CN101892194A - 一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法 - Google Patents
一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法，将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制剂milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养6-9小时，用不含有milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时；脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，移至洗涤液内，捡出排出第一极体的卵母细胞，统计极体排除率即成熟率；将排出第一极体的卵母细胞用5μMol/L离子霉素激活4-5分钟，洗涤液洗涤1-3次，再用2-3小时前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6-甲氨基嘌呤激活2-3小时，用2小时前在CO2箱平衡好的培养液洗涤3-4次，入培养液内培养48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率即可。另将染色分离获取的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时直接利用。该法对绵羊卵母细胞体外利用有重大的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及磷酸二酯酶抑制剂(PDE)milrinone，对经过BCB筛选后的质量不好的BCB阴性卵母细胞进行抑制的方法，能显著提高绵羊卵母细胞体外成熟率。
背景技术
PDEs是一类能水解细胞内环核苷酸第二信使的同工酶，在哺乳动物中，根据PDE动力学、底物特异性、组织细胞中的分布、抑制剂和激动剂以及氨基酸序列而将其分为11类，PDE3是其中一类。许多研究表明，哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复受第二信使cAMP调节，而PDE是调控细胞内cAMP水平的一种关键酶，因此PDE能够阻滞体外培养卵母细胞减数分裂的恢复，在卵母细胞成熟分裂的调控过程中起重要作用。
在前期研究的一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法(专利申请号：200910113567.9)中发现，经过BCB筛选后的阴性卵母细胞成熟率极显著低于阳性卵母细胞，因而，如何提高阴性卵母细胞质量成为亟待解决的问题。文献检索披露：1.Biology of Reproduction，69(2003)，2045-2052，作者：D.Nogueira等，发表的《磷酸二酯酶抑制剂3在小鼠体外未成熟卵母细胞发育能力中的作用》文章得出，10μMol/L PDE3抑制剂短暂阻滞小鼠卵母细胞减数分裂，能促进其发育能力。2.Fertility and Sterility，91，5(2009)，2037-2042，作者：Byung Chul Jee，M.D.发表的《成熟培养液中磷酸二酯酶抑制剂3对小鼠胚胎发育的作用》文章内容是，比较了1μMol/L、5μMol/L、10μMol/L浓度的PDE3抑制剂分别作用6h和24h，对小鼠卵母细胞的成熟、受精及后期发育没有影响。3.Biology of Reproduction，66(2002)，180-184，作者：Mario A.Mayes等发表的《PDE3和PDE4在维持牛卵母细胞减数分裂阻滞中的作用》的文章中得出，PDE3在维持牛卵母细胞减数分裂阻滞中起重要作用，而PDE4不起作用。4.Biology of Reproduction，74(2006)，177-184，作者：D.Nogueira等发表的《PDE3能提高人卵母细胞体外成熟及后期发育能力》，文章得出：用PDE3抑制的人卵母细胞将近98％阻滞在减数分裂时期，成熟率极显著高于未抑制组。
国内有广西大学动物繁殖研究所卞桂华等5人发表的《磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞减数分裂成熟的影响》、内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室周波等4人发表的《磷酸二酯酶亚型抑制剂与细胞周期蛋白抑制剂对绵羊卵母细胞体外成熟的影响》、中国农业大学生物学院卜淑敏等3人发表的《3种磷酸二醋酶对小鼠卵母细胞自发成熟的影响》以及西北农林科技大学生物工程研究所马利兵等5人发表的《磷酸二酯酶抑制剂对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响》。本发明将PDE3与BCB筛选技术相结合作为本方法的切入点，展开的方法学与应用学的研究，具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目在于：为提高绵羊卵母细胞的质量，即先采用BCB染色筛选，再对筛选后的质量差的卵母细胞用milrinone进行抑制培养，效果十分明显，该方法简单易操作，实用性极强。
