CN101451122B - 褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法 - Google Patents

褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼鳔组织为材料启动原代培养，在含胎牛血清、羧甲基壳寡糖、碱性成纤维样细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、N-乙酰葡萄糖盐酸盐和对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清液的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼鳔细胞系，目前已传至第62代，其工艺科学合理，可望应用于生态毒理学研究，对海洋中存在的各种环境毒物进行污染监测和安全性评价；还可应用于鱼类病毒的分离、鉴定、体外繁殖以及病毒与宿主细胞相互作用等方面的研究。

Description

褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法
技术领域
本发明涉及一种利用褐点石斑鱼鳔组织细胞建立鳔细胞系的方法——褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法。
背景技术
近年来，随着各种海洋鱼类病毒性疾病大规模爆发和海洋环境污染的日益加剧，水产养殖业损失巨大，同时，海洋中各种环境污染物，包括基因毒物、诱变剂、致癌物、环境激素和内分泌干扰物等在水体中存在和在鱼体内的富集对人类健康带来了极大的威胁，急需各种鱼类病毒疫苗，并建立海洋环境监测系统。而鱼类细胞系，特别是海洋重要经济鱼类的各种组织细胞系，正是作为研究病毒感染途径、感染机理，研制鱼类病毒疫苗的重要体外研究体系，也是进行环境污染监测和安全性评价的重要体外研究模型，尽快建立多种海洋重要经济鱼类细胞系并在此基础上进行鱼类病毒学和环境毒理学研究，是该领域的研究热点和主攻方向之一。
褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)俗称“老虎斑”，是我国重要的海水养殖鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带海域，具有较高的经济价值。目前，还未有建立褐点石斑鱼其鳔组织细胞系的相关报道，也没有通过鳔细胞系在病毒病和环境监测中进行应用研究的成功报道。成功建立褐点石斑鱼鳔细胞系可望应用于生态毒理学研究，对海洋中存在的各种环境毒物进行污染监测和安全性评价；还可应用于鱼类病毒的分离、鉴定、体外繁殖以及病毒与宿主细胞相互作用等方面的研究，促进水产养殖业的持续健康发展，带来巨大的经济效益。
发明内容
本发明的目的就是利用褐点石斑鱼鳔组织，提供一种褐点石斑鱼鳔细胞系的构建技术，以弥补现有技术的不足。
本发明的构建方法：首先将鲜活褐点石斑鱼暂养于浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中消毒处理，24小时后以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中解剖取下鳔组织，磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；离心收集的鳔组织块用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶进行预处理的25毫升培养瓶中，22～24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，再添加2.5毫升上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液；待褐点石斑鱼鳔细胞长成单层后，再使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清和0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖、pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液。为了促进褐点石斑鱼鳔细胞的分裂和快速增殖，本发明又添加了0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.02‰～0.04‰的I型人胰岛素样生长因子和0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐。为了建立褐点石斑鱼鳔细胞的最佳增殖条件，本发明在上述专用培养液的基础上又添加了10％-20％的已抽滤的对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清液。
本发明构建的主要特点是：细胞系可以连续传代，因此能提供出大量的褐点石斑鱼鳔细胞；细胞系既可作为进行环境监测和安全性评价的体外模型，又可为鱼类病毒学等多种相关研究提供理想的体外研究，经这种方法所构建的鳔细胞系现已传至第62代。
具体实施方式
将上述本发明的方法按照细胞系构建的细致步骤进行详述如下：
1、0.01％明胶预处理25毫升培养瓶：为了促进体外培养的褐点石斑鱼鳔细胞更好的贴壁生长，原代培养实验前将0.01克明胶(Gibco)溶解在100毫升无钙镁的磷酸盐缓冲液中，放置于50度水浴中15～30分钟使其溶解，0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，吸取1毫升明胶溶液加入25毫升培养瓶中包被培养瓶底面，室温放置1～2小时后将明胶从培养瓶中吸出，培养瓶备用。
2、褐点石斑鱼鳔组织块的制备：鲜活褐点石斑鱼于浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒1～2分钟。于超净工作台中无菌解剖取下鳔组织，用磷酸盐缓冲液漂洗2遍后在含有5％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，将鳔组织剪成约1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳔组织块；用含有5％胎牛血清(Hyclone)和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液(Gibco)充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶预处理的25毫升培养瓶(Corning)中；将培养瓶放入22-24℃培养箱中，正置干贴16～20小时。
3、褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液(pH7.0～7.4)3.0毫升，加入羧甲基壳寡糖0.15～0.3毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为本发明的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液。为了促进褐点石斑鱼鳔细胞的分裂和快速增殖，在上述专用培养液的基础上又添加了0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子(Sigma)、0.02‰～0.04‰的人I型胰岛素样细胞生长因子(Sigma)和0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐(Sigma)。为了建立褐点石斑鱼鳔细胞的最佳增殖条件，本发明在上述专用培养液的基础上又添加了占上述专用增殖培养液10％-20％的已抽滤的对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清液。褐点石斑鱼心脏细胞对数期细胞上清液取自褐点石斑鱼心脏细胞系，经0.22微米的微孔滤膜过滤除去杂细胞和其他杂质。
4、褐点石斑鱼鳔细胞原代培养的启动：将每瓶干贴后的鳔组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22～24℃培养；鳔细胞迁出后，每间隔3～5天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液；
5、褐点石斑鱼鳔细胞的传代培养：待褐点石斑鱼鳔细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.1％～0.3％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5～1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳔细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳔细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳔细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例1
褐点石斑鱼鳔组织原代实验前，将0.01克明胶(Gibco)溶解在100毫升无钙镁的磷酸盐缓冲液中，放置于50度水浴中15分钟使其溶解，0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，吸取1毫升明胶溶液加入25毫升培养瓶中包被培养瓶底面，室温放置1小时后将明胶从培养瓶中吸出，培养瓶备用。将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒2分钟，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出鳔组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子夹取整个取下鳔组织，漂洗2遍，洗去鳔组织表面粘液；转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳔组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶预处理的25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入22℃培养箱中，正置干贴16小时。
取常规配制的DMEM/F12培养液(pH 7.2)3毫升，加入羧甲基壳寡糖0.3毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液。在上述专用培养液中又添加了0.01‰人碱性成纤维细胞生长因子和0.05‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐，更有利于褐点石斑鱼鳔细胞的分裂和快速增殖。将每瓶干贴后的鳔组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22℃培养；鳔细胞迁出后，每间隔5天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液。待鳔细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.3％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳔细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳔细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳔细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例2
褐点石斑鱼鳔组织原代实验前，将0.01克明胶(Gibco)溶解在100毫升无钙镁的磷酸盐缓冲液中，放置于50度水浴中20分钟使其溶解，0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，吸取1毫升明胶溶液加入25毫升培养瓶中包被培养瓶底面，室温放置1.5小时后将明胶从培养瓶中吸出，培养瓶备用。将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒2分钟，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出鳔组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子夹取整个取下鳔组织，漂洗2遍，洗去鳔组织表面粘液；转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳔组织块；用含有5％胎牛血清和0.1‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶预处理的25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴18小时。
将每瓶干贴后的鳔组织中加入5毫升的pH值为7.4的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液，其中添加了0.01‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.02‰的人I型胰岛素样细胞生长因子和0.1‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐，有利于褐点石斑鱼鳔细胞的贴壁、分裂和快速增殖。还添加了占上述专用增殖培养液10％已抽滤的对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清液，以建立褐点石斑鱼鳔细胞的最佳增殖条件。于24℃培养；鳔细胞迁出后，每间隔4天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液；待褐点石斑鱼鳔细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.1％的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳔细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳔细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳔细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例3
褐点石斑鱼鳔组织原代实验前，将0.01克明胶(Gibco)溶解在100毫升无钙镁的磷酸盐缓冲液中，放置于50度水浴中30分钟使其溶解，0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，吸取1毫升明胶溶液加入25毫升培养瓶中包被培养瓶底面，室温放置2小时后将明胶从培养瓶中吸出，培养瓶备用。将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒1分钟，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出鳔组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子夹取整个取下鳔组织，漂洗2遍，洗去鳔组织表面粘液；转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳔组织块；用含有5％胎牛血清和0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶预处理的25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴20小时。
将每瓶干贴后的鳔组织中加入5毫升的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液，其中添加了0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.04‰的人I型胰岛素样细胞生长因子和0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐，以满足褐点石斑鱼鳔细胞的最佳增殖条件。还添加了占上述专用增殖培养液20％已抽滤的对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清液，以建立褐点石斑鱼鳔细胞的最佳增殖条件。24℃培养；鳔细胞迁出后，每间隔3天，吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入2.5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳔细胞专用培养液；待褐点石斑鱼鳔细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳔细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳔细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳔细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

