CN111321106B - 一株华北大黑鳃金龟细胞系及其应用 - Google Patents

一株华北大黑鳃金龟细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株对杀蛴螬类害虫Bt Cry8Ab1蛋白敏感的华北大黑鳃金龟细胞系，所述的细胞系的保藏编号为CCTCC No:C201866。本发明的细胞系，可用于杀蛴螬类害虫Bt杀虫晶体蛋白的活性测定和杀虫机理研究。本发明所提供的华北大黑鳃金龟细胞系QAU‑Ho‑E‑6‑22还可用于蛴螬类害虫杀虫剂的筛选。本发明以华北大黑鳃金龟为材料，建立该昆虫的细胞系并克隆筛选，获得一株对Bt Cry8Ab1杀虫蛋白敏感的细胞系，对其相关的生物学特性进行研究，为华北大黑鳃金龟的生理学研究以及新型杀虫剂的离体生物测定和杀虫机理研究提供材料。

Description

一株华北大黑鳃金龟细胞系及其应用
技术领域
本发明属于昆虫细胞生物学领域，具体涉及一株华北大黑鳃金龟细胞系及其应用，可用于杀蛴螬类害虫苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白的毒力测定和杀虫机理研究。
背景技术
昆虫细胞培养技术已经成为现代实验生物学的重要手段之一，并广泛应用于医学、农学及生物学的各个领域。自Gaw(1959)建立家蚕Bombyx mori细胞系和Grace(1962)建立桉蚕蛾Antheraea eucalypti卵巢细胞系之后，昆虫细胞系的建立工作在全世界范围内广泛开展，目前国际上已从170多种昆虫建立了800多株细胞系。国际上已建立昆虫细胞系的来源主要包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、蜚蠊目(Blattaria)、膜翅目(Hymenoptera)、直翅目(Orthoptera)和半翅目(Hemiptera)等不同昆虫的各种组织，其中以双翅目和鳞翅目居多。鞘翅目是昆虫纲中种类最多、分布最广的一个类群，全世界报道的种类已有36万多种，占全世界已知昆虫种类的1/3左右，其中的许多种类是农业、林业和园艺上的重要昆虫，有着极其重要的经济价值。但是，鞘翅目昆虫细胞系的研究并不深入，来源于鞘翅目昆虫的细胞系只有不到30株，这些细胞系的成功建立为昆虫病理学、昆虫毒理学、杀虫剂毒力检测、害虫防治、昆虫病毒学等领域的研究提供了优良的实验材料。
华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita(Faldermann))属于鞘翅目(Coleoptera)、金龟甲科(Scarabaeidae)，其幼虫(通称蛴螬)可为害多种植物，是中国北方重要的地下害虫之一，造成严重危害。化学防治在生产实际中虽然发挥着主导作用，随着人们环保意识的增强，开发新型高效、低毒的化学药剂以及安全有效的生物防治措施成为当务之急。例如，近年来对蛴螬类害虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株的分离筛选以及杀虫蛋白基因的发掘为蛴螬类害虫的生物防治开辟了一条新途径。基于杀虫剂活性的测定和筛选，活体生物测定需要饲养大量并且生长状态一致的昆虫，由于华北大黑鳃金龟幼虫生活在土壤中，生活周期长，一般需要2年完成一个世代，且难于在室内大规模饲养，亟待建立一些新的生物测定方法以适应新型杀虫剂的研究与开发。利用昆虫细胞系进行杀虫剂的活性测定和筛选作为一种新的检测手段，由于具有简便、快速和高效的特点，其应用也越来越受到人们的重视和青睐。
发明内容
本发明的目的是提供一株对杀蛴螬类害虫Bt Cry8Ab1蛋白敏感的华北大黑鳃金龟细胞系，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供一株华北大黑鳃金龟细胞系QAU-Ho-E-6-22(Holotrichia oblitacell line QAU-Ho-E-6-22，简称Ho-6-22)，其于2018年4月17日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201866。
本发明的细胞系，可用于杀蛴螬类害虫Bt杀虫晶体蛋白的活性测定和杀虫机理研究。
本发明所提供的华北大黑鳃金龟细胞系QAU-Ho-E-6-22还可用于蛴螬类害虫杀虫剂的筛选；
本发明提供了细胞系QAU-Ho-E-6-22的分子鉴定方法，用线粒体细胞色素氧化酶I亚基(COI)基因通用引物进行PCR扩增，通过分析和比对基因序列来鉴定细胞系，其COI基因核苷酸序列见SEQ ID NO:1，其蛋白序列为SEQ ID NO:2。
所述的引物对，其序列信息如下：
通用引物HCO 2198：
5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，SEQ ID NO:3
