JPH06509091A - 軟体動物の生物的防除 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 軟体動物の生物的防除 本発明は、農業および園芸上の有害生物（ｐｅｓｔ）の防除、更に詳細には、ナ メクジ、例えばＤｅｒｏｃｅｒａｓｒｅｔｌｃｕｌａｔｕｌ　、およびカタツム リ（ｓｎａｉｌ）　、例えばＭＯｎａＣｈａ　ｃａｎｔ＋ａｎａなどの軟体動物 の防除に関する。便宜上、本発明を主にナメクジの防除に関して記載するが、本 発明は田畑または温室の植物に有害な、またはヒトまたは動物に有害な寄生虫を 運搬する他の軟体動物の防除にも適用可能であると理解すべきである。

ナメクジは、英国、他の欧州諸国、北および中央アメリカ、および南洋用におけ る幾つかの主要農作物、特に秋まき小麦、脂肪種子（ｏｉｌ　５ｅｅｄ）セイヨ ウアブラナやジャガイモに広く見られる有害生物である。これらは、園芸におい ても、家庭園芸家にとっても問題である。経済的に重大な影響を与えるナメクジ の種は、グレイφフィールドＱスラッグ（ｇｒｅｙ　ｆｉｅｌｄ　ｓｌｕｇ）　 、Ｄｅｒｏｃｅｒａｓｒｅｔｌｃｕｌａｔｕｓ　（Ｌｌｍａｃｌｄａｅ　（コウ ラナメクジ）科）であおよびＢｏｅｔｉｇｅｒｉｌｌａ種もまた重大な損害を引 き起こすことがある。カタツムリも、園芸や農業の有害生物の問題となることが あり、その−例として、Ｍｏｎａｃｈａ動物の例は、Ｇｏｄａｎ著の「有害生物 ナメクジおよびカタツムリＪ　（１９８３年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａ ｇ社、ベルリン）に挙げられている。軟体動物は、ヒトまたは動物の健康に害を 及はす有害生物を運搬することもある。例えば、挙げられる。Ｌｌｓａｃｌｄａ ｅ　、　Ａｒ１ｏｎｉｄａｅ　、旧１ａｃｉｄａｅおよびＨｅ１ｌｃｌｄａｅ科 は、柄眼目に属する。　ＢｕｌｌｎｉｄａｅおよびＬｙｓｎａｅｌｄａｅ科は、 基眼目に属する。

現在用いられている防除法は部分的にしか効果がなく、利用可能な化学薬品は鳥 および咽乳動物に対して非常に毒性が高い。従って、一層効果的で、持続性が高 くかつ毒性が低い軟体動物の防除法が必要であるのは明らかで対する効果的な防 除薬剤であることを見出した。特に効については以下に更に説明する。これらの 種は、かなり以前から知られて、文献に記載されており、特にＡｎｄｒａｓｓｙ 著のｒ　Ｒｈａｂｄｌｔｌｎａ亜目（ＮｅｔＩａｔｏｄａ　：５ｅｃｅｒｎｅｎ ｔ　ｉ　ｎａ）の分類学的概説Ｊ　（１９８３年、０ｒｓｔｏｓ、パリ）中で具 体的に特性決定されている。しかしながら、ナメクジおよび他の有害生物軟体動 物に対するこれらの生物の生物学的活性は、これまで認識されていなかった。

それ故、本発明は、農業および園芸上の有害生物、あるいはヒトおよび動物の健 康上の有害生物、特に軟体動物の防除のためのＰｈａｓｓｏｒｈａｂｄｌｔ１ｓ 種の使用を含むものである。この生物は陸生のナメクジから得ることができ、下 記の方法によって培養して田畑または温室に適用するのに好適な組成物を処方す るのに充分な量を生産することができる。実際の使用のための典型的な組成物は 、泥炭、粘土および他の固形または半固形担体、例えばゲル材料などの許容可能 な担体材料を利用する。屋外でのマイクロプロット（■１ｅｒｏｐｌｏｔ）およ び野外試験によって、線虫はナメクジを殺すと共に、現在利用可能な最良の化学 薬品であるメチオカルブと少なくとも同様、あるいはそれより良好に、白菜の苗 木および小麦の種または苗木をナメクジの被害から予防することがわかった。

この生物の生物学 線虫は、英国のＬｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔ１ｏｎで 採集したナメクジから単離した。線虫が、特有の症状、最も顕著にはナメクジの 外套膜の腫張を有するナメクジの致命的疾患と関係していることがわかった。こ の線虫は、Ｒｈａｂｄｊｔｉｎａ亜目に属するものとして同定し、更に検索表を 用いて同定した（Ａｎｄｒａｓｓｙ、　１９８３年）。この群の主な分類学的特 性は、その口器および雄性の生殖構造である。Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎで単離し た線虫は、同形の口後節（ｍｅｔａｓｔｏ■）を伴う特有の短い口を有し、また 雄性が存在した場合、それはＰｈａｓ曽０ｒｈａｂｄｉｔｌＳ属と一致するベロ プラン嚢（ｐｅｌｏｄｅｒａｎ　ｂｕｒｓａｓ）を有していたｏＡｌｄｒａｓｓ ｙ（１９８３年）は、これらの線虫と形態上は同じであるが、個体群中に存在す る雄性の数が互いに異なる２種を挙げている。Ｐｈａｓｉｏｒｈａｂｄｌｔｌｓ 　ｎｅｏｐａｐｊｌｌｏｓａでは、雄性と雌性は同数だけ存在するが、Ｐ、　ｈ ｅｒｍａｐｈｒｏ旧【ａでは、雄性は非常に希少である。Ｐ、　ｈｅｒｓａｐｈ ｒｏｄｌｔａがＰ、　ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａと異なる種であるのか、または その単なる生物学的変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であるかは、未だに明らかになっ ていない（Ａｎｄｒａｓｓｙ、　１９８３年）。

Ｐ、　ｈｅｒｖａｐｈｒｏｄｉｔａについては、Ｍａｕｐａｓ著のＡｒｃｈｉｖ ｅｓ　ｄｅＺｏｏｌｏｇｉｅ　（１９００年）、第８巻、４６４〜６２４頁に初 めて記載が見られ、その線虫はＲｈａｂｄｌｔｉｓた。彼は、２年間、腐敗した 肉で線虫の培養を続けた。

彼は、成虫が主に雄性完熟の自家生殖性雌雄同体であることを見出した。雄性の 数は非常に少なく　（雌性１３００につき雄性１）、培養物中の雄性数は栄養状 態に左右されなかった。Ｍａｕｐａｓは、雄性が雌性と交尾するのを目にしたこ とがなく、これによって雄性の存在下での生殖力、あるいは子孫の性別比が変化 しないことがわかった。

