DE69213947T2

DE69213947T2 - Biologische bekämpfung von mollusken

Info

Publication number: DE69213947T2
Application number: DE69213947T
Authority: DE
Inventors: David Mckellar Bristol Bs19 4Qr Glen; Jeremy David 6 Maxwell Road West Sussex Bn17 7Bn Pearce; Michael John Bristol Bs6 6Pu Wilson
Original assignee: Agricultural Genetics Co Ltd
Current assignee: MicroBio Group Ltd
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-09
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2012-07-10
Also published as: DK0598746T3; HU219857B; EP0598746A1; US5527525A; IL102451A0; HU9400060D0; HUT69629A; SK2294A3; PL168777B1; CZ1094A3; GR3021953T3; ES2094362T3; PT100669B; IE922218A1; IL102451A; WO1993000816A1; SK279691B6; DE69213947D1; ATE142845T1; CA2113173C

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Bekämpfung von Landwirtschafts- und Gartenschädlingen und insbesondere auf die Bekämpfung von Mollusken einschließlich Nacktschnecken, z.B. Deroceras reticulatum, und Gehäuseschnecken, z.B. Monacha cantiana. Zur bequemeren Darstellung wird die Erfindung hauptsächlich in bezug auf die Bekämpfung von Nacktschnecken beschrieben, aber es gilt als selbstverständlich, daß sie sich auch auf die Bekämpfung anderer Mollusken anwenden läßt, die auf dem Feld oder im Gewächshaus Pflanzen schädigen oder die für Menschen oder Tiere schädliche Parasiten tragen.
Nacktschnecken sind weit verbreitete Schädlinge mehrerer landwirtschaftlicher Hauptnutzpflanzen, insbesondere Winterweizen, Raps und Kartoffeln, im United Kingdom, anderen europäischen Ländern, Nord- und Mittelamerika und Australasien. Sie bilden auch ein Problem im Gartenbau und für den Heimgärtner. Die ökonomisch wichtigste Nacktschneckenart ist die Graue Kellerschnecke, Deroceras reticulatum (Familie Limacidae), obwohl auch andere Limaciden-Nacktschnecken sowie Arten der Gattungen Arion (Familie Arionidae), Tandonia, Milax (Familie Milacidae) und Boettgerilla erhebliche Schäden verursachen können. Gehäuseschnecken können ebenfalls ein Schädlingsproblem im Gartenbau und in der Landwirtschaft darstellen, zum Beispiel Monacha cantiana (Familie Helicidae) Beispiele für schädliche Mollusken werden von Godan in "Pest Slugs and Snails" aufgeführt (1983, Springer-Verlag, Berlin). Mollusken können auch Schädlinge tragen, die eine Gefahr für die menschliche oder tierische Gesundheit darstellen. Beispiele dafür sind Lymnaea-Arten (Familie Lymnaeidae), die den Leberegel Fasciola hepatica tragen, und Bulinus-Arten (Familie Bulinidae), die Opisthorcis sinensis tragen. Die Familien Limacidae, Arionidae, Milacidae und Helicidae gehören zur Ordnung Stylommatophora. Die Familien Bulinidae und Lymnaeidae gehören zur Ordnung Basommatophora.
Die gegenwärtigen Bekämpfungsverfahren sind nur teilweise wirksam, und die verfügbaren Chemikalien sind für vögel und Säuger hochtoxisch. Es besteht also ein klares Bedürfnis nach wirksameren, dauerhafteren und weniger toxischen Verfahren zur Bekämpfung von Mollusken.
Es wurde nun gefunden, daß Nematoden der Gattung Phasmarhabditis wirksame Bekämpfungsmittel für ein breites Spektrum von Molluskenarten sind. Besonders wirksame Phasmarhabditis-Arten sind die miteinander verwandten Organismen p. neopapillosa und P. hermaphrodita, die im folgenden näher beschrieben werden. Diese Arten sind seit vielen Jahren bekannt und in der Literatur beschrieben; sie wurden insbesondere von Andrassy in "A Taxonomic Review of the Sub-Order Rhabditina (Nematoda: Secementina)" (1983, Orstom, Paris) charakterisiert. Die biologische Wirkung dieser Organismen gegen Nacktschnecken und andere schädliche Mollusken wurde bisher jedoch noch nicht erkannt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt daher die Verwendung von Phasmarhabditis-Arten zur Bekämpfung von Schädlingen in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder von Schädlingen für die menschliche und tierische Gesundheit, insbesondere Mollusken. Die Organismen können aus Nacktschnecken auf dem Feld erhalten und nach im folgenden beschriebenen Verfahren kultiviert werden, um ausreichende Mengen zur Zubereitung geeigneter Zusammensetzungen für die Anwendung auf dem Feld oder im Gewächshaus herzustellen. Typische Zusammensetzungen für die praktische Anwendung verwenden annehmbare Trägermaterialien, wie Torf, Tone und andere feste oder halbfeste Träger, wie Gelmaterialien. Freiland-Mikroparzellen- und Feldversuche haben gezeigt, daß die Nematoden wenigstens so gut wie oder besser als Methiocarb, die beste zur Zeit verfügbare Chemikalie, sowohl Nacktschnecken töten als auch Chinakohlpflänzchen und Weizensaaten oder -sämlinge vor Nacktschneckenschäden schützen können.

