CN115948334B - 一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用。所述鳜脑克隆传代细胞株已于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。该细胞株可传代50代以上，原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库冻存的细胞经复苏均可正常传代，为鱼类细胞单细胞克隆株相关研究奠定基础；而且对SGIV、SKIV、LMBV、ISKNV、MSRV病毒均十分敏感，故对海淡水水产类病毒的分离、鉴定、培养、检测和疫苗研究提供较好的细胞平台。

Description

一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用。

背景技术

国际鱼类传代细胞系的鼻祖Wolf，国际上第一个鱼类细胞系(魟鳟性腺细胞系RTG，1962)的建立者，公认鱼类细胞培养方法的创建者。自Wolf建立世界上第一个鱼类细胞系以来，过去的60多年间，全球范围内的数十种鱼类的数百个细胞系获得成功建系。鱼类细胞的研究远晚于其它动物细胞的研究，但近20年，鱼类细胞的研究得到了非常迅速的发展。

细胞系指原代细胞的培养物经过首次传代成功之后而繁殖的细胞群体，也指可长期连续传代的培养细胞。由于没有经过筛选纯化，传代细胞系中细胞种类是不均一的，传代细胞系仅为某类优势群体。细胞株则是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。由于是单个细胞进行分裂增殖而形成具有相同遗传性状的细胞群体。其具有十分相近的形态特征和基本一致的生理、生化特性，在细胞特性、遗传学、功能研究和疫苗制备等方面都有很大的应用。

目前常规的单细胞分离技术主要包括有限稀释法、无限稀释法、克隆环法和显微操作法。这四种方法在操作上均有优缺点，但其最终目的均为在一定的培养空间里，放置单个细胞进行培养，其难点在于很多情况下单个细胞生长缓慢甚至不能分裂增殖，或者分裂增殖数天后便开始死亡，导致细胞的克隆形成率很低，无法获得稳定的单细胞克隆株。

我国的鱼类细胞单克隆培养研究较少，其缘由于鱼类细胞的研究较其它动物细胞的研究落后。鱼类细胞的研究人员较少，无专研应用于鱼类细胞培养的培养基等原因使得目前鱼类细胞的大多数培养仅限于普通的原代培养和传代培养等，因此迄今为止，我国在鱼类细胞的培养上至今并无报道由单细胞克隆技术获得的单克隆传代细胞株。

发明内容

本发明的目的在于提供一株鳜脑克隆传代细胞株及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一株鳜脑克隆传代细胞株，于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。

本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在构建细胞库中的应用。

本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒分离中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒培养中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒非诊断目的检测中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在作为研究水产动物病毒的宿主细胞的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株在筛选和/或制备预防和/或治疗水产动物病毒的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述的鳜脑克隆传代细胞株作为药物筛选、药物制备、药物评价、基因筛选和功能分析、病原功能研究、细胞工程育种或免疫相关功能基因研究的生物模型中的应用

在本发明的一些实施方式中，所述药物为用于预防和/或治疗水产动物病毒所致的疾病的药物。

在本发明的一些实施方式中，所述药物为疫苗。

在本发明的一些实施方式中，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒。

本发明的第九方面，在于提供一种鳜脑克隆传代细胞株的构建方法，包括以下步骤：

1)原代培养：取鲜活鳜鱼，取脑组织分散成组织块，使用消化液消化组织块后添加M199营养液进行培养；

2)传代培养：待原代细胞长成单层后，加入消化液进行消化，然后加入M199营养液，使细胞分散悬浮，进行传代，继续培养至长成单层；

3)单细胞克隆：

S1稀释培养：选取刚好长成单层的细胞，加入消化液进行消化，离心弃上清，使用L15克隆营养液重悬后稀释培养；

S2细胞传代：细胞长成单层后，加入消化液进行消化，然后加入L15克隆营养液，使细胞分散悬浮，进行传代培养。

在本发明的一些实施方式中，在取脑组织之前先将鳜鱼用70～75％酒精浸泡消毒2～3分钟。

在本发明的一些实施方式中，取脑组织后用含抗生素的M199培养基洗涤2～4次。

在本发明的一些实施方式中，所述脑组织块为0.3～0.5cm³小块脑组织。

在本发明的一些实施方式中，原代培养过程中每2～5天更换一次培养液。

在本发明的一些实施方式中，所述M199营养液为含有10～20v/v％胎牛血清的M199培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述M199营养液中还包含200～400IU/ml青霉素和200～400μg/ml链霉素。

