CN101372682B

CN101372682B - 褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN101372682B
Application number: CN2008101574991A
Authority: CN
Inventors: 樊廷俊; 魏云波; 姜国建; 杨洪收
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2008-10-15
Publication date: 2010-08-11
Anticipated expiration: 2028-10-15
Also published as: CN101372682A

Abstract

本发明涉及一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼鳍组织为材料，采用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶联合消化法启动原代培养，在含胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼细胞系，目前已传至第61代，其工艺科学合理，可望应用于鱼类病毒的分离、鉴定、繁殖、病毒疫苗制备，以及病毒与宿主细胞相互作用等方面研究。

Description

褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法

技术领域

本发明涉及一种利用褐点石斑鱼鳍组织细胞建立鳍细胞系的方法——褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法。

背景技术

褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)是广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域的一种具有较高经济价值的名贵海水养殖鱼类。近年来，我国的石斑鱼养殖规模越来越大，但传染性病毒病也随之开始广泛传播，致使其死亡率逐年上升，造成了重大的经济损失。查清鱼类病毒的感染途径和病毒与细胞的相互作用机理是从根本上预防和解决石斑鱼等众多海洋经济鱼类病毒病的关键，而鱼类细胞系正是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要研究体系，也是该领域的研究热点和主攻方向之一。

目前，还未有建立褐点石斑鱼组织细胞系的相关报道，也没有通过相应细胞系大规模生产病毒疫苗的成功报道。显然，尽快建立褐点石斑鱼组织细胞系是为鱼类病毒学等相关研究奠定基础，为鱼类病毒的分离、鉴定、繁殖、病毒疫苗制备以及病毒与宿主细胞相互作用等研究创造条件，从而为石斑鱼养殖业带来巨大的经济效益是非常必要的。

发明内容

本发明的目的就是利用褐点石斑鱼鳍组织，提供一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建技术，以弥补现有技术的不足。

本发明的构建方法：首先对鲜活褐点石斑鱼分别用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水和75％酒精消毒处理，置于超净工作台中取下鳍组织，以75％酒精再次消毒，磷酸缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶对鳍组织块联合消化1～2小时，并离心收集鳍组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中，24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液一次；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，经褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液悬浮后，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养。

所述的褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液，并添加占该培养液0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖。为了促进褐点石斑鱼鳍细胞的分裂和快速增殖，进一步又添加了0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子和0.02‰～0.04‰的I型人胰岛素样生长因子。

本发明的主要特点是：细胞系可以连续传代，因此能提供出大量的褐点石斑鱼鳍细胞；细胞系既可为鱼类病毒学等多种相关研究提供理想的体外研究，又可为鱼类病毒提供一个理想的体外繁殖体系。经这种方法所构建的鳍细胞系现已传至第61代。

具体实施方式

将上述本发明的方法按照基本步骤进行详述如下：

1、褐点石斑鱼鳍组织块的制备：鲜活褐点石斑鱼于浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒1～2分钟。于超净工作台中无菌取下鳍组织，再次用75％酒精漂洗0.5～1分钟，用磷酸缓冲液漂洗2遍后在含有5％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，将鳍组织剪成约1mm³的组织块；800转/分钟离心收集鳍组织块，加入0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶联合消化1～2小时；1000转/分钟离心收集组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴16～20小时。

2、褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液(pH7.0～7.4)3.0毫升，加入羧甲基壳寡糖0.15～0.3毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为本发明的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液。

为了促进褐点石斑鱼鳍细胞的分裂和快速增殖，在上述专用培养液的基础上又添加了0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子和0.02‰～0.04‰的人I型胰岛素样细胞生长因子。

4、褐点石斑鱼鳍细胞原代培养的启动：将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22～24℃培养；鳍细胞迁出后，每间隔3～5天，除去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液；

5、褐点石斑鱼鳍细胞的传代培养：待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.1％～0.3％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5～1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

