CN114424766B - 一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法 - Google Patents

一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及临床医学肝脏移植技术领域，具体涉及一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法。该超低温保存溶液包括加载溶液、低温保存液和复苏溶液；加载溶液包括Williams E培养基、3‑O‑甲基‑D‑吡喃葡萄糖和西洛酰胺；超低温保存液包括UW液、聚乙二醇和西洛酰胺；复苏溶液包括Williams E培养基和西洛酰胺。本申请采用3‑O‑甲基‑D‑吡喃葡萄糖、西洛酰胺和聚乙二醇联合对离体肝脏进行处理，对离体肝脏实现保护，能实现离体肝脏的零下‑6℃超低温保存，有效延长了供肝的有效保存时间为48‑72小时，解冻后的体外源代肝细胞具有良好的品质，显著减轻低温所致的肝组织损伤问题，提升肝移植疗效。

Description

一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法
技术领域
本发明涉及临床医学肝脏移植技术领域，具体涉及一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法。
背景技术
肝脏是人体内最大的消化腺，是体内物质能量代谢的中心站，是维持生命活动的一个必不可少的重要器官。而肝病是指发生在肝脏的病变，包括乙肝、甲肝、丙肝、肝硬化、脂肪化、肝癌、酒精肝等多种肝病，是一种常见的危害性极大的疾病。
治疗肝病的三大原则包括抗病毒、提高免疫力、恢复肝功能，而对于终末期肝病的最有效治疗方式是肝移植，肝移植的良好疗效取决于供肝的质量和临床技术水平。由于肝移植的供体严重匮乏，每年仅有0.6％的终末期肝病接受肝移植，因此临床上尤为重视肝脏移植技术，以利用有限的资源使患者得到良好的疗效，其中，移植前供肝的保存至关重要。
对于移植前供肝的保存，目前静态冷保存仍是肝脏保存最普遍的方法，但缺点是临床有效保存时间仅仅为8-10小时，迫使临床医生在供肝保存的8小时内完成肝移植手术。体外机械灌注肝脏是新近发展起来的肝脏保存技术，虽然该技术尽管可以改善供肝质量，并延长器官的有效保存时间为24小时，但因其技术复杂、价格昂贵、转运困难等缺点，使得其在临床应用上受到极大限制。
至今为止，除个别团队的报道外，肝脏的超低温保存鲜有成功报道，相关技术仍不成熟，很难形成统一的方案。因此，肝脏超低温保存液的成分尚需要进一步的改良与优化。这对于实现器官的体外长时间有效保存尤为重要，且有望进一步应用临床，解决目前肝移植领域供体器官紧缺和区域性分配等问题。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种肝脏的超低温保存溶液及保存方法。
本发明的第一个目的通过下述技术方案实现：一种肝脏的超低温保存溶液，包括加载溶液、低温保存液和复苏溶液；所述加载溶液包括Williams E培养基、3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖和西洛酰胺；所述超低温保存液包括UW液、聚乙二醇和西洛酰胺；所述复苏溶液包括Williams E培养基和西洛酰胺。
在肝脏低温保存方法中，从理论上讲，温度每降低10℃可使细胞代谢需求降低约50％，不仅如此，低温还能减少细胞凋亡、自由基的产生和促炎细胞因子的释放。利用这一原理，将离体肝脏的保存温度降低至零下的超低温保存条件，可使肝脏的生命代谢活动得到有效降低，可以有效延长离体肝脏的保存时间，保障肝脏质量并用于后续移植。
然而，由于肝脏解剖结构复杂，包含多种细胞类型，具有不同的保存特性和功能，使肝脏的超低温保存面临几个挑战：1)在储存过程中可能发生冰核；2)在零下温度下长时间的储存以及长时间的复温过程，会导致肝脏不可逆的质膜损伤以及随后的渗透不平衡；3)一般来说，低温和随后的复温会增加细胞产生自由基的敏感性，同时降低细胞对这种破坏性反应物种的自然防御能力，尤其影响肝窦功能，肝窦是肝脏直接与外界环境相互作用的功能单位，窦状内皮细胞(SECs)对低温极为敏感，低温会导致细胞肿胀和微循环破坏。而上述的几个问题均会引起肝组织损伤现象，影响肝脏质量。
对此，针对零下保存引起的肝组织损失现象，本申请采用加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液进行处理，延长肝脏的有效保存时间至48-72小时，旨在扩大供体肝脏的合理分配范围，且能提高肝脏的保存效果，降低肝脏的废弃率，提高肝脏的使用率以及肝脏移植的临床疗效。其中，加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液中均采用有西洛酰胺，作为磷酸二酯酶3B(PDE3B)的抑制剂，能有效抑制肝细胞在零下超低温保存过程中的细胞死亡情况，减轻低温所致的肝组织损伤问题，使在零下超低温(-3℃～-6℃)条件下不冻保存48h的肝细胞具有更高的细胞存活率及细胞活性，提高肝移植疗效。