在本发明的一些实施方式中，所述传代培养中，按1：(2～5)进行传代。

在本发明的一些实施方式中，可将步骤S1中的消化后的细胞进行冻存处理。

在本发明的一些实施方式中，所述细胞冻存处理中所使用的冻存液为包含35～45v/v％胎牛血清和8～12v/v％二甲基亚砜的M199培养基。

在本发明的一些实施方式中，加入细胞冻存液后使细胞分散悬浮，使细胞浓度约(1～3)×10⁶cells/ml。

在本发明的一些实施方式中，将冻存后的细胞进行稀释培养时应将细胞后先融化，优选为28～32℃水浴融化。

在本发明的一些实施方式中，所述稀释培养具体操作为：将细胞稀释至约200cells/mL，培养20～28小时后补加L15克隆营养液后继续培养；每隔两天更换1/2～1/3L15克隆营养液。

在本发明的一些实施方式中，所述L15营养液为包含10～20v/v％胎牛血清的L15培养基。

在本发明的一些实施方式中，在细胞传代2～4代次后，可将细胞培养液更换为L15营养液。

在本发明的一些实施方式中，所述消化液为0.15～0.35％胰酶消化液。

在本发明的一些实施方式中，所述消化的条件为26～30℃8～12min。

在本发明的一些实施方式中，所述培养温度为26～30℃。

在本发明的一些实施方式中，所述离心的条件为800～1500rpm，2～6min。

在本发明的一些实施方式中，当传代培养至显微镜下观察大部分细胞的轮廓清晰时进行单细胞克隆。

在本发明的一些实施方式中，所述L15克隆营养液包含：10～30v/v％胎牛血清、10～15v/v％M199细胞生长液、10～15v/v％L15细胞生长液和40～70v/v％L15培养基；L15培养基主要含多种高浓度的氨基酸，以及使用半乳糖作为碳源，其营养较M199更为丰富，适用于快速增殖细胞的培养。M199细胞生长液和L15细胞生长液里面富含原细胞培养过程中产生的多种利于该细胞贴壁和生长的成分，更有利于单个细胞的增殖分裂，以及后期形成单细胞群落。

其中所述M199细胞生长液制备方法为：使用M199营养液重悬步骤S1中消化后的细胞，形成70～90％汇合层后收集上清培养液；

所述L15细胞生长液制备方法：使用L15营养液重悬步骤S1中消化后的细胞，形成70～90％汇合层后收集上清培养液。

在本发明的一些实施方式中，M199细胞生长液和L15细胞生长液需要进一步过滤。

在本发明的一些实施方式中，所述过滤为0.1～0.45μm滤膜过滤。

本发明的有益效果是：

本发明利用普通培养基M199培养基对翘嘴鳜脑组织进行原代培养，若干次传代后成功构建了鳜鱼脑传代细胞系，冻存后使用L15克隆营养液进行复苏稀释培养，稀释培养后各孔单细胞培养成细胞群落后进行传代培养，传代过程均能维持良好的生长状态，细胞形态基本一致。经单细胞克隆后筛选得到的鳜脑克隆传代细胞株可传代50代以上，原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库冻存的细胞经复苏均可正常传代，为鱼类细胞单细胞克隆株相关研究奠定基础，并将得到的鳜脑克隆传代细胞株SBCC于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。

而且本发明构建的鳜脑克隆传代细胞株对SGIV、SKIV、LMBV、ISKNV、MSRV病毒均十分敏感，当中涵盖了海淡水鱼类病毒，故对海淡水鱼类病毒的分离、鉴定、培养、检测和疫苗研究提供较好的细胞平台。