实施例1

将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后于75％酒精中消毒2分钟，进行首次消毒；用棉球擦拭鱼体表后取下鳍组织，置于盛有磷酸缓冲液玻璃培养皿中，用镊子夹取浸有磷酸缓冲液的棉球顺着鳍条的方向充分擦拭鳍组织，清除鳍组织表面黏液；再于75％酒精中漂洗1分钟，进行二次消毒；将鳍组织用磷酸缓冲液漂洗2遍，充分洗去酒精后，转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳍组织块，加入0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶联合消化2小时；1000转/分钟离心收集组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入22℃培养箱中，正置干贴16小时。

取常规配制的DMEM/F12培养液(pH7.2)3毫升，加入羧甲基壳寡糖0.3毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至5.0毫升，即为褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液。在上述专用培养液中又添加了0.01‰人碱性成纤维细胞生长因子，更有利于褐点石斑鱼鳍细胞的分裂和快速增殖。将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的上述专用培养液，于22℃培养；鳍细胞迁出后，每间隔3天，除去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液。待鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.1％的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

实施例2

将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后，于75％酒精中消毒1.5分钟，进行首次消毒；然后将鱼转入超净工作台中；用棉球擦拭鱼体表后取下鳍组织，置于盛有磷酸缓冲液玻璃培养皿中，用镊子夹取浸有磷酸缓冲液的棉球顺着鳍条的方向充分擦拭鳍组织，清除鳍组织表面黏液；再于75％酒精中漂洗0.5分钟，进行二次消毒；将鳍组织用磷酸缓冲液漂洗2遍，充分洗去酒精后，转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳍组织块，加入0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶联合消化1.5小时；1000转/分钟离心收集组织块；用含有5％胎牛血清和0.1‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴20小时。

将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的pH值为7.4的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液，其中添加了0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子和0.02‰的人I型胰岛素样细胞生长因子，有利于褐点石斑鱼鳍细胞的贴壁、分裂和快速增殖。于24℃培养；鳍细胞迁出后，每间隔4天，除去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.3％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养。

实施例3

将鲜活褐点石斑鱼放入浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中暂养24小时后，于75％酒精中消毒1分钟，进行首次消毒；然后将鱼转入超净工作台中；用棉球擦拭鱼体表后取下鳍组织，置于盛有磷酸缓冲液玻璃培养皿中，用镊子夹取浸有磷酸缓冲液的棉球顺着鳍条的方向充分擦拭鳍组织，清除鳍组织表面黏液；再于75％酒精中漂洗0.5分钟，进行二次消毒；将鳍组织用磷酸缓冲液漂洗2遍，充分洗去酒精后，转入含有5％胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的组织块；800转/分钟离心收集鳍组织块，加入0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶联合消化1小时；1000转/分钟离心收集组织块；用含有5％胎牛血清和0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.2的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25平方厘米培养瓶中；将培养瓶放入24℃培养箱中，正置干贴18小时。

将每瓶干贴后的鳍组织中加入5毫升的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液，其中添加了0.01‰的人碱性成纤维细胞生长因子和0.04‰的人I型胰岛素样细胞生长因子，以满足褐点石斑鱼鳍细胞的最佳增殖条件。24℃培养；鳍细胞迁出后，每间隔5天，除去旧培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入5毫升新鲜的褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成褐点石斑鱼鳍细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出2.5毫升鳍细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2.5毫升，使之最终体积至5毫升；待褐点石斑鱼鳍细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养即可。

Claims

1.一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法，取经过分别用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水和75％酒精消毒处理的褐点石斑鱼鳍组织，以75％酒精再次消毒，磷酸缓冲液漂洗后剪成大致1mm³的组织块；用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶对鳍组织块联合消化1～2小时，并离心收集鳍组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中，24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液一次；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，经褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液悬浮后，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液，并添加占该培养液0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是在上述褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液中又添加占该培养液0.01‰～0.02‰比例的人碱性成纤维细胞生长因子和占该培养液0.02‰～0.04‰比例的I型人胰岛素样生长因子。