Biologie des Organismus

Die Nematode wurde aus Nacktschnecken isoliert, die in der Long Ashton Research Station in Großbritannien gesammelt wurden. Es wurde gefunden, daß die Nematode mit einer tödlichen Krankheit von Nacktschnecken mit charakteristischen Symptomen, von denen eine Schwellung des Mantels der Nacktschnecke am ehesten wahrnehmbar ist, in Verbindung steht. Es wurde festgestellt, daß die Nematode zur Unterordnung Rhabditina gehört, und sie wurde unter Verwendung eines Schlüssels (Andrassy, 1983) weiter identifiziert. Die hauptsächlichen taxonomischen Merkmale dieser Gruppe sind die Mundteile und die männlichen Fortpflanzungsstrukturen. Die in Long Ashton isolierten Nematoden hatten einen charakteristischen kurzen Mund mit einem isomorphen Metastom, und die Männchen, falls vorhanden, hatten pelodere Samentaschen, was zur Gattung Phasmarhabditis paßt. Andrassy (1983) führt zwei Arten auf, die mit diesen Nematoden morphologisch identisch sind, die aber aufgrund der Anzahl der in den Populationen vorhandenen Männchen voneinander unterschieden werden. Bei Phasmarhabditis neopapillosa sind Männchen und Weibchen gleich häufig, während bei P. hermaphrodita die Männchen äußerst selten sind. Es ist noch nicht bekannt, ob P. hermaphrodita eine eigene Art oder nur eine biologische Variante von P. neopapillosa ist (Andrassy 1983). P. hermaphrodita wurde zuerst von Maupas in Archives de Zoologie (1900), Vol 8, S. 464-624, beschrieben, der die Nematode Rhabditis caussaneli nannte. Er fand resistente Larvenformen im Darm von Arion ater, die er in der Normandie sammelte. Er unterhielt zwei Jahre lang Kulturen der Nematode auf verfaultem Fleisch. Er fand, daß die erwachsenen Würmer vorwiegend protandrische autogame Hermaphroditen waren. Männchen waren in sehr kleiner Zahl vorhanden (1 Männchen auf 1300 Weibchen), und die Zahl der Männchen in den Kulturen wurde durch die Ernährungsbedingungen nicht beeinflußt. Maupas beobachtete nie, daß sich Männchen mit den Weibchen paarten, die in Gegenwart von Männchen keine Veränderung in ihrer Fruchtbarkeit oder im Geschlechterverhältnis ihrer Nachkommen zeigten. Maupas betrachtete diese Nematode nicht als Parasiten von Nacktschnecken.
Phasmarhabditis neopapillosa wurde von Mengert beschrieben, der die Nematode in der Zeitschrift für Morphologie und Ökologie Tiere (1953), Vol 41, S. 311-349, in seinen untersuchungen der Beziehungen zwischen Nematoden und landlebenden Mollusken Rhabditis neopapillosa nannte. Er fand die Nematode in Form von resistenten Larvenstadien ("Dauerlarven") im Enddarm der Nacktschnecke Limax cinereoniger. Mengert betrachtete p. neopapillosa als Saprophagen, der viele Generationen lang auf sich zersetzendem Material lebt, aber wenn die Bedingungen ungünstig werden, reifen die Jungtiere nicht aus, sondern bilden resistente Dauerlarven, die keine Nahrung zu sich nehmen. Er betrachtete die Lebensweise von P. neopapillosa als identisch mit der von zwei anderen Arten, Phasmarhabditis papillosa und P. hermäphrodita. Er war der Meinung, daß die Dauerlarven dieser drei Arten, wenn sich die Gelegenheit ergibt, in den Körper von Nacktschnecken wandern, wo sie als Dauerlarven verbleiben, bis die Schnecke stirbt, woraufhin sie sich entwickeln und fortpflanzen und sich von dem toten Tier ernähren. Mengert dachte, daß der Aufenthalt in der Nacktschnecke kein notwendiger Teil des Lebenscyclus der Nematode sei, aber er ging davon aus, daß die Dauerlarven dieser Spezies einen gewissen Grad der Anpassung an das Leben in den Nacktschnecken zeigen. Er schrieb jedoch, daß sie keine Parasiten von Nacktschnecken seien.
Nematoden können aus Nacktschnecken isoliert werden, die auf dem Feld unter Verwendung von Fallen mit Kleie als Köder, die man in einem Gebiet mit rauhem Grasland beläßt, gesammelt wurden. Wenn man die Nacktschnecken gesammelt hat, können die Nematoden nach der Dissektion aus ihrem Darm oder der Mantelhöhle isoliert werden. Viele Nematodenarten stehen mit Nacktschnecken in Verbindung (Mengert, 1953), und es ist notwendig, die Identifizierung von P. hermaphrodita und P. neopapillosa mit Hilfe eines taxonomischen Schlüssels (Andrassay, 1983) zu bestätigen. Wenn man in der Nacktschnecke nur Nematoden im infektiösen Stadium (Dauerlarven) findet, ist es notwendig, die Nematoden zu kultivieren, um sie zu identifizieren.
Phasmarhabditis-Nematoden wurden in Lang Ashton bei mehreren Gelegenheiten isoliert. In manchen Fällen bestand die Population der Nematoden aus Männchen und Weibchen, während die Populationen in anderen Fällen nur aus Hermaphroditen bestanden. Nematoden aus beiden Populationstypen wurden lichtmikroskopisch und rasterelektronenmikroskopisch untersucht. Proteinprofile aus den verschiedenen Populationen wurden nach einer Auftrennung der Proteine durch isoelektrische Fokussierung ebenfalls untersucht. Mit keinem der obigen Verfahren wurden Unterschiede zwischen den Populationen gefunden. Die isolierten Nematoden entsprechen den verfügbaren Beschreibungen sowohl von P. neopapillosa als auch von P. hermaphrodita.
Phasmarhabditis-Nematoden können nach in dieser Beschreibung beschriebenen Verfahren gewonnen werden. Es ist in der Fachkunde bereits bekannt, daß insektenparasitische Nematoden für die kommerzielle Verwendung in großem Maßstab durch Flüssigkultur unter Verwendung von Rührtank- oder Airlift-Fermentern oder durch Festkultur in Beuteln oder Schalen mit Schaumstoffflocken gewonnen werden können. Ähnliche Techniken können für die Gewinnung von P. hermaphrodita oder P. neopapillosa in großem Maßstab verwendet werden. So läßt sich die gemäß dieser Erfindung verwendete Nematode leicht in Medium auf Nierenbasis in Schaumstoffflocken oder in Flüssigkultur kultivieren, wobei man ähnliche Techniken verwendet, wie sie zur Gewinnung insektenparasitischer Nematoden verwendet werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird empfohlen, daß die Nematodenkultur im Dauerlarvenstadium abgeerntet wird.

Anforderungen für vergeselischaftete Bakterien

Phasmarhabditis-Nematoden ernähren sich von Bakterien. Nach der Isolierung von Phasmarhabditis-Nematoden aus sterbenden Nacktschnecken wurden viele damit vergesellschaftete Bakterienisolate gefunden. Wir haben die Beziehung zwischen der Nematode und diesen vergeselischafteten Bakterien erforscht, um festzustellen, welche Bakterien zu einem guten Nematodenwachstum führen, und um die Pathogenität von Nematoden miteinander zu vergleichen, die auf verschiedenen Bakterienarten gezüchtet wurden.
Um durchweg hohe Ausbeuten von Phasmarhabditis-Nematoden zu gewinnen, die für Mollusken pathogen sind, ist es vorzuziehen, sie in Kulturen mit einem einzigen bekannten vergeselischafteten Bakterium (monoxenischen Kulturen) zu züchten, und daher benötigt man ein Verfahren, um einzelne Bakterienspezies auszusuchen, mit denen sich die Nematoden züchten lassen. Bakterien, mit denen sich Nematoden züchten lassen, können aus dem Innern von Nematoden, aus Nematodenkulturen, die auf einer gemischten Mikrobenpopulation wachsen, aus mit Bakterien infizierten Nacktschnecken und aus mit den Nematoden infizierten toten Nacktschriecken isoliert werden. Die Nematoden können dann von allen Bakterienverunreinigungen befreit und in Kulturen mit den unterschiedlichen einzelnen Bakterienspezies eingebracht werden. Eine Inkubation dieser Kulturen erlaubt eine Auswahl von Bakterienisolaten, mit denen sich die Nematoden züchten lassen.
Ungefähr 100 Bakterienisolate wurden aus den Nematoden, aus mit Nematoden infizierten Nacktschnecken und aus mit Nematoden infizierten toten Nacktschnecken erhalten, von denen 15 daraufhin getestet wurden, ob sich die Nematoden damit züchten lassen. Von diesen wurden 9 Isolate gefunden, die 8 Spezies repräsentieren, mit denen sich die Nematoden gut auf Agar züchten lassen. Die 8 Bakterienspezies, von denen sich erwies, daß sich die Nematoden gut damit züchten lassen, sind die folgenden:
Pseudomonas fluorescens,
Providencia rettgeri,
Serratia proteomaculans,
Aeromonas salmonicida,
Moraxella phenylpyruvica,
Bacillus cereus,
Flavobacterium odoratum,
Flavobacterium brevi.
Die Fähigkeit von Nematoden, die auf verschiedenen Bakterienarten gezüchtet wurden, Nacktschnecken zu töten, kann in einem Bioassay getestet werden. In einem solchen Bioassay werden Nacktschnecken Nematoden in unterschiedlicher Anzahl ausgesetzt, und die resultierende Nacktschneckensterblichkeit wird aufgezeichnet. Mit diesem Verfahren kann ein quantitatives Maß für die Pathogenität (z.B. LD&sub5;&sub0;) von Nematoden gegenüber Nacktschnecken erhalten und zum Vergleich der Pathogenität von Nematoden, die auf verschiedenen Bakterienarten gezüchtet wurden, verwendet werden. Es ist wichtig, daß die Nematode in Verbindung mit spezifischen Bakterien hinzugefügt wird, denn die Bakterien sind nicht nur für das Wachstum der Nematode (sowohl in vitro als auch in vivo), sondern auch für ihre Fähigkeit, Nacktschnecken zu töten, wesentlich. Die Nematode trägt die damit vergesellschafteten Bakterien mit in die Nacktschnecke hinein, was eine rasche Behauptung und Vermehrung der Nematode erlaubt, was zum Tode der Nacktschnecke führt.
Beispiele für geeignete Bakterienstämme sind Moraxella phenylpyruvica Stamm 48 und Pseudomonas fluorescens Stamm 141, von denen Proben am 9. Juni 1992 unter dem Budapester Abkommen bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria* unter den Zugriffsnummern NCIMB 40508 bzw. NCIMB 40509 hinterlegt wurden. Der Stamm Pseudomonas fluorescens 141 ist ein Gramnegatives, Oxidase-positives, Katalase-positives unbewegliches Bakterium, das beim O/F-Test (Hugh-und-Leifson-Test) auf aeroben oder anaeroben Glucoseabbau negativ abschneidet. Der Stamm Moraxella phenylpyruvica 48 ist ein Gram-negatives, Oxidasepositives, Katalase-positives unbewegliches Bakterium, das beim O/F-Test (Hugh-und-Leifson-Test) negativ abschneidet. Die biochemischen Profile beider Stämme auf Standardsubstraten (API- ZONE-Teststreifen) sind unten gezeigt.
* Adresse: 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, United Kingdom
* nicht getestet
Geeignete Varianten von M. phenylpyruvica Stamm 48 und von P. fluorescens Stamm 141 können erhalten werden, indem man wiederholt Unterkulturen von reinen Kulturen dieser Stämme anlegt. Varianten können auch erhalten werden, indem man entweder Bakterien aus Phasmarhabditis-Nematoden, die zuvor in Verbindung mit einem der beiden Stämme gezüchtet wurden, zurückisoliert, oder indem man Bakterien aus mit Nematoden infizierten Nacktschnecken zurückisoliert. Solche Varianten können als Ergebnis von Umwelteinflüssen oder eines Selektionsdrucks genotypische oder phänotypische Veränderungen erfahren haben. Geeignete Derivate von M. phenylpyruvica Stamm 48 und von P. fluorescens Stamm 141 können aufgebaut werden, indem man DNA aus anderen Organismen einführt, die für wünschenswerte Eigenschaften codiert. Verfahren zur Einführung von Fremd-DNA in Bakterien sind dem Fachmann wohlbekannt; dazu gehören Techniken wie Plasmidübertragung, Transduktion und Transfektion. Geeignete Mutanten von M. phenylpyruvica Stamm 48 und von P. fluorescens Stamm 141 können durch Mutagenese unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, erhalten werden, wie chemische (z.B.mit Nitrosoguanidin), physikalische (UV-Licht) und genetische (Transposon-Mutagenese) Techniken. Solche Varianten, Derivate und Mutanten der Stämme können in bezug auf Merkmale wie Wachstumsgeschwindigkeit oder Fähigkeit zum Wachstum auf bestimmten Nahrungsquellen verändert sein, werden aber die für diese Erfindung wesentlichen Eigenschaften beibehalten, d.h. die Fähigkeit, sowohl ein Wachstum von Phasmarhabditis-Nematoden zu ermöglichen als auch Pathogenität gegenüber Mollusken zu induzieren.
Zur Verwendung bei der Bekämpfung von landwirtschaftlichen Schädlingen werden Nematoden durch Zentrifugation, Filtration oder Absetzen unter der Schwerkraft aus Fermentern entnommen. Die Nematoden werden gewaschen, um Komponenten des verbrauchten Mediums zu entfernen, und entweder sofort zubereitet oder vor der Zubereittung in Form gekühlter, belüfteter wäßriger Suspensionen aufbewahrt. Die Nematoden können für die landwirtschaftliche Verwendung als wäßrige Suspensionen auffesten Trägern, wie künstlicher Kohle, Tonen, Torf, Vermiculit oder Polyether-Polyurethan- Schwamm, zubereitet oder in Gelen, wie Alginat oder Polyacrylamid, eingekapselt werden. Eine besonders wünschenswerte Zubereitung enthält getrocknete oder partiell getrocknete Nematoden. Die zubereiteten Nematoden können zur Bekämpfung von Schädlingen aufgetragen werden, indem man eine wäßrige Suspension bildet und diese durch Sprühen, Berieseln oder Überbrausen auf die zu behandelnde Fläche aufträgt.

