JP2949218B2

JP2949218B2 - 菌食性線虫アフェレンクス・アベネの大量生産法

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Publication number: JP2949218B2
Application number: JP9021245A
Authority: JP
Inventors: 信義石橋
Original assignee: SAGA DAIGAKUCHO
Current assignee: SAGA DAIGAKUCHO
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1997-02-04
Publication date: 1999-09-13
Anticipated expiration: 2017-02-04
Also published as: EP0856253A3; US6033658A; JPH10215729A; EP0856253A2; US6057145A; AU705805B2; AU5038498A; US6033657A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は植物寄生性糸状菌並
びに植物寄生性線虫による農林土壌病害・線虫害を予防
するために、菌食性線虫アフェレンクス・アベネ（Aphe
lenchus avenae）を利用した土壌改良剤に関し、特に、
菌食性線虫アフェレンクス・アベネ（Aphelenchus aven
ae）を植物質産業廃棄物からなる固体培地あるいは人工
培地からなる液体培地により大量生産する方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】従来の化学農薬に依存した農作物生産
は、多くの環境公害を引き起こしながらも、農業生産手
段の主流であることは否定できない。一方、生物的手段
による持続型農業は、２１世紀への課題として、有用ウ
ィルス、細菌、糸状菌、昆虫病原性線虫、天敵昆虫など
が鋭意研究され、普及に努められている。しかし、生物
的手段に万能というものはなく、比較的広範囲に害虫防
除できるものは、昆虫病原性線虫とＢＴ剤（細菌）くら
いのものである。病害に対しては更に困難で２〜３種以
上の病原菌を同時に防除できる生物的資材又は手段はな
かった。

【０００３】本発明に係る線虫アフェレンクス・アベネ
（Aphelenchus avenae）［以下、「本線虫」という］は
温帯地域では普遍的に存在する線虫であるが、土壌糸状
菌を餌として生活しており、実験的には９６種の糸状菌
で培養可能であることが報告されている（Townshend,
J. L.（1964） Fungus hosts of Aphelenchus avenaeBa
stian, 1865 and Bursaphelenchus fungivorous Frankl
in and Hooper, 1962and their attractiveness to the
se nematode species. Can. J. Microbiol. 10:727-73
7）。これらの中には、土壌病原菌となる糸状菌が数多
く含まれるため、土壌病害の本線虫による生物的防除の
研究は、この３０年来、欧米を中心として数多くなされ
て、数多くの試験例が報告されている。これらの試験に
ついては文献上においても７０〜８０％以上の防除効果
を挙げてきたが、試験規模は小さく殆どが滅菌土壌を用
いているために、線虫そのものによる被害が現れたもの
もあり、未だに実用化はされていない。また、適期施用
とならず防除効果が判然としない試験例も散見される。
このように従来、実用化されていない理由を列挙すれば
次の通りである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】１．大量生産法が確立
しなかった。従って、大規模圃場試験は未だに施行され
たことがなく説得力がなかった。

【０００５】２．同一糸状菌で継代培養を続けると、譬
えその糸状菌が最も良く線虫を繁殖させる菌であって
も、線虫は数世代後に菌摂食能力が低下し、１年後には
殆ど種の維持も困難になってくる（石橋信義編（1993）
「有用線虫の探索とその大量生産ならびに施用法のシス
テム化」平成４年度科学研究補助金試験研究Ａ（１）研
究成果報告書Ｐ p.172）。

【０００６】３．滅菌土壌に植物種子と本線虫だけを入
れると、植物の種類にもよるが本線虫は種子の内部に侵
入し、発芽阻害を起こして有害線虫と判定されることも
ある（しかし、実際の圃場で滅菌土壌はあり得ない）。

【０００７】４．採集した場所によって菌選好性が異な
るものがあるが、世界的にも統一した株（strain）は確
立していない。従って、株によっては、場所、試験担当
者によって全く正反対の試験結果となることもあり、病
害防除に利用することに否定的評価もあった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明においては、上記
の課題のうち実用的観点から重要な問題点について以下
のように解決した。課題１に提起された本線虫の大量生
産法は圃場において実用化する上で必須である。かかる
大量生産法を達成する方法は、植物質産業廃棄物または
副産物よりなる固体培地、或いは澱粉及びデキストロー
スまたは蔗糖と燐酸緩衝液とを含む培養液を含浸した多
孔性樹脂支持体よりなる人工液体培地を加熱滅菌した
後、該固体培地または液体培地に本線虫の餌糸状菌を接
種すると共に、体表面を滅菌した上記菌食性線虫を糸状
菌の接種と同時または接種後に上記培地に接種して培養
することを特徴とする。

