CN115595297B - 一种卵形鲳鲹肌肉细胞系及构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种卵形鲳鲹肌肉细胞系，该细胞系的保藏号为CCTCC NO：C2022275，该细胞系细胞增殖速度快，可以连续传代并保持稳定。本发明公开了的该细胞系构建方法。本发明还公开了所述卵形鲳鲹肌肉细胞系在鱼类病毒免疫检测中的应用，以及在表达外源基因中的应用。

Description

一种卵形鲳鲹肌肉细胞系及构建方法和应用
技术领域
本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种卵形鲳鲹肌肉细胞系及构建方法和应用。
背景技术
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，属鲈形目，鲹科，鲳鲹属，俗称金鲳，黄腊鲳，其味道鲜美，营养丰富。卵形鲳鲹作为一种具有重要商业价值以及极具发展前景的海鱼品种，在水产养殖产业中备受青睐。近年来，水产行业随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加，导致鱼类病害频发，制约了水产养殖业的可持续发展，长期以来病毒性疾病是危害鱼类最普遍和最严重的一类病害。因此对卵形鲳鲹病害防治、良种选育的研究极为迫切。
大量研究表明鱼类细胞是研究鱼类病毒良好的载体，主要用于病毒分离和鉴定、病毒敏感性、病毒致病机理等科学研究。鱼类细胞培养研究始于1962年，Wolf和Quimby建立的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞系RTG-2是世界上第一个鱼类细胞系，之后鱼类细胞系研究发展迅速。鱼类细胞培养已经广泛应用于基因功能分析、病毒学、内分泌学、种质资源保护以及遗传学等方面的研究，是一种重要的研究手段。
鱼类细胞系的建立技术目前是一种相对较为成熟的技术，但是要获得一种适用于实验模型的稳定传代的细胞系仍存在较大困难。而且迄今为止，由卵形鲳鲹组织建立的细胞系已报道的有：卵形鲳鲹头肾、中肾、脑、尾鳍、鼻、神经几个细胞系，但是，卵形鲳鲹肌肉细胞系未见报道。肌肉参与脂肪累积、代谢调控、病原免疫等多种生理活动，对鱼类营养、发育及毒理病理等方面的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种卵形鲳鲹肌肉细胞系。
本发明的目的之二在于提供一种上述卵形鲳鲹肌肉细胞系的构建方法。
本发明的目的之三在于提供上述卵形鲳鲹肌肉细胞系的应用。
为实现上述第一目的，本发明采用技术方案：
一种卵形鲳鲹肌肉细胞系，于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：C2022275。该细胞系是从卵形鲳鲹肌肉组织中分离的卵形鲳鲹肌肉组织细胞构建的。
为实现上述第二目的，本发明采用技术方案：
一种卵形鲳鲹肌肉细胞系的构建方法，包括如下步骤：
(1)肌肉组织的处理：无菌条件下取出卵形鲳鲹肌肉组织，在含L-15培养基的培养皿中剪碎接种培养瓶中干贴，加入细胞完全培养基培养；
(2)原代培养：原代细胞培养期间每2天按半量更换新鲜培养基，在第6天有细胞开始迁出；
(3)传代培养：原代培养细胞汇合度达80％～90％时进行传代培养，弃去培养液，PBS 清洗两次，用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞，待细胞脱壁，加入细胞完全培养基终止消化，分瓶后传代培养。
本发明采用的细胞完全培养基中，按体积百分数计，含有10～20％胎牛血清(FBS)。
所述的细胞完全培养基是以Leibovitz’s L-15为基础，包括终浓度为10～20t％胎牛血清、 200IU/mL青霉素以及200μg/mL链霉素。
本发明所述卵形鲳鲹肌肉细胞系迄今已传至70代并保持稳定，能够提供大量稳定的卵形鲳鲹肌肉细胞。
为实现上述第三目的，本发明采用技术方案：
本发明提供所述卵形鲳鲹肌肉细胞系在鱼类病毒免疫检测中的应用。
