DE3854477T2

DE3854477T2 - Massenherstellung in flüssiger kultur von insektentötenden nematoden.

Info

Publication number: DE3854477T2
Application number: DE3854477T
Authority: DE
Inventors: Milton J Friedman; Susan E Langston; Sonia Pollitt
Original assignee: BIOSYS; Biosys Corp
Current assignee: BIOSYS; Biosys Corp
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1996-03-07
Anticipated expiration: 2008-11-19
Also published as: ATE127658T1; HUT54269A; DE3854477D1; JPH03501803A; CA1318625C; WO1989004602A1; US5023183A; EP0390819A4; JP2723206B2; EP0390819A1; EP0390819B1; HU203637B; HU886759D0

Description

Fachbereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Insektenbekämpfung unter Einsatz biologischer Mittel, die sich besonders gegen Insekten in Landwirtschaft, Garten und Haushalt richtet. Genauer gesagt betrifft sie die Massenerzeugung von den Insekten parasitären Nematoden in Flüssigkulturen unter Verwendung eines verbesserten Nährmediums und optimaler Kulturbedingungen.

Hintergrund der Erfindung

Nematoden stellen eine Gruppe ungefurchter runder Würmer dar, deren Anatomie einfach ist, indem sie über einen einfachen Darm und eine gestreckte Spindelform verfügen. Sie werden in zahlreiche Familien unterteilt, von denen einige autark, andere dagegen parasitär mit Pflanzen oder Tieren leben. Jene, die parasitär mit Insekten leben, werden entomogene oder entomophathogene Nematoden genannt.
Die Ordnung von größtem kommerziellen Interesse für die Insektenbekämpfung ist die Ordnung Rhabditida, welche mehrere Familien umfaßt, von denen viele Mitglieder den Insekten parasitär sind. Auffallend unter diesen Familien sind die Steinernematiden und Heterorhabditiden. Eine allgemeine Erörterung der Klassifikation der Nematoden und ihrer entomogenen Familien findet sich in Poinar, G.O., "The Natural History of Nematodes" (1983), Prentice-Hall, Inc., N.J.
Nematoden haben normalerweise einen Lebenszyklus von fünf Stadien, die sich durch einen Häutungsprozeß beschreiben lassen, bei dem ein neues Oberhäutchen gebildet und das alte abgestoßen wird. Kurz gesagt vermehren sich die adulten Tiere des Stadiums 5, wobei aus den Eiern Larven des Stadiums 1 entstehen, welche unter geeigneten Bedingungen in Stadium 2 übergehen. Normalerweise entwickeln sich Larven des Stadiums 2 einfach zu Larven des Stadiums 3 und dann zu Larven des Stadiums 4, welche dann den Zyklus zum adulten Stadium vollenden. Von Interesse für die Verwendung von Nematoden in der Insektenbekämpfung ist allerdings die Tatsache, daß bei relativ ungünstigen Bedingungen für ein weiteres Wachstum und die Vermehrung sich die Larven des Stadiums 2 der Steinernematid- und Heterorhabditid-Nematoden zu "infektiösen Juvenilen des Stadiums 3" oder "IJs" entwickeln. Unter diesen Bedingungen behalten sie die Kutikula-Eigenschaften des zweiten Stadiums bei, die dann Scheide genannt wird. Diese umschließt den Nematoden vollständig. IJs sind für Insekten infektiös, vollenden ihren Lebenszyklus nach Stadium 4 und vollziehen die adulte Altersstufe auf Kosten des Wirts.
Steinernematid- und Heterorhabditid-IJ-Nematoden stellen ein wirksames Mittel zur Insektenbekämpfung dar. Sie sind morphologisch identifizierbar und leben normalerweise in Oberflächenwasserfilmen in der Umgebung von Schmutzpartikeln. Zum überleben benötigen sie Sauerstoff und Feuchtigkeit, aber keine feste Nahrung, da sie als Energiequelle ihre eigenen Nahrungsreserven verwenden. Wird die Scheide entfernt, so bleiben sie infektiös.
Ein weiterer Aspekt der Biologie der Steinernematid- und Heterorhabditid-Nematoden ist von Bedeutung: Die Nematoden innerhalb dieser Familien leben in Symbiose mit Bakterienspezies, die primär, aber nicht ganz und gar verantwortlich sind für ihre entomophathogenen Eigenschaften. Das Nematodenwachstum ist in Gegenwart eines assoziierten Symbionten begünstigt, und zwar wohl deshalb, weil der Symbiont als eine leicht assimilierte Nahrungsquelle dient.
Für die Massenerzeugung entomogener Nematoden wurde die monoxene Kulturmethode von Bedding [(1984) Ann Appl Biol 104:117-120] vorgeschlagen. Bei der Bedding-Methode wird eine Festphasenmatrix aus mit homogenisiertem tierischem Gewebe imprägniertem Kunststoffschaum verwendet, in der die Nematoden gezüchtet werden. Diese Methode verwendet ein wohlbelüftetes Substrat für das Wachstum sowohl von bakteriellen Symbionten als auch von Nematoden. Das Bedding-Verfahren wird für die Erzeugung von 10&sup9; Nematoden pro Charge angewandt, doch kann in potentiellen Märkten eine Erzeugungsumfang vom 10.000fachen dieser Menge gefordert sein. Eine auf großen Maßstab übertragene Version des Bedding-Verfahrens würde eine teure automatisierte Ausrüstung erfordern, wäre schwer in aseptischem Zustand zu halten und würde Schwierigkeiten bei der Präparierung des Mediums und der Ernte der Nematoden aufwerfen.
Flüssige, monoxene Kulturen entomogener Nematoden werden gewöhnlich in kleinen Tropfen von Insektenhämolymphe gezüchtet. Von axenen Flüssigkulturen wurde berichtet, doch sind diese in ihrer Wirksamkeit begrenzt und erfordern teure Nährzusatzstoffe. So wurden beispielsweise im Zuge von Nährstoffstudien Flüssigkulturvolumina von weniger als 100 ml von Stoll, N. (1961) J Helminthol, Lister Suppl, S. 169-174; Jackson, G.J. (1973) Exp Parasitol 34:111-114; Hansen, E., et al (1967), 42nd Ann Meeting Am Soc Parasitol; Lower, W.M.R., et al (1970) Nematologia 16:563-566; und Beucher, E.J., et al (1970) Nematologia 16:403-409 verwendet. Nichtsdestotrotz zeigen diese Berichte, daß die biologischen und physiologischen Anforderungen der Nematoden in Flüssigsuspensionen erfüllt werden können. Zur Belüftung dieser Kulturen ist eine Methode erforderlich, die entweder in Diffusion in dünne Flüssigkeitsschichten, Schütteln oder Einsprudeln bestehen kann.
Eine der größten Schwierigkeiten bei der Präparierung einer flüssigen, monoxenen Kultur ist die, eine ausreichende Belüftung sowohl für die Bakterien als auch für die Nematoden sicherzustellen, ohne dabei die Nematoden übermäßig starken Scherkräften auszusetzen. Von einer Methode für das Wachstum von C. elegans, einer autark lebenden Nematode, in einer flüssigen, monoxenen Kultur wurde berichtet. Bei dieser Methode werden die Bakterien zusammen mit den Nematoden in einer anderen als einer Nährsalzlösung suspendiert. Unter diesen Bedingungen haben die Bakterien wenige freie Nährstoffe zu verdauen und daher einen niedrigen Sauerstoffbedarf. Während der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurde festgestellt, daß dieselbe Methode für eine Kultur von N. carpocapsae verwendet werden konnte, solange ein Sterolzusatzstoff vorhanden war. Der Bedarf an Bakterien erwies sich jedoch als derart hoch, daß eine kommerzielle Nutzung der Methode sich wirtschaftlich ausschloß.
