CN103122334A - 异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养及纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养及纯化方法，包括肠道上皮组织的取样、制备培养液、组织块培养、肠道上皮细胞的纯化的步骤。本发明对异育银鲫肠道上皮细胞的分离、培养和纯化等培养过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养方法，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h，大大缩短了培养时间，所建立的异育银鲫肠道上皮细胞模型可用于营养物质消化吸收机制、外源物质的细胞毒性、细胞的发育与代谢等相关研究，并为这些研究提供了便利。

Description

异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养及纯化方法

技术领域

本发明涉及养殖水生生物组织与细胞培养工程领域，特别是对异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养改进方法。

背景技术

细胞培养就是把细胞从生物体中分离出来，在体外模拟体内的生理环境，使之在人工环境下存活并生长，以便于更直接地研究细胞的结构、功能、代谢和细胞对环境诸因素影响的反应等。目前，细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。

动物细胞的培养技术是1907年Harrison在淋巴块中对蛙的神经板培养成功开始的，虽然动物细胞的培养有上百年的历史，但与植物细胞和细菌、酵母相比，它的体外培养因物种、环境、结构等差异而困难得多。水生动物由于生活的环境特殊，组织器官的发育和结构与陆生动物比较有显著差异，因此细胞培养较晚。目前国内外先后有学者对鱼类的细胞培养作了研究，涉及的组织来源有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、性腺、肝脏、囊胚等。

肠道是鱼等水生动物重要的消化和吸收器官，具有多种生理、生化和免疫功能，可为机体提供充足的营养和能量。这些功能的发挥，有赖于肠道上皮细胞的分裂、分化和成长，实际上由于鱼物种之间的差异、机体系统和局部微环境众多可变因素的相互作用，使得对于鱼肠道上皮细胞的相关研究仍存在很大的困难，必需对不同种类的鱼进行分别研究。

鲫鱼肠道上皮细胞原代培养已有报道（宋增福, 吴天星, 潘晓东, 2008），但是这种培养技术存在以下缺点，影响了鲫鱼肠道上皮细胞的取样和纯化。一是肠壁剪碎成组织块的过程中，缺少明确的尺寸要求；二是培养板中肠道组织块之间的距离不明确；三是缺少肠道上皮细胞纯化的方法和判断标准；四是时间长。培养至细胞间正常衔接时间一般在一周以上。由于鱼种类的差异和细胞结构的区别，这些方法并不能单纯从其他鱼类细胞培养技术中等同或者延伸。鉴于此，本发明结合大量的科学实验，对异育银鲫肠道上皮细胞原代培养方法进行了改进，旨在更加利于此类细胞培养技术的操作和推广。

发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养及纯化方法，能大幅减少培养时间，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h。

异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)肠道上皮组织的取样：选取50-100g的健康异育银鲫禁食24h，经麻醉后在无菌室中取出中段肠道；

(2)制备培养液：在每毫升DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清；

(3)组织块培养：将异育银鲫肠壁剪碎为体积0.9-1.1 mm³的组织块，放入培养板中；培养板中肠道组织块之间的距离为0.2-0.3cm，加入0.25%胰蛋白酶为消化液，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打；加入含5％胎牛血清的DMEM终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入步骤(2)的培养液制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，置25-30℃，5％CO₂培养箱培养；培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的肠道上皮细胞；

(4)肠道上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法；将步骤(3)得到的肠道上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴ /ml，再种植在细胞培养瓶中，置25-30℃，5％CO2培养箱培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1-2次，得到预纯化肠道上皮细胞，去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）混合消化液，至倒置显微镜下80-90%细胞回缩时终止，得到纯化后的肠道上皮细胞。

本发明对异育银鲫肠道上皮细胞的分离、培养和纯化等培养过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养方法，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h，大大缩短了培养时间，所建立的异育银鲫肠道上皮细胞模型可用于营养物质消化吸收机制、外源物质的细胞毒性、细胞的发育与代谢等相关研究，并为这些研究提供了便利。

