CN106358858B - 一种嗜菌异小杆线虫在温室蔬菜地下害虫生防中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种嗜菌异小杆线虫在温室蔬菜地下害虫生防中的应用，通过分离得到嗜菌异小杆线虫，采用新鲜的鸡内脏或去除鸡胗和胆，加入20％w/v的水，10%‑20%的植物油，均质、灭菌后作为培养基培养繁殖昆虫病原线虫，配置成10000Ijs每株幼苗的线虫悬浮液，灌根于幼苗根部，在施用后蚊蝇幼虫致死率100%，大型地下害虫蛴螬、蝼蛄等的致死率达到50%以上，具有无毒绿色和一次施用长效保持的作用效果，并且由于其具有主动搜索和再扩繁的能力，对于地下难于防治的害虫幼虫其具有其他药剂难于企及的作用效果，对于绿色、健康温室蔬菜的生产具有广阔的应用前景。

Description

一种嗜菌异小杆线虫在温室蔬菜地下害虫生防中的应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体的涉及利用一种新的昆虫病原线虫及其在蔬菜生防中应用的技术领域。

背景技术

昆虫病原线虫是一种专性寄生昆虫并且本身体内携带有共生细菌的体型微小的线虫，它消化道内携带有病原菌，这类线虫有一个可以脱离寄主营独立生活的侵染期阶段，当它从昆虫消化道或体壁侵入昆虫寄主体内后，共生菌从线虫体内释放出来，在昆虫血液内增殖，最终使寄主昆虫感染病原杆菌患败血症而死亡。目前世界上描述定名的这类线虫，主要是斯氏线虫科和异小杆线虫科的线虫。昆虫病原线虫生活史中有一个侵染期线虫阶段，称之为侵染期线虫，侵染期线虫不取食，独立于昆虫体外自由生活，线虫在潮湿环境中，借助水膜可蠕动寻找寄主昆虫，通过昆虫自然孔道、节间膜或表皮进人昆虫血腔，释放出携带的共生细菌，细菌在昆虫体内迅速增殖，产生活性物质杀死昆虫。线虫以虫尸为营善物质在其体内繁殖，直至形成新一代侵染期的线虫，离开寄主，寻找新的寄主昆虫。人们利用这一生物学特性，进行人工繁殖生产侵染期线虫，作为一种生物杀虫剂应用于生产中。利用昆虫病原线虫进行生物防治的应用研究开始于Glaser对寄生在日本丽金龟(Popilliajaponica)幼虫体内线虫的发现，随后Steiner将该线虫命名为Neoap lectana(Steinernema)glaseri，在此基础上1933年Oldham提出用于害虫防治。1996年EleanorR.L.等人采用Steinernema carpocapaae Weiser成功地应用于叶部虫害的防治。国外对于昆虫病原线虫的研究和应用都早于国内，并且在开发利用方面较国内先进许多，国内关于此方面的研究起步较晚，但经过多年的不断努力和实践，已在许多方面进行了开拓性的工作，并取得了快速的进步。目前，国内外已有许多利用昆虫病原线虫防治害虫成功的报道，如：杨怀文等用线虫制剂防治危害杨树的小蠢蛾Holcocerus insularis取得了突破性进展，刘奇志等在利用线虫制剂防治李实蜂hoplocampa fulvicornis panzer、桃红颈天牛Aormai bungii方面作了大量研究工作，目前己经研究出线虫制剂防治桃红颈天牛技术。潘洪玉等用线虫制剂Setinernema carpocapsae Agriotos品系防治东北大黑鳃金龟Holotrichia diomphalia、白星花金龟Potosia brevitarsis和向日葵螟Homoeosomaelectellum，发现线虫制剂是理想的生防因子。目前我国已经在昆虫病原线虫的实际应用方面取得了一些研究进展，但与国外相比仍存在许多不足：(1)国内尚无可用于产业化生产的昆虫病原线虫产品，有关这方面的研究成果太少；(2)病原线虫的应用面较窄，只在少数害虫的防治中应用成功；(3)防治方法和手段相对单一。昆虫病原线虫作为生物防治制剂具有化学农药无可比拟的优势，它不污染环境对人畜等脊椎动物安全，可与大多数化学农药混用它能主动寻找寄主能防治化学农药难以奏效的钻蛀性、隐蔽性害虫，线虫不会产生抗性，线虫一旦进人害虫体内，便可大量繁殖、提供新的侵染期线虫并寻找新的寄主，因此线虫比化学农药更容易控制害虫种群数量。在环境污染日趋严重的今天，无疑是害虫综合治理的需要，也是农业可持续发展的需要。而温室的小气候环境是害虫生活的理想条件，但也是昆虫病原线虫生物防治的理想条件，其适宜的温、湿度为采用生物防治提供了最适宣的环境。

