CN103122333A - 一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法 - Google Patents
一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括鳃上皮组织的取样、制备培养液、组织块培养、鳃上皮细胞的纯化、鳃上皮细胞的传代培养的步骤。本发明对异育银鲫鳃上皮细胞的分离、培养和纯化等培养过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明异育银鲫鳃上皮细胞的原代培养方法，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h，大大缩短了培养时间，所建立的异育银鲫鳃上皮细胞模型可用于外源物质的细胞毒性、离子交换规律等相关研究，并为这些研究提供了便利。
Description
技术领域
本发明涉及养殖水生生物组织与细胞培养工程领域，特别是对异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养、传代等原代培养方法。
背景技术
鳃是水生动物重要的呼吸器官，具有多种生理、生化和免疫功能，可保障机体有充足的氧气。这些功能的发挥，有赖于鳃上皮细胞的分裂、分化和成长，实际上由于水生动物种类、机体系统和局部微环境等众多可变因素的相互作用，使得对于鳃上皮细胞发育、分化和防御等的研究存在很大的困难。
细胞培养就是把细胞从生物体中分离出来，在体外模拟在体的生理环境，使之在人工环境下存活并生长，以便于更直接地研究细胞的结构、功能、代谢和细胞对环境诸因素影响的反应等。目前，细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用作出了重要贡献。细胞培养技术应用于生物学领域研究具有许多优点。首先pH值、温度、渗透压、O2/CO2分压等理化因素是可控的，培养液可以根据试验的目的要求而添加或减少已知成份；其次经多次传代培养形成的细胞系，细胞呈均质或是均匀的，特征基本相同，而经克隆化筛选得到的细胞株，细胞类型单一，对外界影响的反应更加一致；再次可以提供大量遗传背景相同的细胞，供比较不同因素或者同一因素的不同剂量对同一细胞株的作用，还可以人工筛选具有一定变异特征的突变株或细胞融合体，有利于进行基因功能的研究。此外，细胞培养中的培养物可直接暴露在待测试剂中，待测试剂的用量少，并可直接观察结果；细胞、组织培养结合缩时电影技术，可以直接观察活细胞的活动和对外界作用的反应。
由于不同动物细胞的结构和组成、生长的环境和要求差异较大，所以针对某种特定的动物需要有独特的培养技术，特别是水生动物，终生生活在水中这一特殊的生境，因此水生动物细胞培养晚于陆生动物，国内外先后有学者对鱼类的细胞培养作了研究，涉及的组织来源有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、性腺、肝脏、肠道、囊胚等，方法具有显著差异，迄今仍没有一个通用的方法。此外，仅见尼罗罗非鱼鳃上皮细胞培养研究。罗非鱼属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科，为广盐性鱼类，而鲫鱼属鲤形目、鲤科，淡水鱼类。因此，尼罗罗非鱼与异育银鲫在生活习性、细胞组织结构和对氧气的耐受性等方面均具有显著的差异，从鳃上皮细胞培养技术来讲，并不能单纯从尼罗罗非鱼等同或者延伸到异育银鲫。由此可见，现有技术中尚缺乏对异育银鲫鳃上皮细胞原代培养技术仍缺乏详细的分离、纯化和培养技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养效果好，并可大幅缩短培养时间的异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法。
一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，其特征是包括以下步骤：
(1) 鳃上皮组织的取样：选取50-100g的健康异育银鲫禁食24h后经麻醉，放入70％乙醇中消毒l min；在无菌室中取出鳃，用磷酸盐缓冲液冲洗数次，去除鳃黏液，将鳃剪碎得体积为0.9-1.1 mm3的组织块，备用；
(2) 制备培养液：在每毫升DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清；
(3) 组织块培养：在步骤(1)得到的异育银鲫鳃组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入含5％胎牛血清的DMEM终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入步骤(2)的培养液制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，置25-30℃，5％CO2培养箱培养；培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的鳃上皮细胞；
(4) 鳃上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(3)得到的鳃上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104 /ml，种植在细胞培养瓶中，置25-30℃，5％CO2培养箱培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1-2次，得到预纯化鳃上皮细胞；去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸混合消化液，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，得到纯化后的鳃上皮细胞；
(5)鳃上皮细胞的传代培养：将步骤(4)纯化后的鳃上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×104 /ml的密度植入培养瓶中于25-30℃，5％CO2培养箱培养，隔日更换培养液。
进一步地，步骤（3）中，培养板中鳃组织块之间的距离优选为0.2-0.3cm。
本发明对异育银鲫鳃上皮细胞的分离、培养和纯化等培养过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明异育银鲫鳃上皮细胞的原代培养方法，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h，大大缩短了培养时间，所建立的异育银鲫鳃上皮细胞模型可用于外源物质的细胞毒性、离子交换规律等相关研究，并为这些研究提供了便利。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括以下步骤。
⑴ 鳃上皮组织的取样：选取64 ± 5 g的健康异育银鲫3只，禁食24h后经麻醉（MS-222, Sigma; 1:2500），放入70％乙醇中消毒l min。在无菌室中取出鳃，用磷酸盐缓冲液冲洗数次，去除鳃黏液，将鳃剪碎得体积为0.9-1.1 mm3的组织块，备用。
