CN102757934B - 一种鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，属于淡水水生生物细胞培养技术领域。鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，是以鱇浪白鱼尾鳍组织细胞为材料，采用组织块法启动原代培养，在含有胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子的pH值为7.0-7.4的DMEM/F12培养基中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。本发明的有益效果在于：1、在保证鱼体存活的前提下，操作简便易行；2、构建的鱇浪白鱼鳍细胞系（AGF）形态为成纤维样细胞，细胞生长状态良好，能够连续传代，直接用于鱇浪白鱼细胞生物学特性及功能基因的研究，满足了对鱇浪白鱼分子细胞水平理论研究的需要；3、该构建方法也适用于其他鱼类构建鳍条的细胞系。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，属于淡水水生生物细胞培养技术领域。
背景技术
鱇浪白鱼Anabarilius grahami隶属于鲤形目Cypriniforms、鲤科Cyprinidae、白鱼属Anabarilius，俗称白鱼，是仅分布于云南抚仙湖的珍稀鱼种，是云南四大名鱼之一。此鱼肉细嫩鲜美，软刺薄鳞，清香可口，是沿湖渔民的主要渔业对象，历史上产量曾占抚仙湖总渔产量的70%－80%。近十多年来，由于外来鱼种入侵，以及水质恶化，捕捞过度，已处于濒危边缘。虽然1999年以来，中国科学院昆明动物研究所人工繁殖鱇浪白鱼成功，并有效保护和挽救了这一珍稀鱼种，使其近年产量保持平稳上升，但其野生种群的数量仍在锐减。
构建与培养动物细胞系已成为研究病毒学、免疫学、遗传学、毒理学、肿瘤治疗的有力工具。鱇浪白鱼鳍细胞系的建立为鱇浪白鱼细胞水平理论研究和应用提供可能。
经文献检索，未见与本发明的相同报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便易行的鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，以满足对鱇浪白鱼理论研究以及其在功能基因中的应用。
本发明的鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，具体步骤如下：
（1）制备细胞培养液
选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5 ng/ml，pH值为7.0-7.4，保存于4℃冰箱中，备用；
（2）原代培养
先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，在超净台上取鱇浪白鱼鳍条组织；然后用含有青霉素、链霉素和两性霉素B的HBSS溶液清洗，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μg /ml，两性霉素B的浓度为10 μg /ml，然后剪成±1mm3的小块，对鳍条组织块用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化30 min；经上述处理的组织块均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100IU/ml青霉素+100 μg /ml链霉素+10 μg /ml两性霉素B的细胞培养液5 ml，在28℃培养箱中启动原代培养；取完组织的鱼体放回鱼缸中常规饲养，两个月后鳍条重新长出。
（3）继代培养
待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的HBSS溶液清洗两遍，加入0.25%的胰蛋白酶1 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入原来吸出的培养液1 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；向细胞悬液内补入8ml DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF细胞培养液，然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；待细胞再次长成单层后，仍按步骤（3）进行传代培养。
本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。
本发明的有益效果在于：
1、在保证鱼体存活的前提下，操作简便易行；
2、构建的鱇浪白鱼鳍细胞系（AGF）形态为成纤维样细胞，细胞生长状态良好，可连续传代，直接用于鱇浪白鱼细胞生物学特性及功能基因的研究，满足了对鱇浪白鱼分子细胞水平理论研究的需要；
3、该构建方法也适用于其他鱼类构建鳍条的细胞系。
具体实施方式：
本发明的鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，具体步骤如下：
1、制备细胞培养液
选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5 ng/ml，pH值为7.0-7.4，保存于4℃冰箱中，备用；
2、原代培养
先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，在超净台上取鱇浪白鱼鳍条组织；然后用含有青霉素、链霉素和两性霉素B的HBSS溶液清洗，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μg /ml，两性霉素B的浓度为10 μg /ml，然后剪成±1mm3的小块，对鳍条组织块用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化30 min；经上述处理的组织块均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 μg /ml链霉素+10 μg /ml两性霉素B的细胞培养液5 ml，在28℃培养箱中启动原代培养；取完组织的鱼体放回鱼缸中常规饲养，两个月后鳍条重新长出。
3、继代培养
待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的HBSS溶液清洗两遍，加入0.25%的胰蛋白酶1 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入原来吸出的培养液1 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；向细胞悬液内补入8 ml DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF的细胞培养液，然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；待细胞再次长成单层后，仍按步骤3进行传代培养。
4、 细胞冻存
对上述构建的细胞进行冻存，配置细胞冻存液，分别取胎牛血清，DMEM/F12和DMSO，按5:4:1的体积比混合，现用现配。
细胞冻存：取处于对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后获得细胞悬液，1200 rpm离心8 min，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入适量配置好的细胞冻存液，重悬，使细胞浓度至1×106个/ml，将细胞悬液转移至1.8 ml无菌冻存管中，每管1ml悬液。将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。
5、 细胞复苏
对上述冻存的细胞进行复苏，将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌条件下将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入1 ml DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF细胞培养液，1200 rpm离心8 min，去除上清，收集细胞。用10 ml新鲜培养液重悬细胞，并转移至两个细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。待细胞长成单层后，按上述方法（步骤3）传代。
Claims (1)
1.一种鱇浪白鱼鳍细胞系的构建方法，其特征在于该构建方法的具体步骤如下：
a.制备细胞培养液
选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5 ng/ml，pH值为7.0-7.4，保存于4℃冰箱中，备用；
b.原代培养
先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，在超净台上取鱇浪白鱼鳍条组织；用HBSS+100 IU/ml青霉素+100μg /ml链霉素+10 μg /ml两性霉素B的溶液清洗，然后剪成1 mm3的小块，对鳍条组织块用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化30 min；经上述处理的组织块均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素+10 μg /ml两性霉素B的细胞培养液5 ml，在28℃培养箱中启动原代培养；取完组织的鱼体放回鱼缸中常规饲养，两个月后鳍条重新长出；
c.继代培养
待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的HBSS溶液清洗两遍，加入0.25%的胰蛋白酶1 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入原来吸出的培养液1 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；向细胞悬液内补入DMEM/F12+20%FBS+5 ng/ml bFGF的细胞培养液8 ml，然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；待细胞再次长成单层后，仍按c步骤进行传代培养。
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