CN112941011A - 一种鞍带石斑鱼头肾细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鞍带石斑鱼头肾细胞系及其构建方法和应用。ELHK细胞系于2020年12月04日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61340。本发明获得了鞍带石斑鱼头肾细胞系‑ELHK细胞系，其生长状态良好，细胞增殖稳定、细胞形态以成纤维样为主要形态，不仅可以连续传代(目前细胞已经传至超过120代)，并可超低温冻存和复苏，该细胞系的建立为石斑鱼种质资源保存的相关研究奠定基础。

Description

一种鞍带石斑鱼头肾细胞系及其构建方法和应用
技术领域：
本发明属于海水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼头肾细胞系及其构建方法和应用。
背景技术：
石斑鱼(Epinephelus sp.)属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、鳍科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinate)，是暖水性底栖鱼类，是我国南方和东南亚国家主要的经济养殖海水鱼类。鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)是近些年在我国广东、福建等南方沿海地区引进的石斑鱼养殖品种，具有肉味鲜美、营养价值高、生长速度快、适应性强等优点。而且作为父本与老虎斑杂交后培育出的珍珠鞍带石斑鱼，目前养殖量已占据海南石斑鱼养殖总量的70％。然而，随着石斑鱼养殖规模的扩大，品种单一化、养殖集约化程度提高及养殖环境恶化等问题，由细菌性、病毒性或寄生虫等病原引起的疾病日益频繁爆发，对石斑鱼养殖造成重大经济损失。病害问题已经逐渐成为制约石斑鱼养殖产业健康发展的主要瓶颈。
虹彩病毒和神经坏死症病毒是石斑鱼病毒性疾病的主要的两种病原，研究病毒感染致病机理、病毒与宿主细胞相互作用将为阐明病原特性提供重要的理论信息，而研制高效的疫苗能为预防和解决石斑鱼病毒性疾病提供有效策略。鱼类细胞系作为一种体外培养系统，最初主要应用于病毒的分离鉴定、病毒纯化及病毒疫苗的制备。但因其成本低、重复性好，条件可控等诸多优点，鱼类细胞系的应用也日趋广泛，逐渐应用于鱼类病毒分子生物学、免疫学、毒理学、遗传发育生物学及疫苗学研究领域。至今，尽管已经建立200多种用于病毒分离鉴定和病毒学研究的鱼类细胞系，但来源于淡水鱼类的细胞系对多数海水鱼类病毒不敏感。故建立对不同病毒敏感的海水鱼类细胞系成为海水鱼类病毒病研究和防控的迫切需要。
迄今为止，针对海水鱼虹彩病毒分离增殖的合适细胞系不多，特别是神经坏死症病毒。另外，在研究病毒-宿主互作的过程中，宿主细胞免疫反应也是研究的热点和重点。鱼类头肾是巨噬细胞、颗粒细胞、B淋巴细胞等免疫细胞发育、分化和增殖的重要场所，也是捕获抗原和产生抗体的主要器官，在鱼类免疫中起着重要作用。故头肾细胞是研究病毒-宿主间免疫相互调节作用的首选细胞系。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种生长状态良好，细胞增殖稳定不仅可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，且没有支原体污染，可用于体外表达基因以及病毒感染分离等研究的鞍带石斑鱼头肾细胞系(Epinephelus lanceolatus head kidney cell)，以下简称ELHK细胞系，其于2020年12月04日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61340。
本发明的第二个目的是提供ELHK细胞系在表达外源基因中的应用。
本发明的第三个目的是提供ELHK细胞系作为病毒感染的宿主细胞在研究病毒感染或病毒诱导免疫反应中的应用。
所述的病毒是新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)或赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)。
本发明的第四个目的是提供一种ELHK细胞系的构建方法，其包括以下步骤：
(1)原代培养：将鞍带石斑鱼头肾组织进行胰酶消化获得细胞悬浮液，加入原代细胞培养液培养获得原代细胞；
(2)传代培养：将原代细胞接种到传代细胞培养液进行传代培养；
(3)收集传代细胞，获得鞍带石斑鱼头肾细胞系。
所述的鞍带石斑鱼头肾选自体长约10cm的养殖鞍带石斑鱼幼鱼。
所述的原代细胞培养液是基础培养基L-15包含20％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4。
所述的原代培养包括以下步骤：将鞍带石斑鱼头肾组织经胰酶消化获得细胞悬浮液，1000rpm离心10min，收集沉淀，加入原代细胞培养液重悬沉淀，移入培养瓶中，28℃培养，每隔4天按半量换液方式更换培养液，直至原代细胞满瓶底形成单层。