本发明鳜脑克隆传代细胞株的构建方法操作简单，无需任何昂贵仪器和试剂，使用不同代次的传代细胞按本发明技术方案进行单细胞克隆均可制备出多孔单细胞克隆群落，克隆成功率高，重复性极强，使用本技术方案还可应用在构建其它利用M199培养基建立的鱼类传代细胞系的克隆传代细胞株上。

附图说明

图1是实施例1传代细胞系前期的纤维样细胞图。

图2是实施例1传代细胞系第35代时大部分细胞轮廓非常清晰。

图3是实施例1倒置显微镜下C8孔单个细胞前9天每天拍摄图。

图4是实施例1中C8孔单个细胞前10天的细胞数量曲线图。

图5是实施例1鳜脑克隆传代细胞株SBCC株细胞形态图；图5A为96孔板克隆群落传代至24孔板后第1天细胞形态图；图5B为传代过程中SBCC株F0的单层细胞形态图；图5C为传代过程中SBCC株F50的单层细胞形态图。

图6是比对例3图：图6A是第8天仅有3个细胞图；同期实施例1如图6C；图6B是第14天开始圆缩死亡图；同期实施例1如图6D。

图7是实施例3和实施例4细胞感染病毒后的细胞病变(CPE)图；图7A为SGIV-HN株病变图、图7B为SKIV-SD株病变图、图7C为LMBV病变图、图7D为MSRV病变图、图7E为ISKNV病变图。

图8是鳜脑克隆传代细胞株SBCC的核型分析结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下实施例中的M199培养液、Leibovitz’s L-15培养液、0.25％胰酶消化液和胎牛血清均购自GIBCO公司。青霉素和链霉素购自华北制药公司。DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。病毒核酸提取试剂盒、PrimeScript^TMOne Step RT-PCR试剂盒和Premix Taq^TM酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。翘嘴鳜购自广东省佛山市某养殖场。

本发明所述斑石鲷虹彩病毒SD株由华南农业大学海洋学院水生动物医学实验室分离、鉴定得到("Isolation,identification and genomic analysis of an ISKNV-typemegalocytivirus from spotted knifejaw(Oplegnathus punctatus)."Aquaculture 532(2021):736032.)，该毒株现保存于华南农业大学海洋学院水生动物医学实验室。

本发明所述新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV-HN株由华南农业大学海洋学院水生动物医学实验室分离、鉴定得到(Isolation and identifcation of Singapore grouperiridovirus Hainan strain(SGIV HN)in China.Archives of Virology(2019)164:1869–1872.)

实施例1鳜脑克隆传代细胞株的构建

包括以下步骤：

1)翘嘴鳜脑组织原代培养：取约500g鲜活翘嘴鳜一尾，浸泡于75％酒精2～3分钟后，无菌条件下剪取脑组织，用含的800IU/ml青霉素和800μg/ml链霉素的M199培养基洗涤3次，剪成0.5cm³小块后接种于25cm²细胞培养瓶中，在组织上滴加50μl 0.25％胰酶消化液，28℃放置10分钟后添加7ml M199营养液(含20v/v％胎牛血清、200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素)。置28℃细胞培养箱培养，每隔3天更换一半细胞培养液，直至原代细胞长成良好单层。

结果：原代培养第2天可见细胞从脑组织中迁出，第5天时形成细胞群落，第15天时汇合形成细胞单层。

2)传代培养：原代细胞长成良好单层后，弃去细胞培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入2ml M199营养液(20v/v％胎牛血清、200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素)，使细胞分散悬浮，取1ml细胞悬浮液至25cm²细胞培养瓶中，并补加6ml M199营养液，置28℃细胞培养箱培养，至长成良好单层时仍以上述相同方法进行细胞传代。

