CN104805053A

CN104805053A - 珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用

Info

Publication number: CN104805053A
Application number: CN201510222399.2A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞爱; 欧阳征亮; 高任; 吉华松
Original assignee: Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co Ltd; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sun Yat Sen University; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104805053B

Abstract

本发明公开了一种珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法，属于动物细胞系领域，其为珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系PGSN，已于2015年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201505。所述珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法包括以下步骤：1)吻端组织的处理；2)原代细胞培养；3)传代培养。本发明所建立的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系生长状态良好，细胞形态为成纤维样细胞，能稳定增殖并传至70代以上，能大量提供珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供研究平台和实验材料。

Description

珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞系领域，具体涉及珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用。

背景技术

珍珠龙胆石斑鱼是由鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂)(俗称龙胆石斑鱼)与棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀)(俗称老虎斑)杂交的新品种，有着老虎斑的头，龙胆石斑鱼的尾巴，显现杂交优势，其肉质细嫩，抗病力强，生长快，已成为我国南方海水养殖业的新宠。近年来，随着养殖石斑鱼规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，以及受养殖环境污染、管理技术措施相对滞后等诸多因素的影响，石斑鱼的病害也日益严重。石斑鱼疾病繁多，病原包括病毒、细菌、寄生虫等，尤其是由虹彩病毒、神经坏死病毒引起的病毒病最为严重，一旦暴发就会造成大规模死亡甚至全军覆没，每年因其造成的直接经济损失亿元以上，已经成为石斑鱼养殖业健康发展的重要制约因素之一。

细胞系作为一种体外培养系统，具有成本低、可重复性好、条件可控等优点。建立细胞系，不断增加和完善我国重要海水养殖动物细胞库，是长期保存重要海水养殖动物遗传资源的重要途径。同时，细胞系又是海水养殖动物细胞工程育种、动物克隆和物种保护、病毒分离与培养、研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等方面的重要工具。

尽管已经有多种鱼类及其不同组织建立细胞系的技术，但很多学者仍然认为建立细胞系是一项非常困难、繁琐、耗时、随机性大和成功率低的工作。不同鱼类之间的细胞系构建方法和难易程度往往不同。斑马鱼作为一种重要的脊椎动物模式生物，被广泛地应用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究。针对斑马鱼的细胞系建立虽然已经做了很多研究，但是斑马鱼组织细胞系建立的研究仍有许多问题没有解决。目前已报道的斑马鱼细胞系仅有两个：ZF4(ATCC CRL-2050)和ZF-L(ATCC CRL-2643)，分别来自胚胎和肝脏。而同为鲤科的草鱼的细胞系建立相对容易，目前已报道了草鱼吻端、肾、肝、尾鳍、囊胚、椎骨间质、鳔等多个组织的细胞系。同时，鱼体不同的组织有着不同的特性，在细胞培养中的难易程度各不相同，有报道表明体表和肠道组织，消毒灭菌是培养的关键；肝脏组织因含有大量的油脂而难以培养；肌肉组织因细胞迁出及生长速度慢，不太适合建立细胞系(Zhou et al,J.fish biol.2008,73(8):2058-2067)。在原代培养的过程中，不同组织细胞迁出的速度有别，与鱼的种类有关，也与培养条件有关。事实上，每一株细胞系都是开展生物学等领域的研究的潜在资源。目前还没有统一和规范的建立鱼类细胞系的方法和技术手段。

迄今为止，已有160种以上的鱼类细胞系用于病毒的分离和扩增。已建立的鱼类细胞系多数来源于淡水鱼类，相比较而言，来源于海水鱼类的细胞系的报道较少。目前，仅有1篇报道建立了珍珠龙胆石斑鱼心脏组织细胞系(Guo etal.,2013)，还没有通过相应细胞系大规模生产病毒疫苗的成功报道。显然，鱼类细胞培养是进行鱼类病毒分离、鉴定与繁殖，进而研究鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基础一步。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能稳定传代的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供研究平台和实验材料。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，其的生物学名称为PGSN，该细胞系于2015年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，并证明存活，保藏登记入册编号为CCTCCNO：C201505。该细胞系细胞生长状态良好，细胞在温度25-32℃、含10-15％胎牛血清的L15培养基中增殖良好。细胞形态为成纤维样细胞，能稳定增殖，目前细胞已传至70代以上。染色体分析显示特征染色体数目为48条。