进一步地，加载溶液中采用葡萄糖衍生物——3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖，作为细胞内保护剂，由于3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖(3-OMG)通过GLUT-1和-2转运体被肝细胞自然吸收，是不可代谢的，因此可在细胞内部积累以有效提高细胞内液体的质量摩尔浓度，减少肝细胞体积的缩小，同时可以降低细胞内液体冰点，阻止细胞内冰核的形成，且当使用3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖进行低温保存时，体外原代肝细胞在解冻后表现出更好的品质，使得经过零下超低温肝细胞(-3℃～-6℃)保存后的肝细胞具有更高的细胞存活率及细胞活性。
同时，为了避免超低温保存过程中冰核的形成，低温保存溶液中添加35kDa-聚乙二醇，能在实现超低温保存不结冰的同时，具有一定的保护上皮细胞膜的作用，减少超低温保存过程中形成的冰核对肝脏的质量影响。
因此，通过在加载溶液中采用3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖和西洛酰胺，在低温保存液中采用聚乙二醇和西洛酰胺，在复苏溶液中采用西洛酰胺，三种处理液联合对离体肝脏进行处理，对离体肝脏实现保护，能实现离体肝脏的零下-6℃超低温保存，有效延长了供肝的有效保存时间为48-72小时，解冻后的体外源代肝细胞具有良好的品质，显著减轻低温所致的肝组织损伤问题，提升肝移植疗效。
优选的，所述加载溶液中，每500mL的Williams E培养基添加18-22g的3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖和0.5-1.0mg的西洛酰胺。
通过控制加载溶液中3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖和西洛酰胺的添加量，能使3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖对供肝的细胞起到保护作用，减少肝细胞体积的缩小，降低细胞内液体冰点，阻止细胞内冰核的形成，并能有效抑制肝细胞在零下超低温保存过程中的细胞死亡情况，减轻低温所致的肝组织损伤问题。
优选的，所述加载溶液还包括L-谷氨酰胺、青-链霉素、氢化可的松、肝素钠和胰岛素，该加载溶液的具体组成包括：
Figure BDA0003485742950000041
通过将上述成分以特定的用量复配组成加载溶液，均是以500mL的Williams E培养基为参考值添加相应的用量，在肝脏超低温保存前则能强化对肝组织的保护，能避免超低温保存过程中肝脏内外冰核的形成，并抑制超低温条件所导致的的肝组织损伤，实现肝脏在-6℃下的不冻保存，延长供肝的有效保存时间，提高肝移植疗效。
优选的，所述低温保存液中，每1000mL的UW液添加1.5-2.0mg的西洛酰胺和40-60g的35kDa聚乙二醇。
通过控制西洛酰胺和聚乙二醇的添加量，能保护肝脏上皮细胞膜，使得超低温保存不结冰，避免超低温保存过程中冰核的形成，减轻低温保存对肝组织的损伤，且能抑制肝细胞在超低温保存过程中的细胞死亡现象，实现-6℃下不冻保存48h的肝细胞具有优良的细胞存活率及细胞活性。
优选的，所述低温保存液还包括青霉素G、胰岛素、地塞米松和聚乙二醇，该低温保存液的具体组成包括：
Figure BDA0003485742950000042
Figure BDA0003485742950000051
通过将上述成分以特定的用量复配组成低温保存液，均是以1000mL的UW液为参考值添加相应的用量，能实现零下-6℃的低温保存，能延长供肝的有效保存时间为48-72小时，扩大了供体肝脏的合理分配范围，且35kDa聚乙二醇和西洛酰胺联合作用，对肝细胞起到保护作用，减轻低温保存对肝组织的损伤，并抑制肝细胞在超低温保存过程中的细胞死亡，使得超低温保存处理后的肝细胞具有优良的细胞存活率和细胞活性，提高肝移植疗效和成功率。
优选的，所述复苏溶液中，每500mL的Williams E培养基添加0.5-1.0mg的西洛酰胺。通过控制复苏溶液中的西洛酰胺含量，能在对供肝进行复苏期间起到保护作用，减少复苏过程细胞死亡现象，使得复苏后的肝脏细胞存活率高，细胞活性高，能使肝脏维持更好的供肝质量，有效改善肝移植术后的肝功能。
优选的，所述复苏溶液还包括L-谷氨酰胺、青-链霉素、氢化可的松、肝素钠和胰岛素，该复苏溶液的具体组成包括：
