CN114395524B

CN114395524B - 一种大黄鱼胚胎细胞系yce1及其应用

Info

Publication number: CN114395524B
Application number: CN202210076955.XA
Authority: CN
Inventors: 郑在予; 池洪树; 龚晖
Original assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114395524A

Abstract

本发明提供了一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1及其应用，涉及细胞系技术领域。本发明所述细胞系YCE1的保藏编号为CCTCC No:C2021236。本发明所述细胞系YCE1的培养方法简便经济，除胎牛血清外无需添加特殊营养因子，在病毒学、免疫学、遗传学、生理学、毒理学等领域都有良好的应用前景。本发明还提供了上述细胞系YCE1的应用，可作为病毒宿主细胞用以构建病毒侵染模型，也可用于构建外源基因表达模型。

Description

一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1及其应用

技术领域

本发明属于细胞系技术领域，具体涉及一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1及其应用。

背景技术

自1962年，第一株真骨鱼类永久性细胞系——虹鳟性腺细胞系RTG-2建立以来，截至2020年，已公开发表的鱼类细胞系共计783株，分属44个科。最近10年中，70％以上的新建鱼类细胞系报导来自亚洲，其中约28％来自中国，说明以中国为首的亚洲地区已经成为世界鱼类细胞培养技术研究的中心。鱼类细胞系培养技术在病原学、免疫学、细胞生物学、发育生物学、生理学、药理学、毒理学、遗传学和种质资源保护等领域都得到广泛的应用，在病毒学研究中的地位尤其关键：病毒在细胞体系中的培养和分离被视为病原鉴定、特性分析和机制研究的不可或缺的基础和起点。

大黄鱼(Larimichthys crocea)，属鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Larimichthys)，其体色金黄，肉质洁白细腻而味美，具有丰富的营养价值，是我国传统“四大海产”之首，有“国鱼”的美誉。在闽、浙等地区，成规模捕捞大黄鱼已有数百年历史。

虽然大黄鱼已经实现了大规模的人工海水网箱养殖，但是由于网箱养殖业普遍存在布局不善、密度过高、水质恶化、滥用药物、近亲繁殖等现象，导致养殖大黄鱼的病害侵袭和种质退化状况相当严重。近年来每年大黄鱼产业因病害造成的损失数以亿计，同时影响了养殖区所在海域的环境治理和整个行业的可持续发展。大黄鱼养殖业的常见病害中，以病毒性疾病研究基础最为薄弱，危害大而防控困难。目前大黄鱼病毒研究的相关报道很少，究其原因，正是由于具备病毒敏感性的宿主细胞系模型的缺乏，致使大黄鱼病毒病的发病机制研究和疫苗开发在起步阶段即遭遇困境。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1及其应用，所述细胞系YCE1具备病毒敏感性和已知生物学特性，能够长期、稳定地大量获取，对于大黄鱼的病害防控和种质保护研究有重要的意义，更有益于大黄鱼养殖业的健康可持续发展，以及在可期的未来实现野生种群的复壮。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种大黄鱼胚胎细胞系(Larimichthys crocea)YCE1，所述细胞系YCE1已完成保藏，保藏编号为CCTCC No：C2021236。

本发明还提供了上述细胞系YCE1在构建病毒侵染模型中的应用。

优选的，所述病毒侵染模型以所述细胞系YCE1为宿主细胞，以侵染大黄鱼的病毒为侵染病毒。

优选的，所述病毒包括大黄鱼虹彩病毒。

本发明还提供了上述细胞系YCE1在构建外源基因表达模型中的应用。

本发明还提供了一种外源基因表达模型的构建方法，包括以下步骤：将上述细胞系YCE1培养成单层细胞，利用携带外源基因的重组表达载体转染所述单层细胞，培养后得所述外源基因表达模型。

优选的，所述单层细胞的培养方法，包括：将所述细胞系YCE1接种到培养皿中，在26℃条件下培养18～24h，得所述单层细胞；所述细胞系YCE1的接种量为0.8×10⁵～2×10⁵个/皿。

优选的，所述携带外源基因的重组表达载体的基础载体包括真核表达载体，所述真核表达载体包括pEGFP-N1。

优选的，所述转染的方法包括脂质体转染法。

本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的外源基因表达模型。

有益效果：本发明提供了一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1，保藏编号为CCTCC No:C2021236。本发明提供的细胞系YCE1为上皮样细胞，是一株异倍体细胞系，在26℃达到最佳生长状态，具有形态稳定、生长旺盛、增殖能力强等特点，传代间隔极短，自第20代起传代周期即稳定为24h，并在传代60次后依然保持典型的上皮样细胞形态，能在短期内提供大量的活性细胞材料；在液氮中保存30天的细胞复苏后其贴壁率可达90％以上，更换培养基后成活率超过80％。同时所述细胞系YCE1的培养方法简便经济，除胎牛血清外无需添加特殊营养因子，在病毒学、免疫学、遗传学、生理学、毒理学等领域都有良好的应用前景。