结果：在之后的传代中，细胞长势良好，平均每3～5天便可进行1次传代。胎牛血清含量降低后，细胞生长并无明显的不适，F1～F15前期细胞形态为纤维样(图1)，当传代培养至35代时，倒置显微镜下观察大部分细胞的轮廓非常清晰(图2)，进行细胞冻存。

3)单细胞克隆：

A.细胞冻存：

选取3瓶25cm²长成良好单层的F35代细胞，弃去细胞培养液，各加入1ml 0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入12ml细胞冻存液(含40v/v％胎牛血清和10v/v％二甲基亚砜的L15培养基)，使细胞分散悬浮，取100μl细胞悬液加入100μl 0.1％台盼蓝染色液，混匀后吸取20μl至细胞计数板上，在countstar细胞计数仪上进行细胞计数，随后用细胞冻存液将细胞浓度稀释至2×10⁶cells/ml，分装于细胞冻存管，1.5ml/管。将冻存管放入程序降温盒里，-80℃冰箱放置过夜后移至液氮中保存。

B.稀释培养：

a.L15克隆营养液制备：从液氮中取出两支冻存的F35代细胞，在30℃温水中快速搅动融化，室温1000rpm离心3分钟后弃去上清，一支加入1ml L15营养液(含20v/v％胎牛血清)重悬后转移至25cm²细胞培养瓶中，补加6ml L15营养液；另一支加入1ml M199营养液(含20v/v％胎牛血清)重悬后转移至25cm²细胞培养瓶中，补加6ml M199营养液。M199营养液复苏的细胞培养24小时后，吸取上清，使用0.22μm过滤器过滤获得M199细胞生长液；L15营养液复苏的细胞培养24小时后，吸取上清，使用0.22μm过滤器过滤获得L15细胞生长液；20v/v％胎牛血清、10v/v％M199细胞生长液、10v/v％L15细胞生长液和60v/v％L15培养基，以此形成L15克隆营养液。

b.稀释操作：从液氮中取出一支冻存的F35代细胞，在30℃温水中快速搅动融化，室温1000rpm离心3分钟后弃去上清，加入1ml L15克隆营养液，使细胞分散悬浮，取100μl细胞悬液加入100μl0.1％台盼蓝染色液，混匀后吸20μl至细胞计数板上，在countstar细胞计数仪上进行细胞计数，随后将细胞悬液稀释至200cells/ml，吸取细胞稀释液至96孔细胞培养板各孔，4μl/孔，置28℃细胞培养箱培养24小时后，倒置显微镜下观察并记录单个细胞的孔位置，于每孔补加200μl L15克隆营养液。每隔2天更换一半L15克隆营养液，直至长成良好细胞群落后进行传代。

C.克隆后细胞传代：弃去单孔细胞培养液，加入30μl 0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入100μl L15克隆营养液，使细胞分散悬浮，随后全部吸至24孔细胞培养板其中一孔，补加900μl L15克隆营养液；其中96孔板克隆群落传代至24孔板后第1天细胞形态图见图5A。克隆成功率统计结果见表1。

表1单细胞克隆成功率统计结果

	贴壁孔数	克隆成功数	克隆成功率
				实施例1(L15克隆营养液)	28/96	19/28	68％
对比例1(M199营养液)	13/96	0/13	0％
				对比例2(L15营养液)	10/96	0/10	0％
对比例3(M199克隆营养液Ⅰ)	21/96	2/21	10％
				对比例4(M199克隆营养液Ⅱ)	22/96	7/22	32％

至长成良好单层后，弃去单孔细胞培养液，加入100μl 0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入500μl L15克隆营养液，使细胞分散悬浮，随后全部吸至6孔细胞培养板其中一孔，补加3ml L15克隆营养液。

至长成良好单层后，弃去单孔细胞培养液，加入300μl 0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入1ml L15营养液(含15v/v％胎牛血清)，使细胞分散悬浮，随后全部吸至25cm²细胞培养瓶，补加6ml L15营养液。