【０００９】課題２の継代培養による繁殖力の低下は、
本線虫を培養段階ごとに異なった種の糸状菌を餌として
逐次段階的に継代培養し、最終培養段階において非病原
性糸状菌を餌として用いることによって解決される。即
ち、この課題は餌糸状菌を変換することによって克服さ
れる。例えば、ボトリチス・シネレア（Botrytis ciner
ea）菌から室内培養を開始したとすると、次はリゾクト
ニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、更に次はピティ
ウム（Pythium ）菌あるいはフザリウム（Fusarium）菌
などと餌糸状菌を変換する。本線虫が繁殖できる糸状菌
であれば何でもよいが、最後に大量生産に入るときに
は、非病原性のボトリチス・シネレア菌を餌として培養
することが好ましい。

【００１０】課題３の無菌土壌における発芽阻害の問題
は主として実験研究の過程で重要な意味を有するもので
あって、実際の農場においてはさほど問題とするには及
ばない。しかし、この問題すらも、本線虫の適宜な利用
による解決が可能であることが確認された。即ち、滅菌
状態にして、植物種子に多量（例えばキュウリ種子１に
対して何万頭）の本線虫を接種すると、発芽率が２０〜
３０％低下する場合がある。或いは発芽しても子葉にハ
モグリガ穿孔虫による被害痕のようなものが現れる。植
物の種類によっては全く被害が現れないものもあるが、
一般的にウリ科の種子は被害が出易い。しかし、病原糸
状菌や他の線虫（例えば、昆虫病原性線虫）と一緒にし
て接種すれば、このような被害は全く現れない。ハモグ
リガ様の被害が子葉に現れても、線虫は地上部まで上が
って来ないのでそれ以上の被害はでない。非滅菌土壌に
おいては、本線虫による被害は全く現れない。実際問題
として、滅菌土壌は自然界に存在しないので、本線虫に
よる発芽阻害を危惧する必要はないと思われる。

【００１１】また、本線虫を大量に土壌に施用すると
（昆虫病原性線虫の場合と同様に）土着線虫相に大きな
変動が起きる。１〜３カ月で線虫相の変動は終息する
が、結果的に自活性線虫が増加し、植物寄生性線虫は減
少する。それは本線虫も植物の根に誘引され、根の先端
部に密集するため、植物寄生性線虫の根への接近や侵入
を妨害するためであろうと考えられる。従って、本線虫
は、薬剤施用による土壌生物相の劣悪化防止として施用
すれば、有害線虫の急速な回復を抑制することができ
る。（Ishibashi, N., and Choi, D-R. (1991) Biologi
cal control of soilpests by mixed application of e
ntomopathogenic and fungivorous nematodes. J. Nema
tol. 23:175-181）。

【００１２】課題４に提起した菌選好性の相違について
は、線虫類の分類は記載分類学であるため、形態が同じ
であれば同一種となるが、同一種とされても生理・生態
が異なる線虫は数多くあり、世界中普遍的に存在する線
虫には特にこの傾向が強い。本線虫も世界中普遍的に存
在し、餌糸状菌に対する選好性も採集場所によって大い
に異なっている。例えば、九州産の本線虫はリゾクトニ
ア・ソラニを餌として最もよく繁殖するが、東北地方の
本線虫の餌はピティウム菌のほうがよい。このように、
選好性の異なる線虫は何々産アイソレート（isolate）
として扱われている。このようなアイソレートは更に精
査していけば、ある病害に特に適した線虫の開拓となる
であろう。ＤＮＡレベルの分類はアイソレートの全国的
あるいは世界的整理に期待されている（石橋信義編（19
93）「有用線虫の探索とその大量生産ならびに施用法の
システム化」平成４年度科学研究補助金試験研究Ａ
（１）研究成果報告書Ｐ p.172）。本発明は、本線虫の
選好性を把握して、それに応じた餌糸状菌を用いるか、
或いは土壌中に生息する餌糸状菌に見合う本線虫を施用
することが最も好ましいことは言うまでもない。

【００１３】

【発明の実施の形態】（本線虫の大量生産法）１．植物質産業廃棄物または副産物による培養サトウキビ絞り滓（バガス）、みかん等の果汁製造過程
で出る果汁絞り滓（果汁絞り滓）、ポテトチップ屑い
も、ウリミバエ大量飼育後の培地、緑茶、ウーロン茶の
出し殻、インスタントコーヒー製造で出る滓（コーヒー
滓）等は、家畜飼料または燃料としても利用されるが、
大部分は廃棄されており、中にはその処理に困惑してい
る企業も多い。これら植物質培養体は温度と湿度が好条
件であれば、糸状菌を培養でき、更にその糸状菌が本線
虫の餌糸状菌であれば本線虫の培養は可能となる。

【００１４】上記植物質培養体、即ち固体培地には全て
糸状菌は育成するが、１種類の培養体では糸状菌の繁殖
に大きな差異がある。その結果線虫の繁殖も差異が大き
い。１種類の培養体で糸状菌、線虫とも良好に繁殖させ
るウリミバエ飼育後培地でも、他の培養体を多少加える
ことにより、更に良好な飼育培地になる。これは複数種
の培養体を混合することによって、培地が緩衝作用をも
つようになり、菌や線虫の培養期間中に培地のｐＨが上
昇しないためである。とくに茶の出し殻は発生したアン
モニアを吸着しｐＨの上昇を抑制する効果がある。従っ
てどのような培地を作製するにしても、２〜３種類の培
養体とともに茶の出し殻を混合する方がよい。

