CN104818241B - 鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的生物学名称为GGSK，其保藏号为CCTCC No：C201515。该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法包括以下步骤：对鞍带石斑鱼鱼体进行消毒、组织取样、原代培养和传代培养，传代的细胞可以长时间冻存，复苏率为73％‑88％；该细胞增殖速率快、成活率高、传代稳定、扩增用培养液成本低廉。

Description

鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物细胞系技术领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系及其构建方法。

背景技术

鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)，又称龙胆石斑鱼，俗称龙胆，是石斑鱼类中体型最大的鱼类，有斑王之称。属鲈形目，鮨科，石斑鱼亚科，石斑鱼属。鞍带石斑鱼是我国一类重要海水养殖经济鱼类，由于其肉质鲜嫩、营养丰富，加之其生长快，适应性强，已成为我国南方海水养殖的重要对象。

近年来，随着养殖石斑鱼规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，以及受养殖环境污染、管理技术措施相对滞后等诸多因素的影响，石斑鱼的病害也日益严重。石斑鱼疾病繁多，病原包括病毒、细菌、寄生虫等，尤其是由虹彩病毒、神经坏死病毒引起的病毒病最为严重，一旦暴发就会造成大规模死亡甚至全军覆没，每年因其造成的直接经济损失亿元以上，已经成为石斑鱼养殖业健康发展的重要制约因素之一。

查清病毒的感染途径及病毒与细胞相互作用机理是从根本上预防和解决石斑鱼等众多海洋经济鱼类病毒病的关键。细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、可重复性好、条件可控等优点，被广泛应用于病毒学、免疫学、毒理学、发育生物学、生理学、肿瘤学、基因组学、蛋白组学、遗传学等领域，尤其是在分离与培养病毒、研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗方面是重要的工具。

鱼类是较低等的脊椎动物，生活在病原更为富集的水环境中。鱼类皮肤是机体与外界水环境接触的门户,也是阻止病原微生物进入体内的第一道防线。鱼类的皮肤发挥了屏障的作用并且可以分泌黏液等抗菌物质。对于大多数鱼类而言，并不像陆生脊椎动物一样皮肤表面存在角质化的死细胞，相反，鱼类的表皮几乎全部由活细胞组成。鱼类的皮肤一旦受到化学或机械等损伤后，细菌、病毒或其他病原体就可以快速在鱼类开放性伤口内生长或进入体内。如对海水鱼类危害较为严重的淋巴囊肿病毒，通过皮肤伤口、鰓或消化道入侵机体，在局部增殖，再通过血液循环到达其他靶器官。

显然，鱼类皮肤组织来源细胞是进行鱼类病毒分离、鉴定与繁殖，进而研究鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的良好材料。鱼类原代细胞系的构建技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以构建一株需求鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系具有传代稳定、存活率高的特点。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的生物学名称为GGSK，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系于2015年1月29提交保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为CCTCC No：C201515，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。

本发明的另一目的在于提供上述鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，技术方案如下：

一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

1)组织取样：将鞍带石斑鱼鱼体消毒，无菌解剖，取皮肤组织，浸泡于漂洗液；

2)原代培养：将步骤1)浸泡后的皮肤组织切成1-5mm²的小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶，28℃恒温于培养瓶壁干贴8-12h，加入培养液，开始组织细胞原代培养；

3)传代培养：原代培养细胞长至60-90％汇合度时，用胰酶在室温下消化，加入培养液进行传代培养。

作为优选，包括以下步骤：

1)组织取样：将健活鞍带石斑鱼鱼体用70-75％医用酒精进行消毒，置于超净工作台中，刮去鱼鳞，用灭菌解剖器械取其皮肤组织，浸泡于漂洗液；

2)原代培养：将步骤1)浸洗后的皮肤组织用漂洗液冲洗，锋利刀片切至1-5mm²的小组织块，加贴块培养液浸没小组织块；将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身28℃恒温干贴8-12h，再加入2-3mL原代培养液，28℃恒温培养箱开始原代培养，每4-6天更换培养液一次；

