PT100669B - Utilizacao de nematodos phasmorhabditis para o controlo de pragas, particularmente para o controlo biologico de moluscos - Google Patents
Utilizacao de nematodos phasmorhabditis para o controlo de pragas, particularmente para o controlo biologico de moluscos Download PDFInfo
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Description
4>. Ν’ ,
Este invento relaciona-se com o 'cbntrolo de pragas agrícolas e hortícolas e mais particularmente com o controlo de moluscos, incluindo lesmas, por exemplo Deroceras reticulatum e caracóis, por exemplo Monacha cantiana. Por razões de conveniência, o invento irá ser descrito principalmente em relação com o controlo das lesmas mas deve ser tomado em consideração que é também aplicável ao controlo de outros moluscos que são prejudiciais para as plantas no campo ou em estufas, ou que transportam parasitas prejudiciais para os seres humanos ou animais.
As lesmas constituem uma praga espalhada em várias colheitas agrícolas importantes, particularmente o trigo de inverno, semente oleaginosa de colza e batatas no Reino Unido, noutros países Europeus, América do Norte e do Sul e Australasia. Contituem também um problema em horticultura e para o jardineiro doméstico. As espécies de lesmas economicamente mais importantes são a lesma cinzenta do campo, Deroceras reticulatum (família: Limacidae), embora outras lesmas limacidas e espécies Arion (família: Arionidae), Tandonia, Milax (família: Milacidae) e espécie Boettgerilla possam também estar na origem de prejuízos significativos. Os caracóis também podem constituir um problema de praga em horticultura e agricultura, sendo um exemplo Monacha cantiana (família: Helicidae). Exemplos de pragas de moluscos são indicadas por Godan em "Pest Slugs and Snails" (1983, Springer--Verlag, Berlin). Os moluscos podem também transpotar pragas que representam um perigo para a saúde humana ou animal. Exemplos incluem espécie Limnaea (família: Lymnaeidae), que transportam a fascíola Fasciola hepatica, e espécie Bulinus (família: Bulinidae) que transporta Opisthorcis sinensis. As famílias Limacidae, Arionidae, Milacidae e Helicidae são membros da Ordem Stylommatophora. As famílias Bulinidae e Limnaeidae são membros da Ordem Basommatophora. Métodos correntes de controlo são àpenas parcialmente eficazes e os produtos químicos disponíveis são altamente tóxicos para pássaros e mamíferos. Existe assim uma necessidade evidente para encontrar métodos, para o controlo de moluscos, mais eficazes, mais persistentes e menos tóxicos.
Foi actualmente descoberto que nemátodos do género Phasmorhabditis são agentes de controlo eficazes para uma ampla gama de espécies de moluscos. Espécies Phasmorhabditis particularmente eficazes são os organismos afins P. neopapillosa e P. hermaphrodita que serão aqui a seguir descritos. Estas espécies são conhecidas há muitos anos e são descritas na bibliografia, tendo sido caracterizadas especialmente por Andrassy em "A Taxonomic Review of the Sub-Order Rhabditina (Nematoda: Secernentina)" (1983, Orstom, Paris). Contudo, a actividade biológica destes organismos contra lesmas e outras pragas de moluscos não foi até hoje reconhecida. 0 presente invento compreende assim a utilização da espécis Phasmorhabditis para o controlo de pragas agrícolas e hortícolas ou de pragas para a saúde humana e animal, especialmente moluscos. Os organismos podem ser obtidos a partir de lesmas no campo ou cultivados por métodos descritos aqui a seguir a fim de produzir quantidades suficientes para a formulação em composições apropriadas para aplicação no campo ou na estufa. Composições típicas para utilização prática usam materiais viculos aceitáveis tais como turfa, argilas, e outros veículos sólidos ou semí-sólidos tais como materiais gel. Ensaios ao ar livre numa pequena porção de terreno ou no campo revelaram que o nemátodo pode tanto matar lesmas como proteger pequenas plantas de couve Chinesa e sementes ou pequenas plantas de trigo do ataque pelas lesmas pelo menos tão bem, ou mesmo melhor, do que com metiocarb, o melhor produto químico habitualmente disponível. 4 - ϊ
Biologia do organismo 0 nemãtodo foi isolado a partir de lesmas recolhidas em Long Ashton Research Station na Grã-Bretanha. Verificou-se que o nemátodo se encontrava associado a uma doença fatal nas lesmas com sintomas característicos, sendo o mais evidente uma tumefac-ção do manto da lesma. 0 nemátodo foi identificado como pertencendo à Sub-Ordem Rhabditina e foi pósteriormente identificado usando uma chave (Andrassy, 1983). As principais características taxonómicas deste grupo são constituídas pelas peças bocais e pelas estruturas reprodutoras do macho. Os nemátodos isolados em Long Ashton apresentavam um estorna curto, identificativo com um metastoma isomórfico, e os machos, quando presentes, apresentavam bursas peloderan, adaptadas ao género Phasmorhabditis. Andrassy (1983) indica duas espécies que são morfologicamente idênticas a estes nemátodos mas que estão separadas uma da outra à base do número de machos presentes nas populações. Em Phasmorhabditis neopapillosa os machos e fêmeas são igualmente abundantes, enquanto que em P. Hermaphrodita os machos são extremamente raros. Ainda não é sabido se P. hermaphrodita é uma espécie separada ou apenas uma variante biológica de P. neopapillosa (Andrassy 1983). P. hermaphrodita foi primeiro descrito por
Maupas, em Archives de Zoologie (1900), vol 8 pp 464-624, que denominou o nemátodo Rhabditis caussaneli. Encontrou formas larvares resistentes no intestino de Arion ater por ele recolhidas na Normandia. Manteve culturas de nemátodos em carne podre durante dois anos. Verificou que os vermes adultos eram predominantemente hermafroditas autógamos protândricos. Os machos estavam presentes em números muito pequenos (1 macho para 1.300 fêmeas) e o número de machos em culturas não era afectado pelas condições nutritivas. Maupas nunca observou machos acasalando-se com as fêmeas, o que revelou não haver alteração na sua fecundidade, ou da taxa de sexo da sua descedencia na presença de 5
machos. Maupas não considerou este nemãtodò cómo sendo um parasita das lesmas.