通用引物LCO 1490：
5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′SEQ ID NO:4。
本发明以华北大黑鳃金龟为材料，建立该昆虫的细胞系并克隆筛选，获得一株对Bt Cry8Ab1杀虫蛋白敏感的细胞系，对其相关的生物学特性进行研究，为蛴螬类昆虫的生理学研究以及新型杀虫剂的离体生物测定和杀虫机理研究提供材料。
附图说明
图1：本发明的华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22的细胞形态图；
图2：本发明的华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22的生长曲线图；
图3：Bt Cry8Ab1蛋白处理后华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22的细胞形态变化图；
图4：Bt Cry8Ab1蛋白对华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22的毒力回归直线图。
具体实施方式
本发明对华北大黑鳃金龟细胞Ho-6-22的建立、克隆筛选、分子鉴定、生长曲线测定以及对Bt杀虫蛋白敏感性测定等进行研究，该细胞系对杀蛴螬类害虫Bt Cry8Ab1蛋白敏感，将在Bt杀虫蛋白的生物测定和杀虫机理研究中具有良好的应用前景。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：华北大黑鳃金龟细胞系的建立
(1)试虫来源
华北大黑鳃金龟成虫采集于山东省青岛市城阳区周边田间，在室内25℃条件下用柳树叶饲喂，待成虫交配产卵后每天收集卵粒，用于细胞培养。
(2)细胞原代培养
收集华北大黑鳃金龟成虫刚产出24h内的卵约50粒，在超净工作台内用10％次氯酸钠和75％酒精分别消毒5min，然后用无菌纯水冲洗3次，用TNM-FH培养基冲洗1次，将卵粒转移至孔径为100μm的细胞筛中，浸于装有10mL含15％胎牛血清的TNM-FH培养基的培养皿中，用灭菌的橡胶头研磨卵粒，将2mL细胞滤液加入装有3mL含15％胎牛血清TNM-FH培养基的25cm2培养瓶中，于28℃培养箱中静置培养，在倒置相差显微镜下观察，根据细胞的生长状态，每隔15～20d更换不同比例的新鲜培养基。
(3)细胞传代培养
在原代培养的过程中，部分细胞的生长状态较好，培养2d细胞开始贴壁，逐渐伸长拉网并形成网状基质，之后从网状基质中开始分裂出新生细胞，随着细胞逐渐分裂，细胞量增加，细胞逐渐铺满瓶底。待细胞生长铺满培养瓶瓶底时，可以进行传代培养。用吸管轻轻吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液，按2:3的比例(2mL细胞悬液加入3mL新鲜培养基)进行传代，以后根据细胞的生长状态适当调整传代时间和更换培养基的比例。待细胞生长逐渐稳定后，将培养基中胎牛血清的比例降为10％，细胞能很快适应新培养基，生长状态良好，并能稳定传代，成功建立了一株华北大黑鳃金龟胚胎细胞系QAU-Ho-E-6(简称Ho-6)。Ho-6细胞以球形细胞为主，占细胞总数的95％，细胞直径为14.54±1.96μm，5％的细胞呈纺锤形，大小为31.28±3.06μm×13.21±1.77μm。
实施例2：对杀蛴螬类害虫Bt Cry8Ab1蛋白敏感的华北大黑鳃金龟细胞系的筛选
(1)华北大黑鳃金龟细胞系的克隆
Ho-6细胞系来源于华北大黑鳃金龟的胚胎组织，其中可能包含多种细胞组分，生物学特性不完全一致，对建立的细胞系继续进行克隆和筛选，可以获得生物学性状不同的细胞株。因此，本发明对Ho-6细胞系进行克隆，并测试不同克隆株对Bt Cry8Ab1杀虫晶体蛋白的敏感性，以获得优良敏感细胞株用于后续研究。
取传代第11代的Ho-6细胞，用培养基将细胞稀释至每毫升16个细胞的浓度，利用384(24×16)孔细胞克隆板对细胞进行克隆，每个大孔加入2mL的细胞悬液，28℃下静置培养2h，在倒置相差显微镜下观察并记录下只含有1个细胞的小格；每7d更换部分培养基，待细胞增殖长满小格底部后，小心将细胞吸出，转入96孔细胞培养板中增殖；待培养板底部长满细胞后再转入24孔细胞培养板；待长满后再转入25cm2的细胞培养瓶中传代培养。通过克隆获得了26个细胞克隆株，按编号分别为QAU-Ho-E-6-1～QAU-Ho-E-6-26。
(2)对Bt Cry8Ab1杀虫晶体蛋白敏感细胞系的筛选