In der PCT Patentanmeldung Nr. 86/01074, veröffentlicht am 27. Februar 1986 (im folgenden als "Pace et al" bezeichnet) ist ein Verfahren für die Großkultivierung von Nematoden beschrieben, das einige der mit den Belüftungs-Anforderungen verbundenen Probleme anspricht. Bei diesem Verfahren wurde die Rührrate in einem Rührreaktor bestimmt, bei der adulte Nematoden zerstört werden. Die Rührrate wurde dann auf ein Niveau unterhalb dieser festgesetzten Rate eingestellt und während der gesamten Kultivierungsdauer beibehalten.
Pace et al beschreiben auch die Verwendung eines herkömmlichen Flüssigkulturmediums, das sich aus Ochsennierenhomogenat und Hefeextrakt zusammensetzt. In anderen Medien für die Nematodenkultur sind Sojapepton-Hefeextrakt-Dextrose (Buecher et al (1971) J Nematol 3:199-200 zur Verwendung in axener Flüssigkultur); Pepton-Glukose und Bakterien (Dutky, S.R., et al (1967) J Nematol 13:140 für monoxene Kultivierung auf Agar); und Nährbrühe-Hefeextrakt-Sojamehl-Maisöl (Wouts, W.M., et al (1981) J Nematol 13:467-469, für monoxene Festphasenoder Schaummatrix) enthalten. Jedes dieser Medien enthält einen oder mehrere Bestandteile, die teuer oder schwer herstellbar sind.
Die monoxene Flüssigkulturmethode von Pace et al ergab eine Reproduktionsrate in den ersten 10 Tagen von 20 (eine Zunahme von 2.000 auf 40.000 Nematoden pro Milliliter) und eine berichtete Entstehung von infektiösen Juvenilen in der Flüssigkultur nach 20 Tagen. Bei anderen Untersuchungen unter Verwendung axener Systeme wurden ähnliche Reproduktionsraten berichtet, doch keine signifikanten Gehalte an infektiösen Juvenilen.
Es wurde entdeckt, daß eine entscheidende Komponente in einem flüssigen Nährkulturmedium als Trägersubstanz für eine monoxene Nematodenkultur, doch mit kontrolliertem Sauerstoffbedarf, die Verwendung eines Emulgators ist, wie z.B. Eigelb, welcher die Verwertung der enthaltenen Öle oder Fette erleichtert. Bis heute liegen keine Berichte über die Verwendung von Emulgatoren in einer Flüssigkultur entomogener Nematoden vor; Eigelb dagegen wurde bereits als Ersatz für Tierserum in der Kultivierung von Säugetierparasiten verwendet und hat dabei sowohl Erfolge als auch Mißerfolge erzielt.
A. Roder [(1982) Naturwissenschaften 69:92-93] verwendete Eigelb als Ersatz für Kälberfötenserum in der Kultivierung von Insektenzellen. M.S. Schnier und B. Fried [(1981) Int J Parasitol 10:391-395] verwendeten Eigelb in NCTC 135 bei der Kultivierung von Ablosoma suwaense, einer parasitären Trematode (ein Wurm aus dem Trematodenstamm). Außerdem wird Eigelb häufig in Bakterienzellkulturen, besonders mit Staphylococcus, verwendet. P.F. Busch et al [(1973) J Parasitol 59:319-322] stellten fest, daß sich Eigelb bei einer Cotylurus-Kultur (eine Trematode) nicht als nützlich erwies, und D.W.W. Kannangara [(1974) Int J Parasitol 4:675-6] stellten fest, daß sich Eigelb bei einer Paragonimus-Kultur nicht als nützlich erwies. In keinem dieser Fälle spielte Eigelb bei der Emulgierung einer Ölkomponente eine Rolle.
Daher ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Effizienz der Erzeugung entomogener Nematoden in einer Flüssigkultur zu erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Flüssigkulturmediums als Trägersubstanz für eine monoxene Nematodenkultur, doch mit kontrolliertem Sauerstoffbedarf. Dieses Nährmedium ist leicht zu präparieren und im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Medien relativ preiswert herstellbar.
Eine darüber hinausgehende Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Förderung der Bakterien- und Nematodenentwicklung, wobei die Rührrate gemäß den veränderlichen Sauerstoffübertragungs-Anforderungen, die mit jedem Entwicklungsstadium der Nematoden verknüpft sind, variiert wird.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein im Handel preiswertes Medium zur Kultivierung entomogener Nematoden in Flüssigkultur zur Verfügung, welches einen Emulgator, eine Hefequelle, Pflanzenöl und eine Proteinquelle umfaßt, wobei das Medium durch Sterilisieren des Mediums und anschließendes Impfen des Mediums mit den Nematoden symbiotischen Bakterien herstellbar ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt etwa 1-2% Eigelb, etwa 0,1-1% (Trockengewicht) Hefezellen, etwa 2-5% Maisöl und etwa 1-3% Sojamehl.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Kultivierung entomogener Nematoden in oben beschriebener Flüssigkultur zur Verfügung, wobei das Medium mit einem bakteriellen Symbiont präinkubiert wird, dann eine Kultur der entomogenen Nematoden zur Impfung dieses Mediums verwendet und eine Methode zum Umrühren des beimpften Mediums während des Reproduktionszyklus der Nematoden eingesetzt wird. Dieses Verfahren fördert eine höhere Reproduktionsrate und schafft infektiöse Nematoden nach zehn bis sechzehn Tagen.
Ebenso wird ein Verfahren zur Kultivierung entomogener Nematoden für die Erzeugung hoher Konzentrationen verhältnismäßig reiner Nematoden des infektiösen Stadiums in einem Fermentierungsbehälter, vorzugsweise in Verbindung mit dem Flüssigmedium der Erfindung, zur Verfügung gestellt, welches das Variieren der Rührrate gemäß den veränderlichen Sauerstoffübertragungs-Anforderungen zur differentiellen Schaffung optimaler Bedingungen für Nematodenfortpflanzung und -wachstum umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 zeigt eine Veranschaulichung der Beziehung zwischen den Rührraten und der Nematodenfortpflanzung während des Fermentierungszyklus entomogener Nematoden. Die Rührrate betrug entweder konstant 50 U/min (durch unausgefüllte Vierecke gekennzeichnet), 125 U/min (durch X gekennzeichnet), 500 U/min (durch umgedrehte Dreiecke gekennzeichnet) oder variierte (durch # gekennzeichnet) im Laufe des Vorgangs, um ein Niveau von 64 mmHg Sauerstoffeintrag aufrechtzuerhalten.