Claims (2)

1.一种褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法，首先将鲜活褐点石斑鱼暂养于浓度均为1000单位／毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中消毒处理，24 小时后以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中解剖取下鳔组织，用磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1mm3 的组织块；离心收集的鳔组织块则用含有5％胎牛血清和0.05 ‰ -0.15 ‰的羧甲基壳寡糖的pH 值为7.0-7.4的DMEM / F12 培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶进行预处理的25毫升培养瓶中，22-24℃ 下正置干贴16-20 小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液，置22-24℃生化培养箱中培养，每隔3-5天吸出2.5 毫升上述25 毫升培养瓶中的培养液，再添加2.5 毫升上述褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液；待褐点石斑鱼鳔细胞长成单层后，使用浓度为0.1％-0.3％胰蛋白酶溶液消化，按1 瓶传2 瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清和0.05‰-0.15‰比例的羧甲基壳寡糖、pH 值为7.0-7.4 的DMEM / F12 培养液。
2.如权利要求1 所述的细胞系的构建方法，其特征是在上述褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液中又添加占该培养液0. 01‰-0.02‰比例的人碱性成纤维细胞生长因子、0.02‰-0.04‰比例的I 型人胰岛素样生长因子和0.05‰-0.15‰ 的N-乙酰葡萄糖盐酸盐。 
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