Figure BDA0003485742950000052
通过将上述成分以特定的用量复配组成复苏溶液，均是以500mL的Williams E培养基为参考值添加相应的用量，能实现超低温保存的肝脏稳定复苏，减少复苏过程的细胞死亡，减轻整个低温保存及复苏过程对肝组织的损失，使得复苏后的肝脏细胞存活率高，细胞活性高，有效改善肝移植术后的肝功能。
本发明的第二个目的通过下述技术方案实现：一种肝脏的超低温保存溶液的保存方法，包括如下步骤：
(1)加载处理：采用SNMP加载溶液作为灌注液，在18-23℃的室温环境下对供肝进行SNMP加载灌注处理50-80min，然后以0.8-1.2℃/min的速率降温至3-5℃；
(2)超低温保存处理：采用预冷至3-5℃的低温保存溶液冲洗供肝，然后将供肝置于装满3-5℃低温保存溶液的无菌袋中，转移到一个可控温的冰箱，控制冰箱温度以0.05-0.15℃/min的速率降温至-3～-6℃，使得装有供肝和低温保存溶液的无菌袋降温至-3～-6℃，并持续保存两天；
(3)复苏处理：先将冰箱温度以0.05-0.15℃/min的速率升温至3-5℃，使得装有供肝和低温保存溶液的无菌袋升温至3-5℃，再采用复苏溶液冲洗供肝，再在温度为18-23℃的环境下，以复苏溶液作为灌注液对供肝持续SNMP加载灌注处理2-5h，复苏供肝。
上述复苏后的供肝则能直接进行原位肝移植术。
本申请通过依次采用加载溶液进行SNMP加载灌注处理、采用低温保存液进行-3～-6℃的超低温保存处理、采用复苏溶液进行SNMP加载灌注处理以复苏供肝，能实现肝脏在-6℃下的不冻保存，延长肝脏的有效保存时间，显著减轻低温所致的肝组织损伤，最终提高肝移植疗效，改善肝移植术后的肝功能，为器官的体外长时间有效保存和远程分配带来便利，扩大供体肝脏的合理分配范围，提高肝移植的肝脏有效率，减少肝脏废弃率。
本发明的有益效果在于：本申请采用加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液进行处理，能在体外-6℃条件下长时间保存，延长肝脏的有效保存时间至48-72小时，扩大供体肝脏的合理分配范围，且能提高肝脏的保存效果，保持更为良好的肝脏质量，减轻肝组织损失，降低肝脏的废弃率，提高肝脏的使用率以及肝脏移植的临床疗效和成功率，改善移植术后的肝功能。
本申请的通过依次采用加载溶液进行SNMP加载灌注处理、采用低温保存液进行-3～-6℃的超低温保存处理、采用复苏溶液进行SNMP加载灌注处理以复苏供肝，能实现肝脏在-6℃下的不冻保存，延长肝脏的有效保存时间，显著减轻低温所致的肝组织损伤，最终提高肝移植疗效，改善肝移植术后的肝功能。
附图说明
图1是本发明实施例3的大鼠肝脏超低温保存48h简易流程图；
图2是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中谷丙转氨酶(ALT)水平示意图；
图3是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中谷草转氨酶(AST)水平示意图；
图4是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中乳酸水平示意图；
图5是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中门脉阻力水平示意图；
图6是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中肝脏的胆汁生成量示意图；
图6是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中肝胆的胆汁生成量示意图；
图7是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理后，灌复苏后肝脏ATP水平示意图；
图8是实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清ALT水平示意图；
图9是实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清AST水平示意图；
图10是实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清胆红素水平示意图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面以大鼠肝脏超低温保存为具体实施例，结合附图1～附图10对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
配置超低温保存溶液，包括如下步骤：
按照如下用量，调配500mL加载溶液：
Figure BDA0003485742950000081