Durchführungsformen der Erfindung

A. Definitionen

"Entomogene Nematoden" bezieht sich auf Nematoden, die einer oder mehreren Insektenspezies parasitär sind. Die wichtigste Ordnung entomogener Nematoden ist die der Rhabditida, und die Erfindung richtet sich hauptsächlich auf die Kultivierung und/oder Bereitstellung zweier Rhabditida-Familien in dieser Gruppe: der Steinernematidae und der Heterorhabditidae. Doch auch andere entomogene Familien können als Objekte der Verfahren der Erfindung geeignet sein; diese umfassen Diplogasteridae, Panagrolaimidae, Rhabditidae und Syrophonematidae, und darüber hinaus andere als die Rhabditida-Familien, nämlich die Allantonematidae, Aphelenchoididae, Entaphelenchidae, Mermithidae, Neotylenchidae, Sphaerulariidae und Tetradonematidae.
Wie oben erläutert sind die wichtigsten Familien der Rhabditida für die kommerzielle Nutzung die Steinernematidae und die Heterorhabditidae. Literturverweise auf "Neoaplactana" beziehen sich auf eine besondere Gattung der Steinernematidae, und die Bezeichnungen Neoaplactana und Steinernema zur Benennung spezifischer Spezies - z.B. N.glaseri oder S.glaseri - werden manchmal austauschbar verwendet.
Die Klassifikation der verschiedenen Nematodengruppen mag zwar verwirrend sein, doch ist klar, daß sich die Erfindung auf jene Gattungen mit den Eigenschaften richtet, für Insekten infektiös zu sein und als ein Stadium in ihrem Lebenszyklus das der "infektiösen Juvenilen des Stadiums 3" (IJs) mit den im obigen Abschnitt zum Hintergrund beschriebenen Eigenschaften aufzuweisen. Je nach beabsichtigter landwirtschaftlicher Anwendung, d.h. dem angezielten Insekt, können eine oder mehrere der Spezies besonders vorteilhaft sein.
"Infektiöse Juvenile" oder "IJ" bezieht sich auf ein nicht-adultes Stadium, in dem Nematoden in der Lage sind, ein Wirtsinsekt zu befallen und zu infizieren. Bei den Familien, die das Objekt der vorliegenden Erfindung sind, sind dies IJs des Stadiums 3.
"Rühren" bezieht sich auf eine physikalische Methode zur Einbringung von Fließbewegung in den Fermentierungsbehälter, welche mechanisches Schaufelrühren und Einsprudeln von Gebläseluft umfaßt, jedoch nicht darauf beschränkt ist.