取Bt HD73-cry8Ab1菌种(含有Cry8Ab1杀虫蛋白基因)(Zhang Yuan,ZhengGuiling,Tan Jianxin,Li Changyou,Cheng Linyou.2013.Cloning andcharacterization of a novel cry8Ab1 gene from Bacillus thuringiensis strainB-JJX with specific toxicity to scarabaeid(Coleoptera:Scarabaeidae)larvae.Microbiological Research,168(8):512-517.)，接种至1.5％的LB平板上，于30℃培养箱内培养；挑取单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，30℃条件下振荡培养过夜；按1％的量接种于200mL的1/2LB液体培养基中，于30℃，250r/min条件下培养至芽孢和晶体分离；收集培养液，于4℃条件下8000r/min离心5min，弃上清液；加入40mL裂解液(50mmol/L的Na2CO3，10mmol/L的EDTA，3％的巯基乙醇)，4℃裂解6h；于4℃条件下12000r/min离心10min，收集上清液用4mol/L的乙酸钠-乙酸缓冲液调至蛋白等电点，沉淀蛋白4h；12000r/min离心10min，收集沉淀溶于PBS缓冲液中，以10：1的比例(蛋白：胰蛋白酶)加入胰蛋白酶，于37℃酶解60min，SDS-PAGE检测和定量后，将制备好的Cry8Ab1蛋白于-20℃保存备用。
取对数生长期的Ho-6细胞系及其克隆株细胞，按3.0×105cells/mL的量分别接入96孔板中，每孔100μL，每种细胞接种6个孔，28℃培养过夜，使细胞贴壁；吸去上清，每种细胞的3个孔加入20μg/mL的Cry8Ab1蛋白100μL，另外3个对照孔加PBS缓冲液，28℃孵育30min～1h；吸去上清，每孔加入100μL 0.5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h；吸去MTT，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；于630nm处测量各孔的吸光值，按下面公式计算细胞的死亡率并比较不同细胞对Cry8Ab1蛋白的敏感性。
细胞死亡率(％)＝(对照OD值－处理OD值)/对照OD×100％
活性测定结果显示，Ho-6细胞系及其26个细胞克隆株经20μg/mL的Cry8Ab1蛋白处理后，细胞死亡率在12.5％～67.6％之间，原始细胞系Ho-6的细胞死亡率为27.2％，克隆株Ho-6-15的细胞死亡率最低为12.5％，而克隆株Ho-6-22的细胞死亡率最高为67.6％，表现出不同克隆株对Cry8Ab1蛋白的敏感性差异，其中Ho-6-22对Cry8Ab1蛋白最敏感。
筛选获得的Ho-6-22细胞系，细胞呈贴壁生长，细胞形态均一性较原始细胞系Ho-6好，均为球形细胞(图1)，细胞的直径平均为15.26±1.87μm，大于原始细胞系Ho-6，细胞可连续稳定传代，生长状态良好，是本发明对原始细胞系生物学性状的筛选改良的结果。
实施例3：华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22的分子鉴定
(1)细胞基因组DNA的提取
取对数生长期的Ho-6-22细胞和华北大黑鳃金龟卵，参照MagExtractorTM-Genome-基因组DNA抽提试剂盒(东洋纺生物科技有限公司)说明书，提取细胞和卵的基因组DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测基因组DNA的提取效果。
(2)线粒体细胞色素氧化酶I亚基(COI)基因片段的扩增和分析
分别以Ho-6-22细胞和华北大黑鳃金龟卵的基因组DNA为模板，使用线粒体细胞色素氧化酶I亚基(COI)基因通用引物HCO 2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′，SEQID NO:3)和LCO 1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，SEQ ID NO:4)对其COI基因片段进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/LdNTPs 4μL，10μmol/L的引物各lμL，Taq DNA聚合酶2.5U，基因组DNA模板50ng，用ddH2O补足至50μL。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并在NCBI网站使用Blast进行序列的比对和分析。
扩增的Ho-6-22细胞COI基因片段长度为561bp(SEQ ID NO:1)，编码187个氨基酸(SEQ ID NO:2)，与华北大黑鳃金龟卵COI基因序列的相似性为100％。经Blast比对，其核苷酸序列与NCBI中华北大黑鳃金龟Q12-1品系的相似性最高为98％。使用通用引物对COI基因片段进行扩增和序列分析，可简便快速鉴定本发明的Ho-6-22细胞系。