⑵ 制备培养液：培养液按照下述投料比获得，在每ml的DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清。
⑶ 组织块培养：将步骤⑴得到的异育银鲫鳃组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入DMEM含5％胎牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入⑵制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，鳃组织块之间的距离为0.2-0.3cm，置28℃，5％CO2培养箱培养。培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的鳃上皮细胞。
⑷ 鳃上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将得到的鳃上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104 /ml的密度再种植在细胞培养瓶，置28℃，5％CO2培养箱培养。待细胞铺展到板底80%时，再依次重复2次，得到预纯化鳃上皮细胞，去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%EDTA混合消化液，至倒置显微镜下85%细胞回缩时终止，得到的即为纯化后的鳃上皮细胞。
⑸ 鳃上皮细胞的传代培养：将上述纯化后的鳃上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×104 /ml的密度植入培养瓶中于28℃，5％CO2培养箱培养，隔日更换培养液。48h即可培养至细胞间正常衔接。
实施例2
一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括以下步骤。
⑴ 鳃上皮组织的取样：选取75 ± 4 g的健康异育银鲫3只，禁食24h后经麻醉（MS-222, Sigma; 1:2500），放入70％乙醇中消毒l min。在无菌室中取出鳃，用磷酸盐缓冲液冲洗数次，去除鳃黏液，将鳃剪碎得体积为0.9-1.1 mm3的组织块，备用。
⑵ 制备培养液：在每ml的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清获得。
⑶ 组织块培养：将步骤⑴得到的异育银鲫鳃组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入DMEM含5％胎牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入⑵制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，鳃组织块之间的距离为0.2-0.3cm，置28℃，5％CO2培养箱培养。培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的鳃上皮细胞。
⑷ 鳃上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将得到的鳃上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104 /ml的密度再种植在细胞培养瓶，置30℃，5％CO2培养箱培养。待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1次，得到预纯化鳃上皮细胞，去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%EDTA混合消化液，至倒置显微镜下80-90%细胞回缩时终止，得到的即为纯化后的鳃上皮细胞。
⑸ 鳃上皮细胞的传代培养：将上述纯化后的鳃上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×104 /ml的密度植入培养瓶中于30℃，5％CO2培养箱培养，隔日更换培养液。48h即可培养至细胞间正常衔接。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或者联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，其特征是包括以下步骤：
(1) 鳃上皮组织的取样：选取50-100g的健康异育银鲫禁食24h后经麻醉，放入70％乙醇中消毒l min；在无菌室中取出鳃，用磷酸盐缓冲液冲洗数次，去除鳃黏液，将鳃剪碎得体积为0.9-1.1 mm3的组织块，备用；
(2) 制备培养液：在每毫升DMEM培养基中添加0.1μg上皮细胞生长因子、0.1IU胰岛素、100IU青霉素、100μg链霉素和0.1ml胎牛血清；
(3) 组织块培养：在步骤(1)得到的异育银鲫鳃组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入含5％胎牛血清的DMEM终止消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入步骤(2)的培养液制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，置25-30℃，5％CO2培养箱培养；培养90 min后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的鳃上皮细胞；
(4) 鳃上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(3)得到的鳃上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104 /ml，种植在细胞培养瓶中，置25-30℃，5％CO2培养箱培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1-2次，得到预纯化鳃上皮细胞；去除培养基，并用Hanks液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸混合消化液，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，得到纯化后的鳃上皮细胞；
(5)鳃上皮细胞的传代培养：将步骤(4)纯化后的鳃上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×104 /ml的密度植入培养瓶中于25-30℃，5％CO2培养箱培养，隔日更换培养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤（3）中，培养板中鳃组织块之间的距离为0.2-0.3cm。
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