所述病毒包括但不限于神经坏死病毒和虹彩病毒。
本发明还提供所述卵形鲳鲹肌肉细胞系在表达外源基因中的应用。
所述卵形鲳鲹肌肉细胞系具有表达外源基因的能力，在转染外源重组质粒后表现出较高 (60％)的转染效率，在转染外源重组质粒后，能够表达有活性的蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供的卵形鲳鲹肌肉细胞系首次在体外培养成功；该细胞系已连续传代培养9 个月，传至70代并保持稳定；
该细胞系细胞增殖速度快，可以连续传代；另外为了避免细胞污染带来的损失、保存不同代数培养期细胞的最佳形态和生理状态，获得遗传性状稳定的细胞，该细胞系经过冻存和复苏后，存活率在80％以上。
2)本发明在利用组织块法培养肌肉组织细胞的第6天从组织迁出细胞，细胞汇合度达 80％～90％时，胰酶消化分瓶传代培养；显微镜下观察细胞具有典型的成纤维细胞形态且具有较强的增殖能力。
3)本发明提供的卵形鲳鲹肌肉细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，感染多种病毒后出现细胞病变效应(CPE)，因此能够直接应用于鱼类病毒免疫检测中；
本发明提供的卵形鲳鲹肌肉细胞系具有表达外源基因的能力，在转染外源重组质粒后表现出较高的转染效率，其中第25代肌肉细胞在转染48h后的转染效率达到60％。
附图说明
图1为显微镜下细胞形态观察图：A为原代培养细胞从肌肉组织中迁出图；B为第10代卵形鲳鲹肌肉细胞形态图；C为第25代卵形鲳鲹肌肉细胞形态图；D为第50代卵形鲳鲹肌肉细胞形态图。
图2为实施例2中第30代肌肉细胞生长最适培养基类型筛选图。
图3为实施例2中第30代肌肉细胞生长最适血清浓度筛选图。
图4为第21代肌肉细胞中期染色体分裂相形态和染色体核型分析图。
图5为新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染第35代肌肉细胞的CPE观察图：
A为虹彩病毒感染肌肉细胞24h CPE观察图；B为虹彩病毒感染肌肉细胞48h CPE观察图；C为虹彩病毒感染肌肉细胞72h CPE观察图。
图6为红斑石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染第35代肌肉细胞的CPE观察图：
A为神经坏死病毒感染肌肉细胞24h CPE观察图；B为神经坏死病毒感染肌肉细胞48h CPE观察图；C为神经坏死病毒感染肌肉细胞72h CPE观察图。
图7为红斑石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染肌肉细胞后两种病毒蛋白和六种宿主免疫因子的转录水平。
图8为红斑石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染肌肉细胞后，病毒颗粒分散在细胞质中，液泡中可见一些20～30nm的病毒颗粒。
图9为卵形鲳鲹肌肉细胞转染外源基因GFP的表达结果：其中A为未转染外源基因的肌肉细胞空白对照，B为转染GFP的肌肉细胞。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。以下具体实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：构建卵形鲳鲹肌肉细胞系：
(1)肌肉组织的处理：取12月龄左右卵形鲳鲹幼鱼(重约300g)，滴入2～3滴丁香酚麻醉，然后用75％酒精棉球擦拭鱼体表面，无菌移入超净工作台快速解剖，分离出肌肉组织块，组织块用PBS(含有400U/mL青链霉素混合液)清洗2～3次，去除血液，然后在含L-15基础培养基中剪碎，用眼科剪将肌肉组织剪碎成1mm3的组织小块接种25cm2培养瓶中干贴，加入适量细胞完全培养基于28℃培养箱培养；
其中采用的细胞完全培养基为含有20vol％胎牛血清、200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素的L-15培养基