Ｍａｕｐａｓは、この線虫がナメクジの寄生虫であるとは考えＭｅｎｇｅｒｔに よって報告されており、線虫と陸生軟体動物との関係についての研究で、Ｚｅｌ ｔｓｃｈｒｉｆｔｆｕｒ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅ　ｕｎｄ　Ｏｋｏｌｏｇｌｅ 　Ｔｌｅｒｅ　（１９５３年）、第４１巻、３１１〜３４９頁で、この線虫をＲ ｈａｂｄｉｔｌｓｎｅｏｐａｐｉ　Ｉ　１ｏｓａと命名した。彼は、ナメクジの Ｌｌｍａｘｃｊｎｅｒｅｏｎｉｇｅｒの後場に耐性幼虫期（「耐久型幼虫（ｄａ ｕｅｒｌａｒｖａｅ）Ｊ　）の線虫、を見出した。ＭｅｎｇｅｒｔはＰ、　ｎｅ ｏｐａｐｉｌｌｏｓａを、何世代にもわたって材料を腐敗させることによって繁 殖する腐生植物であり、好ましくない条件になると、幼若体は成熟できず、摂食 を必要としない耐性の耐久型幼虫を形成すると考えた。彼は、と同じものである と考えた。彼は、これら３種の耐久型幼虫は、機会があれば、ナメクジの体内に 入り込み、ナメクジが死ぬまで耐久型幼虫のままでそこに定着し、その後、その 死体を摂食して成長して、繁殖すると考えた。

Ｍｅｎｇｅｒｔは、ナメクジ体内で生活することは線虫の生活環において必要な 部分ではないが、これらの種の耐久型幼虫は、ナメクジ体内での生活にある程度 の適応を示したと考えた。しかしながら、彼は、それらはナメクジの寄生虫では ないと述べた。

線虫は、ふすまを餌として付け、自然の草原地域に備え付けた罠を用いて野外で 採集したナメクジから単離することができる。採集後、解剖したナメクジの腸（ ｇｕｔ）または外套膜の腔から線虫を単離することができる。多くの種の線虫が ナメクジに関連したものであり（Ｍｅｎｇｅｒｔ、１９５３年）　、Ｐ、　ｈｅ ｒｍａｐｈｒｏｄＨａおよびＰ、　ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａを分類学的検索表 を用いて確実に同定する必要がある（Ａｎｄｒａｓｓａｙ　、　１９８３年）。

ナメクジにおいて感染期線虫（耐久型幼虫）のみが得られるときには、線虫を培 養してそれらを同定することが必要である。

Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎては、Ｐｈａｓｓａｒｈａｂｄｉｔｌｓ線虫を何度も単 離してきた。いくつかの場合には、線虫の個体群は雄性および雌性から成ってい たが、他の場合には、個体群は雌雄同体のみて構成された。両タイプの個体群の 線虫を、光学顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法を用いて検討した。等重点電気 泳動を用いてタンパク質の分離を行った後、異なる個体群のタンパク質プロフィ ールも検査した。

前記の方法のいづれを用いても、個体群間の差は認められなかった。単離した線 虫は、Ｐ、　ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａおよびＰ、　ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉｔ ａ両方の参照可能な記載内容に一致する。

より得ることができる。当該技術では既に周知のことだが、昆虫寄生性線虫は、 撹拌タンクまたはエアリフト発酵槽を用いる液体培養、あるいはフオームチップ （ｆｏａ−ｃｈｉｐ）のバッグまたはトレー中での固体培養によって、商業上の 使用を目的として大規模に生産することが可能である。同様の技術を用いて、Ｐ 、　ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉｔａまたはＰ、　ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａを大規 模生産することができる。従って、本発明により用いられる線虫は、昆虫寄生性 線虫の生産に使用したものと同様の技術を用いて、フオームチップ中の腎臓基剤 培地上でまたは液体培養で容易に培養される。本発明の目的には、線虫の培養物 は、耐久型幼虫の段階で採集を行うことが望ましい。

関連細菌の必要条件 Ｐｈａｓｍｏｒｈａｂｄｌｔｌｓ線虫は、細菌のフィーダである。多数の細菌の 分離物が、瀕死のナメクジから単離した後のＰｈａｓｍｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線 虫に付随して見出されている。線虫とこれらの関連した細菌との関係を検討し、 どの細菌が線虫の良好な成長を支持することができるかを調べ、様々な種の細菌 について培養した線虫の病原性を比較した。

軟体動物の病原となるＰｈａｓｍｏｒｈａｂｄ　Ｉ　ｔ　Ｉｓ線虫を一貫して多 量に産生ずるためには、既知の１種類の関連細菌を含む培養中で成長させること （モノゼニツク培養（ｗｏｎｏｘｅｎｊｃ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）’）が好ましく 、従って、線虫の成長を維持することができる個々の細菌種を選択する方法が必 要となる。線虫の成長を維持することができる細菌は、線虫体内から、混合微生 物固体群で成長する線虫の培養物、細菌に感染したナメクジから、および線虫が 寄生しているナメクジの死体から単離することができる。

その後、線虫を混在している総ての細菌から分離し、それぞれ異なる種の細菌を 含有する培養物に導入することができる。これらの培養物を培養することによっ て、線虫の成長を維持することができる細菌の分離物を選択することができる。

約１００個の細菌性分離物が、線虫、線虫に感染したナメクジ、および線虫が寄 生したナメクジの死体から得られ、そのうちの１５個を、線虫の成長を維持する 能力について試験を行った。このうち、８種に属する９個の分離物が、寒天」二 で良好な線虫の成長を維持すること力（わかった。良好な線虫の成長を維持する ことが明らかになった８種の細菌は、以下のものである。

Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ 様々な種の細菌によって成長した線虫のナメクジを殺生する能力は、生物検定法 を用いて試験することができる。このような生物検定法では、ナメクジを様々な 数の線虫に暴露し、その結果としてのナメクジの死亡率を記録するのである。こ の方法を用いることによって、ナメクジに対する線虫の病原性の定量値（例えば 、ＬＤ５ｏ）が得られ、これらを用いて様々な種の細菌について培養した線虫の 病原性を比較した。線虫を特異的な細菌と共に供給するのが重要であるが、これ は細菌が線虫の成長（イン・ビトロおよびイン・ビボの両方）のみならず、その ナメクジを殺生する能力にも必須であるからである。

線虫はナメクジの体内に入る時、付随する細菌を運ぶため、線虫が速やかに定着 し、繁殖して、ナメクジを死に至らしめることができるのである。

好適な細菌株の例は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｐｈｅｎ、ｙｌｐｙｒｕｖｉｃａ４ ８株およびＰｓｅｕｄｏ＊ｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　１４１株であり 、その試料はブダペスト条約に基づき、１９９２年６月９日にそれぞれ受託番号 ＮＣＩＭＢ　４０５０１＋号およびＭＣＩ　ＭＢ４０５０９号でＮａｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄｒｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｓ　１４１株は、グラム陰性のオキシダーゼ陽性で、カタラーゼ陽性の 細菌であり、非運動性であり、グルコースの好気性あるいは嫌気性の分解を判定 するＯ／Ｆ　（ＨｕｇｈおよびＬｅｉｒｓｏｎ）試験では陰性を示すものである 。

Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａ　４８株は、グラム陰性で 、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性の細菌であって、非運動性であり、Ｏ／　 Ｆ　（ＨｕｇｈおよびＬｅＩｆｓｏｎ　）試験では陰性を示す。標準基″ｉ　（ ＡＰＩ　ＺＯＮＥ試験ス試験スラリ）についての両菌株の生化学プロフィールを 以下に示す。

＊住所：２３番街、Ｍａｃｈａｒ　Ｄｒｉｖｅ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　ＡＢ２ １ＲＹ、英国。

グルコースからの酸　− アルギニンジヒドロラーゼ　−　＋ ウレアーゼ　− エスクリン加水分解　− ゼラチン加水分解　十 β−ガラクトシダーゼ　− 同化作用ニ ゲルコース　＋ アラビノース　” マンノース　士 Ｎ−アセチルグルコサミン　−　士 ＊−試験せず。

Ｍ　、　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｅａ　４８株およびＰ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｓ　１４１株の有用な変異体は、これらの株の純粋培養物を繰り返し継代培 養することによって得ることができる。変異体は、予め細菌株のいずれかの存在 下で成長させたＰｈａｓｍｏｒｈａｂｄｌｔｌｓ線虫から細菌を再単離すること により、あるいは線虫により感染したナメクジから細菌を再単離することにより 得ることもできる。このような変異体は、環境の影響あるいは選択圧の結果とし て、遺伝子型あるいは表現型の変化を起こすことがある。

Ｍ、　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａ　４８株およびＰ、　ｒｌｕｏｒｅｓｃ’ ｅｎｓ　１４１株の有用な誘導体は、他の生物からの望ましい属性をコードする ＤＮＡを導入することによって構築することができる。細菌への外来ＤＮＡの導 入方法は当業者にはよく知られており、プラスミド転移、形質導入およびトラン スフェクションなどの技術が挙げられる。

Ｍ　、　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｌｃａ　４ｇ株およびＰ、　Ｎｕｏｒｅｓｃｅ ｎｓ　１４１株の有用な突然変異体は、例えば化学的（例えばニトロソグアニジ ン）、物理的（紫外線）および遺伝学的（トランスポゾン突然変異誘発）技術の ような当業者には周知の方法を用いる突然変異誘発によって得ることができる。

このような株の変異体、誘導体および突然変異体は、特性、例えば成長速度また は特定の食物源についての成長能力に関して変化する場合もあるが、本発明に関 する本質的特性、すなわちＰｈａｓ■ｏｒｈａｂｄｉｔｌｓ線虫の成長を維持す る能力および軟体動物に対する病原性を誘発する能力はいずれも保持される。

農業上の有害生物の防除に使用するには、線虫は、遠心分離、ろ過または重力下 での沈降によって発酵槽から収集する。この線虫を洗浄して消費した培地の成分 を除去し、すぐに処方するかまたは冷却して曝気した水性懸濁液として保存した 後処方する。線虫は、農業での利用のために、木炭、粘土、泥炭、ヒル石または ポリエーテル−ポリウレタンスポンジのような固形担体上の水性懸濁液として処 方するか、またはアルギネートまたはポリアクリルアミドのようなゲルにカプセ ル封入することができる。特に望ましい処方物は、乾燥したまたは部分的に乾燥 した線虫を含有している。処方した線虫は、水性懸濁液を形成し、これをスプレ ー、潅注または浸液により、処理を行う領域に適用することによって、有害生物 の防除に利用することができる。

例Ｉ　ＰｈａｓｔａｏｒｈａｂｄｌｔＩｓ線虫の単離方法ふすまを餌としてつけ た罠を用いて野外で採集したナメクジから取り出した生きた線虫を、１０％ホモ ジナイズしたブタ腎、３．５％トウモロコシ油、２％寒天および８４．５％水（ 重量％）を混合することによって作成した腎臓を基剤とする寒天培地を、次にオ ートクレーブ処理によって殺菌してペトリ皿に入れたものの上に置く。

この培地は、線虫に付随する細菌の成長を促進する。線虫はこれらの細菌を常食 にし、プレート上で成長および繁殖する。

例２　線虫または線虫が感染したナメクジに関連する細菌の単離 線虫または線虫が感染したナメクジに関連する細菌を、下記の方法のいずれかに よって単離することができる。

（ｉ）　線虫体内からの細菌の単離 線虫を、０．１％（重量／容量）エチル水銀チオサリチレートナトリウム（チメ ロサール）中に１時間浸漬した後、新たに調製したチメロサールへ移して更に３ 時間浸して表面殺菌する。細菌は、下記の２つの方法による無菌微生物学的手法 のいずれかを用いて線虫から取り出すごとができる。

ａ）　各線虫の幼虫を、火炎滅菌した顕微鏡スライド上の滅菌食塩水１，１ｌｉ ｌｉへ移す。次いで、線虫を体長に沿って幾つかの部位に切断する。次に、線虫 の死体を含む食塩水の液滴を、滅菌したパスツールピペットを用いて寒天培地の 入った９ｃｍのベトリ皿へ移し、アルコール火炎処理したガラススプレッダ−を 使ってその表面に塗布する。

ｂ）　表面滅菌した多数の線虫を、無菌リンゲル液１１に懸濁し、５１テフロン 製組織ホモジナイザーへ移す。

線虫懸濁液を摩砕し、次いて無菌の栄養ブロス９１中に移す。ブロスを激しく振 盪し、連続希釈を行う。各希釈物０，１１を普通寒天培地のプレート上に置き、 ガラススプレッダ−を用いて塗布し、培養する。２５℃で４８時間培培養た後、 様々な細菌の単離物をコロニーの形態に基づいて選択し、標準的な微生物学的手 法を用いて継代培養する。

（ｉｉ）　ゼニノクフォームチップ（ｘｅｎｉＣｆｏａｍ　ｃｈｉｐ）培養物か らの細菌の単離 線虫および細菌を含有するフオームチップを、成長しているゼニック培養物から アルコール火炎で処理したピンセットを用いて採取する。それぞれのチ・ツブを 、無菌栄養ブロス１０■１の入った管に入れ、撹拌する。生成する細菌／線虫懸 濁液の連続希釈物を作成し、様々な希釈物０．１１を普通寒天培地のプレートに 塗布し、培養する。

（ｊｉｉ）　線虫に感染している生きているナメクジからの細菌の単離 Ｐ、　ｈｅｒｎａｐｈｒｏｄｌｔａ／Ｐ、　ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａはナメク ジの外套膜の部分に感染し、繁殖するので、細菌を単離することができるのは、 この部分からである。最初に、外套膜を乾燥脱脂綿で拭き、可能な限り多くの粘 液を除去する。

次いで、外套膜の表面を７０％（容ｆｆｌ／容量）エタノールで拭いて外套膜を 表面殺菌する。火炎滅菌した固定針（ｍｏｕｎｔｅｄ　ｎｅｅｄｌｅ）を用いて 外套膜に穴をあけ、次に針の末端の流体の液滴を直接普通寒天培地プレートへ移 し、ガラススプレッダ−を用いて塗布し、培養する。

