CN102757933B - 一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术领域。该方法首先配制细胞培养液，以鱇浪白鱼肌肉组织为材料，清洗剪碎后，接种于25cm2培养瓶中，置于28℃培养箱培养。每隔3天半量更换培养液，待细胞长成单层后，采用胰蛋白酶消化法进行传代。5天传代一次，传至第10代时，培养液中血清浓度降至10%，此时细胞系建立成功。本发明的有益效果在于：1.操作简便易行；2.所构建的鱇浪白鱼肌肉细胞系（AGM）细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代50代以上，能直接用于鱇浪白鱼细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究；3.该构建方法也适用于其他鱼类肌肉细胞系。
Description
技术领域：
本发明涉及一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，属于淡水水生生物细胞培养技术。
背景技术：
鱼类的细胞培养起于20世纪60年代初，由Clem等研究海水鱼类的组织培养开始，至今已有250余株细胞系。我国鱼类细胞的培养起步于20世纪70年代，早期的研究大多集中在淡水养殖鱼类，特别是鲤科养殖鱼类，迄今已建立了超过40株细胞系，主要来自20多种鱼类，而云南的土著鱼类涉及极少。
鱇浪白鱼Anabarilius grahami隶属于鲤形目Cypriniforms、鲤科Cyprinidae、白鱼属Anabarilius，俗称白鱼，是仅产于云南抚仙湖的珍稀鱼种，是云南四大名鱼之一。此鱼肉细嫩鲜美，软刺薄鳞，清香可口。该鱼曾是抚仙湖的主产鱼种，多年来，由于外来鱼种入侵，以及水质恶化，捕捞过度，已处于濒危边缘。虽然1999年以来，中科院昆明动物研究所人工繁殖成功，保护并挽救了这一珍稀鱼种，使其近年产量保持平稳，但由于养殖鱼类本身的局限性，病害问题一直是制约养殖业健康发展的瓶颈。而从根本上解决鱇浪白鱼的病害问题，必须加强对鱇浪白鱼致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究，细胞系是必不可少的研究工具。因此鱇浪白鱼肌肉细胞系的建立为实现这一目的提供可能。
经文献检索，未见与本发明的相同报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种简便易行的鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，以弥补现有技术的不足，满足对鱇浪白鱼理论研究以及在功能基因中的应用。
本发明的鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，具体步骤如下：
a.制备细胞培养液
选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为3 ng/ml。pH值为7.0-7.4，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用；
b.鱼体消毒
先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，然后将鱇浪白鱼处死后，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡肌肉组织10 min，其中青霉素的浓度为200 IU/ml，链霉素的浓度为200 μg/ml，庆大霉素的浓度为100 μg/ml；
c.原代培养
在无菌操作台中将肌肉组织用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 μg/ml链霉素+100 μg/ml庆大霉素溶液清洗三次，然后用眼科剪将肌肉组织剪成碎末，并将其均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中；28℃培养箱中正置干贴过夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素+50 μg/ml庆大霉素的培养液3 ml，在28℃培养箱中进行原代培养，每隔3天半量更换培养液，第6天细胞开始迁出，第40天细胞长成单层；
d.继代培养
待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的PBS溶液清洗两遍，加入0.15%的胰蛋白酶1.5 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素+50 μg/ml庆大霉素的溶液8.5 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；以后5天传代一次，传至第3代时，将培养瓶中的细胞培养液全部替换成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培养液5 ml，传至第10代时，将培养液中血清含量降至10%，此时，细胞系建立成功。
本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。
本发明的有益效果在于：
1、操作简便易行；
2、所构建的鱇浪白鱼肌肉细胞系（AGM）细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代50代以上，能直接用于鱇浪白鱼细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究；
3、该构建方法也适用于其他鱼类肌肉细胞系。
具体实施方式
本发明的鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，具体步骤如下：
a.制备细胞培养液
选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的体积占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为3 ng/ml。pH值为7.0-7.4，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用；
b.鱼体消毒
先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，然后将鱇浪白鱼处死后，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡肌肉组织10 min，其中青霉素的浓度为200 IU/ml，链霉素的浓度为200 μg/ml，庆大霉素的浓度为100 μg/ml；
c.原代培养
在无菌操作台中将肌肉组织用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 μg/ml链霉素+100 μg/ml庆大霉素溶液清洗三次，然后用眼科剪将肌肉组织剪成碎末，并将其均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中；28℃培养箱中正置干贴过夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素+50 μg/ml庆大霉素的溶液3 ml，在28℃培养箱中进行原代培养，每隔3天半量更换培养液，第6天细胞开始迁出，第40天细胞长成单层；
d.继代培养
待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的PBS溶液清洗两遍，加入0.15%的胰蛋白酶1.5 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素+50 μg/ml庆大霉素培养液8.5 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；以后5天传代一次，传至第3代时，将培养瓶中的培养液替换成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培养液5 ml，传至第10代时，将培养液中血清含量降至10%，此时，细胞系建立成功。
e.细胞冻存
对上述构建的肌肉细胞进行冻存，配置细胞冻存液，分别取胎牛血清和DMSO，按9:1的体积比混合，现用现配。
细胞冻存：取处于对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后获得细胞悬液，1000 rpm离心10 min，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入适量配置好的细胞冻存液，重悬，使细胞浓度至2×106个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml无菌冻存管中。将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。
f.细胞复苏
对上述冻存的细胞进行复苏，将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌条件下将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入1 ml DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培养液，1000 rpm离心6 min，去除上清，收集细胞。用10 ml培养液重悬细胞，并转移至两个细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。待细胞长成单层后，按步骤d传代。
Claims (1)
1.一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，其特征在于该构建方法的步骤如下：
a.制备细胞培养液
选择DMEM/F12培养基，向培养基中加入胎牛血清和人碱性成纤维细胞生长因子，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为3 ng/ml，pH值为7.0-7.4，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用；
b.鱼体消毒
先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，然后将鱇浪白鱼处死后，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板中，加入PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 μg/ml链霉素+100 μg/ml庆大霉素的溶液浸泡肌肉组织，浸泡10 min；
c.原代培养
在无菌操作台中将肌肉组织用PBS+ 200 IU/ml青霉素+200 μg/ml链霉素+100 μg/ml庆大霉素的溶液清洗三次，然后用眼科剪将肌肉组织剪成碎末，并将其均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中；28℃培养箱中正置干贴过夜，次日加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素+50 μg/ml庆大霉素的培养液3 ml，在28℃培养箱中进行原代培养，每隔3天半量更换培养液，第6天细胞开始迁出，第40天细胞长成单层；
d.继代培养
待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的PBS溶液清洗两遍，加入0.15%的胰蛋白酶1.5 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF+100 IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素+50 μg/ml庆大霉素的细胞培养液8.5 ml，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；然后接种于两个培养瓶内，在28℃培养箱中培养；以后5天传代一次，传至第3代时，将培养瓶中的细胞培养液全部替换成DMEM/F12+20%FBS+3 ng/ml bFGF培养液5 ml，传至第10代时，将培养液中血清含量降至10%，此时，细胞系建立成功。
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