本发明还提供了上述细胞系YCE1的应用，可作为病毒宿主细胞用以构建病毒侵染模型，也可用于构建外源基因表达模型。实施例中，利用大黄鱼虹彩病毒侵染所述细胞系构建病毒侵染模型，接种病毒96h后，可观察到接毒样品中细胞死亡率上升，出现CPE(细胞病变)现象，至接毒后168h病变率可达95％，连续传代接种10次均出现类似病变特征，并且在病毒的细胞传代过程中，细胞内LYCIV衣壳蛋白基因的拷贝数出现了极显著的增长，且增长幅度随传代次数的增加而升高，表明所述细胞系YCE1作为病毒研究模型的潜力；同时还以绿色荧光蛋白为外源表达基因，构建进所述细胞系YCE1中，经观测，自转染后24h起可实现表达，荧光持续时间可稳定达到4天以上，测得转染率约为3％，在鱼类细胞系中表现优秀，说明所建立的大黄鱼胚胎细胞系YCE1可稳定表达外源性基因，该细胞系在基因工程领域具备相当的应用价值。

生物保藏信息

大黄鱼胚胎细胞系YCE1，Larimichthys crocea，保藏于中国典型培养物保藏中心，单位简称为CCTCC，地址为中国武汉，武汉大学，保藏时间为2021年9月30日，保藏编号为CCTCC No:C2021236。

附图说明

图1为显微镜下观察本发明大黄鱼胚胎细胞的原代培养图；

图2为显微镜下观察本发明大黄鱼胚胎细胞的早期传代培养图；

图3为显微镜下观察本发明大黄鱼胚胎细胞经分选纯化培养成系后的常规传代培养图；

图4为大黄鱼胚胎细胞在不同温度下的生长曲线图；

图5为大黄鱼胚胎细胞的染色体组型分析图，右侧图为典型异倍体大黄鱼胚胎细胞的中期分裂相核型，左侧图为100个中期分裂相样本中含有不同染色体数的细胞样本数的柱形分布图；

图6为接种大黄鱼虹彩病毒后，大黄鱼胚胎细胞的形态图；

图7为以荧光定量PCR方法测定的大黄鱼虹彩病毒衣壳蛋白基因特异性检测片段在大黄鱼胚胎细胞中的表达产物的电泳图；

图8为接种大黄鱼虹彩病毒后，透射电镜观察到的大黄鱼胚胎细胞中的病毒粒子形态及分布状况；

图9为质粒pEGFP-N1在大黄鱼胚胎细胞中表达显示的荧光图。

具体实施方式

本发明所述细胞系YCE1为上皮样细胞，具有形态稳定、生长旺盛、增殖能力强的特点，传到第60代时仍然保持典型的上皮样细胞的形态；在体外传代的过程中始终保持其传代间隔极短的特点，且传代周期稳定为24h。

本发明所述大黄鱼胚胎细胞系YCE1的建立方法，优选包括原代培养、二步消化传代培养、常规传代培养和细胞系建立与冻存。

本发明所述原代培养，优选包括：在无菌环境中，利用预冷的含抗生素的PBS溶液漂洗大黄鱼受精卵后，移除卵膜，将胚胎剪碎成0.5～1mm³的块状，再次漂洗后贴附于细胞培养瓶底部，于26℃生化培养箱中密闭倒置4～6h，滴入第一完全培养基后，于26℃正置培养。本发明在所述正置培养时，优选还包括每隔24h追加1mL所述第一完全培养基，直至培养基总体积达到5mL，并且每48h全换液一次，得到原代培养物。本发明所述PBS溶液中含有抗生素，所述抗生素包括青霉素和链霉素，且所述抗生素的浓度优选为青霉素的终浓度优选为200IU/mL，链霉素的终浓度优选为200μg/mL。本发明所述细胞培养瓶的规格优选为50mL细胞培养瓶，且所述贴附前，优选用0.5mL L-15溶液浸润所述细胞培养瓶。本发明所述贴附时，组织块排列间距优选为0.5cm。本发明所述第一完全培养基内优选包括Leibovitz's L-15溶液、抗生素和营养素，所述营养素优选包括胎牛血清(FBS)，所述抗生素优选包括青霉素和链霉素。本发明所述第一完全培养基以Leibovitz's L-15溶液为基液，所述胎牛血清的体积优选为基液体积的15％，并且所述第一完全培养基内，青霉素的终浓度优选为200IU/mL，链霉素的终浓度优选为200μg/mL。本发明所述第一完全培养基用于原代培养和第1-3代传代培养。

在本发明中，当所述原代培养物中贴壁细胞覆盖培养瓶底部90％以上面积后，进行首次传代培养(第1代传代培养)。本发明所述第1代传代培养优选采用全消化传代，可消化去除残余组织块，获取更多细胞，更优选包括利用胰蛋白酶溶液消化所述原代培养物，消化产物与所述第一完全培养基混合，离心收集细胞，将收集的细胞与所述第一完全培养基重悬后按照1:2的扩增比率接种至新的50mL细胞培养瓶中，并添加第一完全培养基至总体积为5mL/瓶，置于26℃密闭培养，至形成密闭的细胞单层。本发明所述第2代至第19代优选均采用二步法传代，即一瓶细胞连续消化两次，产物进行分别接种，其中第2代和第3代时采用第一完全培养基，第4代至第19代采用第二完全培养基。

