CN113925049A

CN113925049A - 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113925049A
Application number: CN202111546441.8A
Authority: CN
Inventors: 彭青; 高毅; 张莹; 李阳; 周树勤
Original assignee: Guangdong Qianhui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Qianhui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN113925049B

Abstract

本发明公开了一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用，涉及细胞保存与运输技术领域。该细胞保存液的组分包括：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸10~30 mmol/L、镁盐2~5 mmol/L、藻酸丙二醇酯80~100mmol/L、棉子糖10~20 mmol/L、三磷酸腺苷二钠2~5 mmol/L、还原性谷胱甘肽1~3 mmol/L、α‑硫辛酸0.1~0.2 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉30~50 g/L以及中药提取物5~20μmol/L。本申请提供的细胞保存液在4℃条件下可以有效保持细胞活性，细胞保存液的各组分对人体安全无毒，便于细胞的后续使用，适合细胞的保存或运输，应用前景广阔。

Description

一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞保存与运输技术领域，具体而言，涉及一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用。

背景技术

细胞培养和保存技术广泛用于生命科学研究的各个领域，如疫苗研制、人工器官和再生医学等。冷冻保存是目前细胞长期保存的通用方法，能够减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变，避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。然而，细胞的冻存和复苏过程会对细胞造成较大损伤，降低细胞膜中的脂质含量，产生过氧化，同时影响细胞的结构和代谢途径。低温保存则降低了细胞因反复冻存复苏造成细胞损伤和基因改变的风险，同时降低了细胞运输过程的成本。

在低温条件下，例如0-4℃，此时细胞的新陈代谢明显下降，不再增殖，接近冻存时的细胞状态。然而低温条件下，细胞内外溶液易产生冰晶，从而对细胞膜造成损伤。因此需要将细胞保存在适合的保存液中，目前市场上虽然已经有各种保存液，但是这些保存液的效果有待提高。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种保持细胞活性的细胞保存液，其能够增强细胞保护作用，降低细胞损伤，保存效果优异。

本发明的目的在于提供一种保持细胞活性的细胞保存液的制备方法，该制备方法简单，操作容易。

本发明的目的在于提供一种保持细胞活性的细胞保存液的使用方法，该使用方法简单，无需梯度降温、超低温冻存和复苏过程，保存效果优异。

本发明的目的在于提供一种保持细胞活性的细胞保存液在细胞的0-4℃低温保存或运输中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种保持细胞活性的细胞保存液，其组分包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸10~30 mmol/L、镁盐2~5 mmol/L、藻酸丙二醇酯80~100 mmol/L、棉子糖10~20mmol/L、三磷酸腺苷二钠2~5 mmol/L、还原性谷胱甘肽1~3 mmol/L、α-硫辛酸0.1~0.2mmol/L、羟乙基磷酸淀粉30~50 g/L以及中药提取物5~20 μmol/L。

第二方面，本发明提供一种如前述实施方式任一项所述的保持细胞活性的细胞保存液的制备方法，其包括将所述组分按照预设浓度溶解于水中进行配制。

第三方面，本发明提供一种如前述实施方式任一项所述的保持细胞活性的细胞保存液的使用方法，其包括吸弃细胞培养液以获得分离后的细胞，向所述分离后的细胞中加入所述细胞保存液，0-4℃低温保存。

第四方面，本发明提供如前述实施方式任一项所述的保持细胞活性的细胞保存液在细胞的0-4℃低温保存或运输中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本申请提供的保持细胞活性的细胞保存液通过4-羟乙基哌嗪乙磺酸来调节溶液的渗透压；藻酸丙二醇酯和棉子糖能够稳定细胞膜和蛋白质结构，减轻低温状态下细胞水肿；同时配合羟乙基磷酸淀粉，不仅仅能提高胶体渗透压，还可以进一步减轻细胞水肿；镁盐和三磷酸腺苷二钠能够为细胞提供能量；还原性谷胱甘肽和α-硫辛酸能够防止或减轻细胞再灌注损伤，自由基对细胞的损伤；同时引入中药提取物，中药提取物可以与还原性谷胱甘肽和α-硫辛酸协同增效，进一步增强清除自由基和抗氧化应激的作用，进而增强细胞保护作用，最大程度降低了细胞损伤。本申请提供的细胞保存液在4℃条件下可以有效保持细胞活性。细胞保存液的各组分对人体安全无毒，便于细胞的后续使用，适合细胞的保存或运输，应用前景广阔。此外，本申请细胞保存液的制备方法和使用方法简单，无需梯度降温、超低温冻存和复苏过程，保存效果优于商品化保存试剂。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本申请提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，本申请所述的低温条件是指0-4℃，优选地，低温条件为4℃。