Beispiel 1. Verfahren zur Isolierung von Phasmarhabditis- Nematoden

Lebende Nematoden, die aus Nacktschnecken entnommen wurden, die auf dem Feld mit Hilfe von Fallen mit Kleie als Köder gesammelt wurden, werden auf Agarmedium auf Nierenbasis gegeben, das man herstellt, indem man 10% homogenisierte Schweineniere, 3,5,% Maisöl, 2% Agar und 84,5% Wasser (Gew.-%) miteinander mischt, und das dann im Autoklaven sterilisiert und in Petri-Schalen gegossen wird. Das Medium begünstigt das Wachstum der mit den Nematoden vergesellschafteten Bakterien. Die Nematoden ernähren sich von diesen Bakterien und wachsen und vermehren sich auf den Schalen.

Beispiel 2. Isolierung von mit Nematoden oder mit Nematoden-infizierten Nacktschnecken vergeselischafteten Bakterien

Mit Nematoden oder mit Nematoden-infizierten Nacktschnecken vergesellschaftete Bakterien können nach einem der folgenden Verfahren isoliert werden:

(i) Isolierung von Bakterien aus dem Innern von Nematoden

Nematoden werden oberflächlich sterilisiert, indem man sie 1 Stunde lang in 0,1% (w/v) Natriumethylmercurithiosalicylat (Thimerosal) eintaucht, und dann weitere drei Stunden in frisches Thimerosal überträgt. Bakterien können aus Nematoden freigesetzt werden, indem man sterile mikrobiologische Techniken nach einer von zwei Methoden anwendet:
a) Einzelne Nematodenlarven werden in einen Tropfen steriler Salzlösung auf einem mit der Flamme sterilisierten Objektträger übertragen. Dann werden die Nematoden an mehreren Stellen längs ihres Körpers aufgeschnitten. Der Tropfen der Salzlösung wird dann komplett mit den toten Nematoden unter Verwendung einer sterilen Pasteurpipette auf eine 9-cm- Petri-Schale mit Nähragar übertragen, wo er mit Hilfe eines alkoholflambierten Glasausbreiters über die Oberfläche verteilt wird.
b) Viele oberflächlich sterilisierte Nematoden werden in 1 ml steriler Ringer-Lösung suspendiert, die in einen 5-ml- Teflon-Gewebehomogenisator übertragen wird. Die Nematodensuspension wird gemahlen und dann in 9 ml sterile Nährlösung übertragen. Die Nährlösung wird kräftig geschüttelt, und es wird eine Verdünnungsreihe hergestellt. 0,1-ml- Aliquote jeder Verdünnung werden auf Nähragarplatten gegeben, mit Hilfe eines Glasausbreiters verteilt und inkubiert. Nach 48 Stunden Inkubation bei 25ºC können anhand der Kolonienmorphologie verschiedene Bakterienisolate ausgewählt werden, aus denen mit mikrobiologischen Standardtechniken Subkulturen hergestellt werden.

(ii) Isolierung von Bakterien aus xenischen Schaumstoffflockenkulturen

Schaumstoffflocken, die Nematoden und Bakterien enthalten, werden mit Hilfe einer alkoholfiambierten Zange aus gedeihenden xenischen Kulturen entnommen. Jede Flocke wird in ein Röhrchen gegeben, das 10 ml sterile Nährlösung enthält, und geschüttelt. Verdünnungsreihen von der resultierenden Bakterien/Nematoden- Suspension werden hergestellt, und 0,1-ml-Aliquote verschiedener Verdünnungen werden auf Nähragarplatten verteilt und inkubiert.

(iii) Isolierung von Bakterien aus lebenden, mit Nematoden infizierten Nacktschnecken

P. hermaphrodita/P. neopapillosa dringt in den Mantelbereich von Nacktschnecken ein und vermehrt sich dort, und aus diesem Bereich können Bakterien isoliert werden. Der Mantel wird zuerst mit trockenen Wattekugeln abgetupft, um so viel Schleim wie möglich zu entfernen. Dann wird die Oberfläche des Mantels mit 70% (v/v) Ethanol abgetupft, um den Mantel oberflächlich zu sterilisieren. Eine mit der Flamme sterilisierte Nadelsonde wird verwendet, um den Mantel einzustechen; dann werden Flüssigkeitstropfen am Ende der Sonde direkt auf Nähragarplatten übertragen, wo sie mit Hilfe eines Glasausbreiters verteilt und inkubiert werden.