本发明所述第2代传代培养的方法，优选包括：将用质量/体积浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液于26℃下消化第1代传代培养得到的所述细胞单层45s，弃去消化液后，加入5mL/瓶所述第一完全培养基，以弯头玻璃滴管轻柔吹打松动脱壁的上层细胞20s后(期间需尽量避免直接触碰细胞层)，将全部含悬浮细胞的上清液(一型细胞悬液)以1:2的扩增比率转移至新培养瓶中，并添加所述第一完全培养基至总体积为5mL/瓶；在原培养瓶中再次加入质量/体积浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，于26℃下消化剩余的下层细胞2min，以弯头玻璃滴管充分吹打悬浮细胞后，将所述下层细胞悬浮液(二型细胞悬液)以1:2的扩增比率接种至新培养瓶中，并添加第一完全培养基至总体积为5mL/瓶。本发明对第2代传代培养得到的细胞进行与第2代传代培养相同的操作，得到第3代传代培养的细胞。本发明所述第4代传代培养至第19代传代培养的方法除培养基不同外，其余操作完全相同，在第4代传代培养至第19代传代培养所用的培养基为第二完全培养基。

在本发明中，第1代传代优选采用全消化传代，第2代和第3代采用二步法传代，自第4次细胞传代起将使用的培养介质替换为第二完全培养基，并采用二步法传代至第19代；自第20次传代培养起适用常规传代培养程序至第60代，该培养程序转换节点可视传代细胞纯化程度进行小幅度提前或延后。本发明所述第二完全培养基优选以Leibovitz's L-15溶液为基液，还包括胎牛血清，胎牛血清的体积百分数为15％，不含其它添加物。

本发明优选利用上层细胞/一型细胞纯化培养物为基础创制大黄鱼胚胎细胞系YCE1，并在上述传代至20代后进行常规传代培养，所述常规传代培养优选包括：利用胰蛋白酶消化所述一型细胞培养物，利用第一完全培养基种植消化后，吹打悬浮细胞，离心后收集细胞，再次利用第二完全培养基重悬，将细胞悬液接种至新的50mL细胞培养瓶中，置于26℃密闭培养，至形成密闭的细胞单层。

本发明利用经所述常规传代培养得到的细胞单层进行细胞系建立与冻存，所述细胞系建立与冻存优选包括：胰蛋白酶消化所述细胞单层，移去消化液后，与所述第二完全培养基混合分散细胞，将得到的细胞悬液以1:2的扩增比率接种至新培养瓶中，并添加第二完全培养基至总体积为5mL/瓶；自第20次细胞传代起，将细胞扩增比率提升至1:3，如因实验方案需要延长传代间隔(不超过72h)则可将扩增比率提升至1:4；传代60次后得到大黄鱼胚胎细胞系YCE1。

本发明对得到的所述细胞系YCE1优选利用液氮保存的方式进行保存，具体包括：传代细胞在体外生长24h后，按上述常规传代培养的方法进行消化和离心，收集细胞用细胞冻存液重悬，稀释至细胞密度为10⁶个/mL，分装至1.2mL细胞冻存管中，按4℃静置30min，-75℃静置过夜，液氮(-196℃)长期保存的流程进行逐级降温保藏，冻存30天后，取冻存管于37℃恒温水浴锅中复苏2min，将细胞重悬后接种至预先加有5mL/瓶所述第二种完全培养基的50mL细胞培养瓶中，12h后需完全换液一次。本发明所述细胞冻存液优选包括体积浓度为70％的Leibovitz's L-15，体积浓度20％的胎牛血清和体积浓度10％的二甲亚砜。

本发明所述病毒侵染模型优选以所述细胞系YCE1为宿主细胞，以侵染大黄鱼的病毒为侵染病毒。本发明对所述病毒的类型并没有特殊限定，只要对大黄鱼具有侵染作用均可用于制备对应的病毒侵染模型。为方便说明，实施例中以大黄鱼虹彩病毒为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明对所述病毒侵染的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规侵染方法即可。

本发明所述单层细胞的培养方法，优选包括：将所述细胞系YCE1接种到培养皿中，在26℃条件下培养18h，得所述单层细胞；所述细胞系YCE1的接种量为1×10⁵个/皿。本发明对所述转染的方法并没有特殊限定，实施例中采用脂质体转染法，所以培养皿中只需要使用脂质体转染法或对应转染法的培养基即可。

本发明所述携带外源基因的重组表达载体的基础载体优选包括真核表达载体，更优选包括pEGFP-N1。本发明对所述外源基因的类型和核苷酸序列并没有特殊限定，所述携带外源基因的表达载体的转染浓度优选为5μg/10μl。本发明所述携带外源基因的表达载体优选以溶液形式存在，溶剂为转染剂，依据不同型号转染剂的使用要求，表达载体的稀释配方和转染后的换液需求可能存在差异。为方便说明，实施例中以绿色荧光蛋白(GFP)为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

下面结合实施例对本发明提供的一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

大黄鱼胚胎细胞的原代培养

1、实验动物：

受精后20h左右的大黄鱼受精卵

2、试剂

L-15(购自Hyclone)；1000000U/10mg青-链霉素混合液(购自上海生工)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin，购自Sigma)；胎牛血清(Fetal bovineserum，FBS，购自Gibco)。

3、仪器

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)。

4、耗材

解剖用眼科镊、维纳斯剪(六六眼科)；50mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管(BDFalcon)；5mL弯头玻璃滴管。

5、步骤：

1)试前准备：通过安排运输时间使得大黄鱼受精卵到达实验室的时间在受精后20h左右，不超过22h；从育种场到实验室的运输途中，需将大黄鱼受精卵全程置于25～28℃的洁净海水中。