【００１５】基本的にはこのような固体培地全体に空隙
を持たせる必要があるため、空隙量の多い植物質培養体
を基礎培地とする。現在入手できる植物質産業廃棄物で
基礎培地となるものは、バガス、チップ屑いもである
が、例えば、バガスを基礎培地とするときは、好適な配
合は、乾燥重量比でバガス１：果汁絞り滓１：緑茶の出
し殻１、またはバガス１：屑いも１：緑茶ないしウーロ
ン茶の出し殻１である。屑いもの場合は、これだけ単独
でもよいが、先に述べた茶の出し殻と混合するのがよ
い。水分はいずれの調製培地も好ましくは５０〜６０％
とする。ｐＨは、培養期間中、５〜６の範囲に維持され
るのが最もよい。

【００１６】これらの固体培地をオートクレーブで滅菌
した後、本線虫の餌となる糸状菌を接種するが、菌糸伸
長の早いリゾクトニア・ソラニでは、菌糸懸濁液と本線
虫を同時に接種するのがよい。リゾクトニア・ソラニよ
りもやや伸長が遅れるボトリチス・シネレア菌では糸状
菌接種後３日程して本線虫を接種する。接種する本線虫
は予め体表面殺菌する必要がある。例えば、ストレプト
マイシン１０００ｐｐｍ液に３０分浸漬し、滅菌水で３
回遠心洗浄後、培地２０ｇ（水分６０％、乾物重で約７
ｇ）に本線虫約７０頭を接種する。

【００１７】最も入手し易い果汁絞り滓、屑いも、バガ
スの組み合わせでは、１００〜１５０万頭の生産量であ
る。これで計算すると、培地乾物重１ｋｇ当たり１億５
千万〜２億頭程度の本線虫が通常生産可能となる（Cho
i, Dong-Ro, and Ishibashi,Nobuyoshi (1989) Propaga
tion of five Aphelenchus avenae isolates on sixspe
cies of fungi and five substrates. Jpn. J. Nemato
l. 19:13-17 ）。

【００１８】然し乍ら、水分６０％を含む湿重３ｋｇの
培地には、１０リットルの容器が必要で、大量生産には
それだけの場所を占拠するため、固体培地による線虫生
産は必ずしも能率的とは言えない。さらに培養期間中ダ
ニの侵入を防ぐことも要求される。そのため、更に能率
的な大量培養法として、人工液体培地による方法があ
る。

【００１９】２．人工液体培地による餌糸状菌並びに菌
食性線虫の培養この方法は、ファーメンター使用による本線虫の大量生
産を目的としている。本線虫が糸状菌を摂食するには、
口針を菌糸に対し直角に差し込まねばならないので、線
虫の体を支える支持体が必要となる。その為に支持媒体
のすべてを液体とすることはできない。従って、先ず糸
状菌を繁殖させるのに必要な固体の支持体に菌を繁殖さ
せる培養液を含浸させる。

【００２０】前述のように、本線虫の大量繁殖には適度
な空間が媒体の中に必要であるから、支持体として何を
用いるかは重要である。また寒天は用いないから、支持
体に含浸させる培養液は寒天使用の場合よりもややリッ
チにしなければならない。培養期間中にｐＨを５〜６の
範囲に保てるよう燐酸緩衝液で培養液を調整する。かよ
うな要件を考慮して調整した支持体と培養液の一例を挙
げれば下記の通りである。

【００２１】支持体：スポンジ、例えば発泡ポリウレタ
ン又は多孔性（連続気孔）ポリビニルホルマール樹脂等
の多孔性樹脂或いは、有機・無機の繊維屑、編織布、不
織布等の繊維集合体、海綿など、動植物の多孔性物質
等、吸水及び保水性を有する固体材料が適用可能であ
る。これらは適宜の寸法に切断、裁断または集合させて
十分に水洗乾燥して用いる。

【００２２】培養液：ＰＤＡまたはＰＳＡ培地の中から
寒天を取り除き、蒸留水の代わりに燐酸緩衝液を用い、
デキストロースまたは蔗糖は処方通りとする。培養液の
ｐＨは５．２〜５．５の範囲とすることが好ましい。

【００２３】上記支持体、例えばスポンジ、を上記の培
養液で含浸し、ファーメンター容器に投入し、過剰の液
を除去した後、オートクレーブ中約１２０℃で６０分程
度の滅菌を施す。次いで餌糸状菌と本線虫とをファーメ
ンター内の培地に接種する。接種は糸状菌と本線虫とを
同時或いは糸状菌接種後に適宜に遅れて本線虫を接種す
る。例えば、糸状菌がリゾクトニア・ソラニの場合は本
線虫と同時、ボトリチス・シネレア菌を餌とするとき
は、本線虫接種の２日前くらいに菌を注入することがよ
い。また、接種する本線虫を寒天培地等に多量に保持し
ている場合は、クリーンベンチ内で４〜５ｃｍ角に切り
取った寒天培地を直接ファーメンター容器内のスポンジ
培地の上に置けばよい。