附图说明

 图1是实施例1原代培养异育银鲫肠道上皮细胞的状态图。

图2是实施例2原代培养异育银鲫肠道上皮细胞的状态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种异育银鲫肠道上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括以下步骤：

⑴ 肠道上皮组织的取样：选取64 ± 5 g的健康异育银鲫3只，禁食24h后经麻醉（MS-222, Sigma; 1:2500）后，放入70％乙醇中消毒l min。在无菌室中取出中段肠道，剪除肠系膜和脂肪，纵行剪开肠壁，用PBS缓冲液冲洗数次，去除肠道黏液，将肠壁剪碎得体积为0.9-1.1 mm³的组织块，备用。

⑵ 制备培养液：培养液按照下述投料比获得，在每ml的DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清。

⑶ 组织块培养：将步骤⑴得到的异育银鲫肠道组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入DMEM含5％胎牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入⑵制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，肠道组织块之间的距离为0.2-0.3cm，置28℃，5％CO₂培养箱培养。培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的肠道上皮细胞。

⑷ 肠道上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将得到的肠道上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴ /ml的密度再种植在细胞培养瓶，置28℃，5％CO₂培养箱培养。待细胞铺展到板底80%时，再依次重复2次，得到预纯化肠道上皮细胞，去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%EDTA混合消化液，至倒置显微镜下85%细胞回缩时终止，得到的即为纯化后的肠道上皮细胞。

⑸ 肠道上皮细胞的传代培养：将上述纯化后的肠道上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10⁴ /ml的密度植入培养瓶中于28℃，5％CO₂培养箱培养，隔日更换培养液，传代培养48h的肠道上皮细胞参见图1。

实施例2

一种异育银鲫肠道上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括以下步骤：

⑴ 肠道上皮组织的取样：选取75 ± 4 g的健康异育银鲫3只，禁食24h后经麻醉（MS-222, Sigma; 1:2500），放入70％乙醇中消毒l min。在无菌室中取出中段肠道，剪除肠系膜和脂肪，纵行剪开肠壁，用PBS缓冲液冲洗数次，去除肠道黏液，将肠壁剪碎得体积为0.9-1.1 mm³的组织块，备用。

⑵ 制备培养液：在每ml的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清获得。

⑶ 组织块培养：将步骤⑴得到的异育银鲫肠道组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入DMEM含5％胎牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入⑵制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，肠道组织块之间的距离为0.2-0.3cm，置28℃，5％CO₂培养箱培养。培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的肠道上皮细胞。

⑷ 肠道上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将得到的肠道上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴ /ml的密度再种植在细胞培养瓶，置30℃，5％CO₂培养箱培养。待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1次，得到预纯化肠道上皮细胞，去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%EDTA混合消化液，至倒置显微镜下80-90%细胞回缩时终止，得到的即为纯化后的肠道上皮细胞。

⑸ 肠道上皮细胞的传代培养：将上述纯化后的肠道上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10⁴ /ml的密度植入培养瓶中于30℃，5％CO₂培养箱培养，隔日更换培养液。传代培养48h的肠道上皮细胞参见图2。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.异育银鲫肠道上皮细胞的原代培养及纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)肠道上皮组织的取样：选取50-100g的健康异育银鲫禁食24h，经麻醉后在无菌室中取出中段肠道；

(2)制备培养液：在每毫升DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清；

(3)组织块培养：将异育银鲫肠壁剪碎为体积0.9-1.1 mm³的组织块，放入培养板中；培养板中肠道组织块之间的距离为0.2-0.3cm，加入0.25%胰蛋白酶为消化液，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打；加入含5％胎牛血清的DMEM终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入步骤(2)的培养液制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，置25-30℃，5％CO₂培养箱培养；培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的肠道上皮细胞；

(4)肠道上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法；将步骤(3)得到的肠道上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴ /ml，再种植在细胞培养瓶中，置25-30℃，5％CO2培养箱培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1-2次，得到预纯化肠道上皮细胞，去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）混合消化液，至倒置显微镜下80-90%细胞回缩时终止，得到纯化后的肠道上皮细胞。

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