所述的传代培养中的传代细胞培养液是：传代1-10代时，传代细胞培养液的配方为：基础培养基L-15中包含20％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4，传代10代以后，传代细胞培养液的配方为：基础培养基L-15中包含10％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素，培养基pH值为7.2-7.4。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明获得了鞍带石斑鱼头肾细胞系-ELHK细胞系，其生长状态良好，细胞增殖稳定、细胞形态以成纤维样为主要形态，不仅可以连续传代(目前细胞已经传至超过120代)，并可超低温冻存和复苏，该细胞系的建立为石斑鱼种质资源保存的相关研究奠定基础。
2.本发明提供的鞍带石斑鱼头肾细胞系的构建方法，采用组织切块和胰酶消化的方法进行原代细胞培养，在细胞原代和传代过程中基础培养基中不需要添加其它生长因子，在传代培养过程中适当调节培养基的配方，确定适合细胞生长的最佳培养调节，同时降低培养成本。
3.本发明提高的鞍带石斑鱼头肾细胞系对石斑鱼的两种重要病毒性病原敏感，故为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要细胞平台。
4.本发明的鞍带石斑鱼头肾细胞系可以直接应用于病毒感染致病机理、病毒-宿主细胞相互作用及外源基因功能研究。
Epinephelus lanceolatus head kidney cell于2020年12月04日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61340。
附图说明
图1为相差显微镜观察鞍带石斑鱼头肾细胞的形态图，A-B表示鞍带石斑鱼头肾细胞原代培养细胞形态；C表示鞍带石斑鱼头肾细胞第50代细胞形态。
图2为鞍带石斑鱼头肾细胞系细胞的支原体染色。
图3为鞍带石斑鱼头肾细胞系在不同培养条件下的生长曲线图；A表示不同温度对鞍带石斑鱼头肾细胞生长的影响；B表示不同胎牛血清浓度对鞍带石斑鱼头肾细胞生长的影响。
图4为鞍带石斑鱼头肾细胞系染色体核型分析图；A表示第50代鞍带石斑鱼头肾细胞中期染色体分裂相；B表示第50代鞍带石斑鱼头肾细胞中期染色体数目分布。
图5为鞍带石斑鱼头肾细胞系(60代)转染pEGFP-N3的荧光图片。
图6为鞍带石斑鱼头肾细胞系感染新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)后细胞病变观察示意图；A表示新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染鞍带石斑鱼头肾细胞的细胞病变观察结果；B表示感染新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)细胞的电镜观察结果。
图7是为鞍带石斑鱼头肾细胞系感染赤点石斑鱼神经坏死症病毒(RGNNV)后细胞病变观察示意图；A表示RGNNV感染鞍带石斑鱼头肾细胞的细胞病变观察结果；B表示感染RGNNV细胞的电镜观察结果。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1：鞍带石斑鱼头肾细胞系的构建方法
(1)鱼体选择：选择鞍带石斑鱼幼鱼，实验鱼体长10cm。
(2)配制漂洗液和细胞培养液：
L15基础培养基：Leibovitz’s-15(L-15)培养基为Gibco公司产品。培养基按照公司产品说明配制，另加入0.266％NaCl和5mM HEPES，调pH值为7.2-7.4，经0.22μm滤膜过滤后分装，4℃保存备用；后期使用时根据需要加入胎牛血清或双抗(青霉素penicillin，链霉素streptomycin)。
漂洗液：L-15基础培养基加入双抗即青霉素和链霉素，终浓度为400IU/mL青霉素和400μg/mL链霉素。
原代细胞培养液：L-15基础培养基加入血清和双抗至终浓度为20％胎牛血清，400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素。
传代细胞培养液：L-15基础培养基加入血清和双抗至终浓度为10％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
本发明中所采用的试剂及来源分别是：胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、双抗混合液购自Gibco公司；二甲基亚讽(dimethylsulfoxide，DMS0)购自Sigma公司；秋水仙素、姬姆萨染料均购自Sigma公司。
(3)原代培养
在无菌条件下将鱼体用75％酒精浸泡漂洗后，用无菌的解剖工具取幼鱼的双侧头肾。用漂洗液漂洗三次，每次5min。接着将头肾切成1-3mm3的组织块，再漂洗三次。然后用刀片将头肾组织块充分切碎，并加入0.25％胰蛋白酶室温消化20min，消化后的细胞悬液用100目的无菌滤网过滤。转移滤液至1.5ml离心管中，1000rpm离心10min。弃上清，用原代细胞培养液重悬沉淀，移入25cm2培养瓶中。每个培养瓶内加入原代细胞培养液5ml。将培养瓶置于28℃培养箱内培养。每隔4天按半量换液方式更换培养液。期间相差显微镜观察拍照记录细胞贴壁生长情况。原代培养的第二天细胞开始贴壁生长，原代培养的初期，细胞形态多样，纤维样细胞和上皮样细胞同时存在(图1A)，15天后原代细胞铺满瓶底形成单层，开始传代培养(图1B)。
(4)传代培养
第一次传代培养时，将原代培养细胞瓶中的培养基转移到无菌的培养瓶中。用0.25％胰酶浸洗原代细胞单层，然后加少许(0.2ml)0.25％胰酶室温下消化单层细胞，显微镜下观察细胞变圆情况。轻轻拍打细胞瓶壁使细胞脱落并分散成单个细胞。加入5ml新鲜传代细胞培养液和5ml原代细胞培养液，轻轻吹打细胞悬液，随后按体积1：1进行分瓶传代培养。