按照如下用量，调配1000mL低温保存液：
Figure BDA0003485742950000082
按照如下用量，调配500mL复苏溶液：
Figure BDA0003485742950000083
Figure BDA0003485742950000091
利用上述的加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液依次对大鼠肝脏进行处理，对大鼠肝脏实现超低温保存处理，具体步骤如下：
(1)加载处理：供体大鼠肝脏获取后，使用大鼠离体肝脏灌注系统，以加载溶液(150mL)作为灌注液，在18℃的室温环境下，通过门静脉对供肝进行循环灌注50min，使供肝充分摄取3-OMG和西洛酰胺(Cilostamide)，然后在机械灌注末期通过水浴装置以0.8℃/min的速度将温度降至3℃。通常在灌注第1分钟时将流量设定为8ml/min，严密监测压力以确保其不超过10cmH2O(1cmH2O＝0.098kPa)；然后缓慢地以1mL/min的增量增加流速至12mL/min，确保压力不超过15cmH2O。
(2)超低温保存处理：用预冷至3℃的10mL低温保存溶液冲洗肝脏，并将其置于一个装满3℃低温保存溶液(100ml)的无菌袋中，确保无菌袋中排尽空气；温度以0.05℃/min的速度缓慢降至-3℃，低温保存维持48h。通常将装有供肝的无菌袋浸没于防冻剂中，于可控温冰箱中以0.05℃/min的速度冷却和复温。
(3)复苏处理：在超低温保存结束时，温度以0.05℃/min的速度逐渐升温至3℃，用预冷至3℃的10mL复苏溶液冲洗肝脏，之后以复苏溶液(150mL)为灌注液，在温度为18℃的条件下，对肝脏持续循环灌注2h促进肝功能恢复。通常在灌注第1分钟时将流量设定为3mL/min，严密监测压力以确保其不超过5cmH2O；然后缓慢地以1mL/3min的增量增加流速，最多至12mL/min。
复苏期间，通过检测灌注液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸和肝脏胆汁生成量等反映供体肝脏水平的指标，并通过干预措施维持灌注液水电解质酸碱平衡。
复苏后肝脏可直接行原位肝移植术。
实施例2
本实施例的加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液，与上述实施例1的用量差异，参见下表1。
大鼠肝脏实现超低温保存处理，具体步骤如下：
(1)加载处理：供体大鼠肝脏获取后，使用大鼠离体肝脏灌注系统，以加载溶液(150mL)作为灌注液，在19℃的室温环境下，通过门静脉对供肝进行循环灌注60min，使供肝充分摄取3-OMG和西洛酰胺(Cilostamide)，然后在机械灌注末期通过水浴装置以0.9℃/min的速度将温度降至3.5℃。通常在灌注第1分钟时将流量设定为8ml/min，严密监测压力以确保其不超过10cmH2O(1cmH2O＝0.098kPa)；然后缓慢地以1mL/min的增量增加流速至12mL/min，确保压力不超过15cmH2O。
(2)超低温保存处理：用预冷至3.5℃的10mL低温保存溶液冲洗肝脏，并将其置于一个装满3.5℃低温保存溶液(100ml)的无菌袋中，确保无菌袋中排尽空气；温度以0.08℃/min的速度缓慢降至-5℃，低温保存维持48h。通常将装有供肝的无菌袋浸没于防冻剂中，于可控温冰箱中以0.08℃/min的速度冷却和复温。
(3)复苏处理：在超低温保存结束时，温度以0.08℃/min的速度逐渐升温至3.5℃，用预冷至3.5℃的10mL复苏溶液冲洗肝脏，之后以复苏溶液(150mL)为灌注液，在温度为19℃的条件下，对肝脏持续循环灌注3h促进肝功能恢复。通常在灌注第1分钟时将流量设定为3mL/min，严密监测压力以确保其不超过5cmH2O；然后缓慢地以1mL/3min的增量增加流速，最多至12mL/min。
复苏期间，通过检测灌注液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸和肝脏胆汁生成量等反映供体肝脏水平的指标，并通过干预措施维持灌注液水电解质酸碱平衡。
复苏后肝脏可直接行原位肝移植术。
实施例3
本实施例的加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液，与上述实施例1的用量差异，参见下表1。
大鼠肝脏实现超低温保存处理，具体步骤如下：
(1)加载处理：供体大鼠肝脏获取后，使用大鼠离体肝脏灌注系统，以加载溶液(150mL)作为灌注液，在21℃的室温环境下，通过门静脉对供肝进行循环灌注60min，使供肝充分摄取3-OMG和西洛酰胺(Cilostamide)，然后在机械灌注末期通过水浴装置以1.0℃/min的速度将温度降至4℃。通常在灌注第1分钟时将流量设定为8ml/min，严密监测压力以确保其不超过10cmH2O(1cmH2O＝0.098kPa)；然后缓慢地以1mL/min的增量增加流速至12mL/min，确保压力不超过15cmH2O。