B. Allgemeine Beschreibung

Infektiöse Juvenile, die Objekte der hierin beschriebenen Verfahren, sind zur Kontrolle einer Vielzahl von Schädlingen nützlich, zu denen Bohrer, Wurzelkäfer, Raupen, Käferlarven, Maiswurzelwürmer, Japanische Käfer und Maulwurfsgrillen zählen. Die landwirtschaftlichen Haupterzeugnisse, die durch diese infektiösen Juvenile befallen werden, umfassen Mais, Erdbeeren, Mandeln, Gewächshauserzeugnisse, Pilze, Zuckerrohr und Kartoffeln. Außerdem werden Geflügelfarmanlagen und andere Tierbehausungen von Fliegen freigehalten. Bei einer typischen landwirtschaftlichen Anwendung werden infektiöse Juvenile in großer Zahl in der Zielumgebung ausgesetzt. So werden zum Beispiel zur Kontrolle von "sciarid"-Fliegen in Pilzgewächshäusern etwa 5 x 10&sup9; Würmer pro Haus eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren der Großflüssigkultivierung entomophathogener Nematoden unter Verwendung eines verbesserten Flüssigkulturmediums. Das Medium enthält einen Emulgator, eine Hefequelle aus Vitaminen und Mineralien, eine Triglyceridquelle, eine Proteinquelle, und kann wahlweise weitere Bestandteile wie Salze, Antischaummittel, Nährstoffe und Puffer enthalten. Es wurde festgestellt, daß die Triglycerid- oder Ölkomponente in Gegenwart eines Emulgators, wie z.B. Eigelb, gut emulgiert wird und über mehrere Tage der Fermentierung hinweg gut emulgiert bleibt. Dies steht in deutlichem Kontrast zu Formulierungen ohne Eigelb, bei denen sich das Öl absetzt und an die Oberfläche des Fermentierungsträgers steigt. Als Emulgator bevorzugt ist Eigelb, wobei bis heute keine Obergrenze für die Emulgatorkonzentration im Medium bestimmt worden ist. Es wurde festgestellt, daß 1-2% (Vol/Vol) recht gute Ergebnisse erzielen. Eigelb ist zwar ein bevorzugter Emulgator, doch kann ein Teil der Eigelbkomponente durch Lecithin ersetzt werden. Allgemein können 0,1-0,5% des Licithins in Verbindung mit Eigelb verwendet werden. Weitere Emulgatoren umfassen Glycerolmonostearat oder Monooleat, Polyoxyethylensorbitan und Fettsäure-Kohlehydratester.
Das Medium sollte auch eine Vitamin- und Mineralienquelle enthalten, wie sie durch Hefeextrakt und Hefezellen zur Verfügung gestellt werden kann. Andere Vitamin- und Mineralienquellen umfassen Fleisch- und Gemüseextrakte, doch stellt Hefe die bei weitem bequemste und wirtschaftlichste Quelle dar. Hefezellen sind gegenüber den Hefeextrakten als preiswertere Alternative bevorzugt. Die Verwendung von 0,1 bis 1% (Trockengewicht) oder vergleichbar dazu 0,3 bis 3% (Feuchtgutmasse) der Hefequelle im Kulturmedium ist bevorzugt.
Eine Vielzahl von Triglyceridquellen steht zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Solche Triglyceridquellen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Pflanzenöle, wie z.B. Mais-, Saflor-, Soja-, Sonnenblumen- und Rübsamenöl, und tierische Öle, wie z.B. Fischöl und Schweineschmalz. Zumindest eine der Triglyceridquellen muß im Medium enthalten sein, doch können auch Ölgemische verwendet werden und liegen im Rahmen der Erfindung. Eine bevorzugte Trigylceridquelle ist Pflanzenöl, besonders Maisöl, bei einer Konzentration von 2 bis 5% (Vol/Vol).
Die Proteinquelle kann ebenfalls durch eine Vielzahl von Quellen zur Verfügung gestellt werden. So sind beispielsweise Proteinextrakte tierischen und pflanzlichen Ursprungs wohlbekannte Bestandteile der Medienkulturen. Getrocknete Tierorganextrakte, wie z.B. EnLivPro und Fleischpepton, Fischmehl, Sojapepton und Sojamehl stehen alle zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Von diesen Quellen ist Sojamehl bevorzugt. Es wurde keine Obergrenze für die Sojamehlkonzentration festgelegt, doch ist die Verwendung von etwa 1 bis 3% (Gew/Vol) bevorzugt.
Die Zugabe weiterer Bestandteile zum Medium ist zwar nicht wesentlich, kann aber nach Wunsch erfolgen. So wurden zum Beispiel Salze, Cholesterin, steriles Wasser oder Phosphatgepufferte Kochsalzlösung in der vorliegenden Erfindung verwendet und beeinträchtigten dabei nicht die Ausbeute an entstandenen infektiösen Nematoden.
Ein bevorzugtes Kulturmedium für die Massenerzeugung entomogener Nematoden umfaßt folglich etwa 1-2% Eigelb, 0,1-1% (Trockengewicht) Hefezellen, etwa 2-5% Maisöl und etwa 1-3% Sojamehl. Dieses bevorzugte Medium wird aus Bestandteilen hergestellt, die unverarbeitete Rohstoffe sind, wie sie in der Lebensmittelindustrie verwendet werden und leicht zur Verfügung stehen.
Das Medium wird präpariert, indem zunächst die Ölkomponente mit dem Eigelb gemischt und dann dieses ölige Material mit Wasser homogenisiert wird. Dann werden die anderen Inhaltsstoffe zugegeben und das Medium im Autoklav sterilisiert. Die Durchführung des ersten Mischvorgangs ist zwar nicht obligatorisch, doch wurde festgestellt, daß die in dieser Weise hergestellten Medien stabilere Emulsionen bilden und höhere Ausbeuten an infektiösen Nematoden erbringen.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Großflüssigkultivierung entomogener Nematoden zur Erzeugung hoher Konzentrationen infektiöser Nematoden, wobei das Kulturmedium der vorliegenden Erfindung mit den Nematoden symbiotischen Bakterien präinkubiert wird. Wie im Fachbereich anerkannt ist die Verwendung einer Bakterienpopulation in ihrer primären Form bevorzugt. Die Zugabe der symbiotischen Bakterien ist zur Maximierung der Ausbeute des Verfahrens und der Infektiosität der Nematoden für Insekten wichtig.