2)缓冲液和消化液配制：按标准配方配置0.1mol/L的PBS储备液，以此为基础配置含有终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200μg/mL的链霉素的0.01mol/L工作缓冲液和含0.25％胰蛋白酶的Trypsin消化液。

3)原代用完全培养液配制：制备以L-15培养基为基础，含终体积浓度为15％的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200μg/mL的链霉素的完全培养液。

4)取材准备：从步骤1)所述的大黄鱼受精卵中择选形状饱满，透光度佳者约20枚，移入步骤2)所述的PBS工作缓冲液中充分浸泡。

5)原代培养：将步骤4)所述的大黄鱼受精卵移入超净工作台，用0℃预冷的如步骤2)所述的PBS溶液漂洗10～15次。于16倍解剖显微镜下用眼科镊移除卵膜，取出胚胎然后将其剪碎成约0.5～1mm³大小的块状，用含抗生素的PBS工作液(0.01mol/L，含青霉素200U/mL和链霉素200μg/mL)漂洗3次后，贴附于洁净的50mL细胞培养瓶底部，并用0.5mL L-15溶液浸润，组织块排列间距为0.5cm；贴附完毕的培养瓶底面向上倒置，于26℃生化培养箱中密闭静置4～6h后取出，每瓶滴入2mL步骤3)所述的完全培养基后缓慢翻转为正置，于26℃恒温下静置，启动原代培养；启动培养后，每隔24h追加1mL完全培养基，直至培养基总体积达到5mL；其后每48h行全换液一次。

结果：大黄鱼胚胎组织十分松散，在解剖过程中极易因机械力而分散，因此接种后24h即可观测到大量细胞从胚胎组织周边分散到整个培养瓶底面，形成大量小型“岛状”聚落(图1)，其后在二周内即可接近铺满瓶底，可准备进行传代培养。

实施例2

大黄鱼胚胎细胞系的建立

1、试剂

L-15(购自Hyclone)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin，购自Sigma)；二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)；胎牛血清(购自Gibco)；

2、仪器

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)；离心机(Beckman)；液氮罐(Locator)；

3、耗材

50mL细胞培养瓶(Corning)，250mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管(BDFalcon)；5mL弯头玻璃滴管；

4、步骤：

1)缓冲液和消化液配制：按标准配方配置0.1mol/L的PBS储备液，以此为基础配置含有终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200μg/mL的链霉素的0.01mol/L工作缓冲液和含0.25％胰蛋白酶的Trypsin消化液。

3)第1～3次传代用完全培养基配制：制备以L-15培养基为基础，含终体积浓度为15％的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200μg/mL的链霉素的完全培养基。

4)常规传代用完全培养基配制：制备以L-15培养基为基础，含终体积浓度为15％的胎牛血清的完全培养基。

5)首次传代培养：当所述原代培养物中贴壁细胞覆盖培养瓶底部90％以上面积后，进行首次传代培养；传代前弃去培养液和脱落的组织块，用少量质量/体积浓度0.25％胰酶润洗细胞层，弃去胰酶，加入5mL胰酶溶液于26℃下充分消化培养物5min，弃去胰酶后在消化产物中加入5mL步骤3)所述的完全培养基中止反应；以弯头玻璃滴管充分吹打离散组织块残基并悬浮细胞，以1000rpm离心3min，收集细胞并以5mL步骤3)所述完全培养基重悬，将此细胞悬液以1:2的扩增比率接种至新的50mL细胞培养瓶中，并添加步骤3)所述完全培养基至总体积为5mL/瓶，置于26℃密闭培养，直至形成密闭的细胞单层。

6)二步消化法传代培养：用质量/体积浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液于26℃下消化步骤5)所述细胞单层45s，弃去消化液后，加入5mL/瓶步骤3)所述完全培养基，以弯头玻璃滴管轻柔吹打松动脱壁的上层细胞20s后(期间需尽量避免直接触碰细胞层)，将全部含悬浮细胞的上清液(一型细胞悬液)以1:2的扩增比率转移至新培养瓶中，并添加步骤3)所述完全培养基至总体积为5mL/瓶；在原培养瓶中再次加入质量/体积浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，于26℃下消化剩余的下层细胞2min，以弯头玻璃滴管充分吹打悬浮细胞后，将所述下层细胞悬浮液(二型细胞悬液)以1:2的扩增比率接种至新培养瓶中，并添加步骤3)完全培养基至总体积为5mL/瓶；重复上述步骤3次后，自第4次细胞传代起将使用的培养介质替换为步骤4)所述的常规传代培养用完全培养基；所述二步消化传代培养程序适用于第2～19次传代培养，该培养程序转换节点可视传代细胞纯化程度进行小幅度提前或延后。

7)常规传代培养：自第20次传代培养起启用该培养程序，当细胞能稳定形成单层后对其进行常规传代培养，以显微镜法对培养细胞进行连续观察，当细胞形成均匀的闭合单层时即行传代，用少量质量/体积浓度0.25％胰酶润洗细胞层，弃去，再加入足量胰酶(2mL/50mL细胞培养瓶)消化细胞至圆缩但未脱壁状态，不弃去消化液，直接加入如步骤4)所述的完全培养液5mL以中止消化反应，用弯头滴管将全部细胞吹下，1000rpm离心3min，弃去上清，再加入5mL如步骤4)所述的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液以1:3的扩增比例接种到新瓶，如因实验方案需要延长传代间隔则可将扩增比率提升至1:4，并追加完全培养基至终体积为5mL/50mL细胞培养瓶，于26℃静置培养。

