CN114874974A - 一种斜带石斑鱼肠道细胞系ecgi-21及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI‑21及其用途。斜带石斑鱼肠道细胞系EpinepheluscoioidesgrouperintestinalECGI‑21，保藏编号为：GDMCCNo：62408。本发明的斜带石斑鱼肠道细胞系Epinepheluscoioidesgrou perintestinalECGI‑21生长状态良好，细胞增殖稳定、细胞形态以上皮样为主要形态，不仅可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，该细胞系的建立为石斑鱼种质资源保存的相关研究奠定基础。

Description

一种斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21及其用途
技术领域
本发明属于海水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21及其用途。
背景技术
石斑鱼(Epinephelus sp.)属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、鳍科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinate)，是暖水性底栖鱼类，是我国南方和东南亚国家主要的经济养殖海水鱼类。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)在海南、台湾、广东等省份俗称“青斑”，属暖水性岛礁鱼类，广泛分布于我国东南沿海，斜带石斑鱼是海水养殖最名贵的经济鱼种之一，由于它具有生长速度快，适应性强，耐高密度养殖等特点，因而近年来收到高度关注，并深受广大养殖户的喜爱。然而，随着石斑鱼养殖规模的扩大，品种单一化、养殖集约化程度提高及养殖环境恶化等问题，由细菌性、病毒性或寄生虫等病原引起的疾病日益频繁爆发，对石斑鱼养殖造成重大经济损失。病害问题已经逐渐成为制约石斑鱼养殖产业健康发展的主要瓶颈。
虹彩病毒和神经坏死症病毒是石斑鱼病毒性疾病的两种主要病原，研究病毒感染致病机理、病毒与宿主细胞相互作用将为阐明病原特性提供重要的理论信息，而研制高效的疫苗能为预防和解决石斑鱼病毒性疾病提供有效策略。鱼类细胞系作为一种体外培养系统，最初主要应用于病毒的分离鉴定、病毒纯化及病毒疫苗的制备。但因其成本低、重复性好，条件可控等诸多优点，鱼类细胞系的应用也日趋广泛，逐渐应用于鱼类病毒学、免疫学、疫苗学、毒理学、遗传发育生物学及营养学研究领域。至今，尽管已经建立200多种用于病毒分离鉴定和病毒学研究的鱼类细胞系，但鱼类肠道细胞系极其缺乏，之前公开的只有来源于淡水养殖的虹鳟(Rainbow trout)的肠道细胞系。建立海水鱼类肠道细胞系成为海水鱼类病毒病研究、水生动物营养与肠道健康、海水环境与毒理研究迫切需要的工具。
鱼类肠道不仅是重要的消化和吸收器官，同时还具有免疫、内分泌以及新陈代谢的功能。肠道是鱼类最大的免疫器官，其健康程度对于鱼体的整体健康起到非常重要的作用。因此肠道细胞系可为研究病毒-宿主间免疫相互调节提供有效的实验材料。迄今为止，针对海水鱼病毒分离增殖的合适细胞系并不多，更没有海水鱼类肠道细胞系的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种能直接应用于病毒感染复制、致病机理、病毒-宿主细胞相互作用及外源基因功能、鱼类营养与健康、环境与毒理研究的斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinal ECGI-21。
所述的斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinalECGI-21于2022年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62408。
本发明的第二个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在水生动物病毒的培养和/或非疾病的诊断和治疗目的的检测中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在作为研究水生动物病毒的宿主细胞的应用。
本发明的第四个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21作为制备抗水生动物病毒的药物筛选模型的应用。
本发明的第五个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在水生动物病毒的分离中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在制备水生动物病毒疫苗中的应用。
所述的水生动物病毒是新加坡石斑鱼虹彩病毒或赤点石斑鱼神经坏死症病毒。
本发明的第七个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在表达外源基因中的应用。