近年来在政府引导、企业带动、种植户积极参与的情形下，新疆设施农业得到了迅猛发展，到2015年种植面积超过100万亩，在市场驱动和产业结构调整作用下种植规模仍在逐年增加，自治区规划到2020年全区设施农业面积发展到200万亩以上。随着产业结构的调整和市场需求的有力推动，设施作物种类已从反季节蔬菜种植扩展到了特色果树、特稀菜、花卉、西甜瓜珍贵药材以及设施养殖等各个方面。由于温室大棚与露地在生态环境、小气候方面有着显著的差异，也给病虫害的孳生繁衍提供了有利条件，大棚生态条件多为高温、多湿、封闭、复种指数和连茬种植的特点，很适合各种病虫害发生，致使病虫发生种类、数量都有明显增加，危害程度也日趋严重。主要温室常见的地下害虫有蝼蛄、蛴螬、金针虫、地老虎、韭蛆等，这些害虫还能传播多种真菌、细菌和病毒病，全生产周期、全年均有危害，且繁殖快、虫量大、抗药性强，对有些有机磷农药产生抗性，已成为生产上的难题，生理障碍发生频繁。其中蛴螬是国内外公认的难以防治的地下害虫，蛴螬是鞘翅目、金龟甲总科Scarabaeoidea幼虫的统称,是一类重要的世界性地下害虫、分布广泛，危害玉米、棉花、油料、蔬菜等多种植物。蛴螬在土中生活，取食各种作物的根、芽、地下茎和果实等，严重影响了作物的生长。蛴螬发生的种类很多，大部分属于混杂发生，由于蛴螬在地下为害，随着高毒农药的禁用，化学防治较难奏效，而且人们对高毒化学药剂使用的要求也越来越严格，不能使用高毒、高残留、有漂移污染的化学药剂,因而对蛴螬进行生物防治方面的探索越来越为人们所重视。

发明内容

针对现有技术中未见有关利用嗜菌异小杆线虫在温室蔬菜地下害虫生防中的应用技术现状，本发明旨在提供一种新嗜菌异小杆线虫在温室蔬菜地下害虫生防中的应用。本发明通过培养繁殖新种嗜菌异小杆线虫，并利用嗜菌异小杆线虫在温室蔬菜地下害虫生防中的应用，可显著杀灭温室地下害虫和明显提高出苗率、成活率等生长特性，在温室蔬菜地下害虫的生物防治技术领域具有广泛的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

本发明通过从新疆伊犁地区尼勒克山区牧场土壤中分离得到嗜菌异小杆线虫。采用新鲜的鸡内脏或去除鸡胗和胆，或采用羊、猪肝脏，加入20％w/v的水，10％-20％的植物油，在均质机中搅碎均质混匀，灭菌后作为培养基培养繁殖昆虫病原线虫，利用其侵染期线虫对地下害虫的主动搜索和高侵染力、致死率和再扩繁能力，配置成10000Ijs每株幼苗的线虫悬浮液，灌根于幼苗根部，并控制温室温度不超过30度在温室蔬菜地下害虫生防中的应用，在施用一周内蚊蝇幼虫致死率100％，大型地下害虫蛴螬、蝼蛄等的致死率达到50％以上，具有无毒，绿色和一次施用长效保持的作用效果，并且由于其具有主动搜索和再扩繁的能力，对于地下难于防治的害虫幼虫其具有其他药剂难于企及的作用效果，对于绿色、健康温室蔬菜的生产具有广阔的应用前景。