Etwa 1 x 10&sup7; Bakterienzellen pro Milliliter des Mediums werden etwa 24-48 Stunden lang bei 25-30ºC gezüchtet und dann erst mit einer Nematodenkultur beimpft wird. Auf die Impfung des Mediums mit den Bakterien hin wird ein Luftstrom bei einer Rate von etwa 1 Fermentierervolumen/Minute eingeleitet und die Rührrate so eingestellt, daß ein Sättigungsgrad von 50% mit dem gelösten Sauerstoff gewährleistet ist, obschon auch andere Bedingungen zur Zufuhr von ausreichend Sauerstoff in die Kultur angewandt werden können.
Bei den juvenilen Nematoden kann es sich entweder um infektiöse Nematoden oder um Juvenile des Stadiums J1 bis J4 handeln, wobei J3 die bevorzugte Form ist. Die Impfkonzentration der Nematoden kann von 100 bis 5.000 Nematoden pro Milliliter Medium variieren. Zum Zeitpunkt der Nematodenbeimpfung kann der Druck auf bis zu 3 Bar eingestellt werden, wenn eine erhöhte Sauerstoffzufuhr erwünscht ist. Sobald bei der Fermentierung das adulte Stadium der Nematoden erreicht ist, sinkt der Sauerstoffbedarf der Bakterien, weshalb die Rührrate reduziert werden kann.
Nach der Beimpfung wird die Temperatur auf 20-28ºC, je nach Nematodenstamm, gesenkt und während des gesamten Wachstums der Kultur auf dieser Temperatur gehalten.
Bei einer spezifischen Ausführungsform dieses Verfahrens unter Verwendung eines Erlenmeyer-Schüttelkolbens wird vorzugsweise ein Volumen der Fermentierkultur in einen Verhältnis von 1:4-1:8 zum Kolbenvolumen beibehalten. Die Kultur wird auf einem Umlaufschüttelgerät für die gesamte Kultivierungsdauer von 10 bis 16 Tagen bei 150 U/min geschüttelt.
Ein Rührtankreaktor ist, ungeachtet der hohen Scherbedingungen, die in solchen Behältern entstehen, ein bevorzugter Fermentierungsbehälter. Wird eine Luftstromrate von etwa 1 Fermentierervolumen/Minute während der Fermentierung beibehalten, so kann die Rührrate in Anpassung an den veränderlichen Sauerstoffbedarf in jedem bestimmten Wachstumsstadium der Kultur recht hoch eingestellt werden, ohne dabei eine abträgliche Wirkung auf die Ausbeute an infektiösen Juvenilen zu riskieren. Wie im folgenden ausführlicher beschrieben, wurde die Schersensibilität der Kultur für die verschiedenen Wachstumsstadien und damit verbunden die Sauerstoffanforderungen der Fermentierungskulturen bestimmt und so die oberen Parameter der Rührrate ermittelt.
Die Konzentration der zweiten Generation von Juvenilen wurde beginnend am Tag 8 bis zum Tag 16 der Fermentierungsdauer bestimmt. Es wurde festgestellt, daß das Medium höhere Reproduktionsraten förderte als andere Medien, indem sie eine 200facher Zunahme pro Generation überstieg, und infektiöse Juvenile in einem kürzeren Zeitraum, d.h. innerhalb von 10 bis 16 Tagen, als bei anderen berichteten Methoden erhalten wurden. So wird durch Medium und Methode der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, mit dem sich große Mengen entomogener Nematoden unter Verwendung preiswerter, ohne weiteres verfügbarer Bestandteile, leicht kultivieren lassen.
Im vorangegangenen wurde ein Chargenherstellungsprozeß beschrieben, doch wird durch die Erfindug auch ein "Fedbatch"- Prozeß zur Verfügung gestellt, worin das Medium während des J3 und J4-Entwicklungsstadiums nochmals zugefügt wird. Diese Methode bietet eine zusätzliche Nährstoffquelle für die Fermentierungskultur und kann jegliche nährstoffbegrenzende Wachstumsbedingung überwinden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhaltung der Bakterien- und Nematodenentwicklung in Mischbehältern, worin die Rührrate gemäß den veränderlichen Sauerstoffübertragungs-Anforderungen zur differentiellen Schaffung optimaler Bedingungen für Nematodenfortpflanzung und -wachstum variiert wird. Die in Mischgefäßen erhaltenen Bedingungen sind bestenfalls schwer vorhersagbar, jedoch entscheidend für eine erfolgreiche Nematodenerzeugung. Die entscheidenden Parameter dabei sind Temperatur, Druck des gelösten Sauerstoffs, Scherbelastung und andere Formen der physischen Belastung. Die Temperatur des Prozesses läßt sich in kleinen Behältern oder statischen Kulturen leicht optimieren. Die Beibehaltung der optimalen Temperatur hat sich in großen Behältern als nicht schwierig erwiesen.
Der Druck des gelösten Sauerstoffs muß während des Großteils des Prozesses über etwa 32 mmHg gehalten werden, muß aber über 40 mmHg und vorzugsweise 80 mmHg betragen, wenn sich die Adulte entwickeln und Eier legen. Die Schwierigkeit, diese Bedingungen in Mischtanks zu erhalten, ist durch den Sauerstoffbedarf des Prozesses und die Sauerstoffübertragungsrate gegeben. Die Sauerstoffübertragungsrate setzt sich zusammen aus Luftstromrate, Verteilung der Blasengrößen und Vermischungsgrad. Der maximale Sauerstoffbedarf während des hierin beschriebenen Prozesses beträgt etwa 20 mMol/Std., kann aber zu bestimmten Zeiten während der Fermentierung 5 mMol/Std. oder weniger sein. Die Beibehaltung des kritischen Sauerstoffdrucks in Rührtankreaktoren zu Zeiten des maximalen Sauerstoffbedarfs kann Rühren bei Hochgeschwindigkeiten erforderlich machen.
