CN103952369B - 一株草鱼鱼鳔上皮样细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株草鱼鱼鳔上皮样细胞系及其应用。保藏编号为CCTCC No.C201443的草鱼鱼鳔上皮样细胞系，草鱼呼肠孤病毒GCRV在该细胞系中的增殖量显著高于目前常用于分离GCRV的CIK、CO、PSF、FHM、EPC等细胞系，且细胞病变时间快，因此，该细胞系可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研究。
Description
技术领域
本发明涉及细胞学技术领域，特别涉及一株草鱼鱼鳔上皮样细胞系及其应用。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodonidellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，一种草食性鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养殖的重要品种，除新疆、青藏高原外，在我国各地均有养殖，也是广东省的淡水主养品种之一。但是草鱼养殖期间易发生病害问题，其中以病毒性出血病最甚，对我国草鱼养殖业造成巨大损失。草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovims，GCRV)感染导致的草鱼出血病已经成为制约草鱼产业健康发展的重要因素之一。目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防。鱼类细胞系正是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要研究体系。因此，建立草鱼细胞系，是进行草鱼呼肠孤病毒的分离与鉴定，研究其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需求鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。
根据病鱼所表现的症状及病理变化，大致可以将草鱼出血病分为“红肌肉型”、“红鳍红鳃盖型”、“肠炎型”三种类型。
红肌肉型：病鱼外表无明显的出血现象，或仅表现轻微出血，但肌肉明显充血，有的表现为全身肌肉充血，有的表现为斑点状充血；红鳍红鳃盖型：病鱼的鳃盖、鳍条、头顶、口腔、眼腔等表现明显充血，有时鳞片下也有充血现象，但肌肉充血不明显，或仅局部表现为点状充血；肠炎型：其特点是体表和肌肉充血现象不太明显，但肠道严重充血，肠道全部或部分呈鲜红色，肠系膜、脂肪，鳔壁时有点状充血。学者研究表明，草鱼呼肠孤病毒GCRV的靶器官是肾，病毒感染导致鱼体免疫力下降，最终死亡。所以，大部分学者将目光放在靶器官细胞系的建立上，而忽视了鱼鳔。
迄今为止，已有草鱼肾脏细胞系、草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S1、吻端成纤维细胞系PSF、草鱼尾鳍组织二倍体细胞系、草鱼囊胚细胞系、肝细胞系等几个细胞系的文献报道，但是仍未见草鱼鱼鳔细胞系的报道。本发明对来源于草鱼的鱼鳔组织进行细胞培养，建立了草鱼鳔细胞系（命名为GSB,GrasscarpSwimmingBlander），并纯化出两株不同形态的细胞系GSB-E（上皮样细胞系）和GSB-F（成纤维样细胞系）。
发明内容
本发明的目的在于提供一株草鱼鱼鳔上皮样细胞系及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
申请人于2014年3月1日将细胞系提交至位于湖北省武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2014年3月6日收到申请人提供的草鱼鱼鳔上皮样细胞系GSB-E，给予该培养物的保藏号为CCTCCNo.C201443，并于2014年3月20日检测其存活。
保藏编号为CCTCCNo.C201443的草鱼鱼鳔上皮样细胞系在在鱼类病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研制中的应用。