上述细胞保存液组分包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸10~30 mmol/L、镁盐2~5 mmol/L、藻酸丙二醇酯80~100 mmol/L、棉子糖10~20 mmol/L、三磷酸腺苷二钠2~5 mmol/L、还原性谷胱甘肽1~3 mmol/L、α-硫辛酸0.1~0.2 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉30~50 g/L以及中药提取物5~20μmol/L。

其中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。其能够调节溶液的渗透压，保持液体渗透压相对平衡。

藻酸丙二醇酯和棉子糖用于稳定细胞膜和蛋白质结构，减轻低温状态下细胞水肿。

镁盐和三磷酸腺苷二钠为高能磷酸化合物的底物，用于为细胞提供能量。其中，镁盐包括硫酸镁和氯化镁中的至少一种。

还原性谷胱甘肽和α-硫辛酸用于防止或减轻细胞再灌注损伤，自由基对细胞的损伤。

羟乙基磷酸淀粉用于提高胶体渗透压，减轻细胞水肿。

中药提取物用于清除自由基，抗氧化，增强细胞保护作用。本申请中通过引入中药提取物可以最大程度降低了细胞损伤。

具体来说，本申请中的中药提取物包括但不限于五味子乙素、槲皮素和白藜芦醇的一种或多种。优选地，中药提取物包括五味子乙素5~10 μmol/L、槲皮素5~20 μmol/L和白藜芦醇5~10 μmol/L中的一种或多种。

其中，五味子乙素不仅具有增强细胞抗氧化状态的能力，还具有防止细胞线粒体结构和功能退化的作用，而这两者正是细胞生死存亡的关键因素。五味子乙素凭借着上调细胞抗氧化防御机制的能力，促进了线粒体的功能和抗氧化状态，从而对细胞产生了广泛的保护作用。槲皮素具有抗氧化、清除自由基，抑制脂质过氧化的作用。白藜芦醇是植物体在逆境或遇到病原侵害时分泌的一种抗毒素，紫外线照射、机械损伤及真菌感染时合成急剧增加，故称之为植物抗菌素，其具有抗菌、抗氧化的作用。

本申请中，通过引入上述中药提取物中的一种或多种的组合可以提高细胞的抗氧化性能，增强细胞的保护作用，显著降低了细胞损伤。

进一步地，本申请中细胞保存液的pH值为7.2-7.4，渗透压为305-315mmol/L。通过严格控制细胞保存液的pH值和渗透压，可以使细胞处于更为适宜的保存液条件下，适合细胞的保存或运输。

第二方面，本发明提供了一种上述保持细胞活性的细胞保存液的制备方法，其包括将上述组分溶解于水中并配制成上述特定的浓度。

具体来说，先将4-羟乙基哌嗪乙磺酸、镁盐、氯化镁、藻酸丙二醇酯、棉子糖、三磷酸腺苷二钠、还原型谷胱甘肽、α-硫辛酸和羟乙基磷酸淀粉溶解于水中，调节pH至7.2-7.4后加入中药提取物，灭菌密封保存。

本申请中的水包括但不限于超纯水、纯水、蒸馏水等等。

第三方面，本发明提供一种保持细胞活性的细胞保存液的使用方法，向分离后的细胞中加入细胞保存液，0-4℃低温保存；优选地，每毫升保存液与每平方厘米细胞培养面积的比例为1:2-4；优选地，通过吸弃细胞培养液以获得分离后的细胞。

上述保持细胞活性的细胞保存液可以广泛应用于细胞的0-4℃低温保存或运输中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，其包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mmol/L、氯化镁3 mmol/L、藻酸丙二醇酯90 mmol/L、棉子糖15 mmol/L、三磷酸腺苷二钠3 mmol/L、还原性谷胱甘肽2 mmol/L、α-硫辛酸0.1 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉40 g/L和五味子乙素10μmol/L。

其制备方法包括：

按照指定浓度分别称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化镁、藻酸丙二醇酯、棉子糖、三磷酸腺苷二钠、还原性谷胱甘肽、α-硫辛酸、羟乙基磷酸淀粉于超纯水中溶解；调节pH至7.2-7.4，加入五味子乙素，灭菌密封保存；制得细胞保存液，其渗透压为305-315mmol/L。