本发明目的之二在于提供上述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其包括以下步骤：

1)吻端组织的处理：取健活珍珠龙胆石斑鱼，对鱼体进行消毒，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中；

2)原代细胞培养：将吻端组织块切成小组织块，加贴块专用培养液浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中进行恒温干贴后，加入完全培养液，置于恒温培养箱开始原代培养；

3)传代培养：原代培养细胞汇合度达60-90％时进行传代培养，每5-7天传代一次。

其中，步骤2)的具体步骤如下：取健活珍珠龙胆石斑鱼，用医用酒精浸泡1-5min对鱼体进行整体消毒，用75％酒精进行再次消毒，置于超净工作台中，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中。

其中，步骤2)的具体步骤如下：吻端组织块用漂洗液冲洗，使用刀片切至1-4mm³的小组织块，加贴块专用培养液，浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身28℃恒温干贴8-12h，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入完全培养液中，置于28℃恒温培养箱开始原代培养，每4-6天更换培养液一次。

其中，步骤3)的具体步骤如下：原代培养细胞汇合度达60-90％时，加入0.25％的胰蛋白酶消化后，加入完全培养液使细胞悬浮，然后接种于两个培养瓶内，置于28℃培养箱中培养，每5-7天传代一次。

具体地，所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素和800μg/ml制霉菌素的M199溶液。

具体地，所述的贴块专用培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％的胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液。

具体地，所述的完全培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为5-20％胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液或MEM培养液或M199培养液。

具体地，在步骤3)中，当传代至第5-10代时，将完全培养液中的血清浓度降至15％，青霉素浓度降至100IU/ml、链霉素浓度降至100μg/ml；当传代至第15-20代时，将完全培养液中的血清浓度降至8-10％。

本发明目的之三在于提供上述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系在鱼类病毒分离、鉴定与繁殖研究中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

采用本发明的技术方案，对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，该细胞系可连续传代，已连续传至72代，因此能提供大量的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织来源细胞，且细胞增殖培养液配方简单，无需添加外源生长因子，传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。本发明所构建的吻端组织细胞系为海水鱼类病毒的分离培养及分子细胞水平上开展感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了便利。

下面结合具体附图和实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为珍珠龙胆石斑鱼吻端组织块迁出细胞状态图(标尺＝100μm)；

图2为珍珠龙胆石斑鱼第1代吻端组织细胞状态图(标尺＝100μm)；

图3为珍珠龙胆石斑鱼第20代吻端组织细胞状态图(标尺＝100μm)；

图4为珍珠龙胆石斑鱼第57代吻端组织细胞状态图(标尺＝100μm)；

图5为不同培养基对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞的影响；

图6为不同血清浓度对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞的影响；

图7为不同温度对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞的影响；

图8为第53代吻端组织细胞中期染色体分裂相；

图9为第53代吻端组织细胞中期染色体数目分析。

具体实施方式

除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。

在本发明中所采用的材料及试剂分别如下：

1)实验动物

珍珠龙胆石斑鱼购自广东大麟洋海洋生物有限公司(经分子方法验证未感染水产动物病毒)，体重为160g。

2)培养基及其它试剂

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，Gibco公司；0.25％胰蛋白酶(Trypsin)，Gibco公司；PSN抗体混合液(青霉素penicillin，链霉素streptomycin，制霉菌素nystatin)，Gibco公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，Sigma公司；Leiboviz`s L15培养基，Life Technologies公司产品，胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)，Gibco公司；0.25％胰蛋白酶(Trypsin)，Gibco公司；MEM(Eagle'sminimum essential medium)、Leibovitz’s L-15、M199培养基，Life Technologies公司产品，培养基按产品说明书配制后过滤除菌，4℃保存备用。

本发明的目的之一在于提供一种珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，该细胞系于2015年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072)，并证明存活，保藏登记入册编号为CCTCCNO：C201505。该细胞系细胞生长状态良好，细胞在温度25-32℃、含10-15％胎牛血清的L15培养基中增殖良好。细胞形态为成纤维样细胞，能稳定增殖，目前细胞已传至70代以上。染色体分析显示特征染色体数目为48条。

