CN112725236A - 土壤短芽孢杆菌dr2-1及其应用 - Google Patents

土壤短芽孢杆菌dr2-1及其应用 Download PDF

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CN112725236A CN202110082616.8A CN202110082616A CN112725236A CN 112725236 A CN112725236 A CN 112725236A CN 202110082616 A CN202110082616 A CN 202110082616A CN 112725236 A CN112725236 A CN 112725236A
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明涉及土壤短芽孢杆菌DR2‑1及其应用。土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2‑1，其保藏编号为CGMCC No.21197。本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2‑1对于根结线虫具有优异的防治效果，还能够促进植物生长，在农业生产中具有良好的应用价值。

Description

土壤短芽孢杆菌DR2-1及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月08日提交、申请号为202011444098.1的中国专利申请的优先权，其全文通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及土壤短芽孢杆菌及其在杀根结线虫及促植物生长方面的应用。
背景技术
根结线虫是植物专性内寄生线虫，寄主范围十分广泛，在全世界范围内能够侵染2000多种植物，包括大田作物，蔬菜及景观植物等，成为限制这些作物种植的重要因素。根结线虫经由根尖侵染成功后，能够通过侵染中后期形成的固定性取食位点(巨大细胞)获取营养来维持自身的生长及繁殖。根结线虫侵染寄主植物后，能够造成植株弱小，生长缓慢，抗逆境能力下降。随着设施农业的发展，作物长期的连作使得根结线虫危害面积日益加大，已经成为农业生产中急需解决的突出问题。
根结线虫的防治手段有抗病品种的选育、物理防治、化学防治及生物防治，目前生产上主要应用化学防治的方法治理根结线虫。但化学农药不仅成本高，长期使用杀线剂还会造成土壤及水体污染，对人的健康存在严重的安全隐患。因此安全、无污染的生物防治越来越受到人们的关注。
发明内容
本发明提供一株土壤短芽孢杆菌DR2-1及其应用。
本发明提供一株土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1，该菌株是从多肉植物秀妍叶片中分离得到的，并于2020年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri，保藏编号为CGMCCNo.21197。
本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1，形态观察：短杆状，菌落颜色为米黄色，菌落形状呈规则圆形，边缘较整齐，表面光滑，菌落不隆起，不透明，培养基颜色未见明显变化。经革兰氏染色显示为紫色，为革兰氏阳性菌(参见图1和图2)。
本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1，生理生化鉴定：通过淀粉水解，明胶液化，柠檬酸盐，菌膜形成，伏普试验，甲基红试验，耐盐性试验等重要特征进行鉴定。结果见下表：
Figure BDA0002909912680000021
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性
本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1，16S rDNA序列如SEQID NO.1所示。
本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1，gyrB基因序列如SEQID NO.2所示。
本发明还提供包含所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的菌剂。
本发明中，所述包含土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述包含土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明还提供所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1或包含所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的菌剂在防治根结线虫中的应用。其中，所述根结线虫包括南方根结线虫。
本发明还提供所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1或包含所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的菌剂在促进植物生长的应用。其中，所述促进植物生长包括促进植株增高、根系增长，茎增粗，植株地上部及地下部鲜重增加。所述植物包括黄瓜。
作为本发明的另一种实施方式，是将所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1施用于所述植物。
作为本发明的另一种实施方式，是以所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的发酵液(例如上清液)用于防治根结线虫或促进植物生长。
作为本发明的另一种实施方式，所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的发酵液中有效活菌数为1-2×109CFU/mL，例如109CFU/mL。
