CN113475529B - 一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及制备方法和应用，属于生物农药技术领域。本发明的线虫制剂包括含有不同活性成分的制剂A和制剂B，制剂A的活性成分包括寄生性小杆线虫和多酚氧化酶的底物抑制剂L‑多巴；制剂B的活性成分包括多酚氧化酶的结构抑制剂槲皮素。应用本发明的线虫制剂在防治花卉蛞蝓时，制剂A于傍晚施用于花卉根际土壤表面；制剂B于同一天的下午喷于花卉的嫩芽、叶片上。本发明首次将蛞蝓生防因子寄生性小杆线虫与蛞蝓多酚氧化酶的两种功能抑制剂结合使用，并利用蛞蝓食性引诱极大提高了寄生性小杆线虫的田间速效性，并通过制剂A和制剂B选用不同的施用位置、施用时间和方法，加速了线虫侵染致死蛞蝓。

Description

一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂及制备方法和应用。
背景技术
蛞蝓Agriolimax agrestis Linnaeus为腹足纲，柄眼目，蛞蝓科动物的统称。中国南方某些地区称蜒蚰，是一种软体动物。蛞蝓喜食植株幼嫩组织，以成虫体或幼体在作物根部湿土下越冬。5-7月在田间大量活动为害，入夏气温升高，活动减弱，秋季气候凉爽后，又活动为害。蛞蝓怕光，强光下2-3小时即死亡，因此均夜间活动，从傍晚开始出动，晚上10-11时达高峰，清晨之前又陆续潜入土中或隐蔽处。蛞蝓取食花卉的叶片成孔洞，或取食其花朵，影响商品价值，是一种食性复杂和食量较大的有害动物。目前蛞蝓的防治主要是采用化学农药防治。
寄生性小杆线虫与昆虫病原线虫(EPN)一样，都是具有“昆虫天敌”兼“病原微生物”双重特点的微生物杀虫剂。将其应用于蛞蝓的防治，特别是花卉蛞蝓的防治具有较好的前景。但目前寄生性小杆线虫在害虫的综合治理应用中，因其作为生物活性体，对外界环境敏感，存在使用效果不佳和持效持效期短的问题。
Figure BDA0003115316170000011
在2016年在《Zootaxa》期刊中发表了题目为“Phasmarhabditis bonaquaense n.sp.(Nematoda:Rhabditidae),anew slug-parasitic nematode from the Czech Republic”一文描述的Phasmarhabditisbonaquaense小杆线虫能够防治蛞蝓，但是发明人发现该小杆线虫单独用来防治蛞蝓存在侵染致死进程慢等等的缺陷。因此如何提供一种防治花卉蛞蝓的生防制剂，对蛞蝓具持续性的控制作用且防效稳定，保护环境并延缓有害生物抗性产生，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，解决了现有技术中寄生性线虫田间使用效果不佳及持效期短的问题。本发明添加了一系列助剂抑制蛞蝓体内多酚氧化介导的体液免疫，继而增强寄生性小杆线虫Phasmarhabditis bonaquaense对蛞蝓田间侵染力。
本发明的目的之二在于，提供该线虫制剂的制备方法。
本发明的目的之三在于，提供该线虫制剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，包括含有不同活性成分的制剂A和制剂B，其中制剂A的活性成分包括寄生性小杆线虫和多酚氧化酶的底物抑制剂L-多巴；制剂B的活性成分包括抑制蛞蝓多酚氧化酶活性的结构抑制剂槲皮素。
本发明前期研究发现，寄生性小杆线虫侵染蛞蝓时寄主体液免疫中的多酚氧化酶PO活性非正常增强，因此利用“生物合理设计”，针对蛞蝓的PO酶蛋白结构特征及其催化反应特性，筛选了蛞蝓多酚氧化酶的两种功能抑制剂分别结合使用。本发明首次将蛞蝓多酚氧化酶抑制剂与生防因子“寄生性小杆线虫”结合起来，利用蛞蝓多酚氧化酶抑制剂削弱蛞蝓的体液免疫，从而加快生防因子“寄生性小杆线虫”侵染致死蛞蝓，大大提高了蛞蝓的生防速率。
本发明的部分实施方案中，所述寄生性小杆线虫为Phasmarhabditisbonaquaense。
本发明的部分实施方案中，每1L制剂A中含有寄生性小杆线虫10,000,000IJs～15,000,000IJs；L-多巴3～5MM。
本发明的部分实施方案中，所述制剂A中还包括有诱食剂；优选地，所述诱食剂包括诱食剂基质、或/和保湿剂、或/和防腐剂、或/和共生菌养分。
本发明通过在制剂A中添加诱食剂加速寄生性小杆线虫对蛞蝓的侵染。
本发明的部分实施方案中，每1L制剂A中包括有诱食基质：黄瓜粉碎物30-50g、甘蓝卷心菜粉碎物40-60g、酵母粉30-50g、米粉5-10g、大豆粉100-150g、马铃薯粉15-20g、玉米粉80-120g、大豆油1-3g。
本发明的部分实施方案中，每1L制剂A中包括有保湿剂琼脂粉5-10g，海藻糖(α,α)10-12g；