(2)原代培养：用组织块法原代培养的第6天有细胞从组织块迁出(见图1A)；原代培养期间每2天按半量更换新鲜完全培养基，具体操作为：弃去一半旧培养基，更换新鲜完全培养基；待细胞汇合度达80-90％时可以进行传代培养。
(3)传代培养：待卵形鲳鲹肌肉细胞铺满单层后(细胞汇合度约为90％)，用无菌移液管吸出旧培养基，加入PBS清洗两遍，用含EDTA的0.25％胰酶消化贴壁细胞，倒置显微镜下观察细胞变圆并开始脱落时，加入细胞完全培养基终止消化，轻轻吹打分散悬起细胞，按照1∶2进行细胞分瓶，使完全培养基至5mL/瓶，放入28℃培养箱中进行传代培养，约3～4 天传代一次。图1B～D分别显示第10代、25代、50代卵形鲳鲹肌肉细胞形态。
目前卵形鲳鲹肌肉细胞系已连续传代培养9个月，细胞能稳定增殖，已传至70余代。
(4)细胞冻存及复苏：收集胰酶消化后的细胞悬液，离心弃上清后，加入预冷的冻存液(包括10％DMSO，90％胎牛血清细胞)重悬细胞，在-80℃冰箱中冷冻过夜，再移入液氮中长期保存，完成细胞冻存；从液氮中取出后，迅速放在冰上使其融化，然后转入37℃恒温水浴锅震荡至融化，加入细胞完全培养基，离心弃去培养基和冻存液，加入细胞完全培养基重悬细胞，均匀铺于培养瓶中培养，完成细胞复苏；复苏后的细胞存活率在80％以上。
实施例2：确定构建卵形鲳鲹肌肉细胞系最适培养基类型和最适血清浓度
1)取生长稳定、形态良好的第30代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并接种于24孔板，以 2×104个细胞/mL的初始密度接种在培养板每孔中，待细胞贴壁稳定后，吸去原培养基，PBS 清洗，分别培养于L-15、MEM、DMEM培养基中，上述各种培养基中均添加20％FBS以及200U/mL的青链霉素混合液，28℃下培养。取第1、3、5、7天的三种培养基的每孔细胞，每个实验组收集3孔细胞，将细胞消化脱壁并在显微镜下使用血球计数板统计细胞数目，实验重复3次，绘制细胞系在不同培养基类型下的生长状态图(图2)。
结果显示在相同FBS浓度和培养温度下，本发明肌肉细胞在L-15培养基中生长最佳。
2)取生长稳定、形态良好的第30代细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并接种于24孔板，以 2×104个细胞/mL的初始密度接种在培养板每孔中，分别配置FBS浓度为10％、15％、20％的完全L-15培养基，在28℃下使用上述三种血清浓度培养基培养细胞，取第1、3、5、7天的三种培养基的每孔细胞，每个实验组收集3孔细胞，将细胞消化脱壁并在显微镜下使用血球计数板统计细胞数目，实验重复3次，绘制细胞系在不同FBS浓度下的生长状态图(图3)。结果显示，在相同的培养基类型L-15和培养温度下，随L-15培养基中FBS浓度从10％增加到20％，细胞的生长速率增加。考虑到FBS的实际效果和高成本，在传代培养时，特别是传至第20～30代后，胎牛血清浓度可适当降低至10％～15％。
实施例3：卵形鲳鲹肌肉细胞系染色体核型分析
取第21代卵形鲳鲹肌肉细胞进行染色体核型分析，具体步骤如下：
1)待细胞处于对数生长期时，加入终浓度为0.8μg/mL秋水仙素，28℃培养箱中作用6h。
2)吸弃旧的培养液，PBS清洗，再常规胰酶消化法消化细胞，加入上述L-15细胞完全培养基终止消化，以800g离心3min，收集细胞。
3)低渗处理：吸弃上清，往细胞沉淀中加入5mL 0.075mol/L KCl溶液，轻轻吹散沉淀， 37℃水浴低渗处理40min。
4)预固定处理：加入2mL提前预冷的卡诺固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)预固定5min，然后以800g离心3min。
5)固定：弃上清，细胞沉淀中加入5mL预冷卡诺固定液固定15min，800g离心3min，收集细胞，重复操作2次。
6)滴片：将细胞沉淀重悬于0.5mL预冷的卡诺固定液中，然后将细胞悬液以冷滴片法滴片 (载玻片提前预冷)。
7)染色：10％吉姆萨染色15min后清水冲洗，自然晾干。