(iv) Isolierung von Bakterien aus toten Nacktschnecken

Gewebeabstriche von toten Nacktschnecken, die nach einer Infektion mit Nematoden gestorben und in Nematoden eingehüllt sind, werden mit Hilfe einer bakteriologischen Öse in Nährlösung suspendiert. Von dieser Suspension wird eine Verdünnungsreihe hergestellt, und 0,1-ml-Aliquote werden auf Nähragarplatten verteilt und inkubiert.

Beispiel 3. Verfahren zum Auswählen von Bakterien, mit denen sich die Nematoden gut züchten lassen.

Bevor es möglich ist, verschiedene Bakterien daraufhin zu durchmustern, ob sich Nematoden damit züchten lassen, muß man zunächst Nematoden frei von Bakterien erhalten. Der weibliche Fortpflanzungstrakt von Nematoden ist im allgemeinen steril (Poinar und Hansen, Helminthological Abstracts, Series B [1986] , Vol 55, Nr. 3, S. 61-81), und so sind auch J1-Jungtiere unmittelbar nachdem Schlüpfen steril. Einzelne trächtige erwachsene Nematoden, die aus Nematodenkulturen oder Nacktschnecken ausgewählt wurden, werden auf ein steriles Uhrglas übertragen, das 0,02% (w/v) Thimerosal enthält; dort läßt man sie über Nacht bei 10ºC. Während dieser Zeit schlüpfen aus Eiern innerhalb der Erwachsenen Jungtiere (J1) und werden freigesetzt. Am folgenden Tag werden die Jungtiere mit der Pipette in Zentrifugenröhrchen übertragen, die mit 10 ml vierfach verdünnter Ringer-Lösung gefüllt sind, die 500 Einheiten/ml Penicillin G und Streptomycinsulfat enthält. Die Jungtiere werden weitere 24 Stunden bei 10ºC in dieser Lösung gehalten. Dann werden sie durch leichte Zentrifugation (10 Minuten mit 50 x g) konzentriert, vom Boden des Röhrchens entnommen, in frischer steriler vierfach verdünnter Ringer-Lösung resuspendiert und erneut heruntergeschleudert. Das Resuspendieren und Zentrifugieren wird noch einmal wiederholt, um jede Spur von Antibiotika zu entfernen. Dann werden die Larven in ein steriles Uhrglas gegeben. Unter Verwendung von Mikropipetten, die durch Ausziehen von Tropfpipetten in einer Bunsen-Flamme auf eine Weite von ungefähr 0,1 mm hergestellt werden, können die Nematoden dann einzeln gehandhabt werden. Nematodenkulturen werden in 3-cm-Petri-Schalen auf Nierenagar (wie in Beispiel 1 beschrieben) gezüchtet. Eine bakteriologische Öse voll einer 18 Stunden alten Nährlösungskultur der zu testenden Bakterien wird über eine Hälfte jeder der 30-mm-Nierenplatten ausgestrichen. Zehn axenische Jungnematoden, die wie in Beispiel 8 beschrieben erhalten wurden, werden auf der Hälfte ohne Bakterien auf den Rand der Petri-Schale gegeben, so daß sich die Nematoden wenigstens 15 mm weit über die bakterienfreie Oberfläche bewegen müssen, bevor sie das Testbakterium erreichen. Die Platten werden bei 15ºC inkubiert. Eventuell mit den Nematoden eingeschleppte Bakterien, die während des Axenisierungsverfahrens nicht abgetötet wurden, bilden auf dieser Hälfte der Platte sichtbare Kolonien, und die Platten können dann verworfen werden. Nach einer Woche werden die Platten verworfen, die eine bakterielle Kontamination in der "sauberen" Hälfte zeigen. Nach zwei Wochen kann die Zahl der auf den Platten vorhandenen Nematoden durch direkte mikroskopische Untersuchung ermittelt werden; der Deckel der Petri-Schale wird entfernt und durch einen anderen Deckel ersetzt, der zuvor mit einem Zählgitter markiert wurde. Nach drei Wochen können die Nematoden erneut gezählt werden, indem man die Nematoden in einem bekannten Volumen Wasser von dem Agar herunterspült und mit Hilfe einer 1-ml-Peter-Zählkammer die in der resultierenden Suspension vorhandenene Zahl ermittelt.
Neun verschiedene Bakterienspezies, die mit den beschriebenen Verfahren gewonnen wurden, wurden daraufhin durchmustert, ob sich Nematoden damit züchten lassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Zahl der Phasmarhabditis-Nematoden pro Petri-Schale nach zwei bzw. drei Wochen Wachstum in monoxenischer Kultur mit verschiedenen Bakterien. Die Daten wurden für die statistische Analyse logarithmisch transformiert.
S.E.D. zum Vergleich der Logarithmen der Nematodenzahlen 0,204, 128 D.F.
Nach drei Wochen gab es hochsignifikante (P < 0,001) Unterschiede in der Fähigkeit der Bakterien, das Wachstum der Nematoden zu ermöglichen.

Beispiel 4. Verfahren zur Massenkultur von Phasmarhabditis- Nematoden durch Schaumstoffflockenkultur

Die Nematoden können unter Verwendung ähnlicher Techniken, wie sie für die Massenzucht von insektenparasitischen Nematoden entwickelt wurden (Bedding, in Nematologica (1981), Vol 27, S. 109- 114, und Annals of Applied Biology (1984) , Vol 104, S. 117-120) auf Polyether-Polyurethan-Schaumstoffflocken in Masse kultiviert werden. Das Medium besteht aus 65% Schweineniere, 15% Rinderfett und 25% Wasser (Gew.-%). Die Niere wird in kleine Stücke zerhackt, das Wasser wird hinzugefügt, und darin wird das Gemisch in einem Waring-Mischer Itverflüssigtfl Das Rinderfett wird in einer großen Pfanne über einem Gasring geschmolzen, und dann wird das Nierenhomogenisat hinzugefügt und gründlich mit dem Fett gemischt und gekocht, bis es braun ist. Dann wird das Gemisch in den Waring-Mischer zurückgegeben und noch einmal gemahlen. Dieses Gemisch wird dann mit Schaumstoffflocken gemischt, wobei 12 Gewichtsteile Medium zu 1 Teil Schaumstoffflocken gegeben werden. Dieses Medium kann auf Spitzkolben oder Autoklavenbeutel verteilt werden, wie es von Bedding (1984) beschrieben wurde. Schaumstoffflockenkulturen werden gleichzeitig mit Nematoden und Bakterien beimpft. Jeder Beutel wird oben aufgeschlitzt, und 75 ml einer Übernachtkultur von Bakterien wird hinzugefügt. Die Bakterienkultur kann in Form einer gemischten Mikrobenpopulation, die wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten wurde, oder als Reinkultur eines Bakterienstammes, der wie in Beispiel 3 beschrieben ausgewählt wurde, weil sich die Nematoden gut damit züchten lassen, vorliegen. Nematoden auf Agar aus Petri-Schalen oder auf Schaumstoffflocken aus früheren Beutelkulturen werden hinzugefügt. Die Kulturbeutel werden drei Wochen lang bei 15ºC inkubiert; danach sind im Innern der Beutel viele infektiöse Jungtiere zu sehen, die das verbrauchte Medium übriggelassen haben. Die Nematoden werden mit einer modifizierten Trichterextraktionstechnik ähnlich der, die zum Sammeln von Nematoden aus Bodenproben verwendet wird, von den Schaumstoffflocken abgeerntet. Kupfer-Bodensiebe mit einem Durchmesser von 17,5 cm werden mit einem 17,5-cm-Milchfilter ausgelegt und in 50-cm-Blumentopfuntersetzer gelegt. Die Schaumstoffflocken aus den Beuteln werden bis zu einer Tiefe von ungefähr 2 cm in die Siebe gegeben, und die Blumentopfuntersetzer werden mit Wasser gefüllt, bis der Wasserpegel eben den Boden der Schaumstoffflockenschicht erreicht. Dann läßt man die Siebe über Nacht stehen, und während dieser Zeit schwimmen lebende Nematoden durch die Milchfilter und sammeln sich in dem Wasser darunter.
Nach dem Säubern der Nematodensuspension von verbrauchtem Medium und Bakterien durch mehrmaliges Wechseln des Wassers werden die Nematoden bei 10ºC in belüftetem Wasser aufbewahrt, bis sie benötigt werden.