每3-5天传代一次，传至第10代时，将细胞培养液中血清含量降低到10％，抗生素浓度为正常使用浓度(100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。
传代培养以L-15培养基为基础培养基，培养温度为28℃，在本实施例的基础上对不同传代细胞的培养条件进行了优化，具体如下：
传代细胞培养液(1-10代时)和原代细胞培养液一样，具体配方为：L-15基础培养基加入血清和双抗至终浓度为20％胎牛血清，400IU/mL青霉素和400μg/mL链霉素。
传代细胞培养液(10代以后)为：L-15基础培养基加入血清和双抗至终浓度为10％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
本实施例构建的鞍带石斑鱼头肾细胞系从原代细胞传代至120代，细胞生长状态良好，能够连续稳定增殖传代，命名为鞍带石斑鱼头肾细胞系(Epinephelus lanceolatushead kidney cell,ELHK)，简称ELHK细胞系。从传代20代开始，细胞形态主要以成纤维样细胞为主(图1C)。
Epinephelus lanceolatus head kidney cell于2020年12月04日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61340。
实施例2检测传代的鞍带石斑鱼头肾细胞支原体污染情况
将鞍带石斑鱼头肾细胞(ELHK细胞系)传代到35mm的培养皿(底部为玻片)内48h，培养液是含10％胎牛血清的L-15培养基，培养温度为28℃，细胞密度达到80％-90％。细胞用4％多聚甲醛室温固定1h，PBS漂洗后，用Hoechst 33258染色工作液(0.05μg/ml)染色10min，PBS漂洗三次后，100倍荧光显微镜观察。
荧光显微镜观察结果显示，在传代的鞍带石斑鱼头肾细胞的间隙或细胞上均没有观察到支原体的蓝色荧光，表明细胞没有支原体污染(图2)。
实施例3检测不同培养温度以及FBS浓度对鞍带石斑鱼头肾细胞生长的影响
1、不同培养温度对细胞生长情况的影响。
利用本实施例1第45代鞍带石斑鱼头肾细胞(ELHK细胞系)，检测在不同的培养温度下细胞的生长曲线，具体操作如下：丢弃培养瓶内的培养基，加入0.25％胰酶漂洗1次，加入0.2ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞至完全脱落，加入培养基(含10％胎牛血清的L-15培养基)轻轻吹打细胞悬液使细胞成单个。用血球计数板计数细胞密度。
分别将5×104个细胞(ELHK细胞系)接种于12孔板中，培养基为含10％胎牛血清的L-15培养基，28℃恒温培养箱贴壁生长2h后，分别将细胞放置与25℃、28℃和37℃培养箱中培养。于培养后1、3、5天用血球计数板分别进行细胞计数，绘制鞍带石斑鱼头肾细胞在不同培养温度下的生长曲线。
不同培养温度对细胞生长的影响如图3A，ELHK细胞最佳的生长温度为28℃。25℃或37℃条件下细胞也可以正常生长，但生长速度明显地低于最适生长温度28℃。
2、不同胎牛血清浓度对细胞生长情况的影响。
细胞计数后，分别将5×104个细胞(ELHK细胞系)接种于12孔板中，L-15培养基中血清浓度分别为5％、10％或15％。28℃恒温培养箱中培养。于培养1、3、5天用血球计数板分别进行细胞计数，绘制鞍带石斑鱼头肾细胞在不同血清浓度培养基中的生长曲线。
不同血清浓度对细胞生长的影响如图3B：细胞生长速度与添加血清浓度具有一定的正比关系，当血清浓度为5％时，细胞增殖明显减缓，仅为10％血清浓度的一半。而10％或15％血清浓度的条件对ELHK细胞生长影响不大，均能保证细胞正常快速生长。
总体来看，ELHK细胞系的细胞适宜生长条件为28℃，含10％-15％血清的L-15培养基，细胞在此培养条件下的倍增时间约1.5天。为节约成本，从传代10代开始，血清使用浓度为10％。
实施例4验证本发明鞍带石斑鱼头肾细胞系细胞的冻存和复苏能力
1、细胞冻存
取实施例1中50代单层贴壁细胞(ELHK细胞)，经0.25％胰蛋白酶消化后获得单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃掉上清液。细胞沉淀用4℃预冷的冻存液(L-15培养基含20％胎牛血清和10％DMSO)重悬，每管1ml转入2ml冻存管。冻存程序为：4℃，30min；-20℃，2h；-80℃过夜，隔天转入液氮中长期保存。
2、冻存细胞的复苏
液氮中冻存30天后对上述冻存细胞进行复苏。从液氮中取出细胞，迅速放入37℃水浴中解冻。解冻的细胞悬液1000rpm离心收集细胞沉淀，用实施例1的传代细胞培养液(10代以后)重悬沉淀。取少量细胞悬液用0.4％的台盼蓝染色5min，用血球计数板计数死活细胞的数目。剩余的细胞悬液转入培养瓶28℃培养，观察细胞的贴壁和生长情况。
细胞冻存30天后复苏率为73％，存活细胞能够贴壁生长分裂，细胞形态和增殖能力与冻存前相比无明显差异。
实施例5分析本发明获得的鞍带石斑鱼头肾细胞系细胞的染色体核型