实施例2-4

实施例2-4提供的保持细胞活性的细胞保存液，组分基本与实施例1相同，区别在于：中药提取物不同。

实施例2中，中药提取物为槲皮素10 μmol/L。

实施例3中，中药提取物为白藜芦醇10 μmol/L。

实施例4中，中药提取物为白藜芦醇5μmol/L和槲皮素5μmol/L。

实施例5

本实施例提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，其包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸15 mmol/L、氯化镁2 mmol/L、藻酸丙二醇酯85 mmol/L、棉子糖12 mmol/L、三磷酸腺苷二钠2 mmol/L、还原型谷胱甘肽1 mmol/L、α-硫辛酸0.1 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉33 g/L和五味子乙素5μmol/L。

实施例6

本实施例提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，其包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸28 mmol/L、镁盐5 mmol/L、藻酸丙二醇酯98 mmol/L、棉子糖18 mmol/L、三磷酸腺苷二钠5 mmol/L、还原型谷胱甘肽3 mmol/L、α-硫辛酸0.2 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉50 g/L和槲皮素10μmol/L。

对比例1

本对比例提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，其包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mmol/L、氯化镁3 mmol/L、藻酸丙二醇酯90 mmol/L、棉子糖15 mmol/L、三磷酸腺苷二钠3 mmol/L、还原性谷胱甘肽2 mmol/L、α-硫辛酸0.1 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉40 g/L。

对比例2

本对比例提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，其包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mmol/L、氯化镁3 mmol/L、藻酸丙二醇酯90 mmol/L、棉子糖15 mmol/L、三磷酸腺苷二钠3 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉40 g/L和五味子乙素10μmol/L。

对比例3

本对比例提供了一种保持细胞活性的细胞保存液，其包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 mmol/L、氯化镁3 mmol/L、藻酸丙二醇酯90 mmol/L、棉子糖15 mmol/L、三磷酸腺苷二钠3 mmol/L、还原性谷胱甘肽2 mmol/L、α-硫辛酸0.1 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉40 g/L，红景天苷10μmol/L。

对比例4

本对比例的细胞保存液为市售UW保存液，其包括以下浓度的组分：乳糖钾盐100mmol/L、磷酸二氢钾25mmol/L、硫酸镁5mmol/L、棉子糖30mmol/L、腺苷5mmol/L、谷胱甘肽3mmol/L、胰岛素100U/L、青霉素40U/L、地塞米松8mg/L、别嘌呤醇1mmol/L、羟乙基淀粉50g/L。

实验例一

本实施例研究实施例1~6和对比例1~4所制备的细胞保存液对HepG2细胞的保存效果。保存效果检测采用CCK-8法对细胞活性进行检测。结果如表1所示。

表1 .HepG2细胞存活率检测结果

上述结果表明，本发明实施例1~6所述细胞保存液在4℃条件下保存HepG2细胞HepG2细胞冻存1、3、5天存活率仍然很高，取得很好的保存效果。从实施例4可以看出，中药提取物槲皮素和白藜芦醇有协同增效的作用，联合使用可以增加HepG2细胞的存活率，冻存效果比单一使用更优。从对比例1-4可以看出五味子乙素和三磷酸腺苷二钠以及还原型谷胱甘肽有协同增效的作用；跟具有抗氧化作用的中药提取物红景天苷对比，本申请采用的药物细胞保护作用更优；与市售UW液比较，细胞存活率更高，冻存效果更好。

实验例二

将上述实施例1~6和对比例1~4获得的细胞保存液对UC-MSCs细胞存活率检测。

1、制备脐带间充质干细胞

（1）采用组织块直接贴壁法分离脐带间充质干细胞：在无菌操作台下用PBS多次漂洗脐带中血液，将脐带切成1-2cm长度大小的片段。用组织剪和血管钳剥离脐带的血管（一条静脉和两条动脉）及外层羊膜以防止内皮细胞污染。将脐带中的华通胶部分切成小块，体积为0.5-1cm³，将切取的小块脐带均匀铺在10cm培养皿底部，间隔以0.5cm为宜。用10ml含0.1%青链霉素双抗及10% FBS的间充质干细胞专用培养基覆盖于脐带上，将培养皿置于5%CO₂、37℃培养箱中培养。每日在倒置显微镜下观察脐带边缘有无细胞游出，每隔4天换液一次，待脐带块周围有大量细胞游出时取出脐带块继续培养。传代后细胞生长加速，细胞排列规则，以梭形为主，生长均匀。