【００２４】本線虫は培地に接種するに先立って体表面
を殺菌しておく必要がある。殺菌は、適宜な頭数の線虫
を滅菌水で遠心洗浄、濃縮した後、ストレプトマイシン
水溶液を用い常法によって行う。

【００２５】培養は温度を２５℃に設定して、滅菌した
空気を通し好気条件で行う。通気量は使用している容器
の最少量でよく、時折通気を止めることもよい。特に、
菌と本線虫の接種後３日間は通気しないほうがよい。ｐ
Ｈは１週間おきに測定し、ｐＨ６以上になるようであれ
ば、培養液のｐＨをやや低めに（ｐＨ：５．０〜５．
２）調整する。ガラス壁面に本線虫がコイル状になって
付着し始めたら容器内を洗浄して４００メッシュの篩に
かける。スポンジは１００メッシュの篩の上に置き、そ
の下に４００メッシュを入れて、本線虫は４００メッシ
ュに集める。

【００２６】次いで本発明方法で大量生産された本線虫
の農業上の応用について述べる。本線虫は、農作物等、
植物の土壌病害防除、植物寄生有害線虫の増殖抑制或い
は土壌病害虫の総合防除等に幅広く応用することができ
る。

【００２７】［土壌病害防除］例えば、キュウリ立枯れ病の土壌病原糸状菌であるリゾ
クトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）ＡＧ−４、フ
ザリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．ラゲナリエ（Fu
sarium oxysporum f. sp. lagenariae）、ピティウム
ｓｐ（Pythiumsp. ）および／またはフィトフトラ・ニ
コティアナ・変種パラシティカ（Phytophthora nicotia
na var. parasitica）を含有する土壌においてはキュウ
リは全く発芽しないが、この土壌１リットル当たりに、
好ましくは高々４０万頭、更に好ましくは高々２０万頭
の本線虫を接種し約１週間培養すると、キュウリ種子の
発芽率は、滅菌土壌（土壌病原菌も本線虫も含まない）
における発芽率の７０〜８５％に達し土壌病害防除の効
果は大きい。本線虫の接種頭数が４０万頭／リットル土
壌を超えると、発芽率が却って低下する。滅菌土壌に本
線虫を単独で施用した場合の発芽率に比して、土壌病原
菌共存下の発芽率の低下が殆ど見られないことは、正に
驚くべきことである。

【００２８】更に、植物の土壌病原菌、例えばキュウリ
立枯れ病菌、および植物寄生性線虫、例えばネコブセン
チュウ（Meloidogyne spp.）およびネグサレセンチュウ
（Pratylenchus spp.)を含む土壌におけるキュウリ種子
の発芽阻害は本線虫により防止することができる。即
ち、立枯れ病菌のみ、或いは立枯れ病菌とネコブセンチ
ュウあるいはネグサレセンチュウとの混合接種土壌では
キュウリの発芽率は０であるのに対し、立枯れ病菌含有
土壌に約２０万〜５０万頭／リットル土壌、好ましくは
約４０万頭／リットル土壌程度の量の本線虫を混和した
後、植物の種子を播種すると発芽阻害は全く見られなく
なる。それに更に約５０万〜１５０万頭／リットル土
壌、好ましくは１００万頭／リットル土壌程度の量の昆
虫病原性線虫スタイナーネマ・カルポカプセ（Steinern
ema carpocapsae ）を混用した場合にも発芽阻害を全く
生じない。上記土壌病原菌の例としては、リゾクトニア
・ソラニ（Rhizoctonia solani）ＡＧ−４、フザリウム
・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．ラゲナリエ（Fusarium o
xysporum f. sp. lagenariae）、ピティウムｓｐ（Py
thium sp. ）、フィトフトラ・ニコティアナ・変種パラ
シティカ（Phytophthoranicotiana var. parasitica）
の少なくとも１種が挙げられる。

【００２９】更にまた、例えばネコブセンチュウ（Melo
idogyne spp.）およびネグサレセンチュウ（Pratylench
us spp.)よりなる群から選ばれる少なくとも１種の植物
寄生性線虫を上記の、立枯れ病菌と本線虫と昆虫病原性
線虫との三者共存系に約２００頭／リットル土壌加える
と、発芽率は１００％から８０％までに低下するが、生
育植物の草丈は変わらず、本線虫の有用線虫との併用に
よる病害虫被害消滅効果は顕著である。