保藏编号为CCTCCNo.C201443的草鱼鱼鳔上皮样细胞系在草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研制中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一株保藏编号为CCTCCNo.C201443的草鱼鱼鳔上皮样细胞系。草鱼呼肠孤病毒GCRV在该细胞系中的增殖量显著高于目前常用于分离GCRV的CIK、CO、PSF、FHM、EPC等细胞系，且细胞病变时间快，因此，该细胞系可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研究。
附图说明
图1为显微镜下观察传代培养的草鱼鱼鳔细胞系；
图2为透射电镜观察感染GCRV-JX-0901后的草鱼鱼鳔细胞系；
图3为GCRV-JX-0901在GSB-E中的增殖曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明内容。
实施例1
1、制备细胞培养液
取GIBCO公司M199培养基，加入占培养基总体积10-20%（以下所述百分比若无特别说明，均为体积百分比）的胎牛血清，终浓度为20ng/ml的碱性成纤维生长因子（bFGF），终浓度为1ng/ml的表皮生长因子（EGF），4℃存放，备用。
2、原代培养
本发明所用4尾草鱼（10±0.5cm）来源于珠江水产研究所养殖基地，约40日龄，原代细胞分离培养时间为2011年7月。
取鲜活草鱼于75％酒精中浸泡1～2min，无菌取出鱼鳔，用镊子去除膜，经PBS漂洗2次后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中（含200ulPBS），用手术剪将其剪碎；用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的25cm2培养瓶中，均匀地摆放在培养瓶底部，每瓶贴块20片左右；最后将培养瓶倒置放入饱和湿度的27℃培养箱中，倒置干贴4h后，加入5mL含20%胎牛血清的M199培养基正置继续培养10～15d，得到生长至80%～90%汇合的原代鱼鳔细胞。
3、传代培养
原代鱼鳔细胞铺满单层后，用吸管除去旧培养液，用PBS清洗两遍，加入0.25%胰酶（含EDTA）1mL消化细胞，待镜下观察细胞变圆后，加入10mL完全培养液，吹打，悬起细胞，以1:2进行传代，加入完全培养液至5mL/瓶，放入27℃培养箱中进行传代培养；以后约5天传代一次；传至第10代时，细胞培养液中血清含量减为总体积的10%，传至第20代时，培养液中不再添加bFGF和EGF（即，培养基配方为含有20%胎牛血清、PH值为7.2-7.4的M199培养液）。
4、细胞纯化
传代培养的草鱼鱼鳔细胞在传至20代时出现了成纤维样和上皮样两种细胞形态，按下述方法进行纯化：①将铺满瓶底的细胞采用胰酶消化法制备成细胞悬液，用含20%血清的M199培养基稀释至每毫升含5、15、50和100个细胞三种不同的稀释度；②分装96孔板一块，每个稀释度24孔，每孔量为0.2mL；③27℃湿润培养7-10天，出现克隆；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔；④待标记的孔长满，胰酶进行消化，转入6孔板培养；⑤6孔板细胞铺满底壁后，转入25cm2的细胞瓶中扩大培养。用此方法将两种形态的鱼鳔细胞分开，得到草鱼鱼鳔上皮样细胞系（GSB-E）和草鱼鱼鳔成纤维样细胞系（GSB-F）。
5、细胞冻存
用胰酶消化法收集细胞悬液，1000g离心5min后弃去上清,用1mL冻存保护液(含20%FBS和10%DMSO的M199培养液)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中于-70℃过夜，最后投入液氮(-196℃)中保存。
6、细胞复苏
自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于37℃水浴中融化，1000g离心5min，弃掉上清液，加入培养液5mL清洗细胞，1000r/min离心5min，以除去残留的冻存保护液。收集细胞后接种于25cm2的培养瓶中，放入27℃培养箱中进行培养，培养24h后更换培养液，继续培养。
本发明在进行组织块原代培养时，通过预先对培养瓶底部涂布胎牛血清和倒置培养4h，有效避免了组织块在培养液中脱离底壁浮起，提高了组织块的成活率。本发明的组织块培养法相对于酶消化法所获得的细胞较好的保持了原组织细胞的特性，避免了酶消化法对细胞表面蛋白的破坏。