至长成良好单层后，弃去细胞培养液，加入0.5ml 0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入2ml L15营养液(含10v/v％胎牛血清)，使细胞分散悬浮，随后吸取1/3细胞悬液至25cm²细胞培养瓶，补加6ml L15营养液(含10v/v％胎牛血清)，待细胞再次长成良好单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养至F55，至此鳜鱼脑细胞单克隆细胞株建立，以本代次细胞记为SBCC株F0代。并将SBCC株F0代鳜脑克隆传代细胞株于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。传代过程中SBCC株F0代的致密单层细胞形态图见图5B。

结果1：单细胞克隆后24小时多孔可见单个轮廓清晰的细胞贴壁(28/96)。取例C8位置的细胞克隆孔每天进行拍摄(图3)：第1天可见单个细胞贴壁；第2天可见单个细胞分裂成2个细胞；第3天可见8个细胞；第4天可见13个细胞；第5天可见23个细胞；第6天可见47个细胞；第7天可见93个细胞；第8天可见244个细胞；第9天可见524个细胞；第10天可见1000个细胞以上；第21天可见良好细胞群落，进行传代培养处理。基本上大部分克隆孔均有较好的增殖分裂生长(28/28)，各个细胞克隆孔的细胞数量规律均呈指数增长曲线(图4)，且各孔均能在3周内形成较大面积(约0.16cm²)的细胞群落(19/28)。以3周内形成较大面积(约0.16cm²)的细胞群落作为克隆成功的判定标准。

结果2：该鳜脑克隆传代细胞株已传代50余代(SBCC株F50代细胞图见图5C)，各代次细胞均贴壁生长，且传代后细胞形态基本一致，可定为单克隆传代细胞株。将SBCC株F1～F10细胞冻存在液氮中，作为鳜脑克隆传代细胞株SBCC原始细胞库，SBCC株F11～F20细胞冻存在液氮中，作为鳜脑克隆传代细胞株SBCC基础细胞库，SBCC株F21～F30细胞冻存在液氮中，作为鳜脑克隆传代细胞株SBCC工作细胞库。

对比例1使用M199营养液进行克隆培养

包括以下步骤：

1)翘嘴鳜脑组织原代培养：方法同实施例1的步骤1)。

2)传代培养：方法同实施例1的步骤2)。

3)单细胞克隆：

A.细胞冻存：方法同实施例1的步骤3)A。

B.稀释培养：

a.克隆营养液制备：无需克隆营养液。

b.稀释操作：操作方法同实施例1的稀释操作，但使用M199营养液进行培养(含20v/v％胎牛血清)。

结果：使用M199营养液进行复苏稀释培养，克隆后24小时仅少数孔可见单个轮廓清晰的细胞贴壁(13/96)，均无法增殖生长，随着形态逐渐展开陆续死亡。克隆成功率统计结果见表1。

对比例2使用L15营养液进行克隆培养

包括以下步骤：

1)翘嘴鳜脑组织原代培养：方法同实施例1的步骤1)。

2)传代培养：方法同实施例1的步骤2)。

3)单细胞克隆：

A.细胞冻存：方法同实施例1的步骤3)A。

B.稀释培养：

a.克隆营养液制备：无需克隆营养液。

b.稀释操作：操作方法同实施例1的稀释操作，但使用L15营养液进行培养(含20v/v％胎牛血清)。

结果：利用L15培养基进行复苏和使用L15营养液克隆培养，克隆后24小时仅少数孔可见单个轮廓清晰的细胞贴壁(10/96)，且均无法增殖生长，随着形态逐渐展开陆续死亡。结果同比对例1。克隆成功率统计结果见表1。