实施例4：华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22生长曲线测定
(1)生长曲线测定方法
取对数生长期的Ho-6-22细胞，血球计数板计数，用培养基稀释细胞至浓度为2×105cells/mL，接于24孔板中，每孔1mL，于28℃条件下培养。每天取3孔细胞用血球计数板计数，计算细胞的浓度，以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，绘制细胞的生长曲线，并计算细胞的群体倍增时间。
(2)生长曲线测定结果
Ho-6-22细胞的生长曲线见图2，接种24h细胞密度略有增加，在72h以后细胞生长速度明显加快并呈对数增长，培养168h时细胞密度达到最大值，为6.77×105cells/mL。细胞达到最大密度后，由于培养基中营养缺乏、生长空间受限使得细胞堆积、生长速度缓慢，细胞密度逐渐下降。经计算，Ho-6-22细胞的群体倍增时间为75.7h，较原始细胞系Ho-6(群体倍增时间为85.6h)的生长速度加快。
实施例5：华北大黑鳃金龟细胞系Ho-6-22对Bt Cry8Ab1杀虫蛋白的敏感性测定
(1)Bt Cry8Ab1杀虫晶体蛋白的提取纯化
取Bt HD73-cry8Ab1菌种(含有Cry8Ab1杀虫蛋白基因)(Zhang Yuan,ZhengGuiling,Tan Jianxin,Li Changyou,Cheng Linyou.2013.Cloning andcharacterization of a novel cry8Ab1 gene from Bacillus thuringiensis strainB-JJX with specific toxicity to scarabaeid(Coleoptera:Scarabaeidae)larvae.Microbiological Research,168(8):512-517.)，接种至1.5％的LB平板上，于30℃培养箱内培养；挑取单菌落，接种于50mL的LB液体培养基中，30℃条件下振荡培养过夜；按1％的量接种于200mL的1/2LB液体培养基中，于30℃，250r/min条件下培养至芽孢和晶体分离；收集培养液，于4℃条件下8000r/min离心5min，弃上清液；加入40mL裂解液(50mmol/L的Na2CO3，10mmol/L的EDTA，3％的巯基乙醇)，4℃裂解6h；于4℃条件下12000r/min离心10min，收集上清液用4mol/L的乙酸钠-乙酸缓冲液调至蛋白等电点，沉淀蛋白4h；12000r/min离心10min，收集沉淀溶于PBS缓冲液中，以10：1的比例(蛋白：胰蛋白酶)加入胰蛋白酶，于37℃酶解60min，SDS-PAGE检测和定量后，于-20℃保存备用。
(2)杀虫晶体蛋白的离体生物测定
采用MTT法，取对数生长期细胞计数，按3.0×105cells/mL的量接入96孔板中，每孔100μL，28℃培养过夜，使细胞贴壁；吸去上清，每孔加入100μL稀释成不同浓度的Cry8Ab1蛋白，另外分别设置调零孔(无细胞，用溶解蛋白的缓冲液处理)和对照孔(有细胞，用溶解蛋白的缓冲液处理)，每个处理设3次重复，28℃孵育30min～1h；吸去上清，每孔加入100μL0.5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h；吸去MTT，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；于630nm处测量各孔的吸光值，按下面公式计算细胞的死亡率，采用DPS数据处理系统计算有效中浓度EC50。
细胞死亡率(％)＝(对照OD值－处理OD值)/对照OD×100％
经测定，Bt Cry8Ab1蛋白能引起Ho-6-22细胞发生明显的病变和死亡(图3)，细胞死亡率随着蛋白浓度的增大而升高，细胞死亡率几率值与Bt Cry8Ab1蛋白浓度对数的回归直线方程为Y＝2.456+2.066X(图4)，其有效中浓度EC50为17.02μg/mL。
本发明以华北大黑鳃金龟为材料，建立该昆虫的细胞系并克隆筛选，获得一株对Bt Cry8Ab1杀虫蛋白敏感的细胞系，对其相关的生物学特性进行研究，为华北大黑鳃金龟的生理学研究以及新型杀虫剂的离体生物测定和杀虫机理研究提供材料。

Claims (3)

1.一株华北大黑鳃金龟细胞系，其特征在于，所述的细胞系（Holotrichia oblitacell line）QAU-Ho-E-6-22的保藏编号为CCTCC No: C201866。
2.权利要求1所述的细胞系在蛴螬类害虫杀虫剂筛选中的应用。
3.一种筛选蛴螬类害虫杀虫剂的方法，其特征在于，所述的方法中使用权利要求1所述的细胞系来筛选蛴螬类害虫的杀虫剂。
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