本发明的第八个目的是提供上述斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在动物遗传育种研究、动物营养研究或水生环境与毒理研究中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinalECGI-21生长状态良好，细胞增殖稳定、细胞形态以上皮样为主要形态，不仅可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，该细胞系的建立为石斑鱼种质资源保存的相关研究奠定基础。
2.本发明的斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinalECGI-21对石斑鱼主要病毒—虹彩病毒和神经坏死症病毒敏感，同时为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要细胞平台。
3.本发明的斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinalECGI-21是国际上第一株海水鱼肠道细胞系，可以直接应用于病毒感染复制、致病机理、病毒-宿主细胞相互作用及外源基因功能、鱼类营养与健康、环境与毒理研究。
Epinephelus coioides grouper intestinal ECGI-21于2022年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62408。
附图说明
图1为相差显微镜观察斜带石斑鱼肠道细胞的形态图，A-B表示斜带石斑鱼肠道细胞原代培养细胞形态；C表示斜带石斑鱼肠道细胞第60代细胞形态。
图2为斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在不同胎牛血清浓度培养下的生长曲线图；
图3为斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21染色体核型分析图；A表示斜带石斑鱼肠道细胞中期染色体分裂相；B表示斜带石斑鱼肠道细胞中期染色体数目分布。
图4为斜带石斑鱼肠道细胞系转染pEGFP-N3的荧光图片。
图5为斜带石斑鱼肠道细胞系感染新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouperiridovirus,SGIV)后细胞病变与电镜观察示意图；A表示SGIV感染斜带石斑鱼肠道细胞的细胞病变观察结果；B表示感染SGIV的斜带石斑鱼肠道细胞的电镜观察结果。
图6为斜带石斑鱼肠道细胞系感染赤点石斑鱼神经坏死症病毒(Red-spottedgrouper nervous necrosis virus,RGNNV)后细胞病变与电镜观察示意图；A表示RGNNV感染斜带石斑鱼肠道细胞的细胞病变观察结果；B表示感染RGNNV的斜带石斑鱼肠道细胞的电镜观察结果。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1:斜带石斑鱼肠道细胞系的构建方法
(1)鱼体选择：选择健康的养殖斜带石斑鱼，实验鱼体长20cm。
(2)配制漂洗液和细胞培养液：
基础培养基：Leibovitz’s-15(L-15)培养基为Gibco公司产品。培养基按照公司产品说明配制，另加入0.266％NaCl和5mM HEPES，经0.22μm滤膜过滤，分装，4℃保存备用；用时再加入15-30％的胎牛血清、1-4倍双抗体混合液(青霉素penicillin，链霉素streptomycin)。
漂洗液：基础培养基L-15包含400IU/mL青霉素和400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4。
原代细胞培养液：基础培养基L-15包含30％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素，培养基pH值为7.2-7.4。
本发明中所采用的试剂及来源分别是：胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、双抗体混合液购自Gibco公司；二甲基亚讽(dimethylsulfoxide，DMSO)购自Sigma公司；秋水仙素、姬姆萨染料均购自Sigma公司。
(3)原代培养
在无菌条件下将斜带石斑鱼鱼体用75％的酒精浸泡漂洗后，用无菌的解剖工具取斜带石斑鱼的肠道。漂洗液仔细清洗三次。接着将肠道组织切成1-3mm3的组织块，并按一定间距均匀地接种于25cm2的细胞培养瓶中，将其倒置于28℃的培养箱内培养1h到3h，待组织块贴壁后翻瓶，每个培养瓶内加入原代细胞培养液5ml，使贴壁的组织块浸没于培养液中。将培养瓶置于28℃培养箱内培养。每隔两周更换培养液。期间用相差显微镜观察拍照记录细胞贴壁生长情况。原代培养的初期，细胞形态多样，纤维样细胞和上皮样细胞同时存在(图1A)，8周后原代细胞铺满瓶底形成单层，开始传代培养(图1B)。
(4)传代培养
第一次传代培养时，用0.25％胰酶浸洗原代细胞单层，然后加新的胰酶室温下消化单层细胞，显微镜下观察细胞变圆情况。轻轻拍打细胞瓶壁使细胞脱落并分散成单个细胞。加入5ml新鲜传代细胞培养液，轻轻吹打细胞悬液，随后按体积1：1进行分瓶传代培养。
每3-5天传代一次，传至第10代时，将细胞培养液中血清含量降低到20％，并降低其抗生素浓度(200IU/ml penicillin和200μg/ml streptomycin)；传至第20代后，将细胞培养液中血清含量降低到15％，并降低其抗生素浓度(100IU/ml penicillin和100μg/mlstreptomycin)。