(2)超低温保存处理：用预冷至4℃的10mL低温保存溶液冲洗肝脏，并将其置于一个装满4℃低温保存溶液(100ml)的无菌袋中，确保无菌袋中排尽空气；温度以0.1℃/min的速度缓慢降至-6℃，低温保存维持48h。通常将装有供肝的无菌袋浸没于防冻剂中，于可控温冰箱中以0.1℃/min的速度冷却和复温。
(3)复苏处理：在超低温保存结束时，温度以0.1℃/min的速度逐渐升温至4℃，用预冷至4℃的10mL复苏溶液冲洗肝脏，之后以复苏溶液(150mL)为灌注液，在温度为21℃的条件下，对肝脏持续循环灌注3h促进肝功能恢复。通常在灌注第1分钟时将流量设定为3mL/min，严密监测压力以确保其不超过5cmH2O；然后缓慢地以1mL/3min的增量增加流速，最多至12mL/min。
复苏期间，通过检测灌注液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸和肝脏胆汁生成量等反映供体肝脏水平的指标，并通过干预措施维持灌注液水电解质酸碱平衡。
复苏后肝脏可直接行原位肝移植术。
实施例4
本实施例的加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液，与上述实施例1的用量差异，参见下表1。
大鼠肝脏实现超低温保存处理，具体步骤如下：
(1)加载处理：供体大鼠肝脏获取后，使用大鼠离体肝脏灌注系统，以加载溶液(150mL)作为灌注液，在22℃的室温环境下，通过门静脉对供肝进行循环灌注70min，使供肝充分摄取3-OMG和西洛酰胺(Cilostamide)，然后在机械灌注末期通过水浴装置以1.1℃/min的速度将温度降至4.5℃。通常在灌注第1分钟时将流量设定为8ml/min，严密监测压力以确保其不超过10cmH2O(1cmH2O＝0.098kPa)；然后缓慢地以1mL/min的增量增加流速至12mL/min，确保压力不超过15cmH2O。
(2)超低温保存处理：用预冷至4.5℃的10mL低温保存溶液冲洗肝脏，并将其置于一个装满4.5℃低温保存溶液(100ml)的无菌袋中，确保无菌袋中排尽空气；温度以0.12℃/min的速度缓慢降至-6℃，低温保存维持48h。通常将装有供肝的无菌袋浸没于防冻剂中，于可控温冰箱中以0.12℃/min的速度冷却和复温。
(3)复苏处理：在超低温保存结束时，温度以0.12℃/min的速度逐渐升温至4.5℃，用预冷至4.5℃的10mL复苏溶液冲洗肝脏，之后以复苏溶液(150mL)为灌注液，在温度为22℃的条件下，对肝脏持续循环灌注4h促进肝功能恢复。通常在灌注第1分钟时将流量设定为3mL/min，严密监测压力以确保其不超过5cmH2O；然后缓慢地以1mL/3min的增量增加流速，最多至12mL/min。
复苏期间，通过检测灌注液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸和肝脏胆汁生成量等反映供体肝脏水平的指标，并通过干预措施维持灌注液水电解质酸碱平衡。
复苏后肝脏可直接行原位肝移植术。
实施例5
本实施例的加载溶液、低温保存液和复苏溶液三种溶液，与上述实施例1的用量差异，参见下表1。
大鼠肝脏实现超低温保存处理，具体步骤如下：
(1)加载处理：供体大鼠肝脏获取后，使用大鼠离体肝脏灌注系统，以加载溶液(150mL)作为灌注液，在23℃的室温环境下，通过门静脉对供肝进行循环灌注80min，使供肝充分摄取3-OMG和西洛酰胺(Cilostamide)，然后在机械灌注末期通过水浴装置以1.2℃/min的速度将温度降至5℃。通常在灌注第1分钟时将流量设定为8ml/min，严密监测压力以确保其不超过10cmH2O(1cmH2O＝0.098kPa)；然后缓慢地以1mL/min的增量增加流速至12mL/min，确保压力不超过15cmH2O。
(2)超低温保存处理：用预冷至5℃的10mL低温保存溶液冲洗肝脏，并将其置于一个装满5℃低温保存溶液(100ml)的无菌袋中，确保无菌袋中排尽空气；温度以0.15℃/min的速度缓慢降至-6℃，低温保存维持48h。通常将装有供肝的无菌袋浸没于防冻剂中，于可控温冰箱中以0.15℃/min的速度冷却和复温。
(3)复苏处理：在超低温保存结束时，温度以0.15℃/min的速度逐渐升温至5℃，用预冷至5℃的10mL复苏溶液冲洗肝脏，之后以复苏溶液(150mL)为灌注液，在温度为23℃的条件下，对肝脏持续循环灌注5h促进肝功能恢复。通常在灌注第1分钟时将流量设定为3mL/min，严密监测压力以确保其不超过5cmH2O；然后缓慢地以1mL/3min的增量增加流速，最多至12mL/min。
复苏期间，通过检测灌注液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸和肝脏胆汁生成量等反映供体肝脏水平的指标，并通过干预措施维持灌注液水电解质酸碱平衡。