Beispiel 5. Flüssigkultur monoxenischer Phasmarhabditis-Nematoden

Axenisierte Nematoden wurden mit den geeigneten Bakterien auf einem festen Medium (auf Nierenbasis) kultiviert. Nach 3 Wochen wurden die Nematoden in eine Flüssigkultur übertragen.
Die Nematoden wurden unter den folgenden Bedingungen in Schüttelkolbenkultur gezüchtet:
Medium - 10% Niere, 1% Hefeextrakt, 3,5% Maisöl.
Kolben - 250-ml-Spitzkolben mit 50 ml Medium.
Temperatur - 15ºC.
Schüttelgeschwindigkeit - 200 U/min.
Die Kolben wurden mit 1 ml einer in Nährlösung gezüchteten Bakterienspezies beimpft. Nach 24 Stunden wurden die Nematoden mit sterilem Leitungswasser in die Kolben gespült und drei Wochen inkubiert.
Die Nematoden wurden zweimal mit sterilem Wasser gewaschen und dann gezählt. Dann wurden die Nematoden als Impfmaterial für Kulturexperimente verwendet. Die Nematoden wurden in einer Menge von 3000 Nematoden/ml in Kulturkolben gegeben, die mit Bakterien vorgeimpft worden waren.
Die Nematode wurde mit 4 verschiedenen Bakterien kultiviert. Zu verschiedenen Zeiten während des Kulturzeitraums wurden die Nematoden gezählt. Dauerlarven (die auch als infektiöse Jungtiere bekannt sind) wurden als Nematoden mit zurückbehaltener Cuticula des zweiten Stadiums bewertet.
Nach 20 Tagen Inkubation wurden die Nematoden gezählt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2. Flüssigkultur monoxenischer Nematoden
Eine Massenproduktion der Nematode durch Flüssigkultur in Gefäßen für Fermentation in großem Maßstab auf der Basis der in diesem Beispiel beschriebenen Bedingungen kann der Fachmann leicht erreichen.

Beispiel 6. Verfahren zur Auswahl von Bakterien, die Pathogenität gegenüber Nacktschnecken verleihen

Nematoden, die wie in Beispiel 5 beschrieben mit zwei Bakterienspezies, Providencia rettgeri und Moraxella phenylpyruvica, in monoxenischer Kultur gezüchtet wurden, wurden auf Pathogenität gegenüber der Nacktschnecke Deroceras reticulatum getestet. Kunststoffboxen (135 x 75 x 50 mm) wurden mit 440 g luftgetrockneten Bodenaggregaten mit einem Durchmesser von 12,5 bis 25 mm gefüllt, die durch Sieben erhalten worden waren. Die Bodenaggregate wurden aus jeder Box entfernt und in 80 ml Wasser getränkt.
Unbehandelte Boxen ohne hinzugefügte Nematoden und Boxen, die mit Nematoden in fünf Dosen (15 000, 23 000, 35 000, 55 000 und 75 000 Nematoden pro Kunststoffbox) behandelt worden waren, wurden verwendet. Für beide Chargen monoxenischer Nematoden wurden für alle sechs Behandlungen jeweils zwei identische Boxen verwendet. Die Nematoden wurden gezählt, und die passende Zahl wurde in 50 ml Leitungswasser suspendiert. Die Aggregate wurden wieder in die Box zurückgegeben, und die Nematodensuspension wurde Schicht für Schicht gleichmäßig über die Oberfläche der Aggregate verteilt. Zehn D. reticulatum wurden zwischen die mittleren Schichten jeder Box gesetzt. Über die Aggregate in den Boxen ohne hinzugefügte Nematoden wurden 50 ml Leitungswasser gleichmäßig verteilt, so daß der Endfeuchtigkeitsgehalt in jeder Box ungefähr 30% (w/w) betrug.
Die Nacktschnecken wurden während einer Infektionszeit von fünf Tagen bei 10ºC in dem Boden gehalten; danach wurden sie entfernt und auf Petri-Schalen übertragen, wo sie einzeln gehalten und mit Scheiben von Chinakohlblättern gefüttert wurden. Nach weiteren neun Tagen bei 10ºC (vierzehn Tage nach dem ersten Kontakt mit den Nematoden) wurde die Zahl der toten und der lebenden Nacktschnecken aufgezeichnet. Die Sterblichkeitsdaten wurden um die Hintergrundsterblichkeit korrigiert, die in den unbehandelten Boxen zu sehen war. Die korrigierten Sterblichkeitsdaten wurden für Nematoden, die mit beiden Bakterien in monoxenischer Kultur gezüchtet wurden, gegen die Nematodendosis aufgetragen.
Bei diesem Experiment waren mit M. phenylpyruvica und Pr. retlgeri gezüchtete Nematoden pathogen gegenüber D. reticulatum. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um andere Bakterienstämme, z.B. P. fluorescens Stamm 141, die Pathogenität gegenüber Nacktschnecken verleihen, auszuwählen.

Beispiel 7. Zubereitung von Phasmarhabditis-Nematoden

Monoxenische Phasmarhabditis-Nematoden, die wie in Beispiel 5 beschrieben zusammen mit M. phenylpyruvica Stamm 48 gezüchtet worden waren, wurden durch Zentrifugation geerntet und in einem wiederholten Vorgang des Absetzens und Resuspendierens in frischem Wasser mit Wasser gewaschen, bis die Nematoden frei von restlichem Kulturmedium waren. Die gewaschenen Nematoden wurden durch Zentrifugieren konzentriert, so daß man eine wäßrige Nematodenpaste erhielt, die Nematoden im Bereich von 0,1 x 10&sup6; bis 2,0 x 10&sup6; pro Gramm Paste enthielt. Die Nematodenpaste wurde mit einem Calciummontmorillonit-Ton gemischt, so daß man eine wasserdispergierbare Pulverzusammensetzung erhielt, die 0,05 x 10&sup6; bis 1,8 X 10&sup6; Nematoden pro Gramm (Naßgewicht) enthielt.

Beispiel 8. Die Fähigkeit von durch Schaumstoffflockenkultur gewonnenen Phasmarhabditis-Nematoden, verschiedene Nacktschneckenarten zu töten