本发明的目的之二在于提供所述的鱼吻端组织细胞系的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

1)吻端组织的处理

取健活珍珠龙胆石斑鱼，置于含有浓度均为1000IU/ml的青霉素和链霉素高双抗海水中充气暂养24小时，鱼体用医用酒精浸泡1-5min进行整体消毒，然后使用75％酒精再次消毒，置于超净工作台中，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中；所述漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素和800μg/ml制霉菌素的M199溶液；

2)原代培养

吻端组织块使用漂洗液冲洗4-6次，锋利刀片切至1-4mm³的小组织块，加1-2ml贴块专用培养液，浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身28℃恒温干贴8-12h，再加入2-3ml完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，28℃恒温培养箱开始原代培养，每4-6天更换培养液一次；

所述的贴块专用培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％的胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液；

所述的完全培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为5-20％胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液或MEM培养液或M199培养液；

3)传代培养

原代培养细胞长至60-90％汇合度时，进行原代细胞的传代；用0.25％胰酶室温下消化2～3min，加入完全培养液吹下贴壁细胞；将细胞悬液接种于2个培养瓶中28℃培养箱培养；以后每5-7天传代一次，传至第5-10代时，将细胞培养液中血清浓度降15％，抗生素浓度降至正常使用浓度，即青霉素浓度为100IU/ml、链霉素浓度为100μg/ml；传至第15-20代时，将培养液中血清含量降至8-10％。

实施例1:

鱼吻端组织细胞系的构建方法，其包括以下步骤：

1)吻端组织的处理：取健活珍珠龙胆石斑鱼，置于含有浓度均为1000IU/ml的青霉素和链霉素高双抗海水中充气暂养24h，鱼体用医用酒精浸泡5min进行整体消毒，然后使用75％酒精再次消毒，置于超净工作台中，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中；所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素和800μg/ml制霉菌素的M199溶液；

2)原代细胞培养：吻端组织块用漂洗液冲洗5次，使用刀片切至4mm³的小组织块，加贴块专用培养液，浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身25℃恒温干贴12h，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入完全培养液中，置于25℃恒温培养箱开始原代培养，每5天更换培养液一次；所述的贴块专用培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％的胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液；所述的完全培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液；

3)传代培养：原代培养细胞汇合度达60-90％时，加入0.25％的胰蛋白酶消化后，加入完全培养液使细胞悬浮，然后接种于两个培养瓶内，置于25℃培养箱中培养，每5天传代一次。

实施例2

鱼吻端组织细胞系的构建方法，按照实施例1的步骤，与实施例1的区别在于：在该实施例中，

所述的完全培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为MEM培养液；

实施例3

所述的完全培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为M199培养液；

培养液是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是细胞培养的最重要条件。不同培养液营养成分不同，不同细胞对培养液要求不同。培养液除了要有细胞生命活动必需的各种营养物质之外，还必需提供调节细胞生长与功能活动的激素、生长因子以及生长基质成分等。此外，不同的培养条件对细胞的影响也不同。因此，为了获得珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的适宜培养条件，进行如下条件筛选试验:

在本发明，我们进一步考察了不同培养液以及FBS浓度对细胞生长的影响。具体如下：

1.细胞在不同培养基中的生长情况

从实施例1的第45代细胞中分别取25×10⁴个细胞接种于含10％FBS的L15、MEM和M199培养基中，28℃下培养；在培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同培养基中的生长曲线。

结果如图5所示，细胞在L15、M199培养基中生长速度明显高于MEM培养基，且在L15培养基中细胞的生长速度略高于M199培养基；由此，可以确定其中较佳的培养基为L15培养基。

2.细胞在不同FBS浓度下的生长情况

从实施例1的第45代细胞中分别取25×10⁴个细胞接种于含有2％、5％、10％或15％FBS的L15培养基中，28℃下培养。于培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同FBS浓度的生长曲线。

结果如图6所示，细胞生长速度与所添加的血清浓度成正比，当血清浓度为10-15％时细胞生长快，当血清浓度为5％时细胞生长速度出现比较明显的增幅，且血清浓度为5-15％时的细胞生长速度明显优于血清浓度为2％时的细胞生长速度。由此，结合细胞的培养情况和经济成本，优选血清浓度为5-20％为较佳条件。

3.细胞在不同温度下的生长情况

从实施例1的第45代细胞中分别取25×10⁴个细胞接种于含有10％FBS的L15培养基中，28℃培养2h后分别转入20℃、25℃、28℃、32℃培养箱培养。于培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同温度下的生长曲线。