（Ｉｖ）　死亡したナメクジからの細菌の単離線虫に感染した後に死亡し、線虫 におおわれたナメクジの死体から採取した組織の塗抹を、細菌ループを用いて栄 養ブロスに懸濁する。この懸濁液から連続希釈物を作成し、０．１１づつを普通 寒天培地プレート上に塗布し、培養する。

例３　良好な線虫の成長を維持する細菌の選択方法線虫の成長を維持する能力に ついて種々の細菌をスクリーニングする前に、先ず細菌を含まない線虫を得る必 要がある。線虫の雌性生殖管は通常は無菌であり（ＰｏｉｎａｒおよびＨａｎｓ ｅｎ、　Ｈｅｌｗｉｎｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ。

シリーズＢ、１９８６年、第５５巻、３号、６１〜８１頁）、従って畔化直後の Ｊ１幼若体は無菌である。線虫の培養物あるいはナメクジから選択した卵を持っ た各成体線虫を、０．０２％（重量／容量）チメロサールを含有する無菌時計皿 に移し、１０℃で一晩放置する。この間、成体内で卵が町化し、幼若体（Ｊｌ） が放出される。

翌日、幼若体を、５００単位／１のペニシリンＧおよびストレプトマイシン硫酸 塩を含有する、４分の１強度のリンゲル溶液１０１を入れた遠心管にピペットで 移す。

幼若体を、更に２４時間１０℃でこの溶液中に保持する。

その後、それらをゆるやかな遠心分Ｍ（１０分間５０ＸＧ）にかけて濃縮し、管 の底から採取して、新たに調製し、た無菌の４分の１強度のリンゲル溶液中に再 び懸濁し、再度遠心分離した。再懸濁および遠心分離をもう一度繰り返し、抗生 物質を完全に除去する。次に、幼虫を無菌時計皿に置く。その後、滴下ピペット をブンゼンバーナーの火炎で約０．１ｍｍの幅に引き伸ばして作成したマイクロ ピペットを用いて、線虫を個々に処理する。線虫の培養物を、３ｃｍのベトリ皿 中の腎臓寒天（例１に記載したのと同じもの）上で生育させる。試験を行う細菌 を栄養ブロスで１８時間培養したものを１細菌用ル一プ分を、′う０■の腎臓プ レートの半分にすし状に塗布する。

例８に記載したのと同様の方法によって得た無菌の幼若体の線虫１０匹を、ベト リ皿の細菌を含まない半分のふちに入れて、線虫が試験細菌に到達する前に細菌 不含の表面を少なくとも１５ｍ５横切って移動しなければならないようにする。

プレートを、１５℃で培養する。無菌化の過程中に死亡しなかった線虫と共存す る細菌は総て、プレートの半分に視認可能なコロニーを形成するため、このプレ ートは廃棄してもよい。１週間後、「完全な」半分に細菌の混在を示すプレート は廃棄する。２週間後、プレート上に存在する線虫の数を、直接顕微鏡観察によ って計数することができる。この時、ベトリ皿の蓋を取り除き、予め計数用の格 子をつけた他の蓋と取り替える。

３週間後に、既知容量の水を注いで線虫を寒天から取り除き、懸濁液に存在する 線虫の数を１１ビータ−計算盤を用いて計数することによって、再度線虫の数を 数えることができる。

上記の方法を用いて採集した異なる９種の細菌を、線虫の成長を維持する能力に 基づいてスクリーニングした。

その結果を、第１表に示す。

第１表 種々の細菌を用いたモノゼニック培養によって２週問および３週間培養した後の 、ベトリ皿当たりのＰｈａｓｗｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫の数。データは対数に 変換して統計解析を行った。

細菌　２週日　３週目 数　対数　数　対数 無菌　２　０．４１　０　０．００ 細菌ＩＡ　Ｉ７０　２．１８　１８０９０　４．２２細菌＋７　０　０．０４　 ０　０．００細菌３４　１　０．１３　８９０　１．００細閑４８　８０　１． ７０　５４０８０　４．７３細菌５４　８０　１．５３　２５９５０　４．３９ 細菌７７　１１６０　３．０６　８６３４０　４．９３細菌８３　５２０　２． ４６　６７０００　４．７８細菌１４１　６９０　２．７７　７５２２０　４． ８５細菌１５６　２５０　２．２Ｂ　８３８３０　４．８９対数線虫数を比較す るためのＳ、Ｅ、Ｄ、　−０，２０４，１２８Ｄ、Ｐ。

３週間後、線虫の成長を維持する細菌の能力に関して、非常に有意な（Ｐ＜０． ００１）差異が認められた。

例４　フオームチップ培養によるＰｈａｓｗｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫の多量培 養方法 線虫は、昆虫寄生性線虫の多量飼育用に開発したもの（Ｂｅｄｄｉｎｇ　、　Ｎ ｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ　（１９８１）、ｖｏｌ　２７．１０９−１１４および ＾ｎｎａｌｓ　ｏｒＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８４）、ｖｏｌ　 １０４．１１７−１２０）と同様の技術を用いて、ポリエーテルウレタンフオー ムチップ上で大量培養することができる。培地は、６５％ブタ腎、１５％牛肉汁 および２５％水（重量％）から成っている。腎臓を細かく切って水を加え、次に その混合物をＷａｒｉｎｇブレンダーで「液化する」。ガスコンロ上の大きな平 鍋で牛肉汁を溶かした後、腎臓ホモジネートを加え、脂肪と充分に混合し、褐色 になるまで加熱する。その後、混合物をＷａｒｉｎｇブレンダーに戻し、再度摩 砕する。次に、この混合物をフオームチップと混合して、フオームチップ１重量 部に対して培地１２重量部を加えるようにする。この培地はＢｅｄｄｉｎｇ（１ ９８４）が記載したのと同様にして三角フラスコあるいはオートクレーブバッグ 中に分配することができる。フオームチップ培養物に、線虫および細菌を同時に 接種する。各バッグの上部を切り開き、−晩培養した細菌７５１を加える。細菌 培養は、例２に記載した方法を用いて得た混合微生物個体群の形態をとることが でき、または例３に記載した通り、良好な線虫の成長を維持する能力について選 択した細菌株の純培養物であることもできる。

ベトリ皿の寒天上または前記のバッグ培養物のフオームチップ上の線虫を加える 。培養バッグを１５℃で３週間培養すると、バッグ内部に、消費した培地から離 脱した多数の感染性幼若体が認められる。線虫を、土壌試料から線虫を採集する 際に用いたのと同様の漏斗抽出変法によってフオームチップから採取する。直径 １７　、５ｃｍの銅製土壌篩を１７．５ｃｍのミルクフィルターてライニングし 、５０ｃｌの植木ばち用量は皿の中に置く。バッグから取り出したフオームチッ プを、篩に約２０■の深さに置き、植木ばち用量は皿に水位がちょうどフオーム チップ層の底に達するまで水を注ぐ。その後、篩を一晩放置しておくと、その間 に生存している線虫がミルクフィルターを泳いで渡り、下方の水中に集まる。水 を何回か取り替えて、消費した培地および細菌の線虫懸濁液を浄化した後、線虫 を必要となるまで通気した水中で１０℃で保存する。