8)细胞的冻存及复苏：当细胞进入传代培养阶段后，每隔2代对其分批进行液氮冷冻保存，冻存液组成为70％L-15、20％胎牛血清以及10％DMSO；取处于对数生长期的细胞，依步骤7)所述消化方法获得细胞悬液后，1500rpm离心3min，弃去上清后以冻存液重悬细胞，按每管5×10⁵～1×10⁶细胞数分装于细胞冻存管内，置于内盛异丙醇的程序降温盒中，在4℃冷却30min后移入-70℃冰箱，过夜后移入液氮长期保存；复苏细胞时，以37℃水浴迅速解冻样品，吸出细胞悬液后与步骤4)所述的完全培养基轻柔混匀接种于50mL培养瓶内，12h后更换培养基，去除未成活细胞和DMSO成分后继续培养。

结果：在所述大黄鱼胚胎传代细胞的前十余代中，这一培养物都明显地体现为两种主要细胞类型的混合体(图2)，由于这两类细胞在消化酶作用下脱壁的速度有显著差异，因此通过二步消化法逐渐将二者分离，至第20代以后，这两株分选细胞培养物已经高度纯化，拥有不同形态且生长速率差别显著；其中，一型细胞分离株消化脱壁速度较快，消化程序仅需30～60s，传代周期极短，仅需24h左右即可再行传代，而二型细胞分离株消化脱壁速度较慢，消化程序需100～150s，传代周期较长，需72h左右。选择增殖旺盛的一型细胞分离株作为优先建系对象，将其在体外连续传至60代，该细胞株始终保持着稳定的上皮样细胞形态以及增殖旺盛和传代间隔极短的特点(图3)，在50～60代之间传代周期仍稳定为24h；在液氮中保存一个月的细胞复苏后其贴壁率可达90％以上，更换培养基后成活率超过80％，至此，成功建立了一株大黄鱼胚胎细胞系，命名为YCE1(Yellow Croaker Embryo 1)，上述YCE1细胞系已经连续传代超过65代，并于2021年9月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:C2021236。

实施例3

对自建的大黄鱼胚胎细胞系YCE1进行生长特性测定

1、试剂

L-15(购自Hyclone)；胰蛋白酶(Trypsin，购自Sigma)；胎牛血清(购自Gibco)；

2、仪器

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)，液氮罐(Locator)，离心机(Beckman)，流式细胞仪(Bio-rad)；

3、耗材

50mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管、1.5mL离心管(BD Falcon)；5mL弯头玻璃滴管；

4、步骤

第60代YCE1细胞以2×10⁵个/瓶的密度接种至50mL细胞培养瓶中，分为6组，分别于10℃，15℃，20℃，26℃，37℃和40℃下培养。

每隔1天，从每组细胞中各取3瓶，用0.25％胰酶消化收获细胞后，以流式细胞仪计数，重复上述步骤至接种后第7天，收集数据绘制生长曲线，根据公式I计算细胞倍增时间(PDT)：

T＝t[lg2(lgN_t-lg N₀)^-1] (公式I)

结果：YCE1细胞系在15℃～37℃的温度区间内均可形成汇合单层，而在10℃和40℃下仅可见少数零星细胞存活，细胞量低于计数所需最低标准；接种后第2～5天为YCE1细胞的对数生长期，在此区间于26℃观察到最高生长率，随着温度降低，YCE1的增殖速度也相应下降，而在37℃的较高温度下，YCE1在接种后24h内有小规模增殖，其后细胞密度迅速下降，至培养120h时已无细胞存活(图4)；因此，经多次对比试验，选择26℃为YCE1细胞系的常规培养温度，在此温度下该细胞系能于18h内形成单层，并维持该状态超过72h；测得26℃下YCE1细胞的倍增时间为PDT＝33.35h，说明该温度下YCE1细胞系生长十分活跃旺盛，适用于常规病原分离、毒价分析等实验。

实施例4

对自建的大黄鱼胚胎细胞系YCE1进行染色体型分析

1、试剂

L-15(购自Hyclone)；甘油、甲醇、冰醋酸、Giemsa粉剂(购自上海生工)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(购自Sigma)；胎牛血清(购自Gibco)；秋水仙素(Colchicine，购自Sigma)；

2、仪器:

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)；液氮罐(Locator)，离心机(Beckman)；

3、耗材:

250mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管(BD Falcon)；载玻片；5mL弯头玻璃滴管；标准玻璃脱色皿；

4、步骤

当YCE1细胞在体外连续培养超过12个月，且传代次数超过50代后，选择对数生长期的细胞，以秋水仙素法处理后进行染色体型分析：

1)维持性培养基的配制：制备以L-15培养基为基础，含有终浓度为5％的胎牛血清，不含抗生素及其他营养添加物的维持性培养基，该配方适用于多种生理学、药理学和病原学分析试验。

2)将所选代次的细胞接种至250mL细胞培养瓶中，于26℃下培养24h后，将培养基完全替换为如步骤1)所述的维持性培养基，并加入终浓度为0.5μg/mL的秋水仙素，孵育4h。