本发明具体提供一种利用嗜菌异小杆线虫在蔬菜生防中应用，具体步骤如下：

(1)采用新鲜的鸡内脏或去除鸡胗和胆，或采用羊、猪肝脏，加入20％w/v的水，10％-20％的植物油，在均质机中搅碎均质混匀，去除大颗粒后与1厘米见方的海绵按质量比1：8至1：10的比例均匀混合，后装瓶灭菌作为培养基培养繁殖嗜菌异小杆线虫。

(2)选用1.3L的组培聚丙烯耐高温组培瓶，装入量控制在1L，使海绵块有摇动的空间，后经121度30分钟高温蒸汽灭菌，灭菌完成后，待固体培养基温度降到40度以下时，把经过36小时培养准备好的一型共生菌悬液按每瓶3mL的量在无菌条件下接入培养瓶中，盖紧瓶盖后上下左右摇动数次，放置于避光25度条件下培养3天，期间每天上下左右摇动两次，后每瓶接入5000IJS/ml表面消毒的侵染期线虫5ML，放置于避光25度条件下培养2周；即可在瓶壁上看到白色的侵染期线虫-嗜菌异小杆线虫。

(3)取上述步骤增殖完成的培养瓶倒入上层有40目筛网下层密封水层没过筛网底部的收集盒中过夜收集，后多次沉淀清洗，直至在体视显微镜下90％以上为侵染期线虫，最终稀释为1000IJs/ml的嗜菌异小杆线虫悬浊液后按体积比1％加入福尔马林溶液，10-20度条件下密封保存制备嗜菌异小杆线虫喷洒液备用。

(4)将上述步骤制备的嗜菌异小杆线虫喷洒液在温室蔬菜地下害虫施用中，以育苗初期或定殖苗后按每株幼苗10000IJS的量灌根于幼苗根部，并且可与其他低毒或非刹线虫生物杀虫剂混合使用，在使用期间，除刹线虫制剂严禁使用外，其余杀菌杀虫制剂均可正常使用，但对温度尤其是温室土壤温度要控制在30度以下。

经过上述利用嗜菌异小杆线虫在蔬菜生防中应用表明，嗜菌异小杆线虫对温室蚊蝇幼虫的致死率一周内达到100％,对大型地下害虫蛴螬、蝼蛄等的致死率达到50％以上，并且显著提高蔬菜幼苗成活率及壮苗率，并且降低了后期果实的病果率。

通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：

采用新分离新的嗜菌异小杆线虫在蔬菜生防中应用，通过采用新鲜动物内脏、水和植物油按一定比例复合均质灭菌后作为培养基，经培养繁殖，利用其侵染期线虫对地下害虫的主动搜索和高侵染力、致死率和再扩繁能力，在温室蔬菜地下害虫生防中的应用，具有具有施用一周内蚊蝇幼虫致死率100％，大型地下害虫蛴螬、蝼蛄等的致死率达到50％以上，具有无毒，绿色和一次施用长效保持的作用效果，并且由于其具有主动搜索和再生产的能力，对于地下难于防治的害虫幼虫其具有其他药剂难于起效的作用效果，对于绿色、健康温室蔬菜的生产具有广阔的应用前景。

附图说明

图1嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditis bacteriophora Nileke)ITS序列进化树图。