Schon seit langem ist bekannt, daß intensives Rühren die Nematodenreproduktion hemmen kann (Stoll, N. (1953) J Parasitol 39:422-444). Pace et al (bereits früher erwähnt) beschreiben ein Verfahren zur Bestimmung der Rührrate in einem Rührreaktor, bei der adulte Nematoden zerstört werden. Sie definieren eine "Scherkraft", die adulte Nematoden zerstören kann, als die Minimalgeschwindigkeit an der Spitze des Rührflügels in ihrem Reaktor, bei der eine Zerstörung auftritt. Allerdings ist wohlbekannt, daß Scherspannung das Produkt aus Scherrate (proportional zur Geschwindigkeit an der Spitze des Rührflügels) und Viskosität ist (Bowen, R.L. (1986) Chem Engineering, 9. Juni, S. 55-63). Die Messungen von Pace et al der zulässigen Geschwindigkeiten an der Spitze des Rührflügels wurden in Wasser mit einer Viskosität von 1 cP vorgenommen, wobei allerdings die Viskositat des Mediums in ihrem Prozeß nicht bestimmt wurde. Bei dem beschriebenen Verfahren ist es daher nicht möglich, die Belastungsbedingungen während des Prozesses selbst vorherzusagen, bei dem die Viskosität unbekannt und möglicherweise variabel ist. Es wurden viele Methoden zur Berechnung der maximalen Scherspannung veröffentlicht, doch ist allgemein bekannt, daß keine dieser Methoden zur Bestimmung der zulässigen Scherbedingungen während der Übertragung auf großen Maßstab von biologischen Prozessen zuverlässig angewendet werden kann (Trilli, A. (1986) Industrial Microbiology, American Society of Microbiology, S. 277-307).
Es gibt jedoch zwei Strategien, die zur Optimierung des Gleichgewichts zwischen Sauerstoffübertragungsrate und Rührintensität vorteilhaft eingesetzt werden können. Eine davon betrifft die Verwendung eines Behälters ohne Rührvorrichtung, z.B. ein Blasensäulenreaktor oder ein Druckluftreaktor, von dem bekannt ist, daß er mit geringen (doch begrenzten) Scherkräften verbunden ist. Die andere, besonders im Zusammenhang mit Fermentierungsbehältern wie Schüttelkolben und Rührtankreaktoren nützliche Strategie ist die, die Rührintensität lediglich zu Zeiten zu reduzieren, zu denen die Scherkräfte tatsächlich Grenzen setzen, und die Rührintensität nur dann zu steigern, wenn für die Sauerstoffübertragung erforderlich ist. Anders als bei vielen Fermentierungsprozessen ist die Nematodenerzeugung durch eine veränderliche Verteilung der Entwicklungsstadien während des Prozesses gekennzeichnet. So herrschen beispielsweise adulte Nematoden zwischen den Tagen 2 und 5 nach der Nematodenbeimpfung vor, während junge Juvenile vom Tag 6 an überwiegen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß der Sauerstoffbedarf während der anfänglichen Züchtung der Bakterien am größten ist, während der Entwicklung von Adulten abnimmt und bei wachsender Anzahl der Juvenilen wieder steigt. Weiterhin wurde entdeckt, daß junge Juvenile bedeutend weniger empfindlich gegenüber Scherbelastung sind als Adulte. So wurden beispielsweise die Scherwirkungen getestet, indem Nematoden zwischen einen Rotationskörper und einen Hohlzylinder bei einem Abstand der beiden Oberflächen von 2 mm eingebracht wurden. Die Scherwirkungen waren die folgenden: Stadium der Nematoden U/min bei Zerstörung
Bei einem separaten Experiment in einem Laminarschergerät wurden bei 630 Dyn/cm² keine Adulte zerstört.
Zwar ist es schwer, die in einem Behälter vorhandenen Scherkräfte mit denen in einem anderen Behälter zu vergleichen, doch ist klar, daß Adulte empfindlicher als jüngere Formen sind. Eine grobe Extrapolation der obigen Ergebnisse würde die Vraussage zulassen, daß eine Zerstörung in einem 201 Fermentierer bei etwa 500 U/min und in einem 25001 Fermentierer bei weniger als 100 U/min auftreten würde.
Dieses Wissen ermöglicht also eine derartige Kontrolle über den Fermentierungsprozeß, daß die Rührraten zur differentiellen Schaffung optimaler Bedingungen für das überwiegend infektiöse Stadium der Nematodenentwicklung in der Kultur variiert werden können.
Nach Beendigung der Fermentierung werden die Nematoden direkt aus dem Fermentierungsbehälter geerntet. Die Ernte kann unter Anwendung eines bebiebigen der herkömmlichen Verfahren zur Trennung der Nematoden vom Medium vorgenommen werden, einschließlich Zentrifugierung, Absitzenlassen und Filtrierung. Beim vorliegenden Verfahren wurde eine Vollmantelzentrifuge zur Trennung der Nematoden vom viskosen Teil des Mediums verwendet. Die Aufschlämmung wurde durch Vollmantelzentrifuge bei einer maximalen Fließgeschwindigkeit von 6 l/min bei etwa 2.500-3.000 U/min geschickt. Die Aufschlämmung wurde weitergeklärt, um die Nematoden von Schmutz, Öl und anderen als IJ-Elementen zu trennen.
Dann wurde die Aufschlämmung mit einer milden Seife, z.B. einer Ivory -Seife, bei einer Konzentration von 2% (Gew/Vol) verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt ist eine sichtbare Veränderung der Oberflächenspannung zu erkennen. Das Produkt wird dann durch eine Scherpumpe zur Dispergierung der Partikel geschickt. Die resultierende Aufschlämmung wird daraufhin nochmals zentrifugiert, und zwar bei maximaler Fließgeschwindigkeit und minimaler Umdrehungszahl, um den Großteil der IJs zu erhalten.
Der Klärschritt wurde solange wiederholt, bis eine ausreichende Reinigung erzielt war, wie durch mikroskopische Beobachtung der Nematoden/Partikel-Verteilung bestimmt.
Auf die Zurückgewinnung des Produktes hin kann nach Wunsch ein Konzentrierungsschritt folgen.
Ungeachtet weiterer Formen, die in den breiten Bereich der vorliegenden Erfindung fallen können, veranschaulichen die folgenden Beispiele die Kultivierung verschiedener Nematodenstämme unter zusätzlicher Verwendung bakterieller Symbionten. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die Erfindung auf alle Stämme entomogener Nematoden anwendbar ist, wennauch die Beispiele nur ausgewählte Stämme veranschaulichen.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen weiter beschrieben. Diese sollen nur der Veranschaulichung von Ausführungsformen der Erfindung dienen und sind nicht als Einschränkungen des Rahmens der Erfindung aufzufassen.