3)用质量/体积浓度0.25％的胰酶消化细胞45s后，加入如前文所述的常规传代用完全培养基终止反应，以弯头滴管吹打收集细胞后，1000rpm离心3min，弃去上清，沉淀用5mL质量/体积浓度0.3％的KCl溶液重悬，低渗处理25min；向细胞悬液中滴加1mL卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，预冷至0℃)预固定5min，1500rpm离心5min后，弃去上清，沉淀加入1mL卡诺氏固定液，静置固定10min；固定后的细胞再次1500rpm离心5min去除杂质，以1mL卡诺氏固定液重悬，4℃静置过夜。

将含有固定细胞的悬液从70～80cm高度垂直滴落于预冷至0℃的洁净载玻片上，轻敲玻片背面使样本细胞均匀分散；滴片风干后以10％Giemsa染色液(pH＝6.8)染色1h，漂洗1次后再度风干，于显微镜下选取100个典型的中期分裂相细胞，拍照并进行染色体数目统计分析。

结果：对第51代YCE1细胞进行染色体型分析实验，细胞样本的染色体众数分散在2n＝32～96的区间里，在100个中期分裂相样本中，仅有22％的样本细胞染色体众数符合2n＝48(图5中左侧图)，大多数样本的染色体型都呈现严重的异倍化(图5中右侧图)，证明YCE1是一株异倍体细胞系。

实施例5

确证自建大黄鱼细胞系的种属来源

1、试剂

L-15(购自Hyclone)；胰蛋白酶(Trypsin)、琼脂糖(Agarose，购自Sigma)；胎牛血清(购自Gibco)；

2、仪器

ABI 7500荧光定量PCR仪(Thermo)；NanoDrop 2000凝胶成像仪(Thermo)；

3、耗材

DNA提取试剂盒Tissue DNAKit(Omega)、荧光定量PCR反应试剂盒PremixEx Taq^TMII(Takara)；

4、步骤：

当YCE1细胞在体外连续培养超过12个月，且传代次数超过50代后，通过线粒体细胞色素氧化酶I亚基的基因序列检测来验证该细胞系的种属来源：

1)引物设计：根据大黄鱼线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基(cytochrome oxidasesubunit I，COI)基因序列(GenBank Accession No.FJ595214.1，GenBank AccessionNo.MF004323.1)设计合成简并引物如下，其中R代表A/G，Y代表C/T：

CFF(SEQ ID No.1)：5'TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCAC 3'

CFR(SEQ ID No.2)：5'ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA 3'

2)反应体系：PCR反应总体积为50μL，包括：Premix Taq(TaKaRa)25μL，模板DNA 1μL，引物CFF/R(10μM)各2μL，灭菌水20μL。

扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环；72℃延伸5min。

3)基因扩增与结果分析：如步骤2)所述的PCR扩增反应完成后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对目的条带进行切胶回收纯化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。将所得序列在NCBI数据库中进行Blast检索比对。

PCR产物琼脂糖电泳检测结果显示，目的片段大小约为700bp。测序结果为SEQ IDNo.3所示，Blast比对显示，目的片段与Genebank中大黄鱼(Larimichthys crocea)细胞色素氧化酶I亚基基因序列相似度为100％，因此可知YCE1确实是大黄鱼来源的细胞系，培养过程中未有发生交叉污染。

实施例6

对自建的大黄鱼胚胎细胞系YCE1进行作为大黄鱼虹彩病毒宿主细胞的应用方法研究

1、试剂

L-15(购自Hyclone)；胎牛血清(购自Gibco)；感染大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)的大黄鱼肾组织样品(采集自福建宁德地区大黄鱼养殖场)；LB肉汤培养基(购自sigma)；电镜固定液(2.5％戊二醛，购自上海生工)；琼脂糖(购自sigma)。

2、仪器

超净工作台(Air Tech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；液氮罐(Locator)；NanoDrop 2000凝胶成像仪(Thermo)；ABI 7500荧光定量PCR仪(Thermo)；高速冷冻离心机(Beckman)、水平凝胶电泳仪(北京六一)。

3、耗材

250mL细胞培养瓶(Corning)；5mL弯头玻璃滴管；0.22μm微孔滤膜过滤器(Millipore)；96孔荧光定量PCR板及封膜(ABI)、Viral DNA Kit(Omega)、Ex Taq(Takara)、TBPremix Ex Taq^TMII荧光定量PCR反应试剂盒(Takara)、DNAmarkerDL2000(Takara)、Gene JET DNA提取试剂盒(Thermo)；(Takara)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(Sangon)；pMD-19T克隆载体试剂盒(Takara)；Amp/IPTG/X-Gal LB平板培养基。

4、步骤:

1)将第50代YCE1细胞以5×10⁵细胞数接种于250mL细胞培养瓶，26℃下18h可长成新鲜闭合单层。

2)将完全培养基更换为如实施例4中所述的维持性培养基，移至28℃恒温孵育4h。

3)取感染大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)的大黄鱼肾脏组织，冻融3次后通过差速离心(3000rpm 5min；12000rpm 30min)去除组织残余，上清经0.22μm滤膜过滤除菌后备用；该病毒样品系由本实验室从福建省宁德地区某大黄鱼养殖场分离得到并鉴定，鉴定方法参见步骤7)所述的LYCIV-MCP基因的PCR检测。

4)取上述步骤2)中制备的实验用YCE1细胞，将培养瓶中大部分维持性培养基弃去，仅留少许保持瓶底呈完全润湿状态，取上述步骤3)中制备的病毒样品液，以100μL/瓶的用量接种，28℃静置吸附2h后不移除病毒液，直接添加维持性培养基至体积为20mL/瓶，于28℃下继续静置培养，并以仅进行步骤2)的未接毒细胞作为对照。

