CN112695010A - 高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS‑Ha‑8，其保藏号为CGMCC No.17690。本发明提供了所述高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：步骤1)获取棉铃虫雌蛹卵巢组织；步骤2)培养卵巢组织，至增殖的细胞充满培养瓶，其中，所述组织紧贴在细胞培养瓶底；步骤3)取新增殖的单个细胞，继续培养至细胞传代，即得；整个过程都是在无菌条件下进行的。本发明提供的高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系可以用来复制杆状病毒，用于杆状病毒或杆状病毒杀虫剂的规模化生产；该细胞系还可应用于构建杆状病毒表达载体系统，表达具有商业或科学价值的蛋白质。

Description

高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种昆虫细胞系。更具体地，本发明涉及一种棉铃虫蛹卵巢细胞系。本发明提供的细胞系对杆状病毒高度敏感。本发明还涉及该细胞系的建立方法，以及该细胞系在杆状病毒规模化生产中的应用。
背景技术
据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过700种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。昆虫细胞系作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具，而且昆虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经济意义或科学意义的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也发挥了重要的作用。
大量的来源于鳞翅目昆虫商品化的细胞系已得到人们广泛的应用，比如，来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf21和其克隆株Sf9，来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名为High Five)等，已经成功的应用于表达和生产重组蛋白。
鳞翅目的细胞系来源于很多组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。然而，值得一提的是，由于昆虫细胞不完全的去分化，有的已经建立的昆虫细胞系仍然保持一定原始组织和器官的特征。来源于不同种类昆虫的细胞系或来源于同一种昆虫不同组织部位的细胞系扩增病毒或重组蛋白的表达能力各有不同。因此建立和筛选新的、更多的杆状病毒敏感细胞系(株)是一项非常有必要而且有理论和实践意义的工作。
到目前为止，来自棉铃虫(Helicoverpa armigera)的细胞系共21株。来自卵巢的有12株(McIntosh et al.,1983；Yang et al.,1983；Su et al.,1987；Kolokol et al.,1995；McIntosh et al.,1999；Gordon et al.,2008)；其中来源于棉铃虫蛹卵巢的有7株，对病毒敏感性总结见表1。
表1已建立棉铃虫蛹卵巢细胞系对病毒敏感性
Figure BDA0002244730810000021
昆虫的卵巢通常是成对的，是卵子发生和发育的场所。卵巢是由卵巢管(ovariole)组成，在各类昆虫中卵巢管的数目差异很大。自Grace利用卵巢组织建立了第一个昆虫细胞系以来，卵巢一直是细胞系建立的重要组织来源。解剖将要羽化的蛹获得的卵巢组织更易于操作，减少污染机会。更多种类的昆虫细胞系仍存在很大的需求，建立新的来源于昆虫卵巢的细胞系，构建更加高效的杆状病毒表达载体系统是十分有意义的。
参考文献
1)钟江，肖淑林，苏德明，棉铃虫细胞系SFE-HA-8212的克隆化及对HaSNPV受纳性提高的克隆系得建立，复旦学报，1994，33(2)，148-156
2)McIntosh AH,Ignoffo CM,Quhou C,Pappas M.Establishment of a cellline from Heliothis armigera(Hbn.)(Lepidoptera:Noctuidae).In Vitro19:589～590；1983；
3)Grasela JJ,McIntosh AH.In vitro and in vivo host range ofAnticarsia gemmatalis multiple nuclear polyhedrosis virus.In Vitro Cell DevBiol Anim.1998Jan；34(1):79-83.PubMed PMID:9542640."
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5)裘卫,朱国凯.棉铃虫核型多角体病毒在同源和异源寄主细胞系内复制及其感染性比较[J].病毒学报,1991(02):153-157.
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7)Gordon OJ,Caoili BL.2008.Susceptibility of Newly Established CellLines from Helicoverpa armigera to Homologous and HeterologousNucleopolyhedroviruses.Journal of Insect Biotechnology&Sericology,77(77):25-34.