图2所示为嗜菌异小杆线虫培养固体增值培养图。

图3所示为嗜菌异小杆线虫固体增值培养显微观察及统计图。

图4所示为嗜菌异小杆线虫不同浓度对蛴螬的致死作用图。

图5所示为嗜菌异小杆线虫对蛴螬的致死情况图。

图6所示为嗜菌异小杆线虫对蛴螬的侵染图。

具体实施方式

下面，参见幅附图1至附图6，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明选用的“一型共生菌”即为本领域熟知并公知的与各种昆虫病原线虫共生菌相伴的常见菌种，也为各种常见的与各种昆虫病原线虫共生的菌种。

本发明中选用的新的嗜菌异小杆线虫编号为Hb-NLK。

实施例一：

利用嗜菌异小杆线虫在蔬菜生防中应用具体步骤如下：

(1)采用新鲜的鸡内脏或去除鸡胗和胆，或采用羊、猪肝脏，加入20％w/v的水，10％-20％的植物油，在均质机中搅碎均质混匀，去除大颗粒后与1厘米见方的海绵按质量比1：8至1：10的比例均匀混合，后装瓶灭菌作为培养基培养繁殖嗜菌异小杆线虫。

(2)选用1.3L的组培聚丙烯耐高温组培瓶，装入量控制在1L，使海绵块有摇动的空间，后经121度30分钟高温蒸汽灭菌，灭菌完成后，待固体培养基温度降到40度以下时，把经过36小时培养准备好的一型共生菌悬液按每瓶3mL的量在无菌条件下接入培养瓶中，盖紧瓶盖后上下左右摇动数次，放置于避光20-26度条件下培养3天，期间每天上下左右摇动两次，后每瓶接入5000IJS/ml表面消毒的侵染期线虫5ML，放置于避光25度条件下培养2周；即可在瓶壁上看到白色的侵染期线虫-嗜菌异小杆线虫。

(3)取上述步骤增殖完成的培养瓶倒入上层有40目筛网下层密封水层没过筛网底部的收集盒中过夜收集，后多次沉淀清洗，直至在体视显微镜下90％以上为侵染期线虫，最终稀释为1000IJs/ml的嗜菌异小杆线虫悬浊液后按体积比1％加入福尔马林溶液，10-20度条件下密封保存制备嗜菌异小杆线虫喷洒液备用。

(4)将上述步骤制备的嗜菌异小杆线虫喷洒液在温室蔬菜地下害虫施用中，以育苗初期或定殖苗后按每株幼苗10000IJS的量灌根于幼苗根部，并且可与其他低毒或非刹线虫生物杀虫剂混合使用，在使用期间，除刹线虫制剂严禁使用外，其余杀菌杀虫制剂均可正常使用，但对温度尤其是温室土壤温度要控制在30度以下。

实施例二：嗜菌异小杆线虫分离、鉴定及毒力测定

用昆虫病原线虫侵染期线虫侵染黄粉虫幼虫，待黄粉虫死亡后，分离其共生菌。在无菌操作台用75％的酒精对黄粉虫表面及镊子、剪刀等进行消毒，随后用镊子将黄粉虫的头和尾夹起，露出腹部，用剪刀剪去其中一只腹足，将其体内流出的含共生细菌的体液直接滴到NBTA鉴别培养基上，用灭过菌的涂布棒进行均匀涂布，接种后，置于30℃培养箱中培养。48h左右平板上出现单菌落，将初生型菌(能吸附蓝色，且周围有透明圈)分别挑出，纯化。