5)以24h为间隔对接毒后的YCE1细胞进行显微镜观察，并和对照细胞进行比较，当接毒培养时间达到7天或细胞病变率(cytopathic rate)达到60％时，对接毒样品进行传代培养：待传接毒细胞样品冻融3次后，用弯头玻璃滴管轻柔吹打混匀，以200μL/瓶的用量接种至如步骤2)所述的备用细胞中，接种方法如步骤4)所述，重复上述操作至少10次直至细胞的病变周期和病变表征趋于稳定，或病变表征消失。

6)于每一代接毒细胞收毒冻融前，分别取一瓶细胞用Gene JET DNA提取试剂盒(Thermo)提取总DNA，保存于-40℃，作为LYCIV衣壳蛋白基因表达量荧光定量PCR检测的模板。

7)根据大黄鱼虹彩病毒MCP基因序列，设计合成引物如下：检测引物MCP uni332-F3/uni1108-R8，用于特异性检测肿大细胞病毒属虹彩病毒衣壳蛋白基因777bp片段；全长基因引物MCP 760F/627R，用于扩增LYCIV-MCP全长序列，进行标准质粒构建；定量引物Q-MCP F/R，用于荧光定量PCR标准曲线绘制和定量检测MCP片段的扩增(表1)。

表1引物信息

8)依照如下条件进行大黄鱼肿大细胞虹彩病毒衣壳蛋白基因777bp特异性检测片段以及衣壳蛋白全基因片段的扩增与克隆：

LYCIV-MCP扩增体系：Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)25μL、MCP760F/MCP uni3 32-F3(10μM)2μL、MCP 627R/MCP uni1 108-R8(10μM)2μL、DNA模板2μL和灭菌水19μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s，32个循环；最后72℃延伸5min。

PCR产物用2％琼脂糖凝胶水平电泳检测，通过凝胶成像系统记录结果。将目的带切下，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化。

9)将上述回收片段连接至pMD19-T克隆载体，转化至E.coli菌株DH5-α感受态细胞中，并涂至Amp/IPTG/X-Gal LB平板培养基中37℃培养12h；挑取单个白色菌落，接至LB肉汤(含100μg/mL氨苄青霉素)培养基中，37℃210rpm扩大培养12h后，取得阳性克隆菌，送至生工生物工程(上海)股份有限公司对其进行测序鉴定，和NCBI数据库进行blast比对以确认基因序列。

10)将如步骤9)所述的阳性克隆菌株扩大培养后提取质粒，用NanoDrop 2000凝胶成像系统进行浓度测定，依照公式：拷贝数＝(质量÷分子量)×6.02×10²³，由浓度换算得质粒拷贝数；将质粒样品稀释成10¹⁰～10¹拷贝的标准梯度，作为荧光定量PCR标准品模板。

11)依照如下条件进行荧光定量PCR标准曲线的制作与细胞样品检测荧光定量PCR反应体系：TBPremix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL、Q-MCP-F(10μM)1μL、Q-MCP-R(10μM)1μL、ROX Reference Dye II(50×)0.4μL、DNA模板*32μL和灭菌水5.6μL。

以标准品和样品各2μL为模板，每个标准品重复3孔。扩增标准程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。熔解曲线反应条件为：95℃15s，60℃60s，95℃15s，测定各标准梯度扩增产物的CT值，以其常用对数lg值作为横坐标，对应CT值为纵坐标作散点图，作线性回归分析，绘制标准曲线并得出相应公式。

依照上述方法对如步骤6)所述的不同代次的接毒细胞总DNA样品模板进行扩增和CT值测定，对照标准曲线计算病毒拷贝数，并对LYCIV在体外传代培养中的增殖趋势进行归纳总结。

12)依照如下条件对第7代接种大黄鱼虹彩病毒的大黄鱼胚胎细胞YCE1进行超薄切片和透射电镜观察：接毒96～120小时的细胞弃培养基，不经漂洗迅速加入电镜固定液(2.5％戊二醛)行预固定20s，用细胞刮将细胞轻柔刮下收集到离心管内，1500rpm离心3min，弃固定液后加入新的电镜固定液室温(25～28℃)固定2h，再转移至4℃过夜，在4℃下将固定样品运送至武汉由塞维尔(Service Bio)公司进行超薄石蜡切片、透射电镜观察及显微摄影。

结果：于接毒48h后，开始观察到接毒样品中漂浮细胞碎片增加，接毒96～120h出现显著的CPE(细胞病变)现象，光镜下可见细胞层出现多处空洞，大量细胞皱缩变圆脱落(图6)，168h左右细胞死亡超过90％，而对照样品细胞生长良好，贴壁紧密，细胞密度有显著增加现象；第10代病毒接种细胞的Megalocytivirus MCP基因777bp片段特异性扩增结果显示，经过多次传代接种，依然可在细胞内稳定检测到该基因片段的表达(图7)；荧光定量PCR分析结果显示，随着接毒代次的增加，细胞内LYCIV衣壳蛋白基因的拷贝数出现了极显著的增长(表2)；透射电镜观察结果显示，第7代接种LYCIV的YCE1细胞内有大量未覆包膜的不成熟病毒粒子/病毒装配中间体，集中分布于数种囊泡结构中：可清晰观察到多个病毒粒子被包裹于囊泡状小体(图8左上)，以及具有双层膜结构的类自噬体中(图8右上)，更可观察到上述二者被膜结构包围形成更大的多囊体(multivesicular bodies,MVBs)，在多囊体中的囊泡间隙可见散在分布的病毒粒子(图8左下)，胞质内局部可见病毒粒子呈晶格状排列(图8右下)；以上结果充分显示了所述大黄鱼胚胎细胞系作为大黄鱼虹彩病毒研究模型的潜力。