或/和防腐剂抗坏血酸0.4-0.6g；
或/和共生菌养分蛋白胨2.5-5g，牛肉膏2.5-6g。
本发明的部分实施方案中，每1L制剂B中含有槲皮素5～8MM，还包括有助剂；优选地，所述助剂包括附着剂、或/和渗透剂、或/和分散剂；
更优选地，所述附着剂包括乙氧基改性聚三硅氧烷0.8～1mL；其能增加液体在植物表面的附着力，不被雨水等冲刷。
更优选地，所述渗透剂包括青皮桔油1.0～1.5mL。
本发明的青皮桔油属于纯天然植物精油，从青皮桔中采用低温蒸馏提取工艺而成，其主要成分是D-柠檬烯，可以携带槲皮素快速穿透蛞蝓细胞壁，直达细胞质，帮助药物渗透，提高槲皮素的酶抑制效果。
更优选地，所述分散剂包括吐温类分散剂0.3～0.5mL；进一步优选地为吐温20，其能提高制剂在叶片上的稳定性。
本发明部分实施方案中，制剂B不含有诱食剂。
本发明所述的防治花卉蛞蝓的线虫制剂的制备方法，其中制剂A的制备包括以下步骤：按比例准备各组份，混匀，即得制剂A；
优选地，所述寄生性小杆线虫经蛞蝓的幼虫体侵染扩繁后使用；更优选地，将侵染扩繁后的寄生性小杆线虫采用White trap法收集到蒸馏水中，低温储存一段时间后使用；
优选地，按比例称取害虫诱食剂基质、或/和保湿剂、或/和防腐剂、或/和共生菌养分，加入蒸馏水至规定量，密封，灭菌，配制成诱食剂，备用；
所述制剂B的制备包括以下步骤：按比例称取制剂B的各组分，混合均匀后，加水至规定量；即得制剂B。
本发明所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂在防治花卉蛞蝓中的应用。
本发明的部分实施方案中，所述制剂A施用在花卉根际土壤表面；所述制剂B喷于花卉的嫩芽、叶片上；
优选地，所述制剂A于傍晚施用；
优选地，所述制剂B于下午施用；
更优选地，所述制剂A和制剂B同一天施用。施用方法为：制剂B于下午喷于花卉的嫩芽、叶片上，每一株花卉均匀喷施10～15ml；制剂A于同一天傍晚施用在花卉根际土壤表面，每平方米均匀撒施1.5～2.0g。7～10天施用一次。
本发明将包括多酚氧化酶活性的结构抑制剂槲皮素的制剂B喷于花卉的嫩芽、叶片等组织上，将包括寄生性小杆线虫和多酚氧化酶的底物抑制剂L-多巴的制剂A施用在花卉根际土壤表面。这两次施用极大提高了寄生性小杆线虫对花卉蛞蝓的生防效率。如果蛞蝓啃食花卉的嫩芽、叶片会提前(第一次)被降低体液免疫(多酚氧化酶活性被抑制)，干扰其正常的生理活动；然后，线虫与多酚氧化酶的底物抑制剂-L-多巴及蛞蝓诱食剂混合施用在花卉根际土壤表面，在傍晚蛞蝓出动的时候引诱蛞蝓取食，取食后的蛞蝓不仅被再次降低体液免疫(多酚氧化酶活性被抑制)还能被线虫侵染致死。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙，首次将新型蛞蝓生防因子寄生性小杆线虫与蛞蝓多酚氧化酶的两种功能抑制剂结合使用，并结合蛞蝓食性引诱极大提高寄生性小杆线虫在实际应用中的速效性，同时，通过制剂A和制剂B选用不同的施用位置、施用时间和方法，加速了线虫侵染致死蛞蝓。本发明对蛞蝓具持续性的控制作用且防效稳定，保护环境并延缓害虫抗性产生。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
本实施例提供了本发明的线虫制剂的成分含量表及制法，具体见表1。
表1
Figure BDA0003115316170000041
采用表1中的原料制备本发明线虫制剂的制剂A的方法如下：
步骤1.寄生性小杆线虫的扩繁培养：
寄生性小杆线虫经蛞蝓的幼虫体侵染扩繁；繁殖的寄生性小杆线虫三龄侵染期幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于4℃冰箱内2周后使用；
步骤2.按比例称取各原料组分：
用静沉法将步骤1收集到的寄生性小杆线虫悬浮液浓缩，加入L-多巴，加入蒸馏水补充至1000mL，室温混匀，4℃冰箱内储存，备用。
制备制剂B的方法如下：
取槲皮素，加入蒸馏水至1000mL，混匀，备用。
实施例2
本实施例提供了本发明的线虫制剂的成分含量表及制法，其中制剂A和制剂B均按制成1L计，具体见表2。
表2
Figure BDA0003115316170000051
采用表2中的原料制备本发明线虫制剂的制剂A的方法如下：
步骤1.寄生性小杆线虫的扩繁培养：
寄生性小杆线虫经蛞蝓的幼虫体侵染扩繁；繁殖的寄生性小杆线虫三龄侵染期幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于4℃冰箱内2周后使用；
步骤2.按比例称取诱食剂基质、保湿剂、防腐剂、共生菌养分至同一容器中，加蒸馏水补充至900mL，混匀后装入三角瓶，加盖封口膜后放入高压灭菌锅内，在压力为1.0MPa，温度为121℃条件下，灭菌(融化)20min～40min，得到的产物、冷却后取出备用；