传代培养以L-15培养基为基础培养基，培养温度为28℃，在本实施例的基础上对不同传代细胞的培养条件进行了优化，具体如下：
传代细胞培养液(1-10代时)为：基础培养基L-15包含30％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素，培养基pH值为7.2-7.4。
所述传代细胞培养液(11-20代时)为：基础培养基L-15包含20％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、200IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素，培养基pH值为7.2-7.4。从传代20代开始，细胞形态主要为上皮样细胞为主(图1C)。
所述传代细胞培养液(21代时及以后)为：基础培养基L-15包含15％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素，培养基pH值为7.2-7.4。
本实施例构建的斜带石斑鱼肠道细胞系从原代细胞传代至80代，细胞生长状态良好，能够连续稳定增殖传代，命名为斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioidesgrouper intestinal ECGI-21。
将上述斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinalECGI-21于2022年4月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62408。
实施例2检测不同FBS浓度对斜带石斑鱼肠道细胞生长的影响
利用斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21，检测在不同的血清浓度培养下细胞的生长曲线，具体操作如下：吸除培养瓶内的培养基，胰酶润洗1次，加入2ml的0.25％胰酶消化细胞至完全脱落，加入培养基轻轻吹打细胞悬液使细胞成单个。用血球计数板计数细胞密度。
细胞计数后，分别将1.2×104个细胞接种于24孔板中，每孔加入0.5ml L-15培养基，L-15培养基中血清浓度分别为5％、10％、15％或20％。28℃恒温培养箱中培养。连续培养6天，每天用血球计数板分别进行细胞计数，绘制斜带石斑鱼肠道细胞在不同血清浓度培养基中的生长曲线。
不同血清浓度对细胞生长的影响如图2：细胞生长速度与添加血清浓度具有一定的正比关系，当血清浓度为5％时，细胞增殖明显减缓，仅为15％血清浓度的一半。当血清浓度为10％时，细胞增殖速度在5％-15％血清浓度之间。而15％或20％血清浓度的条件对ECGI细胞生长影响不大，均能保证细胞正常快速生长。
总体来看，斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21的细胞适宜生长条件为28℃含15％-20％血清的L-15培养基，细胞在此培养条件下的倍增时间约2天。为节约成本，血清使用浓度为15％。
实施例3验证本发明斜带石斑鱼肠道细胞系细胞的冻存和复苏能力
1、细胞冻存
取斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21，经胰酶消化后获得单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃掉上清液。细胞沉淀用4℃预冷的冻存液(L-15培养基含20％胎牛血清和10％DMSO)重悬，每管1ml转入2ml冻存管。冻存程序为：4℃，30min；-20℃，2h；-80℃过夜，隔天转入液氮中长期保存。
2、冻存细胞的复苏
冻存5天后对上述冻存细胞进行复苏。从-80℃中取出细胞，迅速放入37℃水浴中解冻。解冻的细胞悬液1200rpm离心5min，去除上清收集细胞沉淀，加入5ml传代培养基培养。取少量细胞悬液用0.4％的台盼蓝染色5min，用血球计数板计数死活细胞的数目。剩余的细胞悬液转入培养瓶28℃培养，观察细胞的贴壁和生长情况。
细胞冻存5天后复苏率为87％，存活细胞能够贴壁生长分裂，细胞形态和增殖能力与冻存前相比无明显差异。
实施例4分析本发明获得斜带石斑鱼肠道细胞系细胞的染色体核型
取斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21的细胞贴壁生长48h，加入终浓度为0.8μg/ml的秋水仙素作用6h，胰酶消化后1000rpm离心10min回收细胞。75mM KCl 37℃水浴低渗处理30min，1000rpm离心10min回收细胞沉淀，加入8ml固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1v/v)室温固定30min，重复固定步骤2次。最后一次固定留约200μl固定液，轻柔吹匀。吸取固定液-细胞悬液，高处滴于-20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，并室温晾干。将晾干的玻片浸于姬姆萨染色液中染色10min，纯净水洗净染色液，室温晾干。油镜下观察细胞染色体形态，拍照并计数染色体数目。