（2）待步骤（1）中培养的细胞融合度达到80~90%时，对细胞进行传代，将细胞接种于间充质干细胞特殊培养基中继续培养24h。

2、吸弃培养基，向细胞中加入保存液，将细胞保存于4℃冰箱中，于保存后1天、3天和5天将细胞从冰箱中取出进行保存效果检测，保存效果采用CCK-8法检测细胞活性。检测结果见表2所示：

表2 .UC-MSCs细胞存活率检测结果

上述结果表明，本发明实施例1~6所述细胞保存液在4℃条件下保存UC-MSCs细胞，UC-MSCs细胞冻存1、3、5天存活率仍然很高，取得很好的保存效果。从实施例4可以看出，中药提取物槲皮素和白藜芦醇有协同增效的作用，联合使用可以增加脐带间充质干细胞的存活率，冻存效果比单一使用更优。从对比例1-4可以看出五味子乙素和三磷酸腺苷二钠以及还原性谷胱甘肽有协同增效的作用；与具有抗氧化作用的中药提取物红景天苷对比，本申请使用的药物细胞保护作用更优；与市售UW液比较，细胞存活率更高，冻存效果更好。本发明制得的产品对不同的细胞都有很好的保护作用。

综上所述，本申请提供的保持细胞活性的细胞保存液通过4-羟乙基哌嗪乙磺酸来调节溶液的渗透压；藻酸丙二醇酯和棉子糖能够稳定细胞膜和蛋白质结构，减轻低温状态下细胞水肿；同时配合羟乙基磷酸淀粉，不仅仅能提高胶体渗透压，还可以进一步减轻细胞水肿；氯化镁和三磷酸腺苷二钠能够为细胞提供能量；还原型谷胱甘肽和α-硫辛酸能够防止或减轻细胞再灌注损伤，自由基对细胞的损伤；同时引入中药提取物，中药提取物可以与还原性谷胱甘肽和α-硫辛酸协同增效，进一步增强清除自由基和抗氧化的作用，进而增强细胞保护作用，最大程度降低了细胞损伤。本申请提供的细胞保存液在4℃条件下可以有效保持细胞活性。细胞保存液的各组分对人体安全无毒，便于细胞的后续使用，适合细胞的保存或运输，应用前景广阔。此外，本申请细胞保存液的制备方法和使用方法简单，无需梯度降温、超低温冻存和复苏过程，保存效果优于商品化保存试剂。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种保持细胞活性的细胞保存液，其特征在于，其组分包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸10~30 mmol/L、镁盐2~5 mmol/L、藻酸丙二醇酯80~100 mmol/L、棉子糖10~20 mmol/L、三磷酸腺苷二钠2~5 mmol/L、还原性谷胱甘肽1~3 mmol/L、α-硫辛酸0.1~0.2 mmol/L、羟乙基磷酸淀粉30~50 g/L以及中药提取物5~20μmol/L。

2.根据权利要求1所述的保持细胞活性的细胞保存液，其特征在于，所述镁盐包括硫酸镁和氯化镁中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的保持细胞活性的细胞保存液，其特征在于，所述中药提取物包括五味子乙素5~10 μmol/L、槲皮素5~20 μmol/L以及白藜芦醇5~10 μmol/L中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的保持细胞活性的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的pH值为7.2-7.4。

5.根据权利要求1所述的保持细胞活性的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的渗透压为305-315mmol/L。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的保持细胞活性的细胞保存液的制备方法，其特征在于，其包括将所述组分按照预设浓度溶解于水中进行配制。

7.根据权利要求6所述的保持细胞活性的细胞保存液的制备方法，其特征在于，先将所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸、所述镁盐、所述藻酸丙二醇酯、所述棉子糖、所述三磷酸腺苷二钠、所述还原性谷胱甘肽、所述α-硫辛酸和所述羟乙基磷酸淀粉溶解于水中，调节pH至7.2-7.4之后加入所述中药提取物，灭菌密封保存。

8.一种如权利要求1-5任一项所述的保持细胞活性的细胞保存液的使用方法，其特征在于，其包括吸弃细胞培养液以获得分离后的细胞，向所述分离后的细胞中加入所述细胞保存液，0-4℃低温保存。

9.根据权利要求8所述的保持细胞活性的细胞保存液的使用方法，其特征在于，每毫升所述细胞保存液与每平方厘米细胞培养面积的比例为1:2-4。

10.如权利要求1-5任一项所述的保持细胞活性的细胞保存液在细胞的0-4℃低温保存或运输中的应用。