本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1对于根结线虫具有优异的防治效果。实验表明，24h时土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株对南方根结线虫的校正死亡率能达到81.06％，36h及48h时对南方根结线虫的校正死亡率均高达100％。温室盆栽试验表明，经土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株发酵液处理后，黄瓜根部的根结数量显著降低，土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株发酵液对黄瓜根结线虫的防效达到62.83％，与阿维菌素处理结果无显著差异。说明土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)能够有效的防治黄瓜根结线虫，在农业生产防治根结线虫病中具有良好的应用价值。实验还发现，本发明提供的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillusagri)DR2-1具有明显的促进黄瓜生长作用。
附图说明
图1为本发明实施例1土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1在平板上的菌落形态。
图2为本发明实施例1土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1经革兰氏染色后的细菌形态图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1菌株DR2-1的分离、纯化及鉴定
一、菌株DR2-1的分离、纯化
菌株DR2-1是从青岛市城阳区青岛农业大学温室中多肉植物秀妍叶片中分离得到的，具体步骤如下：称取秀妍叶片10g，先用1％次氯酸钠消毒5min，再用无菌水漂洗三遍，在灭菌研钵中研磨成糊状后加入含有100ml无菌水的三角瓶中混匀，在无菌操作台中分别稀释到10-3，10-4，10-5，10-6，10-7几个梯度，分别将这几个梯度的稀释液在LB培养基上用涂布棒均匀涂布，进行生防细菌的分离。每个稀释梯度设置3个重复。用封口膜封口后将平板倒置于30℃培养箱中培养。培养1-2d后观察细菌的生长情况，挑取单菌落于LB培养基上进行纯化。将挑取的单菌落命名为DR2-1。
二、菌株DR2-1的鉴定
首先将菌株DR2-1接种于NA培养基，2d后于显微镜下观察其大小和形态。同时对其进行革兰氏染色判断其为革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌。观察其是否产生芽孢并拍照记录其形态特征。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》及东秀珠等发表的细菌生理生化鉴定方法对其进一步鉴定。最后提取菌株DR2-1的总DNA，利用16S rRNA鉴定引物27F/1492R及gyrB基因鉴定引物UP-1S/UP-2Sr进行基因片段扩增。纯化回收后送公司进行测序，序列返回后利用BLAST的方法进行序列一致性比较，确定细菌种类。
1)形态观察：通过观察菌体的形态，颜色，菌落形状，边缘，透明度，菌落隆起程度，培养基颜色变化等，通过革兰氏染色观察个体形态特征。
DR2-1菌株形态为短杆状，菌落颜色为米黄色，菌落形状呈规则圆形，边缘较整齐，表面光滑，菌落不隆起，不透明，培养基颜色未见明显变化。经革兰氏染色显示为紫色，为革兰氏阳性菌(见图1和图2)。
2)生理生化鉴定：通过淀粉水解，明胶液化，柠檬酸盐，菌膜形成，伏普试验，甲基红试验，耐盐性试验等重要特征进行鉴定。结果见下表：
Figure BDA0002909912680000041
Figure BDA0002909912680000051
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性
3)分子鉴定：利用OmegaBio-Tek试剂盒提取DR2-1菌株的DNA。采用16SrDNA细菌通用引物27F/1492R(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)及gyrB基因鉴定引物UP-1S/UP-2Sr(UP-1S：ATTGGTGACACCGATCAAACA；UP-2Sr：TCATACGTATGGATGTTATTC)分别进行PCR扩增。PCR反应体系(25μL)：10X Buffer 2.5μL，dNTP2μL，引物F/R各1μL，rTaq0.5μL，ddH2O 16μL，模板DNA2μL；反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s；63℃退火30s；72℃延伸90s；共35个循环；72℃总延伸7min；4℃保存。PCR扩增后，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测合格后送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，经测序获得DR2-1菌株的16S rDNA序列及gyrB基因序列。对菌株DR2-1的16S rDNA基因序列与Genbank Accession No.KC352740.1进行序列比对分析，结果表明：两者同源性＞99％；对菌株DR2-1的gyrB基因序列与Genbank Accession No.CP026363.1进行序列比对分析，结果表明：两者同源性＞99％。
DR2-1菌株的保藏：结合菌株形态特征、生理生化及分子鉴定结果，可以鉴定菌株为土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)。该菌株于2020年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.21197。
实施例2DR2-1发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的触杀试验
1)细菌发酵液的制备