Phasmarhabditis-Nematoden, die unter Verwendung der in Beispiel 4 beschrieben Verfahren auf einer gemischten Bakterienflora gezüchtet worden waren, wurden einem Bioassay mit sechs schädlichen Nacktschneckenarten unterzogen. Bei diesen handelte es sich um Deroceras reticulatum, D. caruanae, Arion ater, A. intermedius, A. distinctus und Tandonia (Milax) sowerbyi. Die Nacktschnecken wurden im November 1990 in der Long Ashton Research Station in Fallen mit Kleie als Köder gesammelt. Alle Nacktschnecken waren erwachsen mit Ausnahme von A. ater, bei der es sich um Jungtiere handelte (mittleres Gewicht 770 mg) . Die Nematoden wurden wie in Beispiel 4 beschrieben in xenischen Schaumstoffflocken-Beutelkulturen gezüchtet. Luftgetrocknete grobe Bodenaggregate mit einem Durchmesser von 12,5 bis 25 mm, die durch Sieben erhalten worden waren, wurden in einer Menge von 440 g luftgetrockneten Bodenaggregaten pro Box in Kunststoffboxen (135 x 75 x 50 mm) gegeben. Ungefähr 1,9 x 10&sup5; infektiöse Larven von Phasmarhabditis, die in 130 ml Leitungswasser suspendiert waren, wurden in jede der mit Nematoden zu behandelnden Boxen gegeben. In die unbehandelten Boxen wurden 130 ml Leitungswasser ohne Nematoden gegeben. Zehn Nacktschnecken wurden in jede Box gegeben, mit Ausnahme der größeren Nacktschneckenarten (T. sowerbyi und A. ater), von denen in jeder Box fünf Nacktschnecken gehalten wurden. Siebzehn A. distinctus-Nacktschnecken wurden mit Nematoden behandelt, und achtzehn wurden als unbehandelte Kontrollen gehalten. Von allen anderen Arten wurden zwanzig Nacktschnecken behandelt, und weitere zwanzig wurden als unbehandelte Kontrollen belassen. Die Nacktschnecken wurden während einer Infektionszeit von fünf Tagen in dem Boden gelassen; danach wurden die Bodenboxen zerlegt, und die Zahl der toten Nacktschnecken wurde aufgezeichnet. Die überlebenden Nacktschnecken wurden in mit feuchtem Filterpapier ausgelegten 9-cm-Petri-Schalen übertragen, wo sie einzeln gehalten und mit Scheiben von Chinakohlblättern gefüttert wurden. Während der Dauer jedes Bioassays wurden die Bodenboxen und die Petri- Schalen auf 10ºC gehalten. In Abständen von drei Tagen wurde die Zahl der toten Nacktschnecken noch zweimal aufgezeichnet. Die Sterblichkeiten einzelner Nacktschneckenspezies in behandelten und unbehandelten Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung eines chi²-Tests miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. Prozentuale Sterblichkeit bei verschiedenen Nacktschneckenarten 8, 11 und 14 Tage nach der Behandlung mit Nematoden oder ohne Behandlung.
Nach der fünftägigen Infektionszeit waren die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen mit Nematoden behandelten und unbehandelten Nacktschnecken bei D. reticulatum, D. caruanae und A. inter medius hochsignifikant (P < 0,001). Die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen behandelten und unbehandelten Nacktschnecken waren in diesem Stadium bei den anderen drei Arten nicht signifikant. Nach acht Tagen waren die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen behandelten und unbehandelten Nacktschnecken bei allen getesteten Arten signifikant (P < 0,001 für D. reticulatum, D. caruanae, T. sowerbyi und A. distinctus und P < 0,01 für A. ater und A. intermedius). Am 11. Tag waren alle mit Nematoden behandelten Nacktschnecken gestorben. Die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen behandelten und unbehandelten Nacktschnecken waren bei allen Arten signifikant (P < 0,01 für A. interrnedius und P < 0,001 für alle anderen Arten). Der Unterschied war bei A. intermedius nicht groß, da auch--viele der unbehandelten Schnecken gestorben waren.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß Phasmarhabditis-Nematoden alle getesteten Nacktschneckenarten töten können.

Beispiel 9. Die Fähigkeit von durch Schaumstoffflockenkultur gewonnenen Phasmarhabditis-Nematoden, Pflanzenschäden einzudämmen, die durch die Graue Kellerschnecke Deroceras reticulatum verursacht wurden, unter Feldbedingungen

Ein Miniparzellen-Feldexperiment wurde durchgeführt, um Nacktschneckenschäden an Chinakohlpflänzchen in unbehandelten Parzellen, mit Methiocarb-Pellets (das allgemein als die beste verfügbare Chemikahe für die Nacktschneckenbekämpfung gilt) behandelten Parzellen und Parzellen, die mit einer einzigen hohen Dosis von wie in Beispiel 3 beschrieben durch Schaumstoffflockenkultur mit einer gemischten Bakterienflora gewonnenen Nematoden behandelt wurden, miteinander zu vergleichen. Der Test wurde in einer Reihe von 40 Mikroparzellen durchgeführt, die einen Lehmboden auf einem Bett aus grobem Kies enthielten. Die Parzellen waren 70 x 70 cm groß und 30 cm tief und waren entweder durch Holz- oder Betonumgrenzungen voneinander getrennt, auf die ein 10 cm hoher Zaun aus einem 0,8-mm-Kupfermaschengewebe montiert war, der als Sperre gegenüber einer Bewegung von Nacktschnecken zwischen den Parzellen wirkte.
Sechsunddreißig der Parzellen wurden zwischen März und Juni 1989 mit Nacktschnecken bevölkert. Zu den übrigen 4 Parzellen, die als Maß für die Nacktschneckenpopulation des Standortes verwendet wurden, wurden keine Nacktschnecken gegeben. Fünf auf dem Feld gesammelte erwachsene D. reticulatum wurden in jede der zu bevölkernden Parzellen gegeben. Diese Nacktschnecken waren wenigstens zwei Wochen lang in Quarantäneboxen gehalten worden, um sicherzustellen, daß sie keine Parasiten trugen. Im Verlaufe der dreimonatigen Zeitspanne wurden in jede Parzelle vierunddreißig nachgezüchtete neugeborene D. reticulatum gegeben, so daß am Anfang des Experiments Nacktschnecken in vielen verschiedenen Entwicklungsstadien vorhanden waren.
Das Experiment beinhaltete neun identische Gruppen aus vier statistisch verteilten Blöcken, wobei jeder Block aus zwei unbehandelten Parzellen, einer mit Nematoden behandelten Parzelle und einer mit Methiocarb-Pellets behandelten Parzelle bestand.
1,05 x 10&sup6; Nematoden wurden in 900 ml Leitungswasser suspendiert und mit Hilfe einer Gießkanne mit Brause über jede Parzelle gegossen. Weitere 100 ml Leitungswasser wurden verwendet, um die Kanne auszuspülen, und wurden dann auf die Parzellen gegossen. Auf die unbehandelten und mit Methiocarb behandelten Parzellen wurde ebenfalls ein Liter Leitungswasser gegeben. Methiocarb- Pellets wurden in der empfohlenen Feldmenge (5,5 kg/ha = 0,275 g/Parzelle) hinzugefügt. Die Pellets wurden abgewogen und von Hand gleichmäßig über die Parzellen verteilt. Die Parzellen wurden während des gesamten Experiments aus einem oberirdischen Rohr berieselt, um zu gewährleisten, daß die Bedingungen für die Nacktschneckenaktivität günstig waren.
Am Anfang des Experiments wurden junge, in einem Gewächshaus gezogene Chinakohlpflänzchen ausgesetzt, in jeder Parzelle neun Pflänzchen, die zu 3 x 3 in einem Quadrat angeordnet waren. Diese wurden zweimal wöchentlich untersucht, und das Ausmaß der Nacktschneckenschäden an jedem Pflänzchen wurde auf 5% genau abgeschätzt.
Zwei Wochen nach dem Pflanzen waren die Pflänzchen in einigen der unbehandelten Parzellen vollständig zerstört; daher wurden die Reste der alten Pflänzchen aus allen Parzellen entfernt und neue gepflanzt. Dies wurde nach weiteren zwei Wochen wiederholt. Nach zwei weiteren Wochen war das Experiment zu Ende (insgesamt sechs Wochen) . Während des gesamten Verlaufs des Experiments wurden die Schäden an den Pflänzchen zweimal pro Woche aufgezeichnet. Die Kupfermaschenumgrenzungen zwischen Parzellen in einem der Behandlungsblocks (Block 9) lösten sich nach den ersten vier Wochen, was eine Bewegung der Nacktschnecken zwischen den Parzellen erlaubte; daher wurden diese Parzellen ignoriert, und die für die fünfte und sechste Woche gezeigten Ergebnisse repräsentieren nur 8 Blocks.
Am Ende des Experiments wurden aus jeder Parzelle der restlichen 8 Blöcke zwei Bodenproben von 25 x 25 cm und 10 cm Tiefe entnommen, wobei eine Probe aus der Mitte und eine aus der südöstlichen Ecke jeder Parzelle entnommen wurde. Die Proben wurden in der LARS-Nacktschnecken-Extraktionseinheit (Glen & Wiltshire, in Proceedings 1986 British Crop Protection Conference (1986), Vol 1, S. 139-144) über neun Tage hinweg allmählich geflutet, und die Nacktschnecken wurden täglich von der Oberfläche entfernt.
Das Ausmaß der Nacktschneckenschäden an den Pflänzchen bei jeder Behandlung im Verlaufe des Experiments ist in Fig. 1 gezeigt.
Eine Varianzanalyse nach einer Winkeltransformation, um die Varianz zu stabilisieren, zeigt, daß sowohl die Methiocarb-Pellets als auch die Nematoden das Ausmaß der Nacktschneckenschäden an den Pflänzchen signifikant (P < 0,001) reduzierte. Bei der ersten Überprüfung (vier Tage nach der Behandlung) waren in den mit Nematoden behandelten Parzellen signifikant (P ( 0,05) größere Schäden als in den mit Methiocarb behandelten Parzellen, aber als die Pflänzchen nach den ursprünglichen Schäden weitergewachsen waren, wurde der Unterschied zwischen den mit Nematoden und den mit Methiocarb behandelten Parzellen geringer. Am Ende der ersten Woche zeigten die mit Nematoden behandelten Parzellen weniger Schäden als die mit Methiocarb behandelten Parzellen, aber dieser Unterschied war nicht signifikant. Nach 17 Tagen (erste Untersuchung der zweiten Charge von Pflänzchen) wiesen die mit Nematoden behandelten Parzellen signifikant (P < 0,05) weniger Schäden auf als die mit Methiocarb behandelten Parzellen, und dies bleib so (P < 0,01) bis zum Ende des Experiments.
Drei Nacktschneckenarten wurden in den Bodenproben gefunden, Deroceras reticulatum, Deroceras caruanae und Boettgerilla pallens, In allen Parzellen wurden nur 2 D. caruanae gefunden, aber 89 B. pallens wurden gefunden gegenüber 55 D. reticulatum. Die B. pallens wurden vermutlich einige Zeit zuvor in die Parzellen eingeschleppt und hatten sich vermehrt und sie vollständig besiedelt. Die bevorzugte Nahrung dieser Nacktschnecke ist nicht bekannt, aber in Labortests schädigte sie während drei Wochen keine Chinakohlblätter, obwohl keine alternative Futterquelle vorhanden war. Es ist daher unwahrscheinlich, daß diese Nacktschnecke bei diesem Versuch Schäden an den Pflänzchen verursachte. In den Bodenproben aus den vier Parzellen, in die keine D. reticulatum gegeben wurden, wurden auch keine gefunden. Dies läßt vermuten, daß im Unterschied zu B. pallens vor Beginn des Experiments nur wenig D. reticulatum, falls überhaupt welche, in den Parzellen vorhanden waren.
Die Gesamtzahl der Nacktschnecken und die aus den unterschiedlichen Behandlungen entnommene Biomasse wurden für die statistische Analyse in Quadratwurzeln transformiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
Aus den mit Nematoden behandelten Parzellen wurden signifikant weniger Nacktschnecken entnommen als von den unbehandelten (P < 0,01 für alle Nacktschneckenarten und für D. reticulatum allein), und auch aus den mit Methiocarb behandelten Parzellen wurden weniger entnommen als von den unbehandelten (P < 0,05 für alle Nacktschneckenarten und für D. reticulatum allein) . Aus den mit Nematoden behandelten Parzellen wurden zwar weniger Nacktschnecken entnommen als von den mit Methiocarb behandelten, jedoch war dieser Unterschied nicht signifikant. Aus den mit Nematoden behandelten Parzellen wurden keine D. reticulatum entnommen, was vermuten läßt, daß diese Art in diesen Parzellen fast ganz beseitigt wurde. Die Zahl der B. pallens wurde durch die Nematoden oder Methiocarb nicht wesentlich beeinflußt, obwohl in mit Nematoden behandelten Parzellen weniger B. pallens gefunden wurden als in den unbehandelten Parzellen.