嗜菌异小杆线虫总基因组的提取以及18S rDNA扩增鉴定

嗜菌异小杆线虫总DNA提取：吸取少量的侵染期幼虫装入离心管，用0.1％的硫柳汞钠溶液消毒30min后，1000rpm/min离心，反复用无菌水清洗沉淀3-5次，清洗后加入蛋白酶K使其终浓度达到60μg/mL，后迅速将离心管放在液氮中3-5min，然后转入65℃下温育5min，重复2-3次后，在95℃下温育10min，使蛋白酶失活。取出后于1200rpm/min高速离心2min，取其上清液用于PCR扩增，部分于-20℃冷冻保存备用。上游引物p1：5’-TTGAT TACGTCCCTG CCCTT T-3’，下游引物p2：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’，PCR扩增反应体系为50μL，含有24μL premix Taq，引物p1 1μL，引物p2 1μL，模板2μL，无菌水22μL。扩增条件：94℃，4min；94℃，1min；55℃，90sec；72℃，2min；30X；72℃，10min；

序列测定及进化树构建分析

PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离测定，PCR产物直接进行双向测序，引物合成及序列测定交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。将测序得到的18S r DNA和16S rRNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，对待鉴定的线虫18SrRNA序列比对，与已知的相似同源序列进行系统发育学分析，参见附图1可以看出，待鉴定的线虫与Heterorhabditisbacteriophora进化距离较近，处于同一个进化分支上，根据分子生物学的初步鉴定结果，可将待鉴定线虫暂定为嗜菌异小杆线虫尼勒克品系Heterorhabditis bacteriophora strain Nileke参见附图1。

实施例三：嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫和果蝇幼虫的致病力

1.嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫和果蝇幼虫的致死率测定

取黄粉虫幼虫和果蝇幼虫分别放置于一个小培养皿中，培养皿内铺两层滤纸，加入1mL清水，每皿10头。将嗜菌异小杆线虫和对照的H.megidis(国外引进用于防治蛴螬的线虫品系)的侵染期幼虫用灭菌水稀释成100IJs/mL，分别取1mL加入到培养皿内，每个浓度共设3个重复，同时设只加清水的无菌水处理为对照。各处理分别置于25℃培养条件下培养，每隔24h检查死亡数。

2.不同侵染剂量的嗜菌异小杆线虫对黄粉虫的致病力

取黄粉虫幼虫于一个小培养皿中，培养皿内铺两层滤纸，加入1mL清水，每皿10头。将嗜菌异小杆线虫的侵染期幼虫用灭菌水稀释成10IJs/mL、30IJs/mL、50IJs/mL、80IJs/m、100IJs/mL、150IJs/mL、200IJs/mL、250IJs/mL、300IJs/mL、400IJs/mL等10个浓度梯度，混匀后分别取1mL加入到培养皿内，每个浓度共设3个重复，同时设只加清水的无菌水处理为对照。各处理分别置于25℃培养条件下培养，每隔12h检查黄粉虫死亡数。

3.不同温度条件下嗜菌异小杆线虫对黄粉虫的致病力

取黄粉虫幼虫于一个小培养皿中，培养皿内铺两层滤纸，加入1mL清水，每皿10头，每皿每条黄粉虫接种线虫100条，试验温度分别设10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等7个梯度，每个处理共设3个重复，同时设只加清水的灭菌水处理为对照。各处理分别置于相应温度培养箱内培养，并于处理后每隔12h检查黄粉虫死亡数。

表1：嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫的致病力

表2：嗜菌异小杆线虫对果蝇的致病力

嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫和果蝇幼虫的侵染力结果见表1和表2，可以看出，随着线虫侵染寄主时间延长，嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫和果蝇幼虫在96h和108h，死亡率分别为89.3％和为92.6％，显著高于H.megidis。

4.不同温度条件下嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫的致病力

表3：不同侵染剂量的嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫的致病力

表4：不同温度条件下嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫的致病力

在25℃下，测定了嗜菌异小杆线虫的10个不同剂量对黄粉虫末龄幼虫的致病力(见表3)。结果显示，嗜菌异小杆线虫对黄粉虫幼虫具有很高的侵染力，所有线虫剂量，黄粉虫幼虫死亡率随供试线虫剂量的增大而增高，其中以250IJs/mL时的时效性最好，60h时黄粉虫幼虫的死亡率为100％；其次为400IJs/mL，黄粉虫幼虫死亡率在72h时达到100％。在不同温度条件下，以每皿100条(IJs)/头黄粉虫幼虫的剂量感染黄粉虫幼虫，由表4可知，20℃～30℃为该嗜菌异小杆线虫侵染黄粉虫末龄幼虫的最佳的温度范围。