将实施例1分离纯化后保存的菌株DR2-1用灭菌牙签于LB平板上划线，封口膜封口后于30℃培养箱中倒置进行活化培养，1d后挑取单菌落转接到装有LB液体培养基的无菌三角瓶中，于30℃、200r培养2～3d直至OD600达到2.0以上。发酵结束后，将发酵液于9000rmp离心5min收集上清液用于后续的二龄幼虫触杀试验。
2)南方根结线虫二龄幼虫的获得
从实验室用于培养南方根结线虫的茄门辣椒根上挑取成熟的线虫卵块，用0.5％的次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗干净。将卵块收集到灭菌培养皿中加入少量无菌水于28℃恒温孵化，48h后收集孵化的线虫备用。
3)发酵液上清杀线虫效果测定
取24孔板向其中加入1mL所述上清液，对照组加等量无菌水，挑入大约50条线虫，于28℃恒温培养，记录24h、36h及48h后线虫死亡数，计算线虫的死亡率和校正死亡率。以观察时在孔板中加入100ul浓度为1mol/L的NaOH溶液对线虫进行刺激后线虫僵直不动判定为死亡。试验设置三次重复。结果见表1。
死亡率(％)＝死亡线虫数×100/供试线虫数
校正死亡率(％)＝(对照组生存率-处理组生存率)×100/对照组生存率
试验结果表明，24h时土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株对南方根结线虫的校正死亡率为81.06％，36h及48h时对南方根结线虫的校正死亡率均高达100％。
表1土壤短芽孢杆菌DR2-1菌株发酵液上清对南方根结线虫二龄幼虫致死率测定
Figure BDA0002909912680000061
实施例3温室盆栽试验测定菌株DR2-1对黄瓜南方根结线虫防治效果
供试材料和方法：
黄瓜：品种为鲁黄瓜3号
线虫：南方根结线虫
将黄瓜种子用1％次氯酸钠消毒5min后，用无菌水清洗3遍，于育苗钵中进行催芽。待黄瓜长出2片真叶后，将其移栽到直径9cm，高度10cm的花盆中。定植5天后，将收集的南方根结线虫配成600条/ml的悬浮液，在植株周围均匀插三个小孔，将线虫悬浮液滴入小孔中，每个花盆中接种1ml线虫悬浮液。同时浇灌菌体浓度最终调成109CFU/mL的菌株DR2-1发酵液(参照实施例2方法制备)，处理组每个花盆浇灌10ml。同样方法黄瓜根部浇灌10ml的清水作为阴性对照，5ml 1.8％阿维菌素(1:5000)作为阳性对照。每个处理21株黄瓜。试验设置3次生物学重复。接种42天后清洗黄瓜根部进行调查，统计根结数，计算防治效果。根结抑制率计算公式：根结抑制率(％)＝(阴性对照根结数-处理组根结数)×100/阴性对照根结数。结果见表2。
结果表明，经土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株发酵液处理后，黄瓜根部的根结数量显著降低，土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株发酵液对黄瓜根结线虫的防效达到62.83％，与阿维菌素处理的结果无显著差异，说明土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)能够有效的防治黄瓜根结线虫。阿维菌素在农业生产中属于高毒农药，对鱼、蚕、蜜蜂等都有高毒性，并且施用时容易污染水源和池塘，操作不慎对人的健康也有严重威胁。而土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株来源于植物，具有高效安全的特点，在农业生产防治根结线虫病中具有良好的应用价值。
表2南方根结线虫盆栽试验
Figure BDA0002909912680000071
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 16.0t检验，P≦0.05)
实施例4温室盆栽试验测定菌株DR2-1对黄瓜生长的影响
在上述实施例3黄瓜接种土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株发酵液后，在接种的第42天分别对黄瓜地上部分株高、地上部鲜重、茎围、及地下根部长度、地下部鲜重进行测量。结果见表3。调查时发现经过DR2-1发酵液处理过的黄瓜无论是株高、地上部鲜重、茎围，还是地下根部长度、地下部鲜重与对照相比都有较显著的增加，经DR2-1发酵液处理过的黄瓜平均株高比对照增加了53.22％，地上部鲜重增加了52.31％，茎围增加30.89％，根长增加45.76％，地下部鲜重增加102％。。这说明经土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1菌株发酵液处理的黄瓜不仅根部变得发达，且地上部生长量增加明显。这不仅说明该菌株对黄瓜安全，且能够促进黄瓜的生长，具有良好的应用价值。
表3菌株DR2-1对黄瓜生长的影响
Figure BDA0002909912680000081
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 16.0t检验，P≦0.05)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 土壤短芽孢杆菌DR2-1及其应用
<130> KHP201117560.3
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1418
<212> DNA
<213> 土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)
<400> 1
cttcgcggct ggctccttgc ggttacctca ccgacttcgg gtgttgcaaa ctcccgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccgacttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagattggt 180
tttaagagat tggcgtcctc tcgcgaggta gcgtcccgtt gtaccaacca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccgcct tcctccgtct 300