Beispiel 1

Ein Medium, das 0,5% NaCl, 0,25% KH&sub2;PO&sub4;, 0,5% Eigelb, 3,0% (Feuchtgutmasse) Hefezellen, 1,0% oder 2,0% Sojamehl, 0,5% EnLivPro, 5,0% Maisöl und 20 mg/l Cholesterin in pH 8,0 enthielt, wurde in Volumina von 30 ml in 125-ml-Kolben im Autoklaven behandelt.
Das sterile Medium wurde mit 3 x 10&sup8; Xenorhabdus nemotophilus- Bakterien beimpft und bei 28ºC in einem Umlaufschüttelgerät (150 U/min) bebrütet. Nach ca. 24 Stunden wurden Neoaplactana carpocapsae (alle IJs) in Dichten von 2.000, 1.000, 500 und 200/ml zugefügt. Die Inkubationstemperatur wurde auf 25ºC gesenkt.
5 und 8 Tage nach der Nematodenbeimpfung wurden Proben genommen. Die folgende Tabelle zeigt die Gesamtpopulation der Nematoden am Tag 5 und die Population der infektiösen Juvenilen am Tag 8. Inokulum Soja Tag
Die beste Reproduktionsrate betrug 705. Die von diesen Kulturen geernteten Nematoden waren pathogen für Insekten.

Beispiel 2

Für 0,25-ml-Kulturen von N. carpocapsae wurden Kunststoffschalen mit Einbuchtungen von 1 cm Durchmesser verwendet. Das Medium enthielt 0,5% NaCl, 0,25% KH&sub2;PO&sub4;, 3,0% (Feuchtgutmasse) Hefezellen, 2,0% Sojamehl, 5,0% Maisöl, 0,625% EnLivPro und eine variable Eigelbkonzentration, wie unten angegeben. Das mit X. nematophilus (Quantität) und N. carpocapsae (Quantität) beimpfte Medium wurde bei 25ºC bebrütet. Nach 7 Tagen waren die Zählungen die folgenden: Eigelb Nemas/ml

Beispiel 3

Ein Medium, das 2,0% Sojamehl, 1,0% Eigelb, 0,625% getrocknetes tierisches Protein (EnLivPro), 0,5% Hefezellen (Trockengewicht), 5% Maisöl, 0,5% NaCl und KH&sub2;PO&sub4; bei pH 8,0 enthielt, wurde in Volumina von 30 ml in vier 125-ml- Erlenmeyer-Kolben im Autoklaven behandelt.
Das sterile Medium in jedem Kolben wurde mit 3 x 10&sup8; Xenorhabdis nemotophilus-Bakterien beimpft und bei 28ºC in einem Umlaufschüttelgerät (150 U/min) bebrütet. Nach 72 Stunden wurde zwei der Kolben unabhängig mit ca. 1.000 Juvenilen/ml von entweder J1-J2-N. carpocapsae-Inokulum oder J3-J4-N. carpocapsae-Inokulum beimpft. Nach Beimpfung mit den Nematoden wurden die Kolben bei 25ºC unter Schütteln bei 150 U/min bebrütet.
Die Nematoden-Dichte wurde am Ende des Experiments 7 Tage (168 Stunden) nach Nematodenbeimpfung gezählt. (Das Stadium des juvenilen Inokulums ist unten angegeben): Bakterieninkubation Dichte nach 7 Tagen *n = Anzahl der Zählungen/Anzahl der Zählungen pro Kolben.
Die Verwendung eines juvenilen Inokulums, bestehend aus J3-J4 (bei diesem Experiment setzte sich das Inokulum großteils aus J3s zusammen) war um 50% erfolgreicher als bei einem Inokulum, bestehend aus J1-J2s.