本发明的目的是这样实现的：一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法，将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制剂milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养6-9小时，用不含有milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时；脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，移至洗涤液内，捡出排出第一极体的卵母细胞，统计极体排除率即成熟率；将排出第一极体的卵母细胞用5μMol/L离子霉素激活4-5分钟，洗涤液洗涤1-3次，再用2-3小时前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6-甲氨基嘌呤激活2-3小时，用2小时前在CO2箱平衡好的培养液洗涤3-4次，入培养液内培养48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率即可；
其中BCB-卵母细胞的获取：摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3-4次；用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为25-30μMol/L的BCB染色液，至于35-39℃水浴中染色80-90分钟；在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离；
其中染色分离的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时，直接利用即可；
其中实验液体的配制：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/ml PVA+0.7mg/ml肝素钠；
亮甲酚蓝染色液：26μMol/L亮甲酚蓝+PBS+5mg/ml BSA；
含有milrinone的成熟培养液：50-100μMol/L milrinone+TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
成熟培养液：TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
洗涤液：10％FBS+90％TCM199-hepes；
SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；
培养液：SOF+3mg/ml BSA；
离子霉素：5μMol/L离子霉素+1％二甲基亚砜+10％胎牛血清+89％TCM199-hepes；
6-甲氨基嘌呤：2mMol/L 6-甲氨基嘌呤+1％二甲基亚砜+10％胎牛血清+89％TCM199-HCO3。
所述的提高绵羊卵母细胞质量的方法，显微镜下的着蓝色的卵母细胞被设为BCB+，没着蓝色的卵母细胞设为BCB-，BCB-的卵母细胞细胞质量显著低于BCB+。
所述的提高绵羊卵母细胞质量的方法，脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，是将卵母细胞置于浓度为0.1％的透明质酸酶溶液内，经反复吹吸即可。
所述的提高绵羊卵母细胞质量的方法，所用试剂均为专项订购或市售产品。
本发明的构思及研究机理表明添加PDE3特异性抑制因子(如cilostamide，milrinone)能有效抑制PDE3活性，维持胞内cAMP高浓度，从而阻滞卵母细胞的自发减数分裂，为核质同步成熟提供时间，恢复成熟培养后，体外培养囊胚发育率能显著提高。
本发明在前期的研究中，已经验证了亮甲酚蓝染色(BCB)(专利申请号：200910113567.9)可用于测定G6PDH活性，根据G6PDH活性的不同，BCB染色呈现不同程度的着色；并且发现BCB-卵母细胞体外培养的成熟率、卵裂率、囊胚率显著低于BCB+组，因此采用milrinone抑制剂与BCB筛选技术相结合；就是将BCB-卵母细胞使用milrinone抑制剂进行抑制，能提高BCB-卵母细胞质量，而BCB+卵母细胞质量不受任何影响，从而能提高卵母细胞总体利用率。
本发明构思以提高卵母细胞总体利用率为切入点，采用milrinone抑制剂与BCB筛选技术相结合的技术路线科学合理，组合方法达到了创新效果，且有独到之处，彰显技术进步。
具体实施方式
实施例
实验操作方法：
摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3次；用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面6mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在45mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为30μMol/L的BCB染色液，至于36℃水浴中染色90分钟；在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离；BCB+卵母细胞直接用成熟培养液洗涤2次，培养至24小时；再将BCB-卵母细胞用含有80μMol/L的PDE3抑制剂milrinone的成熟培养液洗涤2次，培养8小时，用不含有milrinone的成熟培养液洗涤3次，培养至24小时；脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，移至洗涤液内，捡出排出第一极体的卵母细胞，统计极体排除率即成熟率；将排出第一极体的卵母细胞用5μMol/L离子霉素激活4分钟，洗涤液洗涤2次，再用3小时前在CO2箱平衡好的2mMo l/L 6-甲氨基嘌呤激活3小时，用2小时前在CO2箱平衡好的培养液洗涤3次，入培养液内培养48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率即可；
其中染色分离的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤3次，培养至24小时，直接利用即可；