染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，常用来鉴定细胞的来源、是否发生转化的可靠指标。对斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21分别统计了156个分裂相。结果如图3B所示，45代细胞分裂相中染色体数目多数分布在24-64之间，特征染色体数目为48，染色体形态多为端粒染色体(图3A)。虽然染色体数目分布不均匀，但二倍体染色体数目出现频率是最高的，其他非整倍体只占了很小的比例。
实施例5斜带石斑鱼肠道细胞系的外源基因的转染效果
将斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21接种于24孔细胞培养板中过夜培养，细胞铺满单层80％，开始转染。按照Ivitrogen公司Lipofectamine 2000的操作手册将去内毒素的pEGFP-N3转染入细胞。转染48h后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达情况。
结果如图4所示，荧光显微镜观察结果显示，在转染的斜带石斑鱼肠道中观察到绿色荧光信号，转染效率为18.7％，表明pEGFP-N3被转染进细胞，且CMV启动子可在ECGI细胞内启动外源基因表达，提示斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21可以用于体外研究外源基因的功能。
实施例6对本发明获得的斜带石斑鱼肠道细胞系的病毒感染实验
1、细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)观察
取斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21接种至24孔培养板培养过夜后进行病毒感染，分别将实验室保存的两种石斑鱼病毒(SGIV和RGNNV)感染细胞的悬液加入到培养基中，接种指数均为2.7个MOI，混匀后继续培养。每天用相差显微镜观查细胞病变。拍照记录细胞病变过程。
显微镜观察结果如图5A和6A，SGIV感染细胞典型特征为细胞皱缩变圆，变圆的细胞聚焦，细胞单层出现明显的空洞。感染36h后约70％的细胞变圆，整个细胞单层形成一种网状联结。RGNNV感染细胞典型的特征为细胞胞质内出现大小不一的空泡，有些空泡可以融合成大的空泡。随着感染时间的延长，出现空泡的细胞数目增多(6A)。
2、感染细胞的电镜观察
取斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21分别感染SGIV和RGNNV，在病毒感染的第2天收取细胞，2000rpm离心10min，细胞沉淀用2.5％戊二醛4℃固定1h。弃去固定液，PBS漂洗三次，每次5min；1％锇酸℃固定1h；然后乙醇梯度逐级脱水(50％、70％、80％、90％、100％、100％)，每级梯度10min。环氧树脂Epon812浸透包埋。超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅各染色1h，最后置于透射电镜(Talos L120C，Thermo Fisher Scientific)120KV下观察和CCD记录拍照。
电镜观察结果如图5B和6B，在SGIV和RGNNV感染的细胞中，均观察到大量的病毒粒子，SGIV呈六边形，大小约150nm，而RGNNV呈球形，大小约25nm。说明两种病毒可以在ECGI细胞中大量复制、装配。说明斜带石斑鱼肠道细胞系可以用于体外研究病毒感染的机制,也可以用于繁殖制备病毒，并进一步用于水生动物疫苗研究与生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.斜带石斑鱼肠道细胞系Epinephelus coioides grouper intestinal ECGI-21，保藏编号为：GDMCC No：62408。
2.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在水生动物病毒的培养和/或非疾病的诊断和治疗目的的检测中的应用。
3.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在作为研究水生动物病毒的宿主细胞的应用。
4.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21作为制备抗水生动物病毒的药物筛选模型的应用。
5.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在水生动物病毒的分离中的应用。
6.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在制备水生动物病毒疫苗中的应用。
7.根据权利要求2-6所述的任一项应用，其特征在于，所述的水生动物病毒是新加坡石斑鱼虹彩病毒或赤点石斑鱼神经坏死症病毒。
8.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在表达外源基因中的应用。
9.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在动物遗传育种研究或动物营养研究中的应用。
10.权利要求1所述的斜带石斑鱼肠道细胞系ECGI-21在水生环境与毒理研究中的应用。
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