取上述实施例1中的鞍带石斑鱼头肾细胞系(50代，ELHK细胞系)的细胞贴壁生长48h，加入终浓度为0.8μg/ml的秋水仙素作用6h，0.25％胰蛋白酶消化后1000rpm离心10min回收细胞。75mM KCl 37℃水浴低渗处理30min，1000rpm离心10min回收细胞沉淀，加入8ml固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)室温固定30min，重复固定步骤2次。最后一次固定留约200μl固定液，轻柔吹匀。吸取固定液-细胞悬液，高处滴于-20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，并室温晾干。将晾干的玻片浸于姬姆萨染色液中染色10min，纯净水洗净染色液，室温晾干。油镜下观察细胞染色体形态，拍照并计数染色体数目。
染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，常用来鉴定细胞的来源、是否发生转化的可靠指标。对实施例1的50代细胞分别统计了200个分裂相。结果如图4B所示，50代细胞分裂相中染色体数目多数分布在44-64之间，特征染色体数目为60，染色体形态多为端粒染色体(图4A)。虽然染色体数目分布不均匀，但二倍体染色体数目出现频率是最高的，其他非整倍体只占了很小的比例。
实施例6验证鞍带石斑鱼头肾细胞系的外源基因的转染效果
将实施例1中鞍带石斑鱼头肾细胞(60代，ELHK细胞系)接种于24孔细胞培养板中过夜培养，细胞铺满单层80％，开始转染。按照Ivitrogen公司Lipofectamine 2000的操作手册将去内毒素的pEGFP-N3转染入细胞。转染48h后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达情况。
结果如图5所示，荧光显微镜观察结果显示，在转染的鞍带石斑鱼头肾中观察到很强的绿色荧光信号，表明pEGFP-N3被转染进细胞，且CMV启动子可以在ELHK细胞内高效启动外源基因表达，提示ELHK细胞系可以用于体外研究外源基因的功能。
实施例7对本发明获得的鞍带石斑鱼头肾细胞系的病毒感染实验
1、细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)观察
取实施例1的鞍带石斑鱼头肾细胞(45代，ELHK细胞系)接种至24孔培养板培养过夜后进行病毒感染，分别将实验室保存的两种石斑鱼病毒(SGIV和RGNNV)感染细胞的悬液加入到培养基中，接种指数均为2个MOI，混匀后继续培养。每天用相差显微镜观查细胞病变。拍照记录细胞病变过程。
显微镜观察结果如图6A，SGIV感染细胞典型特征为细胞皱缩变圆，变圆的细胞聚焦，细胞单层出现明显的空洞。感染36h后约60％的细胞变圆，整个细胞单层形成一种网状联结。RGNNV感染细胞典型的特征为细胞胞质内出现大小不一的空泡，有些空泡可以融合成大的空泡。随着感染时间的延长，出现空泡的细胞数目增多(7A)。
2、感染细胞的电镜观察
取实施例1的鞍带石斑鱼头肾细胞(45代)按照1的方法分别感染SGIV和RGNNV，在病毒感染的第2天收取细胞，2000rpm离心10min，细胞沉淀用2.5％戊二醛4℃固定1h。弃去固定液，PBS漂洗三次，每次5min；1％锇酸℃固定1h；然后乙醇梯度逐级脱水(50％、70％、80％、90％、100％、100％)，每级梯度10min。环氧树脂Epon812浸透包埋。超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅各染色1h，最后置于透射电镜(Talos L120C，Thermo Fisher Scientific)120KV下观察和CCD记录拍照。
电镜观察结果如图6B和7B，在SGIV和RGNNV感染的细胞中，均观察到大量的病毒粒子，SGIV呈六边形，大小约150nm，而RGNNV呈球形，大小约25nm。说明两种病毒可以在ELHK细胞中大量复制、装配。说明鞍带石斑鱼头肾细胞系可以用于体外研究病毒感染的机制。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.Epinephelus lanceolatus head kidney cell，保藏号为：GDMCC No：61340。
2.权利要求1所述的Epinephelus lanceolatus head kidney cell在表达外源基因中的应用。
3.权利要求1所述的Epinephelus lanceolatus head kidney cell作为病毒感染的宿主细胞在研究病毒感染或病毒诱导免疫反应中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的病毒是新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV或赤点石斑鱼神经坏死症病毒RGNNV。
5.一种权利要求1所述的Epinephelus lanceolatus head kidney cell的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原代培养：将鞍带石斑鱼头肾组织进行胰酶消化获得细胞悬浮液，加入原代细胞培养液培养获得原代细胞；
(2)传代培养：将原代细胞接种到传代细胞培养液进行传代培养；