tgtcgacggc agtctctcta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaag ataagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcaccg ctgccccgaa gggaagctct gtctccagag cggtcagcgg gatgtcaaga 480
cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt ttcactcttg cgagcgtact ccccaggcgg agtgcttatt 600
gcgttagctg cggcactgag ggtattgaaa cccccaacac ctagcactca tcgtttacgg 660
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gctacacgtg gaataccgct ttcctcttct gcactcaagc tacacagttt ccgatgcgaa 840
ccggggttga gccccgggct ttaacaccag acttacatag ccgcctgcgc gcgctttacg 900
cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960
agccgtggct ttctcgtcag gtaccgtcaa ggtaccgccc trttcgaacg gtacgtgttc 1020
gtccctgaca acagaacttt acaatccgaa gaccttcatc gttcacgcgg cgttgctcca 1080
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tgtctcagtc ccagtgtggc cggtcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt 1200
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<211> 1151
<212> DNA
<213> 土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)
<400> 2
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aacgcctgat gctgatcttg ccgtcattgg cgagacagag gagacgggaa caaaagtcac 180
cttcaagcca gatccgacga tttttacgga aacgactgtt tttgaatacg acgttttgca 240
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gcgcccggac caggagcgag aagaatcgtt ccactatgag ggcggtatcg tacagttcgt 360
ggaatacttg aataaaaacc gggaaccgtt gcacgaagag gtcatttact gcgagggcga 420
aaaagacggc cttttcgttg aggttgctct gcagtacaac gacagctatg tgagcaacat 480
ctactcgttc gccaacaaca tcaacacgca tgagggcgga acgcacgaaa caggcttcaa 540
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gattcaggag ccgcagtttg aagggcagac gaaaaccaag ctcggcaatt cggaagcgcg 720
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<211> 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcatacgtat ggatgttatt c 21

Claims (9)

1.土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1，其其保藏编号为CGMCC No.21197。
2.包含权利要求1所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1的菌剂。
3.权利要求1所述的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1或权利要求2所述的菌剂在防治根结线虫中的应用；优选地，所述根结线虫包括南方根结线虫。
4.权利要求1所述的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)DR2-1或权利要求2所述的菌剂在促进植物生长的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述促进植物生长包括促进植株增高、根系增长，茎增粗，植株地上部及地下部鲜重增加。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其中，所述植物包括黄瓜。
7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其中，是使用土壤短芽孢杆菌(Brevibacillusagri)DR2-1的发酵液。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述发酵液中有效活菌数为1-2×109CFU/mL，优选为109CFU/mL。
9.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其中，是使用土壤短芽孢杆菌(Brevibacillusagri)DR2-1的发酵液的上清液。
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