实施例四：嗜菌异小杆线虫固体小试培养及对蛴螬的致死率测定

1.固体发酵培养基

采用新鲜的鸡内脏或(去除鸡胗和胆)或羊、猪肝脏，加入20％w/v的水，10％-20％的植物油，在均质机中搅碎均质混匀，去除大颗粒后与1厘米见方的海绵按质量比1比8-10的比例均匀混合，后装瓶灭菌作为培养基培养繁殖昆虫病原线虫。

2.共生菌的培养及接种

将共生菌挑取接种在液体NBTA培养基中，25度条件下培养2到3天，转速120到200之间，后取0.5ml的培养液接种到固体发酵料中，在25度条件下培养3天，期间每天来回颠倒晃动瓶子两次，使得每块海绵都能有共生菌充分的生长。

3.线虫的准备及接种

把收集到的线虫倒入三角瓶中，用0.1％的sodiumhypochlorite(次氯酸钠)漂洗3次，每次15分钟，最后用无菌水多次反复冲洗。在共生菌培养三天后，接入线虫，接种量为个每5000IJS/ml表面消毒的侵染期线虫5ML，放置在23到24度条件下，培养2周左右，即可在瓶壁上看到白色的侵染期线虫。

4.嗜菌异小杆线虫对蛴螬的致死率测定

从多年种植蔬菜的温室大棚土壤中采集蛴螬，并连同温室土壤一并采集，剔除弱小和死去的蛴螬。试验用带有气孔的50ML塑料培养管，每个管中放一头害虫，并加入培养管体积约三分之二的温室土壤。嗜菌异小杆线虫和H.meigidis设定两个个梯度：5000IJS/管,10000IJS/管；每个处理分四组，每组30个重复；对照加相同数量的蒸馏水。每隔一天检查和统计蛴螬的死亡和侵染情况，周期为一个月时间；

5.试验结果

嗜菌异小杆线虫固体发酵培养：固体培养嗜菌异小杆线虫，最终计数结果为每瓶约400-1000万条侵染期线虫。

嗜菌异小杆线虫对蛴螬的致死率：通过嗜菌异小杆线虫对蛴螬的实验室生物防治，结果表明：嗜菌异小杆线虫在5000、10000IJS浓度下杀虫效率均高于H.megidis，在10000IJS施用条件下，嗜菌异小杆线虫对蛴螬的致死率在第10天的时候就达到50％以上，显示出在此类害虫防治中嗜菌异小杆线虫具有较高的杀虫及应用潜力；

6.温室番茄和辣椒应用试验

在温室蔬菜地下害虫施用中，以育苗初期或定殖苗后按每株幼苗10000IJS的量灌根于幼苗根部，实验组和对照组均为一个标准温室，出苗或定殖后均按照日光温室常规管理，但对温度尤其是温室土壤温度要控制在30度以下，施用一周后统计其幼苗成活率，到第45天每组各随机取样100株检测，通过测量其生长指标，计算壮苗指数等。

表5：不同蔬菜苗成活率统计

成活率分析表明昆虫病原线虫处理后，辣椒和番茄苗的成活率均高于对照组10％以上，见表5，说明施用嗜菌异小杆线虫后能够增加蔬菜幼苗的成活率。

表6：不同蔬菜苗壮苗指数统计

注：壮苗指数＝(茎粗/株高+地下部干重/地上部干重)*全株干重

通过壮苗指数分析来看，见表6，在施用了嗜菌异小杆线虫后，番茄和辣椒的壮苗指数均较大幅度高于对照组，说明嗜菌异小杆线虫对地下害虫的控制和杀灭，间接的提高了幼苗根部的生态环境和促进根系健康发展。