(3)收集传代细胞，获得鞍带石斑鱼头肾细胞系。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的鞍带石斑鱼头肾选自体长约10cm的养殖鞍带石斑鱼幼鱼。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的原代细胞培养液是基础培养基L-15包含20％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的原代培养包括以下步骤：将鞍带石斑鱼头肾组织经胰酶消化获得细胞悬浮液，1000rpm离心10min，收集沉淀，加入原代细胞培养液重悬沉淀，移入培养瓶中，28℃培养，每隔4天按半量换液方式更换培养液，直至原代细胞满瓶底形成单层。
9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的传代培养中的传代细胞培养液是：传代1-10代时，传代细胞培养液的配方为：基础培养基L-15中包含20％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、400IU/ml青霉素和400μg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4，传代10代以后，传代细胞培养液的配方为：基础培养基L-15中包含10％的胎牛血清、0.266％的NaCl、5mM的HEPES、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素，培养基pH值为7.2-7.4。
CN202110088381.3A 2021-01-22 2021-01-22 一种鞍带石斑鱼头肾细胞系及其构建方法和应用 Active CN112941011B (zh)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874974A (zh) * 2022-04-25 2022-08-09 华南农业大学 一种斜带石斑鱼肠道细胞系ecgi-21及其用途
CN117143806A (zh) * 2023-10-18 2023-12-01 华南农业大学 一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060259A (zh) * 2012-12-06 2013-04-24 沙珍霞 鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法
CN104805053A (zh) * 2015-04-30 2015-07-29 肇庆大华农生物药品有限公司 珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用
CN114617085A (zh) * 2022-02-28 2022-06-14 华南农业大学 一种鞍带石斑鱼抗病家系的培育方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060259A (zh) * 2012-12-06 2013-04-24 沙珍霞 鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法
CN104805053A (zh) * 2015-04-30 2015-07-29 肇庆大华农生物药品有限公司 珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用
CN114617085A (zh) * 2022-02-28 2022-06-14 华南农业大学 一种鞍带石斑鱼抗病家系的培育方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JÉRÔMEDELAMARE-DEBOUTTEVILLE 等: "Interactions of head-kidney leucocytes from giant grouper, Epinephelus lanceolatus, with pathogenic Streptococcus agalactiae strains from marine and terrestrial origins", 《FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY》 *
黄晓红 等: "石斑鱼虹彩病毒SGIV体外感染引起细胞死亡机制研究", 《热带海洋科学学术研讨会暨第八届广东海洋湖沼学会、第七届广东海洋学会会员代表大会论文及摘要汇编》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874974A (zh) * 2022-04-25 2022-08-09 华南农业大学 一种斜带石斑鱼肠道细胞系ecgi-21及其用途
CN114874974B (zh) * 2022-04-25 2023-10-03 华南农业大学 一种斜带石斑鱼肠道细胞系ecgi-21及其用途
CN117143806A (zh) * 2023-10-18 2023-12-01 华南农业大学 一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用
CN117143806B (zh) * 2023-10-18 2024-02-23 华南农业大学 一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用

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