复苏后肝脏可直接行原位肝移植术。
表1实施例1-5的加载溶液、低温保存液和复苏溶液配比
Figure BDA0003485742950000141
Figure BDA0003485742950000151
对比例1
本对比例与上述实施例3的区别在于：
复苏处理中，采用的复苏溶液中不添加0.856mg的西洛酰胺。
试验检测
复苏期间，对实施例3的灌注液(复苏溶液)以及对比例1的灌注液(复苏溶液)，进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸水平、门脉阻力水平、肝脏产生的胆汁量等肝功能参数的比较，并比较复苏后肝脏组织ATP水平。其中，实施例3以“Cilostamide”作为实验组的命名，对比例1以“Controlz”作为对照组的命名。试验检测中，“Cilostamide”的实验组及“Controlz”的对照组，均是以5只大鼠进行平行试验，试验结果取平均值进行比较，对比具体参见表2至表7，以及附图2至附图7。
另外，检测肝移植术后2周血清ALT水平、血清AST水平和血清胆红素水平。
(一)谷丙转氨酶(ALT)水平
表2实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中谷丙转氨酶(ALT)水平数据表
Figure BDA0003485742950000161
结合附图2，附图2是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中谷丙转氨酶(ALT)水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低谷丙转氨酶(ALT)水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，使得肝脏质量较好。
(二)谷草转氨酶(AST)水平
表3实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中谷草转氨酶(AST)水平数据表
Figure BDA0003485742950000171
结合附图3，附图3是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中谷草转氨酶(AST)水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低谷草转氨酶(AST)水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，使得肝脏质量较好。
(三)乳酸水平
表4实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中乳酸水平数据表
Figure BDA0003485742950000181
结合附图4，附图4是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中乳酸水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低乳酸水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，使得肝脏质量较好。
(四)门脉阻力水平
表5实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中门脉阻力水平数据表
Figure BDA0003485742950000191
结合附图5，附图5是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中乳酸水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低门脉阻力水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，使得肝脏质量较好。
(五)复苏期间肝脏产生的胆汁生成量
表6实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，肝胆的胆汁生成量数据表
Figure BDA0003485742950000192
Figure BDA0003485742950000201
结合附图6，附图6是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理期间，灌注液(复苏溶液)中胆汁生成量示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能提高胆汁生成量，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，肝脏的肝功能复苏效果较好。