例５　モノゼニツクＰｈａｓ欝ｏｒｈａｂｄｌｔｌｓ線虫の液体培養純培養した 線虫を、適当な細菌を有する固体培地（腎臓ベース）で培養した。３週間後に、 線虫を液体培養へ移した。

この線虫を下記の条件下で、振盪フラスコ培養で成長させた。

培地−１０％腎臓、１％酵母エキス、３．５％トウモロコシ浦。

フラスコ−培地５０１を入れた２５０１の三角フラスコ。

温度−１５℃。

振盪速度−２０Ｏｒｐｍ　。

フラスコに、栄養ブロスで成長させた細菌種１１を接種した。２４時間後に、線 虫を滅菌水道水でフラスコ中に洗い流し、３週間培養した。

線虫を滅菌水で２回洗浄し、計数した。この線虫を培養実験の接種物として使用 した。線虫を、予め細菌を接種した培養フラスコに線虫３０００匹／１の割合で 加えた。

線虫は、４種類の異なる細菌で培養した。線虫の計数は、培養期間中の様々な時 間に行った。耐久型幼虫（感染性幼若体としても知られる）は、第２段階の表皮 を保持した線虫として評価した。

線虫を２０日間培養した後に計数したが、結果を第２表に示す。

第２表　モノゼニック線虫の液体培養 １腸１当たりの線虫の平均数 細菌　実験回数　耐久型幼虫　他の段階Ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　６　１２ ２０　１１０ｓ、ｐｒｏｔｅｏｗａｃｕ＋ａｎｓ　６　１１５１）０　７４００ Ｐ、　ｒｅｔｔｇｅｒｉ　８　９９９００　１８９０００Ｍ、ｐｈｅｎｙｌｐｙ ｒｕｖｌｃａ　３　７２０００　２２３０００本例に記載の条件による大規模な 発酵槽中の液体培養による線虫の大量生産は、当業者によって容易に達成できる 。

例６　ナメクジに病原性を与える細菌の選択法例５に記載したのと同様にして、 ２種の細菌によるモノゼニック培養で成長させた線虫、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉおよびＭｏｒａｘｅｌｌａ　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｌｃａの 、ナメクジＤｅｒｏｃｅｒａｓ　ｒｅｔｌｃｕｌａｔｕ−に対する病原性につい て試験した。プラスチック製の箱（１３５Ｘ７５Ｘ５０ｍｍ）に、篩によって得 た直径１２，５〜２５ａｍの風乾した土壌塊４４０ｇを満たした。容箱の土壌塊 を取り出し、水８０１に浸漬した。

線虫を加えない未処理の箱および５段階の線虫用量（プラスチック製箱につき線 虫１５０００．２３０００．３５０００．５５０００および７５０００匹）で処 理した箱を使用した。２反復試験の箱を、両バッチのモノゼニック線虫について の全６回の処理に使用した。線虫を計数し、適当数を水道水５０１に懸濁した。

土壌塊を箱に移し、線虫懸濁液をこの凝集体表面に、層状に均等に分配した。１ ０匹のＤ　、　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍを容箱の中間層に入れた。水道水５０ｍ １を、線虫を加えない箱の土壌塊に均等に分配し、容箱の最終的な水分含量が約 ３０％（重ｆｆｉ／重量）になるようにした。

ナメクジは、１０℃で５日間の感染期間、土壌中に保持した後、ペトリ皿に移し て個々に保持し、白菜葉ディスクを与えた。１０℃で更に９日後（最初に線虫に 暴露してから１４日後）、ナメクジの死亡および生存数を記録した。死亡率デー タは、未処理箱で認められるバックグラウンド死亡率について修正した。修正し た死亡率データを、両細菌によるモノゼニック培養で成長させた線虫について線 虫用量に対してプロットした。

し病原性を有した。この方法を用いて、ナメクジに対して病原性を与える他の細 菌株、例えばＰ、　ｒｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ１４１株の選択に使用することがで きる。

て採取し、沈降と新鮮な水への再懸濁の工程を繰り返して、線虫が成長培地の残 渣を含まなくなくなるまで水で洗浄した。洗浄した線虫は遠心分離によって濃縮 し、ペ−ス）−１ｇ当たり０．１ｘｌＯ〜２．０ｘｌＯ”の！虫を含む線虫の水 性ペーストを生成した。線虫ペーストをカルシウムモンモリロナイト粘土と混合 し、１　ｇ（湿重り当たり屹　０５Ｘ］０　から１．８Ｘ１０６の線虫を含む水 分散性の粉末組成物を生成した。

例８　フオームチップ培養で産生じた Ｐｈａｓｍｏｒｈａｂｄｌｔｌｓ線虫の様々な種のナメクジを殺生する能力 例４て記載した方法を用いて混合細菌叢で培養したに対して生物学的検定を行っ た。これらはＤｅｒｏｃｅｒａｓ（Ｍｌｌａｘ　）　ｓｏｗｅｒｂｙｌであった 。このナメクジは１９９０年１１月に、Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　５ｔａｔｉｏｎで餌のついたふすまのわなから採集した。＾、　ａｔｅｒ が幼若体であった以外は、全てのナメクジが成虫であった（平均重量７７０　Ｂ ）。線虫は例４に記載したのと同様にして、ゼーニックなフオーム−チップバッ グ培養で育てた。篩によって得た直径１２．５〜２５ｍ５の風乾した粗い土壌塊 をプラスチック製の箱（］−３５Ｘ７５Ｘ５０ｉｍ）に入れ、１箱につき風乾し た土壌塊４４０ｇの量になるようにし線虫で処理して水道水１３０１に懸濁した 容箱に加えた。

線虫の入っていない水道水１３０１を、未処理の箱に加えた。１０匹のナメクジ を容箱に入れたが、大型のナメクジの種（Ｔ、　５ｏｖｅｒｂｙｌおよび＾、　 ａｔｅｒ　）については、５匹のナメクジを容箱に入れた。１７匹のＡ、　ｄｌ ｓｔｌｎｃｔｕｓナメクジを線虫で処理し、１８匹を未処理のコントロールとし て保存した。他の総ての種については、２０匹のナメクジを処理し、別の２０匹 を未処理のコントロールとして保存した。このナメクジは、５日間の感染期間中 土壌中放置した後に、土の入った箱を解体してナメクジの死亡数を記録した。生 き残ったナメクジを湿った濾紙でライニングした９ｃｓペトリ皿に移し、そこに ナメクジを個々に保存して白菜葉ディスクを与えた。土壌の箱とペトリ皿は、生 物学的検定の間１０”Ｃに保った。ナメクジの死亡数を、３日間隔で更に２回記 録した。処理および未処理の容器の個々のナメクジ種の死亡率は、いずれの時点 にもｅｈ１２試験を用いて比較した。