3)传代培养：原代培养细胞长至60-90％汇合度时，进行原代细胞的传代；用0.25％胰酶室温下消化2-3min，加入10-15mL原代培养液吹下贴壁细胞；将细胞悬液接种于2个培养瓶中28℃恒温培养箱培养，以后每5-7天采用传代培养液传代一次。

作为优选，步骤1)中，所述漂洗液包含基础培养基、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素和800μg/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4、且该基础培养基为M199培养液。

作为优选，步骤2)中，所述贴块培养液包括基础培养基、20-30％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4；该基础培养基为MEM或L-15或M199培养基。

作为优选，步骤2)和步骤3)中，所述原代培养液包括基础培养基、5-20％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及10-20ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4；该基础培养基为MEM或L-15或M199培养基。

作为优选，步骤3)中，所述传代培养液包括基础培养基、5-20％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及0-20ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4；该基础培养基为MEM或L-15或M199培养基。

作为优选，步骤3)中，第2代至第5代时，传代培养液中含有15-20％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及8ng/mL表皮生长因子。

作为优选，步骤3)中，第5代至15代时，传代培养液中含有15％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素以及4ng/mL表皮生长因子。

作为优选，步骤3)中，第15代以后，传代培养液中含有8-10％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素，不含表皮生长因子。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明以鞍带石斑鱼为对象，成功构建了鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该细胞系代传稳定，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研究平台和实验材料；

2.本发明提供的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，采用贴块法，原代皮肤组织细胞迁出与增殖快；在传代过程中就其生长阶段调节培养液中的成分配比，以适合其传代生长，提高传代细胞的增殖性能和存活率，同时降低了培养成本；

3.本发明构建的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系生长状态良好，以上皮样细胞为主要形态，细胞能稳定增殖，目前细胞已传至近60代；

4.本发明构建的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系不同代次细胞冻存后复苏率为73％-88％，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为鞍带石斑鱼皮肤组织块迁出细胞(标尺＝100μm)；

图2为鞍带石斑鱼皮肤组织第2代皮肤组织细胞(标尺＝100μm)；

图3为鞍带石斑鱼皮肤组织第17代皮肤组织细胞(标尺＝100μm)；

图4为鞍带石斑鱼皮肤组织第52代皮肤组织细胞(标尺＝100μm)；

图5为不同培养基对皮肤组织细胞生长的影响图；

图6为不同胎牛血清浓度对皮肤组织细胞生长的影响图；

图7为第44代皮肤组织细胞中期染色体分裂相；

图8为第44代皮肤组织细胞中期染色体分裂相数目分析。

具体实施方式

本发明提供一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的生物学名称为GGSK，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系于2015年1月29提交保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为CCTCCNo：C201515，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。

本发明的另一目在于提供鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)组织取样：将鞍带石斑鱼鱼体消毒，无菌解剖，取皮肤组织，浸泡于漂洗液；

2)原代培养：将步骤1)浸泡后的皮肤组织切成1-5mm2的小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶，28℃恒温于培养瓶壁干贴8-12h，加入培养液，开始组织细胞原代培养；

3)传代培养：原代培养细胞长至60-90％汇合度时，用胰酶在室温下消化，加入培养液进行传代培养。

本发明实施例中，使用的鞍带石斑鱼样本，购自广东大麟洋海洋生物有限公司，经分子方法验证未感染水产动物病毒，体重160g。

本发明中所采用的试剂及来源分别是：胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、青霉素penicillin，链霉素streptomycin，制霉菌素nystatin均购自Gibco公司；重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)购自PeproTech公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma公司；秋水仙素、姬姆萨染料均购自Sigma公司；M199培养基、MEM培养基、L-15培养基均购自LifeTechnologies公司产品，培养基按产品说明书配制后经0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。以下是本发明具体的实施例。