(六)复苏后肝脏ATP水平
表7实施例3与对比例1供肝在复苏后肝脏ATP水平数据表
Figure BDA0003485742950000202
Figure BDA0003485742950000211
结合附图7，附图7是本发明实施例3与对比例1供肝在复苏处理后，灌复苏后肝脏ATP水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，使得复苏后肝脏ATP水平能恢复至正常水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，肝脏的肝功能复苏效果较好。
(七)肝移植术后2周血清ALT水平
表8实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清ALT水平数据表
Figure BDA0003485742950000212
Figure BDA0003485742950000221
结合附图8，附图8是实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清ALT水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低谷丙转氨酶(ALT)水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，肝移植后的肝脏功能较好，恢复效果较好。
(八)肝移植术后2周血清AST水平
表9实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清AST水平数据表
Figure BDA0003485742950000222
Figure BDA0003485742950000231
结合附图9，附图9是实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清AST水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低谷草转氨酶(AST)水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，肝移植后的肝脏功能较好，恢复效果较好。
(九)肝移植术后2周血清胆红素水平
表10实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清胆红素水平数据表
Figure BDA0003485742950000232
结合附图10，附图10是实施例3与对比例1供肝，在肝移植术后2周血清胆红素水平示意图；可见，本申请实施例3的复苏过程中采用含有西洛酰胺的复苏溶液，能降低血清胆红素水平水平，即采用西洛酰胺的复苏溶液进行保存处理，能减少肝细胞损伤，肝移植后的肝脏功能较好，恢复效果较好。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种肝脏的超低温保存溶液，其特征在于：包括加载溶液、低温保存液和复苏溶液；
所述加载溶液包括如下组成：
Figure FDA0003978909300000011
所述低温保存液包括如下组成：
Figure FDA0003978909300000012
所述复苏溶液包括如下组成：
Figure FDA0003978909300000013
2.一种应用权利要求1所述肝脏的超低温保存溶液的超低温保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)加载处理：采用SNMP加载溶液作为灌注液，在室温下对供肝进行SNMP加载灌注处理，然后降温至3-5℃；
(2)超低温保存处理：采用预冷至3-5℃的低温保存溶液冲洗供肝，然后将供肝置于装满3-5℃低温保存溶液的无菌袋中，再降温至-3～-6℃；
(3)复苏处理：先将装有供肝和低温保存溶液的无菌袋升温至3-5℃，再采用复苏溶液冲洗供肝，再以复苏溶液作为灌注液对供肝持续SNMP加载灌注处理，复苏供肝。
3.根据权利要求2所述的一种肝脏的超低温保存方法，其特征在于：所述加载处理中，控制SNMP加载灌注处理的室温温度为18-23℃，SNMP加载灌注处理的时间为50-80min，降温至3-5℃的降温速率为0.8-1.2℃/min；所述超低温保存处理中，降温至-3～-6℃的降温速率为0.05-0.15℃/min。
4.根据权利要求2所述的一种肝脏的超低温保存方法，其特征在于：所述复苏处理中，升温至3-5℃的升温速率为0.05-0.15℃/min，采用复苏溶液SNMP加载灌注处理的处理温度为18-23℃、处理时间为2-5h。
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