结果如图7所示，细胞生长速度与温度成正比，当培养温度为25℃、28℃、32℃时细胞的生长速度显著优于20℃时的生长速度，且28℃、32℃时细胞的生长速度与25℃时的生长速度相对稳定。由此，确定25～32℃为较适宜的培养温度。

上述结果表明：结合细胞的各代培养情况和经济成本来看，该细胞系的最适宜培养条件为：培养温度为28℃，培养液为添加10％FBS的Leibovitz’s L-15。

结果验证

1.细胞的冻存保种与复苏

取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，160g离心10min，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入适量配置好的细胞冻存液，重悬，转移入1.8ml无菌冻存管中；将无菌冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，隔天放入液氮中长期保存。所述细胞冻存液为含有20-30％FBS、10％DMSO的Leiboviz`s L15培养液。

对上述冻存的细胞进行复苏，将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌条件下将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入适量完全培养液，160g离心5-10min，去除上清液，收集细胞；用完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。

结果表明：不同代次细胞冻存后复苏率为80％-95％，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。

2.染色体分析

材料如下：

1)细胞

上述珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，53代。

2)培养基及其它试剂

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，Gibco公司；0.25％胰蛋白酶(Trypsin)，Gibco公司；Leibovitz’s L-15培养基，Life Technologies公司；秋水仙素、姬姆萨染料，Sigma公司；固定液(甲醇：冰醋酸3：1)；75mmol/L KCl；甲醇；甘油。

具体步骤如下：

1)取53代的细胞贴壁稳定生长36-48h，加入终浓度0.6-1.0μg/ml秋水仙素作用4-8h，加入胰酶消化后160g离心10min，回收细胞；

2)用75mmol/L KCl 37℃下低渗处理细胞30min，再加入2ml固定液(甲醇：冰醋酸3：1)预固定；160g离心10min，弃掉上清液，加固定液室温下固定30min；

3)重复固定步骤2-3次；最后一次固定留适量固定液，轻柔吹匀；吸取固定悬液，15cm高处滴于-20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，室温晾干；

4)姬姆萨染液染色10min，油镜下观察染色体形态，计数染色体数目。

结果表明：染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别等较为准确的指标。在细胞培养的过程中，染色体常用来鉴定细胞的来源、是否发生转化的可靠指标。在统计的164个分裂相中，染色体数目从32-58不等，但42.7％的分裂相染色体数目为48条(见图8及图9)。虽然染色体数目分布不均匀，但二倍体染色体数目出现频率是最高的，其他非整倍体只占了很小的比例。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，其特征在于：该珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的生物学名称为PGSN，已于2015年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201505。

2.一种如权利要求1所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：其包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：步骤2)的具体步骤如下：取健活珍珠龙胆石斑鱼，用医用酒精浸泡1-5min对鱼体进行整体消毒，用75％酒精进行再次消毒，置于超净工作台中，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中。

4.根据权利要求2所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：步骤2)的具体步骤如下：吻端组织块用漂洗液冲洗，使用刀片切至1-4mm³的小组织块，加贴块专用培养液，浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身25～32℃恒温干贴8-12h，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入完全培养液中，置于25～32℃恒温培养箱开始原代培养，每4-6天更换培养液一次。

5.根据权利要求3所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：步骤3)的具体步骤如下：原代培养细胞汇合度达60-90％时，加入0.25％的胰蛋白酶消化后，加入完全培养液使细胞悬浮，然后接种于两个培养瓶内，置于28℃培养箱中培养，每5-7天传代一次。

6.根据权利要求2所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素和800μg/ml制霉菌素的M199溶液。

7.根据权利要求2所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述的贴块专用培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为30％的胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液。

8.根据权利要求2所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述的完全培养液包括以下组分：基础培养液、终浓度为5-20％胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO₃、400IU/ml青霉素及400μg/ml链霉素；所述基础培养液为Leiboviz`s L15培养液或MEM培养液或M199培养液。

9.根据权利要求2所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其特征在于：在步骤3)中，当传代至第5-10代时，将完全培养液中的血清浓度降至15％，青霉素浓度降至100IU/ml、链霉素浓度降至100μg/ml；当传代至第15-20代时，将完全培养液中的血清浓度降至8-10％。

10.如权利要求1所述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系在鱼类病毒分离、鉴定与繁殖研究中的应用。