8)镜检。
染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别等的重要指标。上述染色体分析的结果是对第21代卵形鲳鲹肌肉细胞进行染色体分析，共计数200个中期板，中期以正常的二倍体数扩散，计数显示染色体数在18～66之间不等，超过25％的细胞在第21代具有48条染色体的模型值(图4)。综上证明，本发明获得的细胞系与卵形鲳鲹个体染色体数相同，符合卵形鲳鲹染色体数目特征。
实施例4：对本发明的卵形鲳鲹肌肉细胞系进行病毒感染实验
取生长稳定、形态良好的第35代本发明的细胞系，评估对红斑石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus，RGNNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus，SGIV)两种鱼类病毒的敏感性。简而言之，本发明卵形鲳鲹肌肉细胞以2 ×104个细胞/mL的初始密度接种在24孔板中培养24小时，然后以1的感染多重性(MOI) 感染新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)和红斑石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)，分别在感染后24、48和72小时在蔡司显微镜下鉴定和拍摄CPE(见图5、6)；当细胞出现CPE后，在细胞未完全脱落之前收集细胞悬液，提取总RNA并进行qPCR检测，通过检测病毒转录本分析病毒是否在肌肉细胞中增殖以及感染细胞后的宿主免疫反应(见图7)，结果显示在RGNNV感染肌肉细胞24h、48h和72h后，RGNNV CP和RdRp两种病毒蛋白均显著上调，表明该病毒可以感染细胞并在细胞内复制；IL-1β、IRF3、IRF7以及TNFα基因表达水平显著上调，MAVS和IL-8在感染24～48h内表达水平上调，48～72h表达水平下调，表明在感染 48～72h时免疫应答下降，具体机制有待进一步阐明。RGNNV感染肌肉细胞后对先天免疫基因表达的影响表明卵形鲳鲹肌肉细胞系是研究鱼类病毒疾病和宿主反应的一个有用工具，能够用于鱼类病毒免疫研究/检测中。
为了进一步观察感染RGNNV病毒的卵形鲳鲹肌肉细胞形态，在透射电镜下观察感染细胞的超微结构。如图(图8)，病毒颗粒分散在细胞质中，可见一些直径约20～30nm的病毒颗粒。
实施例5：卵形鲳鲹肌肉细胞可通过转染表达外源基因
将第25代本发明肌肉细胞以5×104个细胞/mL的初始密度接种在24孔培养板中，使用不含抗生素的L-15培养基培养贴壁，28℃培养箱培养过夜，大部分所用DNA(μg)与TransMax Reagent转染(μ L)的比值为1∶2到1∶3。具体操作是：在无菌离心管内将47.5μLL-15基本培养基稀释质粒DNA(400ng/μL)轻轻混匀，另取一个无菌离心管将47μL L-15基本培养基稀释TransMax Reagent，大约5min后，将上述两离心管溶液轻轻混匀，使总体积为100μL，室温孵育约20min；把上述100μL混合液逐滴加入到一孔细胞中(已包含500μL的L-15 基本培养基)，每孔细胞均是如此操纵，重复5孔，转染4～6h后更换正常含抗生素的L-15 培养基，结果显示，在转染48h后观察到荧光信号(图9)，转染效率约为60％，这证明本发明卵形鲳鲹肌肉细胞系有表达外源基因的能力，这对于基因分析以及病毒蛋白在细胞内的表达研究有重要价值。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种卵形鲳鲹肌肉细胞系，其特征是，保藏编号为CCTCC NO:C2022275。
2.权利要求1所述卵形鲳鲹肌肉细胞系在制备鱼类病毒免疫检测产品中的应用，所述鱼类病毒包括神经坏死病毒和虹彩病毒。
3.权利要求1所述卵形鲳鲹肌肉细胞系在表达外源基因中的应用。
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