Beispiel 4

Ein Glasfermentierer, Durchmesser 10 cm x Höhe 75 cm, wurde als Druckluftreaktor mit einem Zugrohr, Durchmesser 5 cm x Höhe 20 cm, betrieben. Eine gesinterte Metallsprühvorrichtung mit einer Porosität von 40 um wurde am Boden des Zugrohrs angebracht.
Eine N. carpocapsae-Kultur wurde wie in Beispiel 3 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß das Volumen 6 Liter betrug. Bei einer Geschwindigkeit von 6 Litern/Minute wurde während des gesamten Experiments Luft eingeführt. An Tag 7 wurde eine Nematoden- Dichte von 95.000/ml erhalten.

Beispiel 5

Ein 20-Liter-Rührtankfermentierer (Bioengineering), der 16 Liter Medium enthielt, wurde mit X. nematophilus und nach 48 Stunden mit N. carpocapsae beimpft. Der Fermentierer wurde mit einem Luftstrom von 16 Litern/Minute durch eine Ringsprühvorrichtung betrieben. Der Fermentierer wurde bei 250 U/min gerührt, bis der gelöste Sauerstoff (GS) unter 64 mmHg fiel. Zu diesem Zeitpunkt wurden die U/min auf 300 U/min erhöht, und wurden immer dann um 50 oder 100 U/min erhöht, wenn der GS unter 64 mmHg fiel, bis die maximalen U/min von 500 erreicht waren. Stieg der GS über 96 mmHg, so wurden die U/min um jeweils 50 oder 100 U/min auf eine Endgeschwindigkeit von 250 U/min reduziert.
In Abbildung 1 sind die Ergebnisse aufgezeichnet, die die Wirkung der verschiedenen Rührraten auf die Reproduktionskapazität der kultivierten Nematoden veranschaulichen. Die Rührraten wurden eingestellt auf 50 U/min (durch unausgefüllte Vierecke gekennzeichnet), 125 U/min (durch X gekennzeichnet), 500 U/min (durch umgekehrte Dreiecke gekennzeichnet) oder wurden während des Durchgangs variiert (durch * gekennzeichnet), um einen Sauerstoffdruck von 64 mmHg beizubehalten.
Der Sauerstoffdruck sowohl bei den Durchgängen mit 50 als auch mit 125 U/min fiel während des Zeitraums von 5 bis 12 Tagen nach der Nematodeninokulation auf 0 mmHg. Der Sauerstoffdruck hielt sich sowohl bei dem Durchgang mit 500 U/min als auch dem variablen Kontrolldurchgang erfolgreich über 64 mmHg.

Nutzen

Die mittels des Verfahrens der Erfindung erzeugten entomogenen Nematoden können als biologische Breitspektrum-Insektizide verwendet werden.
Die Nematoden können mittels bekannter Methoden, z.B. Besprühen der Ernte, Einspritzen in Baumstämme, Besprühen des Bodens und Aufbringen auf den Boden in fester Form, z.B. als Kügelchen, in verdünnter oder unverdünnter Form, angewendet werden.

Claims

1. Emulgiertes flüssiges Medium zur Kultivierung entomogener Nematoden in Flüssigkultur, welches einen Emulgator, eine Hefequelle, Pflanzenöl und eine Proteinquelle aufweist, wobei das Medium durch Sterilisierung des Mediums und nachfolgendem Impfen des Mediums mit mit den Nematoden symbiotischen Bakterien herstellbar ist.

2. Medium nach Anspruch 1, wobei der Emulgator durch Eigelb zur Verfügung gestellt ist.

3. Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Hefequelle durch Hefezellen zur Verfügung gestellt ist.

4. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Pflanzenöl Maisöl ist.

5. Medium nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Proteinquelle Sojamehl ist.

6. Medium nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, welches 1 bis 2% Eigelb, 0,1 bis 0,5% Hefezellen, 2 bis 5% Maisöl und 1 bis 3% Sojamehl aufweist.

7. Medium nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bakterium X. Nematophilus ist.

8. Verfahren zum Kultivieren entomogener Nematoden in Flüssigmedium, welches die folgenden Verfahrensschritte aufweist: Zurverfügungstellung des Mediums wie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, Impfen des Mediums mit einer Kultur entomogener Nematoden, Zurverfügungstellung von Mitteln zum Umrühren und Belüften des geimpften Mediums während des reproduktiven Zyklus der Nematodenkultur, und Zurückgewinnung der infektiösen Juvenilen.

9. Verfahren zum Kultivieren entomogener Nematoden zur Herstellung hoher Konzentrationen von verhältnismäßig reinen Nematoden des infektiösen Stadiums in einem Flüssigmedium, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, enthaltenden Fermentierungsbehälter, wobei beim Verfahren die Rührrate gemäß den veränderlichen Sauerstoffübertragungsanforderungen während des Wachstums zur differentiellen Schaffung optimaler Bedingungen für Nematodenfortpflanzung und - wachstum variiert wird, wobei die Rührrate während der Entwicklung der neuausgeschlüpften Juvenilpopulation erhöht wird.