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的棉铃虫蛹卵巢细胞系，本发明提供的细胞系为棉铃虫卵巢组织来源、具有高度病毒敏感性、并且能更加高效的生产杆状病毒。
本发明的另一目的在于提供所述高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系的构建方法。
本发明的又一目的在于提供所述高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系的用途。
一方面，本发明提供了一种高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-Ha-8，其保藏号为CGMCC No.17690，已于2019年5月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
另一方面，本发明提供了所述高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1)获取棉铃虫雌蛹卵巢组织；
步骤2)培养卵巢组织，至增殖的细胞充满培养瓶，其中，所述组织紧贴在细胞培养瓶底；
步骤3)取新增殖的细胞，继续培养至细胞传代，即得；
整个过程都是在无菌条件下进行的。
优选地，所述步骤1是通过包括以下步骤的方法完成的：
①将棉铃虫雌蛹浸没在乙醇溶液中10～20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干虫体表面；
②在Ringer’S生理盐水中解剖昆虫，取出完整卵巢组织；
③用生理盐水清洗②中获得的组织2～3次，再用细胞培养液清洗，得到卵巢组织；
优选地，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法完成的：
(1)将清洗后卵巢组织放入含有1mL细胞培养液润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时；
(2)加入细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤(1)同样条件下培养，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；
优选地，所述步骤3)是通过包括以下步骤的方法完成的：
把含有新增殖出的单个细胞，连同细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞培养液，细胞开始传代，细胞系建立成功，得到本发明的高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系.
本发明上述方法中所使用细胞培养液是常规采用的昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.0-6.5之间。昆虫细胞培养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养液，如Insect XPRESS、TNM-FH、Grace’s、Sf 900、TC-100、IPL-41、Ex-Cell 400等等。
其中，细胞培养液中青霉素含量为100U/mL；链霉素含量为100U/mL；动物血清含量为细胞培养液的5～20％(体积比)。
本发明所述的方法使用棉铃虫蛹的卵巢细胞为实验材料，采用快速建立昆虫细胞系的方法，构建获得一株对棉铃虫核型多角体病毒和美洲棉铃虫核型多角体病毒高敏感的棉铃虫卵巢细胞系，并且命名为IOZCAS-Ha-8。保藏号为CGMCC No.17690。
本发明中棉铃虫卵巢细胞系的生物学特征观察和测定：
1.经实验观察，该细胞系大部分贴壁在培养瓶底部，也有悬浮于培养液的细胞。细胞的形状有3种类型：大部分细胞梭形、少部分圆形(如图2、图3所示)。细胞直径8.59～21.87μm，平均13.12μm。
2.按照McIntosh and Ignoffo，1989(McIntosh，A.H.and C.M.IgnoffoJ.Invertebr.Pathol.1989，54：97～102)的方法，测定第20代细胞生长曲线(图4)和群体倍增时间。以2×105细胞/mL的浓度接种到25cm2培养瓶中，27℃培养，每24h测定细胞浓度，绘制生长曲线，并按公式T＝tlg2/[lg(N/N0)]计算，第20代的细胞群体倍增时间为34.1小时。
其中T＝在对数期平均增长一倍所需的时间
t＝接种到测定细胞数的时间
N0＝接种时的细胞数
N＝时刻t所测定的细胞总数
3.使用线粒体COI基因测序的方法鉴定了细胞系IOZCAS-Ha-8确是来源于棉铃虫。由IOZCAS-Ha-8提取的DNA与棉铃虫蛹DNA，使用引物(上游引物：5'-3'SEQ ID NO:1TACTCGAGCTTATTTCACATC，下游引物5'-3'SEQ ID NO:2GGTATACCTGCTAATCCTAAGA)PCR扩增；(PCR扩增条件：95℃，2min；95℃/30S，60℃/30S，72℃/60S，30个循环；72℃，5min。)后直接进行测序，测序获得序列如SEQ ID NO:3所示，在NCBI网站上Blast比对，与棉铃虫线粒体COI基因序列达到98％，说明IOZCAS-Ha-8来源于棉铃虫。
SEQ ID NO:3：