对比例3使用M199克隆营养液Ⅰ(含10v/v％M199细胞生长液)进行克隆培养

包括以下步骤：

1)翘嘴鳜脑组织原代培养：方法同实施例1的步骤1)。

2)传代培养：方法同实施例1的步骤2)。

3)单细胞克隆：

A.细胞冻存：方法同实施例1的步骤3)A。

B.稀释培养：

a.M199克隆营养液Ⅰ制备：从液氮中取出一支冻存的细胞，在30℃温水中快速搅动融化，室温1000rpm离心3分钟后弃去上清，加入1mlM199营养液(含20v/v％胎牛血清)重悬后转移至25cm²细胞培养瓶中，补加6mlM199营养液，置28℃培养，培养24小时后，吸取上清，使用0.22μm过滤器过滤获得M199细胞生长液，M199细胞生长液按1:9的体积比加入到M199营养液(含20v/v％胎牛血清)中，以此形成M199克隆营养液Ⅰ。

b.稀释操作：操作方法同实施例1的稀释操作，但使用上述M199克隆营养液Ⅰ进行培养。

结果：利用原M199培养基进行复苏和使用M199克隆培养液Ⅰ(含10v/v％M199细胞生长液)进行单细胞克隆培养，克隆后24小时多孔可见单个轮廓清晰的细胞贴壁(21/96)。但大部分单细胞孔无法正常分裂增殖，随着细胞形态逐渐展开陆续死亡，部分单细胞孔虽然可正常分裂增殖生长(8/21)，但生长极为缓慢(图6A：第8天仅有3个细胞；同期实施例1如图6C)，此后细胞形态慢慢开始圆缩(图6B：第14天开始圆缩死亡；同期实施例1如图6D)，最终仅有2/21单细胞孔在3周内克隆成功。由此可见使用M199细胞生长液在一定程度上可以促进单个细胞贴壁和生长。克隆成功率统计结果见表1。

对比例4使用M199克隆营养液Ⅱ(含10v/v％L15细胞生长液和10v/v％M199细胞生长液)进行克隆培养

包含以下步骤：

1)翘嘴鳜脑组织原代培养：方法同实施例1的步骤1)。

2)传代培养：方法同实施例1的步骤2)。

3)单细胞克隆：

A.细胞冻存：方法同实施例1的步骤3)A。

B.稀释培养：

a.M199克隆营养液Ⅱ制备：从液氮中取出两支冻存的细胞，在30℃温水中快速搅动融化，室温1000rpm离心3分钟后弃去上清，一支加入1ml L15营养液(含20v/v％胎牛血清)重悬后转移至25cm²细胞培养瓶中，补加6ml L15营养液；另一支加入1ml M199营养液(含20v/v％胎牛血清)重悬后转移至25cm²细胞培养瓶中，补加6mlM199营养液。M199营养液复苏的细胞培养24小时后，吸取上清，使用0.22μm过滤器过滤获得M199细胞生长液；L15营养液复苏的细胞培养24小时后，吸取上清，使用0.22μm过滤器过滤获得L15细胞生长液；20v/v％胎牛血清、10v/v％M199细胞生长液、10v/v％L15细胞生长液和60v/v％M199培养基，以此形成M199克隆营养液Ⅱ。

b.稀释操作：操作方法同实施例1的稀释操作，但使用上述M199克隆营养液Ⅱ进行培养(含10v/v％L15细胞生长液和10v/v％M199细胞生长液)。

结果：利用原M199培养基进行复苏和使用M199克隆培养液Ⅱ(含10v/v％L15细胞生长液和10v/v％M199细胞生长液)进行单细胞克隆培养，克隆后24小时多孔可见单个轮廓清晰的细胞贴壁(22/96)，部分单细胞孔虽然可正常分裂增殖生长(14/22)，最终7/22单细胞孔在3周内克隆成功。由此可见，L15细胞生长液对于单个细胞贴壁和生长也存在较好的促进作用，将L15细胞生长液和M199细胞生长液配合使用时，对单个细胞贴壁和生长的促进作用更加明显。克隆成功率统计结果见表1。

实施例2鳜脑克隆传代细胞株原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库的建立

取实施例1中的鳜脑克隆传代细胞株F1～F10细胞冻存在液氮中，作为鳜脑克隆传代细胞株SBCC原始细胞库，F11～F20细胞冻存在液氮中，作为鳜脑克隆传代细胞株SBCC基础细胞库，F21～F30细胞冻存在液氮中，作为鳜脑克隆传代细胞株SBCC工作细胞库。