实施例1：

一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)组织取样：将健活鞍带石斑鱼置于浓度均为1000IU/mL的青霉素和链霉素高双抗海水中充气暂养24小时，鱼体用75％医用酒精浸泡3min进行整体消毒，以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中，刮去鱼鳞，用灭菌解剖器械取其皮肤组织，浸泡于漂洗液；

所述漂洗液包含基础培养基、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素和800μg/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4、且该基础培养基为M199培养液；

2)原代培养：将步骤1)浸洗后的皮肤组织用漂洗液冲洗9次，锋利刀片切至3mm²的小组织块，加1mL贴块培养液，浸没所有小组织块；将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身28℃恒温干贴10h，再加入2mL原代培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入原代培养液中，28℃恒温培养箱开始原代培养，每5天更换原代培养液一次；迁出的皮肤小组织块细胞图如图1所示；

所述贴块培养液包括基础培养基、30％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4，所述基础培养基为M199培养基；

所述原代培养液包括基础培养基、20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及20ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4；所述基础培养基为M199培养基；

3)传代培养：原代培养细胞长至70％汇合度时，进行原代细胞的传代；用0.25％胰酶室温下消化2min，加入15mL原代培养液吹下贴壁细胞；将细胞悬液接种于2个培养瓶中28℃培养箱培养，以后每6天采用传代培养液传代一次；

所述传代培养液包括基础培养基、15％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及20ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4；该基础培养基为M199培养液。

实施例2

鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，按照实施例1的步骤，与实施例1的区别在于：在该实施例中，

所述基础培养液为MEM基础培养液。

所述贴块培养液包括基础培养基、30％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4的MEM培养基；

所述原代培养液包括基础培养基、20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及20ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4的MEM培养基。

实施例3

鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的构建方法，按照实施例1的步骤，与实施例1的区别在于：在该实施例中，

所述基础培养液为L15基础培养液。

所述贴块培养液包括基础培养基、30％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4的L-15培养基；

所述原代培养液包括基础培养基、20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及20ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4的L15培养基。

本实施例构建的鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系生长状态良好，第2代皮肤组织细胞如图2所示，第17代皮肤组织细胞如图3所示；第52代皮肤组织细胞图4所示；以上皮样细胞为主要形态，细胞能稳定增殖，目前细胞已传至60代。

优选地，传代培养基以M199培养基为基础培养基、且在该实施例的基础上在传代培养后还对不同代的传代培养液进行了优化，具体如下：

在第2代至第5代时，该传代培养液含有20％胎牛血清、0.06mM NaCl、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素以及8ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4；

在第5代至15代时，该传代培养液含有15％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素以及4ng/mL表皮生长因子，pH值7.2-7.4；

在第15代以后，该传代培养液含有8-10％胎牛血清、0.04-0.05mM NaCl、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素，不含表皮生长因子，pH值7.2-7.4。

离体原代细胞刚脱离机体环境，比较脆弱，胎牛血清和生长因子能为原代细胞贴壁、分裂、生长提供必须的物质；随着传代的进行，细胞对胎牛血清以及抗生素的依赖性将降低，从实施例1进行的不同胎牛血清对细胞的增殖影响试验可知，细胞在胎牛血清浓度为5-15％中，均有较为稳定的增殖曲线，所以先采用浓度稍高的胎牛血清，再在传代过程中依次降低胎牛血清的浓度，一方面细胞在传代初期能迅速增殖，且在传代后期稳定增长，另一方面可以降低培养成本；

同时，随着传代的进行，细胞对生长因子、血清的依赖性会下降，逐步降低血清、生长因子的浓度，可以降低细胞培养成本。

在本发明，我们进一步考察了不同培养液以及FBS浓度对细胞生长的影响。

1.不同培养液对细胞生长情况的影响。

取本实施例1第50-53代细胞系，以观察其在不同的培养基中的生长情况，具体操作如下：

分别将22×10⁴个细胞接种于含10％胎牛血清的L15、MEM和M199培养基中，28℃下培养；于培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同培养基中的生长曲线；