CGGGAGGGGCAAAATCAAAATAAATTGTTGATATAAAATAGGATCACCTCCTCCAGCAGGGTCAAAAAAAGATGTATTAAGGTTTCGATCTGTTAAAAGTATAGTAATAGCACCTGCTAAAACTGGTAATGATAATAATAATAAAAATGCAGTAATTCCTACAGCTCAAATAAATAATGGCATTTGATCAAAAGATAAGCTATTTAATTTTATATTAATAATAGTAGTAATAAAATTAATTGCTCCTAAAATAGATGAGATTCCAGCTAAATGTAAAGAAAAAATAGCTAGGTCTACTGATCTTCCTCCATGTGCAATATTAGATGAAAGTGGGGGGTAAACTGTTCATCCTGTTCCTGCTCCATTTTCTACAATTCTTCTTGAAATAAGTAAAGTTAAAGAAGGGGGAAGTAATCAAAAACTTATATTATTTATTCGGGGGAAAGCTATATCAGGGGCTCCTAATATTAAAGGAACTAATCAATTTCAAAATCCTCCA
4.IOZCAS-Ha-8对棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)和美洲棉铃虫核型多角体病毒(HzNPV)敏感，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒(如图5，图6所示)。
5.使用传统细胞冻存的方法对细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并成功复苏。
本发明提供的高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系可以用来复制杆状病毒，用于杆状病毒或杆状病毒杀虫剂的规模化生产；该细胞系还可应用于构建杆状病毒表达载体系统，表达具有商业或科学价值的蛋白质。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为原代培养过程中，棉铃虫卵巢组织贴壁培养，可见细胞从组织游离出来，证明该细胞来源于蛹卵巢组织，标尺100μm；
图2为根据本发明的棉铃虫蛹卵巢细胞系IOZCAS-Ha-8的细胞形态；标尺100μm；
图3为IOZCAS-Ha-8分别在第5、10、20代圆形、梭形细胞所占比例；
图4为根据本发明的棉铃虫蛹卵巢细胞系IOZCAS-Ha-8的生长曲线；
图5为根据本发明的棉铃虫蛹卵巢细胞系IOZCAS-Ha-8感染棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)后，获得大量的病毒多角体，标尺50μm；。
图6为根据本发明的棉铃虫蛹卵巢细胞系IOZCAS-Ha-8感染美洲棉铃虫核型多角体病毒(HzNPV)后，可见多角体产生，标尺100μm。
生物材料的保藏
该高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系IOZCAS-Ha-8，分类命名为棉铃虫蛹卵巢细胞株，已经于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17690。
具体实施方式
实施例1棉铃虫蛹卵巢细胞系的建立
取末期的棉铃虫蛹(中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究重点实验室饲养)浸没在体积分数为75％的乙醇溶液中10分钟，进行表面消毒。解剖该昆虫取出卵巢组织，操作时尽量保持其完整。用生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液(Insect-XPRESS，含100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗1-2次，放入使用1mL培养液润洗过的25cm2的细胞培养瓶中，放入摄氏27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时。然后加入3mL上述细胞培养液，放入同样条件下培养。注意该方法成功建立细胞系的关键是要使组织块紧贴在细胞培养瓶底，勿使组织块悬浮在细胞培养液中。在此操作第2-3天后可以观察到组织块周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展(图1)。第21天后见到细胞不断增殖并充满整个培养瓶，将培养环境中的氧气降低，第30天恢复至常氧，第44天把含有新增殖出的细胞，连同细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养液。在细胞开始传代的第7天后开始第二次分瓶传代，以后传代时间逐渐缩短，传到第8代时，细胞生长开始稳定，最终该细胞系被命名为IOZCAS-Ha-8。IOZCAS-Ha-8于2019年5月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.17690。
实施例2.IOZCAS-Ha-8的生物学特性观察和测定
(1)形态特征：经显微镜观察，该细胞系通常悬浮于培养液中，细胞的形状有2种类型：圆形和梭形(图2，图3)。
(2)细胞的生长：27℃下，细胞系第10代在含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素的TNM-FH培养液中，细胞群体倍增时间为67.95小时(图4)。细胞最高密度约可达3.61×106个细胞/mL，目前该细胞已经传代超过50代。
(3)使用线粒体COI基因测序的方法鉴定：细胞系IOZCAS-Ha-8来源于棉铃虫。由IOZCAS-Ha-8提取的DNA与棉铃虫蛹DNA，使用引物(上游引物：5'-3'SEQ ID NO:1TACTCGAGCTTATTTCACATC，下游引物5'-3'SEQ ID NO:2GGTATACCTGCTAATCCTAAGA)PCR扩增；(PCR扩增条件：95℃，2min；95℃/30S，60℃/30S，72℃/60S，30个循环；72℃，5min。)后直接进行测序，测序获得序列如SEQ ID NO:3所示，在NCBI网站上Blast比对，与棉铃虫线粒体COI基因序列达到98％，说明IOZCAS-Ha-8来源于棉铃虫。
