时后，荧光细胞计数仪检测到的细胞存活率。
图2为实施例5中保存液B保存的293t细胞和HeLa细胞，保存72小时后，荧光细胞计数仪检测到的细胞存活率。
图3为实施例6中小鼠脾脏细胞分别在保存液C和商品化保存液HypoThermosolFRS 中保存24小时和96小时后，荧光细胞计数仪检测到的细胞存活率。
具体实施方式
以下内容为结合具体实施例和附图，对本发明进一步详细的说明。本发明的保护内容不局限于以下实施例。
实施例1：保存液A的配制
在一个具体的实施例中，保存液的组成包括氢氧化钾（5-6 g/L）、乳糖酸（30-40 g/L）、磷酸二氢钠 （3-5 g/L）、无水硫酸镁（0.5-1 g/L）、棉子糖（15-20 g/L）、羟乙基淀粉（50-60g/L）、腺苷（1-2 g/L）、别嘌呤醇（0.2-0.5 g/L）、谷胱甘肽（0.5-2 g/L），溶于灭菌去离子水中，使用氢氧化钠和稀盐酸将溶液pH值调到7.2-7.6。
实施例2: 保存液B的配制
在一个具体的实施例中，保存液的组成包括氢氧化钾（1-1.5 g/L）、氯化钾（0.8-1.2g/L）、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （5-6 g/L）、乳糖酸 （30-40 g/L）、葡聚糖 （50-60 g/L）、氯化镁 （0.6-1.2 g/L）、磷酸二氢钠 （1-2 g/L）、碳酸氢钠（0.4-0.6 g/L）、葡萄糖（0.5-1 g/L）、蔗糖（5-7 g/L）、甘露糖（4-5 g/L）、腺苷（1-2 g/L）、谷胱甘肽（0.5-2 g/L）、维生素E（0.2-0.5 g/L），溶于灭菌去离子水中，使用氢氧化钠和稀盐酸将溶液pH调到7.2-7.6。
实施例3: 保存液C的配制
在一个具体的实施例中，保存液的组成包括氢氧化钾（1-1.5 g/L）、氯化钾（0.8-1.2g/L）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （5-6 g/L）、乳糖酸 （30-40 g/L）、葡聚糖 （50-60 g/L）、氯化镁 （0.6-1.2 g/L）、磷酸二氢钾 （1-2 g/L）、碳酸氢钠（0.4-0.6 g/L）、葡萄糖（0.5-1 g/L）、蔗糖（5-7 g/L）、甘露糖（4-5 g/L）、腺苷（1-2g/L）、别嘌呤醇 （0.2-0.5 g/L）、谷胱甘肽（0.5-2 g/L），溶于灭菌去离子水中，使用氢氧化钠和稀盐酸将溶液pH调到7.2-7.6。
实施例4：人临床血细胞样本保存
在一个具体的实施例中，采集从人新鲜血液中分离的外周血单个核细胞（PBMC），离心后使用 2 mL保存液A重悬，4℃冰箱保存。分别保存24和72小时后，使用荧光细胞计数仪检测细胞存活率（AO/PI染色）。
实验结果：图1 为实施例4中保存的人PBMC细胞，分别保存24小时后和72小时后，使用荧光细胞计数仪检测细胞存活率。保存24小时后细胞存活率为95%，保存72小时后细胞存活率为85%，都保持了较高的细胞活性。表明保存液A 可以保存人血液细胞，在低温条件下，且在72小时内保持细胞的活性。
实施例5：培养细胞的保存
在一个具体的实施例中，分别采集培养的人肾上皮细胞系293t细胞和人宫颈癌细胞系HeLa细胞。细胞培养在培养皿中，经消化离心后，使用 2 mL保存液B重悬细胞，置于4℃冰箱，保存72小时后，使用荧光细胞计数仪检测细胞存活率（AO/PI染色）。
实验结果：图2 为实施例5中保存的293t细胞和HeLa细胞，使用荧光细胞计数仪，分别检测刚采集到的新鲜细胞和保存72小时后的细胞存活率。保存72小时后293t细胞存活率为88%，HeLa细胞存活率为73%，都保持了较高的细胞活性。表明保存液B 可以保存培养细胞，在低温条件下，且在72小时内保持细胞的活性。
实施例6：组织消化细胞保存
在一个具体的实施例中，采集新鲜小鼠脾脏组织，消化解离为单细胞悬液。分别使用 2mL保存液C和商品化保存液HypoThermosol FRS重悬细胞，置于4℃冰箱，分别保存24小时和96小时后，使用荧光细胞计数仪检测细胞存活率（AO/PI染色）。
实验结果：图3 为实施例6中保存的小鼠脾脏组织消化解离的细胞，使用荧光细胞计数仪，分别检测了保存24小时和保存96小时后的细胞存活率，同时比较保存液E和商品化保存液的保存效果。经保存液C保存24和96小时的小鼠脾脏细胞存活率分别为89%和86%，细胞活性没有明显下降。而商品化保存液保存的小鼠脾脏细胞，24和96小时的存活率分别为81%和72%，有较为明显的下降。保存液C有较好的保存组织消化解离细胞的效果，96小时内，细胞存活率高于85%，效果优于目前市场上商品化的保存液。表明经保存液及相应保存方法可用于组织消化解离的细胞的保存。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
Claims (4)
1.一种用于低温条件保持细胞活性的保存液，其特征在于，所述保存液包括如下成分：2-4 g/L氢氧化钠、1-6 g/L氢氧化钾，3-5 g/L磷酸二氢钠、1-2 g/L 磷酸二氢钾、0.4-0.6g/L 碳酸氢钠、0.8-1.2 g/L 氯化钾、5-6 g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的任意一种或几种，0.6-1.2 g/L无水硫酸镁和/或0.6-1.2 g/L 氯化镁，30-40 g/L乳糖酸、15-20 g/L棉子糖、0.5-1 g/L葡萄糖、6-7 g/L蔗糖、3-4 g/L 甘露糖中的任意一种或几种，50-60 g/L羟乙基淀粉和/或50-60 g/L葡聚糖， 1-2 g/L腺苷、0.8-2 g/L谷胱甘肽、0.2-0.5 g/L维生素E 、0.2-0.4 g/L别嘌呤醇中的任意一种或几种；所述保存液的pH值为7.2-7.6；所述低温条件为0-6℃。
2.一种使用权利要求1所述的保存液保存细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：将分离的细胞重悬于所述保存液中，0-6℃低温保存。
3.如权利要求1或2所述的保存液在细胞的0-6℃低温保存和运输中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细胞来源于动物或人的细胞。
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