【００３０】また、燻蒸剤で処理・無処理の試験区に立
枯れ病菌リゾクトニア・ソラニ・ＡＧ−４を施した病害
菌単独接種区と、それに大量の本線虫（例えば約２億
頭）を混合施用した混合接種区とに、例えば、ホウレン
ソウの芽だし種子をそれぞれ播種すると２０日後の発芽
率は、単独接種区では、燻蒸剤無処理区で高く、処理区
では有意に低くなりその後約１週間以内に１００％枯死
するに至る。即ち、燻蒸剤処理区では化学物質による土
壌処理は生物相の劇的な貧困化となり、そのため有害生
物の急速な回復を齎す。一方混合接種区では、逆に、燻
蒸剤処理区で発芽率は高くなり、無処理区で低くなる。
これは、無処理区土壌では生物相が豊富で、生物間の干
渉作用が大きいためと思われる。本線虫をこのような化
学処理された土壌に施用すれば、土壌病害の予防的効果
を高めることができる。

【００３１】［植物寄生性線虫の増殖抑制］植物寄生性有害線虫を含む土壌に大量培養した本線虫を
施すことによって植物寄生有害線虫の増殖を抑制するこ
とができる。本線虫は上記植物寄生性有害線虫の５０〜
１００倍量施用することによって本発明の目的を達成す
ることができる。植物寄生性線虫の例としては、ネコブ
センチュウ（Meloidogyne spp.）およびネグサレセンチ
ュウ（Pratylenchus spp. ）よりなる群から選ばれる少
なくとも１種を含む。

【００３２】［土壌病害虫の総合防除］土壌に病菌と害虫の両者を含む土壌には、昆虫病原性線
虫（スタイナーネマ）と本線虫とを混合施用することに
よって土壌病害虫の総合防除を行うことができる。ま
た、土壌害虫はハスモンヨトウおよび／またはカブラヤ
ガについて本発明の顕著な効果が確認されたが、それら
に限定されない。

【００３３】上記土壌害虫がハスモンヨトウであるとき
は、スタイナーネマ（Steinernemacarpocapsae ）に対
し本線虫を等量以上混合することが好ましく、また、土
壌害虫がカブラヤガであるときは、スタイナーネマに対
し本線虫を実質的に等量混合することが好ましい。

【実施例】以下、本発明の方法並びに本線虫の利用法を
実施例及び応用例について詳述する。

【００３４】（実施例１）［菌食性線虫アフェレンクス・アベネの大量生産法］市販の枕またはクッションに用いる多孔性樹脂スポンジ
［エバーライトピース（商品名）］を厚さ０．５ｃｍ、
幅１ｃｍ程度で長さ約２０ｃｍの短冊型に切り、良く水
洗いして乾燥したものを支持体とした。馬鈴薯６００
ｇ、デキストロースまたは蔗糖６０ｇ、ゼーレンゼン燐
酸緩衝液（ｐＨ：５．２〜５．５の範囲）３，０００ｍ
ｌで培養液を調製した。調製した培養液を上記スポンジ
に吸い込ませ、５Ｌ容のファーメンター容器の７分目程
度に入れ、余分の液は取り除いてオートクレーブ中で１
２０℃、６０分間滅菌処理し、自然冷却して人工液体培
地を得た。

【００３５】次いで、１００頭〜１２０頭の本線虫を１
５００ｒｐｍ遠心で３回滅菌水で洗い、５０ｍｌシリン
ダーに集めて、５ｍｌにした。０．００１％のアレタン
またはヒビタンを加えて、全量を３０ｍｌとして２時間
放置した。この間、パスツールピペット等を用いて通気
した。この後、３回滅菌水で遠心洗浄し、１ｍｌに濃縮
し、１０ｍｇストレプトマイシンを含む滅菌水９ｍｌを
加えて全量を１０ｍｌとし、直ちに２分間遠心して上澄
液を捨てた。この操作を２回行った後、滅菌水で３回遠
心洗浄し、０．５ｍｌ以下に濃縮して体表面を殺菌した
接種線虫とした。

【００３６】糸状菌リゾクトニア・ソラニと本線虫とを
同時にファーメンターフランジの植菌口から注入して培
養した。培養温度を２５℃に設定して、菌と本線虫の接
種後３日間を経過した後に、滅菌した空気を通した。通
気量は使用している容器の最少量（この容器の場合は
０．５Ｌ／ｍｉｎ）とし、時折通気を止めた。ｐＨは１
週間おきに測定しｐＨ６以上になるようであれば、培養
液のｐＨをやや低めに（ｐＨ：５．０〜５．２）ゼーレ
ンゼン緩衝液でで調整した。

【００３７】ガラス壁面に本線虫がコイル状になって付
着し始めた時点（培養開始後２５日）で容器内を洗浄し
て４００メッシュの篩にかけた。スポンジは１００メッ
シュの篩の上に置き、その下に４００メッシュを入れ
て、本線虫は４００メッシュに集め、採集した本線虫約
２億頭を後記の長期保存法で保存した。

【００３８】（実施例２）本線虫の餌となる糸状菌をボトリチス・シネレアとし、
この糸状菌を人工液体培地に接種して２日間経過後に本
線虫を注入した他は、すべて上記実施例１と同様にし
て、本線虫２〜３億頭を得た。