本发明构建的草鱼鱼鳔细胞系生长状态良好，细胞能稳定增殖，GSB-E和GSB-F均传至80代以上。图1显示相差显微镜下传代培养的草鱼鱼鳔细胞系（标尺示100μm），A:草鱼鱼鳔组织块迁出细胞；B:草鱼鱼鳔细胞5代；C:草鱼鱼鳔细胞20代；D：纯化后草鱼鱼鳔上皮样细胞GSB-E50代；E:纯化后草鱼鱼鳔成纤维样细胞GSB-F50代。
实施例2
检测草鱼出血病病毒（GCRV）对不同细胞系的敏感程度：待细胞接种铺满25cm2细胞瓶底壁后，将1mL病毒溶液（3.2×103拷贝/μl）加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换含3%胎牛血清的新鲜细胞培养液，继续培养，约2天后，观察到细胞病变效应(CPE)后，将细胞做电镜切片观察。
比较不同细胞中两种株型GCRV病毒（GCRVJX-0901、GCRVHZ08）的增殖量：按上述方法将特定浓度的病毒（GCRVJX-0901160拷贝/μl、GCRVHZ083.6×106拷贝/μl）分别接种于本发明的第50代草鱼鱼鳔细胞（GSB-E、GSB-F）和其他5种常用鱼类细胞系：CIK（草鱼肾细胞，购于中国典型培养物保藏中心）、PSF（草鱼吻端成纤维细胞，珠江水产研究所自行培养）、CO（草鱼性腺细胞，购于中国典型培养物保藏中心）、EPC（鲤鱼内皮瘤细胞，购于中国典型培养物保藏中心）、FHM（胖头鱼细胞，购于中国典型培养物保藏中心）。6d后，提取病毒RNA，用FQ-PCR方法检测病毒含量，并应用统计学分析软件SPSS16.0对各细胞中同一毒株的病毒增殖量进行显著性分析，结果如表1所示，对GCRVJX-0901株病毒增殖最多的细胞是GSB-E，增殖量可达2.1033×107拷贝/μl，显著高于其它鱼类细胞（p＜0.01）；而对GCRVHZ08株病毒扩增量最大的细胞也是GSB-E细胞，其增殖量为8.9660×106拷贝/μl，显著高于在其它鱼类细胞中的增殖量（p＜0.01）。
草鱼鱼鳔细胞系感染草鱼呼肠孤病毒GCRV-JX-0901株后，透射电镜观察结果如图2所示，在草鱼鱼鳔细胞系中观察到大量GCRV病毒粒子，A:GSB-E感染GCRV病毒48h后的细胞电镜切片图；B:GSB-F感染GCRV病毒48h后的细胞电镜切片图。
表1不同细胞中GCRVJX-0901株和HZ08株病毒增殖量
注：本表中所有的数据分析P<0.01。
用基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒GCRVJX0901株（病毒含量3.2×103拷贝/μl）分别感染GSB-E和GSB-F，利用建立的基因I型GCRVTaqManReal-TimePCR检测方法对GCRVJX0901株感染GSB细胞后第1-14天中细胞液上清和细胞中病毒量进行定量分析。试验结果表明（见表2、图3），上清中的病毒含量显著低于细胞，JX0901在GSB-E中的增殖量要高于GSB-F，JX0901在GSB-E细胞中第3天拷贝数到达峰值，之后呈下降趋势，在上清中病毒拷贝数呈上升趋势。
表2JX0901感染GSB-E和GSB-F后上清和细胞中拷贝数（拷贝/μl）
实验证明，来源于草鱼鱼鳔的细胞GSB-E中病毒GCRV的增殖量显著高于目前常用于分离草鱼呼肠孤病毒的CIK、CO、PSF、FHM、EPC等细胞系，且细胞病变时间快，因此GSB-E可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研究。
Claims (3)
1.一株草鱼鱼鳔上皮样细胞系，其保藏编号为CCTCCNo.C201443。
2.保藏编号为CCTCCNo.C201443的草鱼鱼鳔上皮样细胞系在鱼类病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研制中的应用，其特征在于：鱼类病毒为呼肠孤病毒。
3.保藏编号为CCTCCNo.C201443的草鱼鱼鳔上皮样细胞系在草鱼呼肠孤病毒的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研制中的应用。
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