(1)细胞的冻存：选取长成良好单层的75cm²细胞一瓶，弃去细胞培养液，加入1ml0.25％胰酶消化液在28℃条件下进行消化，消化完毕后，弃去消化液，加入4ml细胞冻存液(含40v/v％胎牛血清和10v/v％二甲基亚砜的L15培养基)，使细胞分散悬浮，取100μl细胞悬液加100μl 0.1％台盼蓝染色液，混匀后吸20μl至细胞计数板上，在countstar细胞计数仪上进行细胞计数，随后用细胞冻存液将细胞浓度稀释至1×10⁶cells/ml，分装于细胞冻存管，1.5ml/管。将冻存管放入程序降温盒里，-80℃冰箱放置过夜后移至液氮中保存。

(2)细胞的复苏：从液氮中取出冻存的细胞，在30℃温水中快速搅动融化，室温1000rpm离心3分钟后弃去上清，加入1ml L15营养液(含10v/v％胎牛血清)重悬后转移至25cm²细胞培养瓶中，补加6ml L15营养液，置28℃细胞培养箱中培养。

实施例3鳜脑克隆传代细胞株的病毒增殖感染实验

取实施例1中鳜脑克隆传代细胞株SBCC株的F11、F21和F50细胞以及鳜脑传代细胞系F65和F105细胞进行SGIV-HN株(新加坡石斑鱼蛙虹彩病毒)和SKIV-SD株(斑石鲷虹彩病毒)的增殖感染试验，并测定繁殖病毒的病毒含量。

病毒增殖感染：将细胞传代至8个25cm²细胞瓶，长成良好单层后随机取1瓶进行计数，随后上述2种病毒按感染复数M0I＝0.005接种形成良好单层的6瓶细胞，3瓶/种病毒，另取1瓶作为空白对照。当细胞病变(CPE)达到80％以上时置-20℃以下冻融后收获病毒液。并测定繁殖的病毒含量，计算3瓶病毒的病毒滴度平均值。

病毒含量测定：将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，100μl/孔(细胞密度约为4×10⁵个/ml)，置28℃培养箱培养24小时，使细胞形成单层。取病毒液，用无血清L15培养基作10倍系列稀释，取10^-5至10^-8共4个稀释度接种于单层细胞的96孔细胞培养板中，100μl/孔，每个稀释度设6个孔，同时设6个正常细胞对照孔，最后于每孔中补加4％胎牛血清的L15维持液，100μl/孔，继续培养7日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

结果：SGIV-HN株接种各个代次的鳜脑克隆传代细胞株所制得的病毒毒价均远高于在鳜脑传代细胞上所制得的病毒毒价，约高出1个滴度。在鳜脑克隆传代细胞株所制得的SKIV病毒毒价比在鳜脑传代细胞上平均高出大约0.5个滴度。由此可见鳜脑克隆传代细胞株在病毒感染上明显优于鳜脑传代细胞系。病毒毒价结果详见表2，病毒病变(CPE)详见图7A-图7B。

表2细胞感染病毒后的所获得病毒液的病毒滴度

实施例4鳜脑克隆传代细胞株的病料分离实验

(1)病料来源：病料1来自广东某鲈鱼养殖场鲈鱼弹状病毒MSRV发病鲈鱼，病料2来自广东某鳜鱼养殖场传染性脾肾坏死病毒ISKNV发病鳜鱼，病料3来自广东某鲈鱼养殖场大口黑鲈虹彩病毒LMBV发病鲈鱼。

(2)病原分离：取各病料脾脏和肾脏组织混合，加入不含血清的L15培养基，充分匀浆后-20℃反复冻融3次，5000r/min，4℃条件下离心10分钟，取上清经0.22μm过滤器过滤，滤液-20℃保存备用。SBCC株F30细胞长至良好单层后，取上述上清滤液按1:10体积比接种细胞，置28℃培养，7天后收集病毒培养液于-20℃下反复冻融3次后将病毒培养液在SBCC株细胞上盲传3代。