【００３９】［本線虫の長期保存法］上記実施例で得られた本線虫を集めて塊状にしガラス製
デシケーター（１０リットル）容器に入れ、温度２５℃
前後、相対湿度９７％の恒温恒湿下に２日間置いた。湿
度調節の溶液は、有害ガスを発生しない溶液であれば何
を使ってもよく、この場合はグリセリン溶液または飽和
食塩水を用いた。相次いで２日間ずつ湿度８６％、７６
％、５０％、３０％に漸減すれば、体型は収縮してほぼ
コイル状になり、計１０日間で完全な耐無水生存状態と
なった。この状態で室内の長期保存が可能であった。

【００４０】以下の応用例は本発明方法で大量生産され
た本線虫の農業上の応用に関するものである。

【００４１】［本線虫による土壌病害防除法］（応用例１）「キュウリ発芽ポット試験」３００ｍｌ容のポリスチロール製ポットに滅菌砂壌土と
バーミキュライトの１５：１混合土（水分５０％）を入
れた。固体産業廃棄物培地で糸状菌、リゾクトニア・ソ
ラニ・ＡＧ−４（Rhizoctonia solani AG-4 ）、フザリ
ウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．ラゲナリエ（Fusari
um oxysporum f. sp. lagenariae）、ピティウムｓｐ．
（Pythium sp. ）、又はフィトフトラ・ニコティアナ・
変種パラシティカ（Phytophthora nicotiana var. para
sitica）を２週間培養した。培養した糸状菌を含有する
培地１ｇずつと、同時に本線虫の１万、５万、１０万頭
を上記混合土に接種して容器内土壌を混和し、密閉して
暗所、２５℃に１週間置いた。次いで、消毒したキュウ
リ種子を１ポットに４粒播種した。各処理１０反復とし
て５日後発芽率を測定した。結果を表１に示す。

【００４２】

【表１】同一カラムで同じアルファベット文字の付いた生存率は
５％の危険率で有意差なし（t-test）（説明：例えば10
0,000 頭接種区は、病原菌なしが43.2で他と差があり、
他のは49％〜54％までとｆで差なし）

【００４３】本試験では滅菌土壌を用いたため、線虫単
独接種で発芽率の低下が見られ、発芽率は１万頭接種区
で約８０％、５万頭接種区で７０％、１０万頭接種区は
約４０％であった。本線虫を菌と共に接種すると、１万
頭接種区で７０〜８０％、５万頭接種区で８０〜８５
％、１０万頭接種区は却って低下し約５０％となった。
病原菌だけの接種区ではいずれの菌においてもキュウリ
の発芽率は０％であったことを考慮すると、本線虫施用
の効果は歴然としているが、この試験においては、適量
は１ポット当たり５万頭ということになる。使用した九
州産線虫の試験管内繁殖はリゾクトニア・ソラニが最も
高く、フザリウムやピティウムは非常に低いが、キュウ
リの発芽率や生育でみた防除効果には、菌間に有意差は
なかった。またポット内で増殖した線虫の割合も、接種
数の２．５〜２．７倍（１万頭接種区）となり菌間に有
意差はなかった。

【００４４】（応用例２）「キュウリ発芽ポット試験」５００ｍｌの滅菌砂壌土をポリスチロール製ポットに入
れた。一方、応用例１と同様に固体産業廃棄物培地で糸
状菌リゾクトニア・ソラニ・ＡＧ−４を培養した。この
培養した糸状菌を含有する固体産業廃棄物培地それぞれ
１ｇと、本線虫を５万、１０万、２０万、５０万、１０
０万頭とを上記滅菌砂壌土に混合して、土壌水分は約３
５％として密封し２週間２５℃で暗所に置いた。次い
で、１ポットにキュウリ種子３粒を播種し、１処理１０
反復とした。５日後発芽率、１６日後生育状態を調査し
た。結果を表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】本実験では線虫単独処理区を設けなかった
ので、線虫自体による被害は分からないが、線虫施用に
よる立枯れ病防除効果は歴然と現れた。即ち、病菌だけ
の接種では発芽率１３．３％であったのに対して線虫５
万頭接種区で８６．７％と発芽し、その後の生育は順調
であった。しかし、接種頭数が２０万頭以上になると発
芽率は徐々に低下し、５０万頭では６６．７％となっ
た。これは線虫自体による発芽障害と思われる。線虫も
病菌も接種しない区の発芽率は当然１００％となった
［Ishibashi, N. (1993) Integrated control of insec
t pests by Steinernema carpocapasae. In.“Nematode
s and the Biological Control of Insect Pests" (Bed
ding, R., Akhurst, R. and Kaya H. eds.), CSIRO, Ea
st Melbourne, 105-113.］

【００４７】（応用例３）「キュウリ立枯れ病防除ポッ
ト試験（ネコブセンチュウ、昆虫病原性線虫との組み合
わせ試験）」容器は容量５００ｍｌの素焼ポットを用いた。１ポット
の滅菌土壌に立枯れ病菌リゾクトニア・ソラニ・ＡＧ−
４をそれを培養した固体産業廃棄物培地１ｇと共に投入
し、サツマイモネコブセンチュウ１００頭、菌食性線虫
２０万頭、昆虫病原性線虫スタイナーネマ・カーポカプ
セ（Steinernema carpocapsae ）５０万頭を下記表３に
示す組み合わせで処理した。