步骤3.用静沉法将步骤1收集到的寄生性小杆线虫悬浮液浓缩至100mL以内(内含线虫数量不变)，加入到步骤2所得的产物中，再加入L-多巴，加入蒸馏水补充至1000mL，室温混匀，4℃冰箱内储存，备用。本实施例中所得制剂A为凝胶状。
制备制剂B的方法如下：
按比例取槲皮素、乙氧基改性聚三硅氧烷、青皮桔油和吐温20至同一容器中，加入蒸馏水至1000mL，混匀后置4℃冰箱内储存，备用。本实施例中所得制剂B为液体。
实施例3
本实施例提供了本发明制剂防治花卉蛞蝓的应用。
试验方法：防治试验于2020年6月在成都市龙泉驿区唐菖蒲(Gladiolusgandavensis Vaniot Houtt)繁育基地进行，共设置6个处理，每个处理设置3个重复，共计18个小区，每个小区50m2(10m*5m)，小区采用随机区组分布，在每个小区均匀放置双线嗜黏液蛞蝓(Phiolomycus bilineatus)100头幼虫(体长为20mm左右、大小均匀、身体健康)。
放置蛞蝓后的1天开始施用本发明的线虫制剂。施用方法为：制剂B于下午喷于花卉的嫩芽、叶片上，每一株花卉均匀喷施10ml；制剂A于同一天傍晚施用在花卉根际土壤表面，每平方米均匀撒施1.5g。
施用后每天观察并记录蛞蝓的死亡数量，及时取出死亡的蛞蝓。总共观察统计七天，计算七天蛞蝓死亡率。根据对照组死亡率与处理组死亡率的差异，计算防治效果。
7天死亡率(％)＝7天死亡的蛞蝓总数/100×100％
处理1组：仅含有寄生性小杆线虫；
处理2组：仅含有寄生性小杆线虫和L多巴；
处理3组：仅含有寄生性线虫和槲皮素；
处理4组：仅含有寄生性小杆线虫、L多巴和槲皮素；
处理5组：仅含有寄生性小杆线虫、L多巴、槲皮素和诱食剂全组分；
处理6组：仅含有寄生性小杆线虫、L多巴、槲皮素和助剂全组分；
处理7组：包含发明全组分，寄生性小杆线虫、L多巴、槲皮素和诱食剂全组分、以及助剂全组分。
空白对照组：清水处理。
其中处理1组-7组的原料组成如表3-1和3-2所示，其中制剂A和制剂B均按制成1L计，制备方法为按实施例2相关步骤进行：
表3-1
Figure BDA0003115316170000071
Figure BDA0003115316170000072
Figure BDA0003115316170000081
结果如下表所示：
表4
处理 7天内蛞蝓死亡率(％)
空白对照组 14.67±1.45f
处理1组 33.00±3.61e
处理2组 45.67±3.76d
处理3组 47.33±2.73d
处理4组 56.33±4.81c
处理5组 65.33±4.31b
处理6组 63.00±2.31b
处理7组 74.67±3.76a
注：本表中字母a、b、c、d、e、f不相同表示有显著性差异，P＜0.05。
结果显示，本发明的线虫制剂具有良好的防治花卉蛞蝓作用。其中，将线虫与槲皮素及L-多巴配合施用能有显著的协调作用，制剂A含有诱食剂的配方比不含诱食剂的配方对蛞蝓的防治效果更好。此外，含有助剂的制剂B比不含助剂的效果更佳。
实施例4
本实施例考察了不同的施用时间的影响。
本实施例中所用防治花卉蛞蝓的线虫制剂均是采用实施例2中表2中编号为5所列举原料配比、并按照实施例2所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂A和制剂B。
试验方法同实施例3，区别在于施用时间不同。本实施例共3个处理，每个处理设置3个重复，具体如下所示：
处理1组：制剂B于下午施用；制剂A于同一天傍晚施用；
处理2组：制剂B和制剂A均在下午施用；
处理3组：制剂B和制剂A均在傍晚施用；
空白对照组：下午清水喷施。
表5
处理 7天内蛞蝓死亡率(％)
空白对照组 11.00±1.15c
处理1组 73.67±2.19a
处理2组 52.00±1.73b
处理3组 58.00±2.31b
注：本表中字母a、b、c不相同表示有显著性差异，P＜0.05。
结果显示，本发明的线虫制剂的施用时间对花卉蛞蝓的防治效果具有显著影响：制剂B于下午施用、制剂A于同一天傍晚施用效果最好。其原因在于蛞蝓啃食花卉的嫩芽、叶片会提前(第一次)被降低体液免疫(多酚氧化酶活性被抑制)，干扰其正常的生理活动；然后，线虫与多酚氧化酶的底物抑制剂-L-多巴及蛞蝓诱食剂混合施用在花卉根际土壤表面，在傍晚蛞蝓出动的时候引诱蛞蝓取食，取食后的蛞蝓不仅被再次降低体液免疫(多酚氧化酶活性被抑制)还能被线虫侵染致死。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，包括含有不同活性成分的制剂A和制剂B，其中制剂A的活性成分包括寄生性小杆线虫和抑制蛞蝓多酚氧化酶的底物抑制剂L-多巴；制剂B的活性成分包括抑制蛞蝓多酚氧化酶活性的结构抑制剂槲皮素；所述寄生性小杆线虫为Phasmarhabditis bonaquaense；