(3)病毒鉴定：收获上述病料1病毒液，用病毒核酸提取试剂盒提取组织的核酸后，用PrimeScript^TMOne Step RT-PCR试剂盒按说明书要求进行反转录。

MSRV特异性PCR鉴定引物：

上游引物：ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG；

下游引物：CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA；

预期扩增片段大小为372bp；

PCR扩增体系：

反应程序：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。

收获上述病料2病毒液，用DNA提取试剂盒提取组织的DNA后，用Premix Taq^TM酶进行PCR扩增。

ISKNV特异性PCR鉴定引物：

上游引物：ATGTCTGCAATCTCAGGTGCAAACG；

下游引物：TTACAGAGGGAAGCCTGCGGCGCCG；

预期扩增片段大小为1300bp；

PCR扩增体系：

反应程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，30个循环；72℃5min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。

收获上述病料3病毒液，用DNA提取试剂盒提取组织的DNA后，用Premix Taq^TM酶进行PCR扩增。

LMBV特异性PCR鉴定引物：

上游引物：TTTCGGGCAGCAGTTTTCGGT；

下游引物：CCGTAGTTGGTGGAGCC；

预期扩增片段大小为1029bp

PCR扩增体系：

反应程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，30个循环；72℃5min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。

结果：病料1、病料2和病料3在SBCC上盲传3代，均可见明显的细胞病变，经测序验证后确定分别为MSRV、ISKNV和LMBV。证明使用SBCC株细胞可成功分离到MSRV病毒、ISKNV病毒和LMBV病毒，CPE见图7C-图7E。

实施例5鳜脑克隆传代细胞株的鉴定

胞核学检查：取鳜脑克隆传代细胞株F20、F50和F60细胞进行胞核学检查。将细胞传至25cm²培养瓶中，形成70％～80％的汇合层时，加入终浓度为0.2μg/ml的秋水仙素，置28℃细胞培养箱继续培养6小时。用0.25％胰酶将细胞消化下来，灭菌PBS洗涤一次，然后将细胞重悬于新鲜配制的0.05％(w/v)的KCl溶液中，37℃低渗处理30分钟；室温1000r/min离心5分钟，加入3：1比例的甲醇：冰乙酸固定液，轻轻震荡重悬，室温作用20分钟后，再次室温离心收集细胞，并用新的固定液进行二次固定。将干净的载玻片置于-20℃以下冰箱预冷，形成冰片。吸取处理好的细胞，约60cm的高度滴在倾斜放置的冰片上，每个冰片滴1滴。室温自然晾干后，用新鲜配制的10％吉姆萨染液作用约15～30分钟，自来水冲洗，室温晾干，置相差显微镜下进行观察、照相并计数。每个代次随机取50个细胞的染色体进行计数。

结果：对F20、F50和F60进行胞核学检验，结果显示所有被检代次细胞中，染色体众数均为46，各代次细胞核型均未发生改变，且细胞核型相同。如图8。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (9)

1.一株鳜脑克隆传代细胞株，其特征在于，于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62565，分类学名称为鳜脑克隆传代细胞株。

2.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株在构建细胞库中的应用。

3.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒分离中的应用。

4.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒培养中的应用。

5.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株在水产动物病毒非诊断目的检测中的应用。

6.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株在作为研究水产动物病毒的宿主细胞的应用。

7.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株在筛选和/或制备预防和/或治疗水产动物病毒所致的疾病的药物中的应用。

8.权利要求1所述的鳜脑克隆传代细胞株作为水产动物病毒的基因筛选和功能分析、病原功能研究、细胞工程育种或免疫相关功能基因研究的生物模型中的应用。

9.根据权利要求3～8任一项所述的应用，其特征在于，所述水产动物病毒为石斑鱼蛙虹彩病毒、斑石鲷虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒或鲈鱼弹状病毒中的至少一种。