結果を、第３表に示す。

第３表　線虫による処理または未処理のままの８．１１および１４日後の様々な 種のナメクジのパーセント死亡率５目目　８日目　１１日目 ナメクジの種　処理　未処理　処理　未処理　処理　未処理間ｒｏｃｅｒａｓ　 １００　１０　１００　２５　１００　．４０ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ　７０　１０　１００　１５　１．００　２０ｃａｒｕａｎ ａｅ Ａｒｉｏｎ　５　０　４０　０　１００　０共虹 Ａｒ１ｏｎ　１００　４０　１００　Ｇｏ　１００　７０ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕ ｓ Ａｒｉｏｎ　６　Ｇ　８８　１１　１００　２８ｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ Ｔａｎｄｏｎｊａ　２０　１５　８０　１５　１００　２５５日間の感染期間の 後、線虫処理および未処理のナメとなった。他の３種の処理および未処理のナメ クジの死亡率の差は、この段階では有意でなかった。８日後には、処理および未 処理のナメクジの死亡率の差は、試験を行でに、線虫で処理したナメクジは総て 死亡した。処理および未処理のナメクジの死亡率の差は、総ての種で有意であっ た（　Ａ、　ＩｎｔｃｒｍｅｄｌｕｓについてはＰ＜０．０１、他の総ての種に ついてはＰ＜０．００１）。

＾　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓの差は余り大きくなかったが、これは未処理のナメ クジの多くが死んだためである。

これらの結果から、ＰｈａｓＩｌｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫が試験を行った総て のナメクジ種を殺すことができることは明らかである。

例９　フオームチップ培養で産生じた 力 小区画の野外実験を行って、白菜苗木に対するナメクジの被害を、未処理の区画 、メチオヵルブペレット（通常ナメクジ防除に最適な市販の化学薬品と考えられ ている）で処理した区画、および例３に記載したのと同様にして混合細菌叢を用 いてフオームチップ培養によって産生しだ線虫の単−同高用量で処理した区画と で比較した。

試験は、粗い砂利のベッド上にローム土壌を含む一連の微小な４０区画で行った 。この区画は、７０Ｘ７０Ｘ深さ３０ｃｍであって、木またはコンクリートの障 壁で分離し、高さ１０ｃｍ、織目０．８ｍｍの銅メツシユ製フェンスで囲み、各 区画の間のナメクジの動きに対する障壁とした。

３６の区画には、１９８９年３月がら６月の間、ナメクジを生息させた。残りの ４区画にはナメクジを加えず、これを既に生息しているナメクジ個体群の尺度と して使用した。野外で採集した５匹のＤ　、　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓの成虫を 、各区画に加えて繁殖させた。これらのナメクジは、寄生虫を全く有していない ことを確認するため、少なくとも２週間隔離箱に入れておいた。検査室飼養した ３４匹のｏ、　ｒｅｔｉｅｕｌａｔｕｍを３ケ月間に亙って各区画に加え、実験 開始時に様々な発育段階のナメクジが存在するようにした。

この実験の設計は、４つの無作為抽出ブロックの９反復試験区から成り、各ブロ ックは２未処理区画、線虫で処理した１区画およびメチオカルブペレットで処理 した１区画から成っていた。

１．０５Ｘ１０”匹の線虫を水道水９００＋Ｉに懸濁し、散水口付じょうろを用 いてこれを各小区画に撒いた。更に水道水１００ｍ１を用いてじょうろを濯ぎ、 これらの区画に注いた。水道水１リツトルを、未処理およびメチオカルブで処理 した区画の両方に加えた。メチオカルブベレットを、推奨される田畑への割合（ ５，５ｋｇ／ｈａ−０，２７５ｇ／区画）で加えた。このベレットは重量を測定 し、区画に手で均等に散布した。区画は、実験の全過程を通じて頭上バイブから 散水し、ナメクジの活動に好適な条件となるようにした。

実験開始時に、温室で成長させた若い白菜の苗木を、各区画あたり９本を３本ず つ３列に配置して植えた。これらを毎週２回調査し、各苗木に対するナメクジの 被害量は５パーセント近くまで見積った。

移植２週間後に、幾つかの未処理の区画では苗木が完全に破壊されたため、古い 苗木の残余を全区画から除去し、新しいものを植えた。これを更に２週間後に繰 り返し行った。更に２週間後に実験を終了した（合計６週間）。苗木の被害は、 実験の全過程を通じて毎週２回記録した。処理ブロックのうち１区画（ブロック ９）の間の銅メソシュ製の障壁を４週間後に外し、ナメクジが区画間を移動でき るようにしたため、これらの区画については無視し、第５週および第６週の間の 結果は、８ブロツクだけで表わした。

この実験の終わりに、２つの土壌試料２５Ｘ２５Ｘ深さ１０ｃ１１を、残り８ブ ロツクの各区画から取り、１つの試料は中央から採り、１つは各区画の南東角か ら採取した。この試料を、ＬＡＲＳナメクジ抽出ユニット（Ｇｌｅｎ　＆　Ｗｉ ｌｔｓｈｌｒｅＳＰｒｏｃｅｅｄｌｎｇｓ　１９８８　Ｂｒ１ｔ１ｓｈ　Ｃｒｏ ｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　（１９８６）、　ｌ、　１３ ９−１４４）で９日間徐々に潅水し、ナメクジを毎日表面から除去した。

本実験過程での各処理における苗木に対するナメクジの被害量を第１図に示す。

分散を安定させる角変換にしたがった分散分析では、メチオカルブベレットおよ び線虫のいずれもが、苗木に対するナメクジの被害量を有意に（Ｐ＜０．００１ ）減少させることを示している。最初の読み（処理後４日目）では、線虫で処理 した区画にはメチオカルブで処理した区画よりも有意に大きな（Ｐ＜０．０５） 被害があったが、苗木が最初の被害を克服して成長するにつれ、線虫およびメチ オカルブで処理した区画の間の差は小さくなった。第１週の終わりまでに、線虫 で処理した区画は、メチオカルブで処理した区画よりも被害が少ないことを示し たが、この差は有意ではなかった。１７日後（苗木の第２バツチでの最初の検査 ）に、線虫で処理した区画はメチオカルブで処理した区画よりも有意に被害が少 なくなり（Ｐ＜０．０５）、これは実験の終わりまで続いた（Ｐ＜０．０１）。

土壌試料に見出された。総ての区画で、Ｄ、　ｃａｒｕａｎａｅは僅か２匹しか 見つからなかったが、Ｄ、　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕＩｌｌが画に導入され繁殖し 、至る所にコロニーを造ったと考えられる。このナメクジの好ましい食餌は不明 であるが、研究所での試験では、代替の食物源なしで３週間白菜葉に暴露した間 、何の被害も与えなかった。従って、このナメクジがこの試験で苗木に被害を与 えていたとは考えにくい。何も加えなかった４区画からは、Ｄ、　ｒｅｔｉｃｕ ｌａｔｕｍは見つからなかった。これは、もし実験開始以前に区画中にり、　ｒ ｅｔｌ’ｃｕｌａｔｕ■がいたとしても、様々な処理の区画から抽出したナメク ジの総数および生物量は、統計解析用に平方根に変換した。この結果を第２図に 示す。