表2 LYCIV-MCP基因拷贝数在细胞传代培养中的增长(Ct标准曲线：y＝-3.2655x+37.132，R²＝0.9979,2≤x≤10)

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实施例7

对自建的大黄鱼胚胎细胞系YCE1进行作为外源基因表达模型的应用方法研究

1、试剂

L-15、MEM(购自Hyclone)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin，购自Sigma)，胎牛血清(购自Gibco)，lipofectamineTM 3000脂质体转染试剂盒(购自Takara)，pEGFP-N1质粒(购自Takara)。

2、仪器

超净工作台(AirTech)；TCS-SP8激光共聚焦显微镜(Leica)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)，离心机(Beckman)；

3、耗材

50mL细胞培养瓶(Corning)，35mm细胞培养皿(底部附带圆形观察窗，Thermo)；15mL离心管(BD Falcon)；5mL弯头玻璃滴管。

4、步骤

1)第50代大黄鱼胚胎细胞以1×10⁵个/孔的密度接种至标准35mm细胞培养皿内，于26℃培养18h至其形成单层。

2)使用pEGFP-N1质粒对步骤1)所述的培养细胞进行转染，质粒/转染剂质量体积比浓度为5μg/10μL，稀释液为250μL MEM培养基，转染后细胞置于于26℃继续培养24h。依据lipofectamineTM 3000脂质体转染试剂盒的使用需求，转染后无需进行换液，该步骤依使用的转染剂型号不同可能有所差异。

3)使用激光共聚焦显微镜观察转染后细胞的荧光信号，随机选取10个不同视野，计算视野内绿色荧光蛋白(GFP)表达阳性的细胞数占总细胞数的比率，取均值得出转染率。

结果：所建立的大黄鱼胚胎细胞系可稳定表达外源性绿色荧光蛋白，自转染后24h起可在显微镜下观察到绿色荧光，持续时间可长达4天以上(图9)，测得转染率约为3％，说明该细胞系在基因工程领域深具潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种大黄鱼胚胎细胞系YCE1及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcracyaayc ayaaagayat yggcac 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acttcwgggt grccraagaa tca 23

<210> 3

<211> 668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaatcaga ataggtgttg gtagaggatg ggatcgcctc cgcccgaagg gtcgaagaaa 60

gttgtattca gattgcggtc agtcaaaagc attgtgatgc cggcggctaa aacaggtagt 120

gagagcagca ggaggacggc tgtaattaga acggctcaga caaacagagg tgtttgatat 180

tgggtgatgc cggggggttt catattaata attgttgtaa tgaagttgat ggcccccagg 240

attgaggaaa cacctgcgag gtgtagggaa aaaatagcta agtcgactga aggccctgcg 300

tgcgccaggt ttccagcaag cggggggtag actgtccacc ctgttccggc ccctgcttca 360

acccctgatg aggcgaggag cagtaggaaa gaagggggga tgagccagaa gcttatgtta 420

ttcattcggg ggaatgctat gtcgggggcg ccaattatta aaggcacaag ccagttcccg 480

aaccctccaa ttataacggg tattactata aagaagatta taacgaaagc atgtgccgta 540

acgattacat taaaaatctg gtcgtctccg agaagtgagc cgggctggct tagttctgct 600

cgaattagga gacttagggc tgtgcccact attccggctc atgcaccaaa aattaggtag 660

agggtgcc 668

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtgtcggt gtcattaacg acctg 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcaggcat gctgggcgca aag 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtctgcga tctcaggtgc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttacaggata gggaagcctg c 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggtatcacc aacggtcaga ctatg 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcagagaca cggtaggcaa tg 22

Claims

1.一种大黄鱼胚胎细胞系(Larimichthys crocea)YCE1，所述细胞系YCE1已完成保藏，保藏编号为CCTCC No：C2021236。

2.权利要求1所述细胞系YCE1在构建病毒侵染模型中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述病毒侵染模型以所述细胞系YCE1为宿主细胞，以侵染大黄鱼的病毒为侵染病毒。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述病毒包括大黄鱼虹彩病毒。

5.权利要求1所述细胞系YCE1在构建外源基因表达模型中的应用。

6.一种外源基因表达模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述细胞系YCE1培养成单层细胞，利用携带外源基因的重组表达载体转染所述单层细胞，培养后得所述外源基因表达模型。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述单层细胞的培养方法，包括：将所述细胞系YCE1接种到培养皿中，在26℃条件下培养18～24h，得所述单层细胞；所述细胞系YCE1的接种量为0.8×10⁵～2×10⁵个/皿。

8.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述携带外源基因的重组表达载体的基础载体包括真核表达载体，所述真核表达载体包括pEGFP-N1。

9.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述转染的方法包括脂质体转染法。

10.利用权利要求6～9任一项所述构建方法构建得到的外源基因表达模型。