其中实验液体的配置：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠；
亮甲酚蓝染色液：26μMol/L亮甲酚蓝+PBS+5mg/ml BSA；
含有milrinone的成熟培养液：50-100μMol/L milrinone+TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
成熟培养液：TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
洗涤液：10％FBS+90％TCM199-hepes；
SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；
培养液：SOF+3mg/ml BSA；
离子霉素：5μMol/L离子霉素+1％二甲基亚砜+10％FBS+89％TCM199-hepes；
6-甲氨基嘌呤：2mMol/L 6-甲氨基嘌呤+1％二甲基亚砜+10％FBS+89％TCM199-HCO3。
该方法将显微镜下的着蓝色的卵母细胞设为BCB+，没着蓝色的卵母细胞设为BCB-，BCB-的卵母细胞细胞质量显著低于BCB+。
该方法在脱去卵母细胞周围的颗粒细胞时，是将卵母细胞置于浓度为0.1％的透明质酸酶溶液内，经反复吹吸即可。
实验结果及数据验证：用两组数据验证其采用milrinone抑制与BCB染色相结合的方法的有效性。
实验一组：
未经BCB筛选的卵母细胞用milrinone直接抑制，无法提高卵母细胞的总体效率。结果见表1。
表1
由上表得知：未经BCB筛选的卵母细胞经milrinone抑制后，成熟率、卵裂率和囊胚率的数据都低于对照组。
实验二组：
将milrinone与BCB染色相结合，能最大限度的提高卵母细胞质量及后期发育能力。
表2
由上表得知：经milrinone抑制的BCB-卵母细胞成熟率和卵裂率皆显著高于没经抑制的BCB-卵母细胞，囊胚率也显著高于没经抑制的BCB-卵母细胞。
Claims (4)
1.一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法，其特征在于：将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制剂milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养6-9小时，用不含有milrinone的成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时；脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，移至洗涤液内，捡出排出第一极体的卵母细胞，统计极体排除率即成熟率；将排出第一极体的卵母细胞用5μMol/L离子霉素激活4-5分钟，洗涤液洗涤1-3次，再用2-3小时前在CO2箱平衡好的2mMol/L 6-甲氨基嘌呤激活2-3小时，用2小时前在CO2箱平衡好的培养液洗涤3-4次，入培养液内培养48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率即可；
其中BCB-卵母细胞的获取：摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3-4次；用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为25-30μMol/L的BCB染色液，至于35-39℃水浴中染色80-90分钟；在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离；
其中染色分离的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24小时，直接利用即可；
其中实验液体的配制：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/ml PVA+0.7mg/ml肝素钠；
亮甲酚蓝染色液：26μMol/L亮甲酚蓝+PBS+5mg/ml BSA；
含有milrinone的成熟培养液：50-100μMol/L milrinone+TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml estradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
成熟培养液：TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
洗涤液：10％FBS+90％TCM199-hepes；
SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；
培养液：SOF+3mg/mlBSA；
离子霉素：5μMol/L离子霉素+1％二甲基亚砜+10％胎牛血清+89％TCM199-hepes；
6-甲氨基嘌呤：2mMol/L 6-甲氨基嘌呤+1％二甲基亚砜+10％胎牛血清+89％TCM199-HCO3。
2.按照权利要求1所述的提高绵羊卵母细胞质量的方法，其特征在于：显微镜下的着蓝色的卵母细胞被设为BCB+，没着蓝色的卵母细胞设为BCB-，BCB-的卵母细胞细胞质量显著低于BCB+。
3.按照权利要求1所述的提高绵羊卵母细胞质量的方法，其特征在于：脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，是将卵母细胞置于浓度为0.1％的透明质酸酶溶液内，经反复吹吸即可。
4.按照权利要求1所述的提高绵羊卵母细胞质量的方法，其特征在于：所用试剂均为专项订购或市售产品。
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