Beispiel 10. Die Fähigkeit von monoxenischen Phasmarhabditis- Nematoden, verschiedene Arten schädlicher Mollusken zu töten

Monoxenische Phasmarhabditis-Nematoden, die wie in Beispiel 5 beschrieben in Verbindung mit M. phenylpyruvica Stamm 48 gezüchtet worden waren, wurden einem Bioassay mit verschiedenen Arten schädlicher Mollusken einschließlich Monacha cantiana (einer Gehäuseschnecke), wie er in Beispiel 8 beschrieben ist, unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Prozentuale Sterblichkeit bei verschiedenen Arten schädlicher Mollusken nach der Behandlung mit monoxenischen Nematoden oder ohne Behandlung.
Die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen behandelten und unbehandelten Mollusken waren bei allen getesteten Arten signifikant (P < 0,001), was darauf hinweist, daß alle getesteten Arten schädlicher Mollusken auf mit M. phenylpyruvica Stamm 48 monoxenisiertem Phasmarhabditis sp. ansprachen. Das Wirkungsspektrum der monoxenischen Nematoden ist im Vergleich zu dem xenischer Nematoden unverändert.
Monoxenische Phasmarhabditis-Nematoden wurden in Verbindung mit M. phenylpyruvica oder P. rettgeri gezüchtet, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, und einem Bioassay mit der Nacktschneckenart D. reticulatum, wie er in Beispiel 8 beschrieben ist, mit verschiedenen Dosierungen unterzogen. Die Ergebnisse sind in Figur 3 zusammengefaßt. Beide Typen monoxenischer Nematoden sind gegen D. reticulatum aktiv.

Beispiel 11. Die Fähigkeit monoxenischer phasmarhabditis-Nematoden, Pflanzenschäden einzudämmen, die durch die Graue Kellerschnecke Deroceras reticulatum verursacht wurden, unter Feldbedingungen

Ein Feldversuch wurde durchgeführt, um die Nacktschneckenschäden an Winterweizen (cv Mercia) in unbehandelten Parzellen, mit Methiocarb-Pellets behandelten Parzellen und Parzellen, die mit verschiedenen Nematodendosen behandelt wurden, miteinander zu vergleichen. Monoxenische Nematoden wurden in Verbindung mit M. phenylpyruvica Stamm 48 gewonnen, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, und in Ton als wasserdispergierbares Pulver zubereitet, das 0,36 x 10&sup6; Nematoden pro Gramm enthielt (Naßgewicht), wie es in Beispiel 7 beschrieben ist. Die Nematoden wurden unmittelbar nach dem Aussäen der Saat als wäßriger Sprühregen in einem Volumen, das 1100 Liter/Hektar entsprach, aufgetragen. Methiocarb-Pellets wurden in der empfohlenen Feldmenge (5,5 kg/Hektar) von Hand aufgetragen.
Oberflächenfallen und Bodenproben wurden verwendet, um die Nacktschneckenpopulation in den Feldversuchparzellen zu überwachen. Viele verschiedene Nacktschneckenarten einschließlich Deroceras reticulatum, Arion silvaticus, Arion subfuscus, Arion ater, Tandonia sowerbyi und Milax gagates wurden in den Parzellen gefunden, aber D. reticulatum war die bei weitem vorherrschende Spezies.
Sechs Wochen nach dem Aussäen wurden die Parzellen auf das Hervorkommen von Weizensämlingen hin beurteilt, was eine Abschätzung der lethalen Schäden durch Nacktschnecken (d.h. Reduktion im Pflanzenbestand) ergibt, und die sublethalen Schäden durch Nacktschnecken (d.h. Pflanzenfraß durch Nacktschnecken) wurden durch visuelle Bewertung zufällig ausgewählter Pflanzen abgeschätzt. Die mittlere Anzahl der hervorgekommenen Weizenpflanzen pro 0,5 m Länge Saatrille für die unterschiedlichen Behandlungen sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5. Mittlere Anzahl der hervorgekommenen Weizenpflanzen pro 0,5 m Länge Saatrille für die verschiedenen Behandlungen in dem Feldversuch (Bewertungen wurden 6 Wochen nach dem Aussäen vorgenommen)
S.E.D. = 1,314 (399 d.f.)
Man erkennt eindeutig eine Zunahme der Anzahl der hervorgekommenen Pflanzen mit der Erhöhung der Nematodendosis; also bewirkten die Nematodenbehandlungen eine Reduktion der lethalen Schäden durch Nacktschnecken.
Die Daten über den mittleren Prozentanteil der durch Nacktschnecken beschädigten Blattfläche wurden vor der Analyse in Winkel transformiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6. Mittlere anguläre prozentuale Blattfläche, die durch Nacktschnecken beschädigt wurde, pro Pflanze für die verschiedenen Behandlungen in dem Feldversuch (Bewertungen wurden 6 Wochen nach dem Aussäen vorgenommen)
S.E.D. = 3,395 (24 d.f.)
Es gab signifikante Unterschiede in der durch Nacktschnecken beschädigten Blattfläche zwischen Behandlungen den (P < 0,001), wobei Pflanzen, die mit den drei höchsten Nematodendosen behandelt wurden, signifikant (P < 0,01) geringere Nacktschneckenschäden aufwiesen als Pflanzen aus den unbehandelten Parzellen. Pflanzen aus Parzellen, die mit der höchsten Nematodendosis behandelt wurden, wiesen signifikant (P < 0,05) geringere Nacktschneckenschäden auf als Pflanzen aus den mit Methiocarb behandelten Parzellen. Die Nematoden sind also in der Lage, die sublethalen Nacktschneckenschäden gut einzudämmen.