培养基内细胞数量曲线图如图5所示，从0-3天，L15、MEM和M199培养基内细胞数量均大于起始细胞数量的2倍，到第5天，细胞数量均大于起始细胞数量的3倍，可见采用本实施例提供的方法构建的细胞系能稳定地增殖，且在L15、MEM和M199培养基均表现出良好的活力，该细胞系在M199培养基内的增殖速率明显高于在L15和MEM培养基中的增殖速率。

2.胎牛血清浓度对细胞生长情况的影响。

取本实施例1第50-53代细胞系，以观察其在在不同胎牛血清浓度中的生长情况，具体操作如下：

将22×10⁴个细胞接种于含有2％、5％、10％或15％胎牛血清的M199培养基中，28℃下培养，于培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同胎牛血清浓度的生长曲线。

培养基内细胞数量曲线图如图6所示，培养基中胎牛血清的浓度为2％时，在试验进行的7天内，未见明显增殖，胎牛血清浓度为5％时，在试验的第7天，培养基内的细胞数量为起始数量的3倍；胎牛血清浓度为10％时，增殖现象较为明显，在试验的第1到第7天，培养基内的细胞数量呈线性增长模式，到第7天细胞总量为起始数量的5-6倍；胎牛血清浓度为15％，增殖现象更加明显，在试验的第7天，总量为起始数量的6-7倍；

综上所述，该细胞系在胎牛血清浓度为5-15％时，均能稳定增殖。细胞生长速度与添加血清浓度成正比，血清浓度为10-15％时，细胞生长快。

结果验证

1.细胞的冻存保种与复苏，包括以下步骤：

A)细胞冻存：取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，160g离心10min，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入细胞冻存液，重悬，转移入1.8mL无菌冻存管中；将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，隔天放入液氮中保存；所述细胞冻存液的基础培养基为M199培养液，且该培养液中含25％FBS、10％DMSO；

B)细胞复苏：将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌条件下将解冻细胞转移至15mL离心管中，并加入适量原代培养液，160g离心10min，去除上清，收集细胞；用原代培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。

本可于液氮中长久保存且复苏率高，不同代次细胞冻存后复苏率为73％-88％，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。

2.染色体分析，包括以下步骤：

1)将44代的细胞贴壁稳定生长36-48h，加入终浓度0.6-1.0μg/mL秋水仙素作用4-8h，胰酶消化后160g离心10min回收细胞；

2)75mM KCl 37℃低渗处理30min，再加入2mL甲醇-冰醋酸混合固定液预固定；160g离心10min，弃上清液，加甲醇-冰醋酸固定液室温固定30min，重复固定步骤2-3次；

3)留适量固定液，轻柔吹匀；吸取固定悬液，15cm高处滴于-20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，室温晾干；

4)姬姆萨染液染色10min，油镜下观察染色体形态，计数染色体数目；

所述甲醇-冰醋酸混合固定液中甲醇与冰醋酸的体积比为3：1。

结果表明：染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别等较为准确的指标。在细胞培养的过程中，染色体常用来鉴定细胞的来源、是否发生转化的可靠指标；第44代皮肤组织细胞中期染色体分裂相如图7所示，染色体的形态规整，无畸变。分裂相数目分析统计如图8所示，在统计的130个分裂相中，染色体数目从31-56不等，但47.7％的分裂相染色体数目为48条，且二倍体染色体数目出现频率是最高的，其他非整倍体只占了很小的比例；正常染色体数目与已报道的鞍带石斑鱼染色体数一致。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系，该鞍带石斑鱼皮肤组织细胞系的生物学名为GGSK，保藏号为 CCTCC No：C201515。