每1L制剂A中含有寄生性小杆线虫10,000,000 IJs ~15,000,000 IJs；L-多巴3~5 MM；
每1L所述制剂B中含有槲皮素5~8 MM。
2.根据权利要求1所述一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，所述制剂A中还包括有诱食剂。
3.根据权利要求2所述一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，所述诱食剂包括诱食剂基质、或/和保湿剂、或/和防腐剂、或/和共生菌养分。
4.根据权利要求3所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，每1L制剂A中包括有诱食剂基质：黄瓜粉碎物30-50 g、甘蓝卷心菜粉碎物40-60 g、酵母粉30-50 g、米粉5-10 g、大豆粉100-150 g、马铃薯粉15-20 g、玉米粉80-120 g、大豆油1-3 g。
5.根据权利要求4所述一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，每1L制剂A中包括有保湿剂琼脂粉5-10 g，海藻糖10-12 g；
或/和防腐剂抗坏血酸0.4-0.6 g；
或/和共生菌养分蛋白胨2.5-5 g，牛肉膏2.5-6 g。
6.根据权利要求1或2所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，每1L所述制剂B中还包括有助剂；所述助剂包括附着剂、或/和渗透剂、或/和分散剂。
7.根据权利要求6所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，每1L制剂B中的附着剂包括乙氧基改性聚三硅氧烷0.8~1 mL。
8.根据权利要求6所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，每1L制剂B中的渗透剂包括青皮桔油1~1.5 mL。
9.根据权利要求6所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，每1L制剂B中的分散剂包括吐温类分散剂0.3~0.5 mL。
10.根据权利要求9所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂，其特征在于，所述吐温类分散剂为吐温20。
11.权利要求1-10任意一项所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂的制备方法，其特征在于，制剂A的制备包括以下步骤：按比例准备各组份，混匀，即得制剂A；
所述制剂B的制备包括以下步骤：按比例称取制剂B的各组分，混合均匀后，加水至规定量；即得制剂B。
12.根据权利要求11所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂的制备方法，其特征在于，所述寄生性小杆线虫经蛞蝓的幼虫体侵染扩繁后使用。
13.根据权利要求12所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂的制备方法，其特征在于，将侵染扩繁后的寄生性小杆线虫采用White trap法收集到蒸馏水中，低温储存7~14天后使用。
14.根据权利要求11所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂的制备方法，其特征在于，按比例称取害虫诱食剂基质、或/和保湿剂、或/和防腐剂、或/和共生菌养分，加入蒸馏水至规定量，密封，灭菌，配制成诱食剂，备用。
15.权利要求1-10任意一项所述的一种防治花卉蛞蝓的线虫制剂在防治花卉蛞蝓中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述制剂A施用在花卉根际土壤表面；所述制剂B喷于花卉的嫩芽、叶片上。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述制剂A于傍晚施用。
18.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述制剂B于下午施用。
19.根据权利要求16-18任意一项所述的应用，其特征在于，所述制剂A和制剂B同一天施用。
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