Beispiel 12. Die Fähigkeit von monoxenischen Phasmarhabditis- Nematoden, die Wasserschnecke Lymnaea stagnalis zu töten

Monoxenische Nematoden wurden wie in Beispiel 5 beschrieben in Verbindung mit M. phenylpyruvica Stamm 48 gezüchtet und in Ton als wasserdispergierbares Pulver zubereitet, das ungefähr 0,36 x 106 Nematoden pro Gramm enthielt (Naßgewicht), wie es in Beispiel 7 beschrieben ist. Jeweils zehn Exemplare der Wasserschnecke Lymnaea stagnalis wurden in fünf saubere Fischbecken gesetzt, die mit Teichwasser halb gefüllt waren und einige Wasserpflanzen enthielten, die als Nahrungsquelle für die Schnecken dienten. Die Becken wurden mit Hilfe einer kleinen Luftpumpe belüftet und bei 15ºC gehalten.
In jedes von vier Becken wurden ungefähr 6 x 10&sup6; Nematoden in Form der wasserdispergierbaren Pulverzubereitung gegeben. In das fünfte Becken, das als Kontrolle diente, wurden keine Nematoden gegeben. Nach drei Tagen Inkubation betrug die mittlere Schnekkensterblichkeit in den mit Nematoden behandelten Becken 45% und stieg nach sechs Tagen auf 100%. Die Sterblichkeit in dem unbehandelten Kontrollbecken nach sechs Tagen Inkubation betrug null.

Claims

1. Verwendung von Phasmarhabditis-Nematoden zur Bekämpfung von Schädlingen in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder von Schädlingen für die menschliche und tierische Gesundheit.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dei Nematoden um P. neopapillosa oder P. herrnaphrodita handelt.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2 in Verbindung mit einem geeigneten wachstumsfördernden Bakterium oder in Verbindung mit einer Gemeinschaft geeigneter wachstumsfördernder Bakterien.

4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Bekämpfung schädlicher Mollusken in der Landwirtschaft und im Gartenbau, vorzugsweise zur Bekämpfung schädlicher Nacktschnecken der Familie Limacidae, insbesondere Deroceras reticulatum und Deroceras caruanae, zur Bekämpfung schädlicher Nacktschnecken der Familie Arionidae, insbesondere Arion ater, Arion intermedius und Arion distinctus, zur Bekämpfung schädlicher Nacktschnecken der Familie Milacidae, ins besondere Tandonia sowerbyi, oder zur Bekämpfung schädlicher Gehäuseschnecken der Familie Helicidae, insbesondere Monacha cantiana.

5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Bekämpfung von Mollusken, die schädlich für die menschliche und tierische Gesundheit sind, vorzugsweise zur Bekämpfung schädlicher Gehäuseschnecken der Gattung Lymnaea.

6. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nematoden als Dauerlarven angewendet werden.

7. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nematoden in Verbindung mit Bakterien, die das Wachstum der Nematoden fördern, angewendet werden.

8. Stamm von Moraxella phenylpyruvica 48, von dem eine Probe unter der Zugriffsnummer NCIMB 40508 hinterlegt wurde, oder eine Variante, abgeleitete Form oder Mutante davon mit der Fähigkeit, das Wachstum von Phasmarhabditis-Nematoden zu fördern und deren Pathogenität gegenüber Mollusken zu induzieren.

9. Stamm von Pseudomonas fluorescens 141, von dem eine Probe unter der Zugriffsnummer NCIMB 40509 hinterlegt wurde, oder eine Variante, abgeleitete Form oder Mutante davon mit der Fähigkeit, das Wachstum von Phasmarhabditis-Nematoden zu fördern und deren Pathogenität gegenüber Mollusken zu induzieren.

10. Zusammensetzung zur Bekämpfung schädlicher Mollusken in der Landwirtschaft, im Gartenbau und von Mollusken, die schädlich für die menschliche und tierische Gesundheit sind, umfassend eine Nematoden-Spezies der Gattung Phasmarhabditis in Verbindung mit einem geeigneten wachstumsfördernden Bakterium oder einer Gemeinschaft geeigneter wachstumsfördernder Bakterien sowie einen geeigneten Träger oder ein geeignetes Einkapselungsmittel.

11. Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei die Nematode in Form von Dauerlarven vorliegt.

12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei der Spezies um P. neopapillosa oder P. hermaphrodita handelt.

13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei das wachstumsfördernde Bakterium aus

Pseudomonas fluorescens,

Providencia rettgeri,

Serratia proteomaculans,

Aeromonas salmonicida,

Moraxella phenylpyruvica,

Bacillus cereus,

Flavobacterium odoratum,

Flavobacterium brevi

ausgewählt ist und es sich vorzugsweise um den Moraxellaphenylpyruvica-Stamm NCIMB 40508 oder den Pseudomonasfluorescens-Stamm NCIMB 40509 handelt.

14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei der Träger ein Ton ist.

15. Wasserdispergierbare Pulverzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend Calcium-Montmorillonit-Ton, Wasser und Nematoden, wobei die Nematodenkonzentration 0,1 x 10&sup6; bis 2,0 x 10&sup6; pro Gramm (Naßgewicht) 1 vorzugsweise 0,3 x 10&sup6;6 bis 0,8 x 10&sup6; pro Gramm (Naßgewicht), beträgt.

16. Verfahren zur Gewinnung von Nematoden zur Bekämpfung von Mollusken, umfassend das Kultivieren von Phasmarhabditis- Nematoden in einem flüssigen Medium, das Vorimpfen des Wachstumsmediums mit wenigstens einem wachstumsfördernden und pathogenitätsinduzierenden Bakterium sowie das Gewinnen von Dauerlarven.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das wachstumsfördernde Bakterium aus

Pseudomonas fluorescens,

Providencia rettgeri,

Serratia proteomaculans,

Aeromonas salmonicida,

Moraxella phenylpyruvica,

Bacillus cereus,

Flavobacterium odoratum,

Flavobacterium brevi

ausgewählt ist und es sich vorzugsweise entweder um Moraxella phenylpyruvica oder um Pseudomonas fluorescens handelt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei das Wachstumsmedium eine Quelle für Vitamine und Mineralstoffe, eine Quelle für Triglyceride und eine Quelle für Protein enthält und vorzugsweise Niere, Hefeextrakt und Maiskeimöl enthält.

19. Verfahren zur Bekämpfung von Mollusken, umfassend das Auftragen von molluskiciden Nematoden der Gattung Phasmarhabditis in Verbindung mit wachstumsfördernden Bakterien auf eine Fläche, die von den Mollusken befallen ist.