【００４８】

【表３】

【００４９】土壌水分５０％、反復数それぞれ１０とし
て、処理後２週間２５℃で暗所に置いた後、キュウリ種
子４粒を播種した。ガラス室に移して２週間後キュウリ
稚苗の生存率と草丈を計測した。結果を表３に示す。立
枯れ病菌だけ、病菌とネコブセンチュウの混合区はキュ
ウリ発芽率０％であった。菌食性線虫２０万頭でも立枯
れ病菌との混合接種区は、本試験の場合、発芽阻害はみ
られなかった。しかし、草丈は対照区（無接種）よりや
や低かった。昆虫病原性線虫を混合すると、発芽率１０
０％で草丈も対照区と有意差はなかった。

【００５０】この三者に更にネコブセンチュウを加えた
場合、発芽率は８０％と低下したが、草丈には有意差は
なかった。昆虫病原性線虫は害虫防除に施用されるもの
であるが、病害虫の同時防除を目的に本線虫との混合施
用もありうる。本試験から有用線虫の混合は本線虫の施
用効果を何ら損なわず、寧ろ混合することによって、本
線虫による被害が消失することが判明した。同様な結果
は、この後実施した多くの試験においても得られた（Is
hibashi, N., and Choi, D-R. (1991) Biological cont
rol of soil pests by mixed application of entomopa
thogenic and fungivorous nematodes. J. Nematol. 2
3:175-181）。

【００５１】（応用例４）「ホウレンソウ立枯れ病小規模圃場試験」佐賀大学構内圃場で６カ月前燻蒸剤テロンII（商品名）
（１，３−ディクロロプロペン、有効成分９８％）（１
５Ｌ／１０ａ）で処理・無処理の試験区を用いた。９月
中旬、１区６ｍ²の培地に、ボトリチス・シネレアを餌
として繁殖させた本線虫を、４ｋｇの培地と共に（約２
億頭）、小麦ふすま培地で増殖させたリゾクトニア・ソ
ラニ・ＡＧ−４（立枯れ病菌）を４０ｇの培地ごと上記
線虫培地と混合または非混合（立枯れ病菌だけ）して、
試験区全面に敷き込み土壌と混和した。１処理３反復と
して、１週間放置した後、ホウレンソウの芽だし種子を
播種（２畝）した。播種２０日後に生育を調査した。結
果を表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】病菌だけの接種でホウレンソウの発芽率
は、燻蒸剤無処理区で高く（２８％）、処理区で有意
（５％水準）に低くなった（発芽率５％）。線虫を施用
すると、燻蒸剤処理区で高くなり（８４％）、無処理区
で低くなった（７８％。両者は５％水準で有意差があっ
た）。無処理区土壌では処理区よりも生物相が豊富で、
生物間の干渉作用が大きいことによるものと思われる。
病菌単独接種区のホウレンソウは生育が極めて悪く、調
査後１週間以内に、特に燻蒸剤処理区では１００％枯死
した。化学物質による土壌処理は生物相の劇的な貧困化
となり、ひいては有害生物の急速な回復を齎すようにな
っている。一方、本線虫をこのような土壌に施用すれ
ば、土壌病害の予防的効果は更に高められるものと期待
される［Ishibashi, N. (1993) Integrated control of
insect pests by Steinernema carpocpasae. In. “Ne
matodes and the Biological Control of Insect Pest
s" (Bedding, R., Akhurst, R. and Kaya H. eds.), CS
IRO, East Melbourne, 105-113.］

【００５４】（応用例５）「本線虫による植物寄生性線
虫の増殖抑制」ネコブセンチュウまたはネグサレセンチュウ等植物寄生
性線虫の１００倍の密度にして寒天上で同時に接種した
ところ、植物寄生性線虫の根侵入率はネコブセンチュウ
単独接種の１〜２％であった。また、滅菌土壌を用いた
ポット試験を行ったところ、植物寄生性線虫接種の１日
前に本線虫を接種して、植物寄生性線虫の侵入率は２０
％以下に低下した。しかし非滅菌土壌では植物寄生性線
虫単独接種と有意な差は見られなかった。一方、植物寄
生性線虫単独接種の侵入率も非滅菌土壌では、滅菌土壌
に植物寄生性線虫だけ接種した場合の３０％以下に低下
した。（自然界とくに多様な生物が存在するところで
は、病原体だけが優勢となれない機構となっている）。
従って、本線虫は、薬剤施用による土壌生物相の劣悪化
防止として施せば、有害線虫の急速な回復を抑制する効
果を奏することが確認された。