線虫で処理した区画から抽出したナメクジは、未処理区画よりも有意に少なく　 （全ナメクジ種およびチオカルブで処理した区画から抽出したものは、未処理区 画からよりも少なかった（全ナメクジ種およびり、　ｒｅＮｃｕｌａｔｕ１１単 独についてＰ＜０．０５）。線虫で処理した区画から抽出したナメクジは、メチ オカルブで処理した区画からよりも少なかったが、この差は有意ではなかった。

Ｄ、　ｒｅＮｃｕｌａｔｕｍは、線虫で処理した区画からは抽出されず、この種 がこれらの区画からほとんど駆除されていたことを示唆した。Ｂ、　ｐａｌｌｅ ｎｓの数は、線虫またはメチオカルブによる著しい影響を受けなかったが、処理 の区画よりも少なかった。

例１０　モノゼニックＰｈａｓｎｏｒｈａｂｄｌｔｉｓ線虫の、様々な有害生物 軟体動物を殺生する能力 タツムリ）のような様々な有害生物軟体動物に対する生物学的検定を行った。こ の結果を表４に示す。

第４表　モノゼニック線虫による処理後または未処理の状態で放置後の様々な種 の有害生物軟体動物のパーセント死亡率 軟体動物種　生物学的検定の期間　処理　未処理（日数） 処理および未処理の軟体動物の死亡率の差は試験を行った種全てについて有意で あり（Ｐ＜０．００１）　、試験を行った有害生物軟体動物の全種が、Ｍ、　ｐ ｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｌｃａ　４８株でモノゼニックにしたＰｈａｓｍｏｒｈａ ｂｄｊｔｌｓ種の影響を受け易いことを示していた。モノゼニック線虫の活性ス ペクトルは、ゼニソク線虫と比較して変わらない。

モノゼニソクＰｈａｓｍｏｒｈａｂｄｌｔｉｓ線虫を、例５に記載したように、 Ｍ、　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｊｃａまたはＰ、　ｒｅｔｔｇｅｒｉと共に成長 させ、例８に記載したように様々な用量率でナメクジ種り、　ｒｅｔｉｃｕｌａ ｔｕｍに対する生物学的検定を行った。

この結果を第３図にまとめている。いずれの型のモノゼニック線虫も、Ｄ、　ｒ ｅｔｉｃｕｌａｔｕｌこ対して活性である。

例１１　モノゼニックＰｈａｓｉｏｒｈａｂｄ　Ｉ　ｔ　ｊｓ線虫の、野外条件 下テノ陸生ナメクジＤｅｒｏｃｅｒａｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｗによる植物の 被害を防除する能力 野外試験を行い、未処理の区画、メチオヵルブペレットで処理した区画、ある範 囲の線虫用量で処理した区画での、秋まき小麦（ｃｖ　Ｍｅｒｃｉａ）に対する ナメクジの被害を比較をした。モノゼニック線虫ヲＭ　、　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒ ｕｖｉｃａ４８株と共に例５に記載したように産生じ、例７に記載したように１ 　ｇ（湿重量）当たり０゜３６Ｘ１０６の線虫を含む水分散性の粉末として粘土 に配合した。線虫は、種蒔き直後に１，１００リツトル／ヘクタールまでの容量 当量の水性スプレーとして適用した。メチオヵルブペレットは、好ましい野外散 布率（５，５ｋｇ／ヘクタール）　′を手で撒いた。

表面のトラップおよび土壌試料を用いて、この野外試験の区画におけるナメクジ 個体数を監視した。

の様々な種が区画から見つかったが、この中ではＤ　、　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕ ｌが断熱優勢な種であった。

種撒きの６週間後、区画を小麦苗木の発生について評価したが、これは致命的な ナメクジの被害の見積もり（すなわち植物の起立の減少）であり、見積は、無作 為に選択した植物の視覚的評価による準致命的なナメクジの被害（すなわちナメ クジに食われた植物）から成った。

様々な処理についての０．５メートルの長さの数列について生えた小麦植物の弔 均数を、第５表に示す。

第５表　野外試験での様々な処理に対して０．５メートルの長さの数列に生えた 小麦植物の平均数（種蒔きの６週間後に行った評価） 処理　生えた植物の平均数 未処理　１２．９３ 線虫用量１ヘクタール当たりＩＸ］、０８　１２．７８線虫用量１ヘクタール当 たり３Ｘ１０８　１３．９５線虫用量４ヘクタール当たりｌＸｌ０９　１３．２ ５線虫用量４ヘクタール当たり３Ｘ１０”　１４．８８線虫用ｇｋ１ヘクタール 当たりｌＸｌ０１０　１６．５０メチオカルブ　１４．　５’７ Ｓ、Ｅ、Ｄ、−１，３１４，（３９９ｄ、ｒ、）線虫用量の増加により、生えた 植物の数が明らかに増加していることから、この線虫による処理はナメクジによ る致命的な被害を減少させている。

ナメクジの被害を受けた葉の面積の平均パーセンテージについてのデータは、分 析前に角に変換した。この結果を第６表に示す。

表６　野外試験における様々な処理に対する植物当たりのナメクジが被害を与え た葉面積の平均角パーセンテージ（種蒔きの６週間後に評価を行った）。

処理　植物あたりの被害を受けた葉 面積の平均角百分率 未処理　３１．８２ 線虫用量１ヘクタール当たりｌＸＩＯ３２９，１５線虫用量１ヘクタール当たり ３Ｘ１０８　２８．８７線虫用量１ヘクタール当たりｌＸｌ０９　２２．１１線 虫用量１ヘクタール当たり３Ｘ１０９　１８．６３線虫用量１ヘクタール当たり ｌＸｌ０”　１６．４９メチオカルブ　２５．１７ Ｓ、Ｅ、Ｄ、−３，３９５，（２４ｄ、ｆ、）ナメクジによる被害を受けた葉面 積には有意差があったが（Ｐ＜０．００１）　、高いほうの３段階の線虫用量で は未処理の区画よりもナメクジの被害が有意に少ながった（Ｐ＜０．０１）。線 虫の最高用量で処理した区画の植物は、メチオカルブで処理した区画の植物より もナメクジの被害が有意に少ながった（Ｐ＜０．０５）。従ってこの線虫は、準 致命的なナメクジ被害に対する防除に優れている。

モノゼニツク線虫を例５に記載したようにＭ、　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｌｃａ 　４ｇ株と共に産生じ、例７に記載したように１　ｇ（湿重量）当たり約０．３ ６Ｘ１０”の線虫を含む水分散性の粉末として粘土に配合した。水生腹足類Ｌｙ ｖｎａｅａ　ｓｔａｇｎａｌｌｓ　１０匹を、腹足類の食物源となる水生植物を いくらか含んだ池水を半分病たした５個の清潔な魚タンク各々に加えた。このタ ンクは小さな空気ポンプを使用して通気し、１５℃に保った。