结论：在温室蔬菜地下害虫施用中，以育苗初期或定殖苗后按每株幼苗10000IJS的量灌根于幼苗根部，并且可与其他低毒或非刹线虫生物杀虫剂混合使用，在使用期间，除刹线虫制剂严禁使用外，其余杀菌杀虫制剂均可正常使用，应用表明，嗜菌异小杆线虫对温室蚊蝇幼虫的致死率一周内达到100％,对大型地下害虫蛴螬、蝼蛄等的致死率达到50％以上，并且显著提高蔬菜幼苗成活率及壮苗率，并且降低了后期果实的病果率。

经过上述系列实施例利用嗜菌异小杆线虫在蔬菜生防中应用，在温室蔬菜地下害虫生防中的应用，具有施用一周内蚊蝇幼虫致死率100％，大型地下害虫蛴螬、蝼蛄等的致死率达到50％以上。温室蔬菜幼苗成活率达到95％以上，且幼苗健壮，高于对照10％以上，在整个生长及成熟期，蔬菜病害率及果实病害率较对照降低20％以上，并且品质显著提高，可见，利用本发明提供的嗜菌异小杆线虫开发应用具有非常大的应用前景，在蔬菜生防中应用具有良好杀灭地下害虫和预防病害发生的作用，也可在种植期间多次喷施，同样具有一定的杀虫防病的效果，对于降低温室土壤中害虫的数量、减少以害虫为媒介传播的病害具有积极作用，并且施用方法简单多样，应用管理简便易行，能够兼顾环境友好和蔬菜品质提升。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (1)

1.一种利用嗜菌异小杆线虫尼勒克品系(Heterorhabditis bacteri-ophorastrainNileke)在蔬菜生防中的应用，其特征在于，具体应用步骤如下：

(1)采用新鲜的鸡内脏或去除鸡胗和胆，或采用羊、猪肝脏，加入20％w/v的水，10％-20％的植物油，在均质机中搅碎均质混匀，去除大颗粒后与1厘米见方的海绵按质量比1：8至1：10的比例均匀混合，然后装瓶灭菌作为培养基培养繁殖嗜菌异小杆线虫；

(2)选用1.3L的组培聚丙烯耐高温组培瓶，装入量控制在1L，使海绵块有摇动的空间，然后经121度30分钟高温蒸汽灭菌，灭菌完成后，待固体培养基温度降到40℃以下时，把经过36小时培养准备好的一型共生菌悬液按每瓶3mL的量在无菌条件下接入培养瓶中，盖紧瓶盖后上下左右摇动数次，放置于避光20-26℃条件下培养3天，期间每天上下左右摇动两次，然后每瓶接入5000IJS/ml表面消毒的侵染期线虫5ML，放置于避光25℃条件下培养2周；即可在瓶壁上看到白色的侵染期线虫-嗜菌异小杆线虫；

(3)取上述步骤增殖完成的培养瓶中所有内容物倒入上层有40目筛网下层密封水层没过筛网底部的收集盒中过夜收集后，多次沉淀清洗，直至在体视显微镜下90％以上为侵染期线虫，最终稀释为1000IJs/ml的嗜菌异小杆线虫悬浊液后按体积比1％加入福尔马林溶液，10-20℃条件下密封保存制备嗜菌异小杆线虫喷洒液备用；

(4)将上述步骤制备的嗜菌异小杆线虫喷洒液施用在温室蔬菜地下害虫防治中，以育苗初期或定殖苗后按每株幼苗10000IJS的量灌根于幼苗根部，并且可与非刹线虫生物杀虫剂混合使用，在使用期间，除刹线虫制剂严禁使用外，其余杀菌杀虫制剂均可正常使用，但对温室土壤温度要控制在30℃以下。

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