【００５５】（応用例６）「昆虫病原性線虫との同時施
用による土壌病害虫の総合防除」本線虫は、滅菌土壌においても、病原菌と混合して接種
すれば、植物に対する加害は起こらないことを先に確認
したが、昆虫病原性線虫スタイナーネマと同時に施用し
ても、植物には被害が見られず、寧ろ本線虫単独接種区
よりもキュウリの発芽は早く、発芽率も高い。混合施用
では逆に、昆虫病原性線虫の害虫に対する防除効果を確
認するため、数度実験を繰り返した。実験結果の１例を
表４に示す。

【００５６】

【表５】

【００５７】表５から明らかな通り、カブラヤガ幼虫の
ように本来スタイナーネマにやや抵抗性を持つ害虫に
は、本線虫をスタイナーネマよりも極度に多くした場
合、スタイナーネマの殺虫能力は更に低下するが、ハス
モンヨトウなどには殆ど問題はないだろうという結論に
達した。将来的に見て、本線虫とスタイナーネマ等有用
線虫との両立性は期待できる［Ishibashi, N. (1993) I
ntegrated control of insect pests by Steinernema c
arpocpasae. In.“Nematodes and the BiologicalContr
ol of Insect Pests" (Bedding, R., Akhurst, R. and
Kaya H. eds.), CSIRO, East Melbourne, 105-113.］。

【００５８】

【発明の効果】１．菌食性線虫アフェレンクス・アベネ
の大量生産が可能となり、大量生産された本線虫の長期
保存方法を確立した上、継代培養による本線虫の劣化を
防止することができたため、本線虫を利用した農作物の
病害虫防除を実地農業に有効に利用できるようになっ
た。

【００５９】２．更に、本線虫を利用した農作物の土壌
病害、植物寄生性線虫の増殖抑制法を確立したため、農
作物の収率、品質の向上に資するところが大きい。結論
的に言うならば、本線虫は罹病した植物を治癒するもの
ではなく、予防的に施用して大きい効果が期待される。
また、線虫施用量には適量があり、それ以上の大量を施
用すると効果は却って低下する。３．本線虫を利用した農作物の土壌病害防除法は、化学
薬品による公害や環境問題を伴わず、また、大量培養に
産業廃棄物を有効利用すれば環境の浄化に寄与すること
もできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A01K 67/033 A01N 63/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】バガス、茶のだし殻、チップ屑いも、果
汁絞り滓、ウリミバエ大量飼育後の培地、およびコーヒ
ー滓よりなる群から選ばれる植物質産業廃棄物または副
産物よりなり５０〜６０重量％の水分を含有する固体培
地を加熱滅菌した後、該固体培地に菌食性線虫アフェレ
ンクス・アベネ（Aphelenchus avenae）の餌糸状菌を接
種すると共に、体表面を滅菌した上記菌食性線虫を糸状
菌の接種と同時または接種後に上記培地に接種して培養
し、培養期間中培地のｐＨを５〜６の範囲に維持するこ
とを特徴とする菌食性線虫アフェレンクス・アベネの大
量生産法。
【請求項２】前記固体培地がバガス、茶のだし殻およ
びチップ屑いもの少なくとも１種を基礎培地として含む
請求項１の大量生産法。
【請求項３】前記固体培地が、植物質産業廃棄物また
は副産物の少なくとも２種の混合物よりなる請求項１ま
たは２の大量生産法。
【請求項４】前記固体培地がみかん果汁絞り滓と茶の
だし殻の乾燥重量比で１：１を含む混合物よりなる請求
項１〜３の何れか１項の大量生産法。
【請求項５】澱粉及びデキストロースまたは蔗糖と燐
酸緩衝液とを含む培養液を含浸した多孔性固体支持体よ
りなる人工液体培地を加熱滅菌した後、該人工液体培地
に菌食性線虫アフェレンクス・アベネ（Aphelenchus av
enae）の餌糸状菌を接種すると共に、体表面を滅菌した
上記菌食性線虫を糸状菌の接種と同時または接種後に上
記培地に接種して培養し、培養期間中前記人工液体培地
のｐＨを５〜６の範囲に維持することを特徴とする菌食
性線虫アフェレンクス・アベネの大量生産法。
【請求項６】前記培養液が澱粉１５０〜２５０ｇ／ｌ
及びデキストロースまたは蔗糖１５〜２５ｇ／ｌを含む
ゼーレンゼン燐酸緩衝液である請求項５の大量生産法。
【請求項７】菌食性線虫アフェレンクス・アベネ（Ap
helenchus avenae）を培養段階ごとに異なった種の糸状
菌を餌として逐次段階的に継代培養し、最終培養段階に
おいて非病原性糸状菌を餌として用いることを特徴とす
る菌食性線虫アフェレンクス・アベネの大量生産法。
【請求項８】上記異なった種の糸状菌がボトリチス・
シネレア（Botrytis cinerea）、リゾクトニア・ソラニ
（Rhizoctonia solani）、ピティウム（Pythium），バ
ーティシリウム（Virticillium）およびフザリウム（Fu
sarium）であり、最終培養段階において用いる非病原性
糸状菌がボトリチス・シネレアである請求項７の大量生
産法。