(4)冻存和复苏：使用传统细胞冻存的方法对细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并可以成功复苏。
实施例3.IOZCAS-Ha-8对杆状病毒敏感性的测定
IOZCAS-Ha-8对棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)和美洲棉铃虫核型多角体病毒(HzNPV)敏感：将HaNPV和HzNPV出芽型病毒粒子BV以0.001幼虫当量/毫升的浓度接种IOZCAS-Ha-8，培养7天后，可以收获细胞及病毒多角体，在倒置相差显微镜下，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒，对HaNPV感染率高达65.4％，显著高于其他已发表细胞系；对HzNPV感染率为19.2％，与其他细胞系相当(图5-图6)。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系及其制备方法和应用
<130> DIC19110094
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactcgagct tatttcacat c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtatacctg ctaatcctaa ga 22
<210> 3
<211> 499
<212> DNA
<213> Helicoverpa armigera
<400> 3
cgggaggggc aaaatcaaaa taaattgttg atataaaata ggatcacctc ctccagcagg 60
gtcaaaaaaa gatgtattaa ggtttcgatc tgttaaaagt atagtaatag cacctgctaa 120
aactggtaat gataataata ataaaaatgc agtaattcct acagctcaaa taaataatgg 180
catttgatca aaagataagc tatttaattt tatattaata atagtagtaa taaaattaat 240
tgctcctaaa atagatgaga ttccagctaa atgtaaagaa aaaatagcta ggtctactga 300
tcttcctcca tgtgcaatat tagatgaaag tggggggtaa actgttcatc ctgttcctgc 360
tccattttct acaattcttc ttgaaataag taaagttaaa gaagggggaa gtaatcaaaa 420
acttatatta tttattcggg ggaaagctat atcaggggct cctaatatta aaggaactaa 480
tcaatttcaa aatcctcca 499

Claims (8)

1.一种高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-Ha-8，其保藏号为CGMCC No.17690。
2.根据权利要求1所述的高产杆状病毒的棉铃虫蛹卵巢细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1)获取棉铃虫雌蛹卵巢组织；
步骤2)培养卵巢组织，至增殖的细胞充满培养瓶，其中，所述组织紧贴在细胞培养瓶底；
步骤3)取新增殖的单个细胞，继续培养至细胞传代，即得；
整个过程都是在无菌条件下进行的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法完成的：
①将棉铃虫雌蛹浸没在乙醇溶液中10～20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干虫体表面；
②在Ringer’S生理盐水中解剖昆虫，取出完整卵巢组织；
③用生理盐水清洗②中获得的组织2～3次，再用细胞培养液清洗，得到卵巢组织。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法完成的：
(1)将清洗后卵巢组织放入含有1mL细胞培养液润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时；
(2)继续加入细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤(1)同样条件下培养，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤3)是通过包括以下步骤的方法完成的：
把含有新增殖出的单个细胞，连同细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞培养液，细胞开始传代，细胞系建立成功。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物；细胞培养液pH为6.0-6.5；
细胞培养液中青霉素含量为100U/mL；链霉素含量为100U/mL；胎牛血清含量为细胞培养液的5～20％(体积比)。
7.根据权利要求1所述的棉铃虫蛹卵巢细胞系在生产杆状病毒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述杆状病毒为棉铃虫核型多角体病毒和美洲棉铃虫核型多角体病毒。
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