４つのタンク各々に、約６×１０６の線虫を、水分散性の粉末配合物の形態で加 えた。第５のタンクには線虫ヲ加えず、コントロールとした。３日間培養を行っ た後、線虫で処理したタンク中の腹足類の平均死亡率は４５％であり、６日後に は１００％に上昇した。６日間の培養後、未処理のコントロールタンクには死亡 が見られなかった。

第１の苗木　：　第２の苗木　：　第３の苗木ロ総ナメクジ数　’Ｓ　Ｏ，Ｒｅ ｊｉｃｕｌａｔｕｍｌ、ｓ、ｄ、！総ナメクジ数の比較用（Ｐ＝０．０５２２ｄ 、　ｆ、　）１、　ｓ、　ｄ、　２：Ｄ、　ｒｅｔｉｃｕｌａｊｕｍ数の比較用 （Ｐ＝０．０５２２ｄ、　ｆ、　）、　、、、　ＰＣＴＩＧＢ９２１０１２４Ｂ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ。

（７２）発明者　パース、シェラミー　ディピッドイギリス国ウェスト、サセッ クス州、リトルハンプトン、マックスウェル、ロード、

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．農業、園芸またはヒトおよび動物の健康上の有害生物を防除するためのＰｈ ａｓｍｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫の使用。
2. ２．線虫がＰ．ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａまたはＰ．ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉｔ ａである、請求の範囲第１項に記載の使用。
3. ３．好適な成長を促進する細菌を併用する、請求の範囲第１項または第２項に記 載の使用。
4. ４．好適な成長を促進する細菌の群落を併用する、請求の範囲第１項または第２ 項に記載の使用。
5. ５．農業および園芸の有害生物軟体動物を防除するための、請求の範囲第１項、 第２項、第３項または第４項に記載の使用。
6. ６．コウラナメクジ科、特にＤｅｒｏｃｅｒａｓｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍおよび Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ　ｃａｒｕａｎａｅの有害生物ナメクジを防除するための、 請求の範囲第５項に記載の使用。
7. ７．Ａｒｉｏｎｉｄａｅ科、特にＡｒｉｏｎ　ａｔｅｒ、Ａｒｉｏｎｉｎｔｅｒ ｍｅｄｉｕｓおよびＡｒｉｏｎ　ｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓの有害生物ナメクジを防 除するための、請求の範囲第５項に記載の使用。
8. ８．Ｍｉａｃｉｄａｅ科、特にＴａｎｄｏｎｉａ　ｓｏｗｅｒｂｙｉの有害生物 ナメクジを防除するための、請求の範囲第５項に記載の使用。
9. ９．マイマイ科、特にＭｏｎａｃｈａ　ｃａｎｔｉａｎａの有害生物腹足類を防 除するための、請求の範囲第５項に記載の使用。
10. １０．ヒトおよび動物の健康に対する有害生物軟体動物を防除するための、請求 の範囲第１項、第２項、第３項または第４項に記載の使用。
11. １１．モノアラガイ属の有害生物腹足類を防除するための、請求の範囲第１０項 に記載の使用。
12. １２．線虫を耐久型幼虫として適用する、請求の範囲１〜１１項のいずれか１項 に記載の使用。
13. １３．線虫を、線虫の成長を促進する細菌と共に適用する、請求の範囲第１〜１ ２項のいずれか１項に記載の使用。
14. １４．Ｐｈａｓｍｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫の成長を促進する能力を有し、その 線虫の軟体動物に対する病原性を誘発するＭｏｒａｘｅｌｉａ　ｐｈｅｎｙｌｐ ｙｒｕｖｉｃａ４８株であって、その試料が受託番号ＮＣＩＭＢ　４０５０８で 寄託されている株、またはその変異体、誘導体または突然変異体。
15. １５．Ｐｈａｓｍｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫の成長を促進する能力を有し、その 線虫の軟体動物に対する病原性を誘発するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｓ１４１株であって、その試料が受託番号ＮＣＩＭＢ　４０５０９で 寄託されている株、またはその変異体、誘導体または突然変異体。
16. １６．農業、園芸、およびヒトと動物の健康における有害生物軟体動物の防除用 の組成物であって、好適な成長促進細菌または好適な成長促進細菌の群落および 適当な担体またはカプセル封入剤と共に、Ｐｈａｓｍｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の 線虫種を含んで成る組成物。
17. １７．線虫が耐久型幼虫として存在する、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
18. １８．種がＰ．ｎｅｏｐａｐｉｌｌｏｓａまたはＰ．ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉｔ ａである、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
19. １９．請求の範囲第１６項に記載の組成物であって、その成長促進細菌が以下か ら選択される組成物：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｒ ｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅｏｍａ ｃｕｌａｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、κｏｒａｘｅｌ ｌａ　ｐｈｅｎｙＩｐｙｒｕｖｉｃａ、Ｂａｃｉｉｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｏｄｏｒａｔｕｍおよびＦｌａｖｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｉ。
20. ２０．成長促進細菌がＭｏｒａｘｅｉｌａ　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａＮＣ ＩＭＢ　４０５０８株またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＣＩＭＢ　４０５０９株である、請求の範囲第１９項記載の組成物。
21. ２１．担体が粘土である、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
22. ２２．線虫濃度が１グラム（湿重量）につき０．１×１０６〜２．０×１０６、 好ましくは１グラム（湿重量）につき０．３×１０６〜０．８×１０６である、 カルシウムモンモリロナイト粘土、水および線虫を含んでなる、請求の範囲第１ ６〜２１項のいずれか１項に記載の水分散性の粉末組成物。
23. ２３．軟体動物を防除するための線虫の産生法であって、液体培地でＰｈａｓｍ ｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ線虫を培養し、生育培地に少なくとも１種類の成長促進お よび病原性誘発細菌を予備接種し、耐久型幼虫を回収することを特徴とする方法 。
24. ２４．成長促進細菌が下記のものから選択される、請求の範囲第２３項に記載の 方法： Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒ ｅｔｔｇｅｒｉ、Ｓｅｒｒａｔｌａ　ｐｒｏｔｅｏｍａｃｕｌａｎｓ、Ａｅｒｏ ｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｍｏｒａｘｅｌｉａ　ｐｈｅｎｙｌｐｙ ｒｕｖｉｃａ、Ｂａｃｉｌｉｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｏｄｏｒａｔｕｍおよびＰｌａｖｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｉ。
25. ２５．成長促進細菌がＭｏｒａｘｅｌｌａ　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａまた はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである、請求の範囲第２４ 項に記載の方法。
26. ２６．生育培地がビタミンおよびミネラル源、トリグリセリド源、およびタンパ ク質源を含有する、請求の範囲第２３〜２５項のいずれか１項に記載の方法。
27. ２７．生育培地が腎臓、酵母エキスおよびトウモロコシ油を含有する、請求の範 囲第２３〜２６項のいずれか１項に記載の方法。
28. ２８．軟体動物の寄生を受けやすい部位にＰｈａｓｍｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ属の 軟体動物駆除性の線虫を成長支持細菌と共に適用することを特徴とする、軟体動 物を防除する方法。