Phasmorhabditis neopapillosa foi descrito por Mengert, que denominou o nemátodo Rhabditis neopapillosa, em Zeitschrift fur Morphologie und Okologie Tiere (1953), vol. 41, pp 311-349 nos seus estudos sobre as relações entre nemátodos e moluscos terrestres. Encontrou o nemátodo nos estádios larvares resistentes ("dauer larvae") no intestino posterior da lesma Limax cinereoniger. Mengert considerou P. neopapillosa como uma sapró-fita que se desenvolve em matéria em decomposição durante muitas gerações, mas quando as condições se tornam desfavoráveis os jovens não conseguem atingir a maturação e formam larvas dauer que não se alimentam resistentes. Considerou que o estilo de vida de P. neopapillosa era idêntico ao de outras duas espécies, Phasmorhabditis papillosa e P. hermaphrodita. Considerou que as larvas dauer destas três espécies vagueiam, quando surge a oportunidade, no corpo das lesmas onde permanecem como larvas dauer até a lesma morrer, após o que se desenvolvem e reproduzem, alimentando-se do cadáver. Mengert pensou que a estadia na lesma não consistia uma parte necessária do ciclo de vida do nemátodo mas considerou que as larvas dauer destas espécies mostravam um grau de adaptação à vida no interior das lesmas. Contudo, declarou que não eram parasitas das lesmas.
Nemátodos podem ser isolados de lesmas recolhidas do campo usando armadilhas com iscos de farelo deixadas numa superfície de erva dura. Uma vez recolhidos os nemátodos podem ser isolados do intestino das lesmas ou da cavidade do manto a seguir a dissecção. Muitas espécies de nemátodos encontram-se associadas a lesmas (Mengert, 1953) e é necessário confirmar a identificação de P. hermaphrodita e de P. neopapillosa usando uma chave taxonó-mica (Andrassay, 1983). Se só nemátodos no estádio infeccioso '1 6
(dauer larvae) forem encontrados na lesma será necessário cultivar os nemátodos a fim identifica-los.
Os nemátodos Phasmorhabditis foram isolados em Long Ashton numa série de ocasiões. Nalguns casos a população de nemátodos consistia em machos e fêmeas, enquanto que noutros casos as populações consistiam apenas em hermafroditas. Nemátodos de ambos os tipos de população foram examinados usando microsco-pia luminosa e microscopia electrónica. Os perfis proteicos das diferentes populações também foram examinados a seguir a separação das proteinas por focagem iso-eléctrica. Não se verificaram diferenças entre as populações usando qualquer um dos métodos atrás referidos. Os nemátodos isolados correspondem às descrições disponíveis de ambos P. neopapillosa e O. hermaphrodita.
Nemátodos Phasmorhabditis podem ser produzidos por métodos a ser descritos nesta descrição detalhada. É já sabido nesta técnica que nemátodos parasitários dos insectos podem ser produzidos em grande escala para utilização comercial por cultura líquida, usando tanque de agitação ou fermentadores de elevação de líquido por pressão de ar, ou por cultura sólida em sacos ou tabuleiros de tiras de espuma. Podem ser utilizadas técnicas semelhantes para uma produção em grande escala de P. hermaphrodita ou P. neopapillosa. Assim o nemátodo usado de acordo com este invento é rápidamente cultivado em meio à base de rim em tiras de espuma ou em cultura líquida, usando técnicas semelhantes às utilizadas para a produção de nemátodos parasitários de insectos. Tendo como finalidade o presente invento é recomendado que a cultura de nemátodos seja recolhida no estádio de larvae dauer.
Requerimentos para bactérias associadas
Nemátodos Phasmorhabditis sao alimentadores bacterianos. 7 -
Verificou-se que muitos isolados de bactérias se encontravam associados a nemátodos Phasmorhabditis após isolamento a partir de lesmas moribundas. Investigámos a relação entre os nemátodos e essas bactérias associadas a fim de determinar que bactérias podem suportar bom crescimento de nemátodos e comparar a patoge-nicidade de nemátodos criados em diferentes espécies de bactérias. A fim de produzir consistentemente altos rendimentos de nemátodos Phasmorhabditis que são patogénicos para moluscos é preferível faze-los crescer em culturas com uma bactéria conhecida associada (culturas monoxenicas) e assim um método para seleccionar espécies individuais de bactérias capazes de suportar o crescimento de nemátodo se necessário. Bactérias capazes de suportar o crescimento de nemátodos podem ser isoladas de entre nemátodos, a partir de culturas de nemátodos crescendo numa população microbiana mista, a partir de lesmas infectadas com bactérias e a partir de cadáveres de lesmas infestados com os nemátodos. Os nemátodos podem ser libertados de todas as bactérias contaminantes, e introduzidos em culturas com as diferentes espécies individuais de bactérias. A incubação destas culturas permite a selecção de isolados de bactérias capazes de suportar o crescimento de nemátodos.
Isolados de aproximadamente 100 bactérias foram obtidos a partir de nemátodos, a partir de lesmas infectadas com nemátodos e a partir de lesmas mortas infestadas com nemátodos, 15 das quais foram testadas quanto à sua capacidade para suportarem o crescimento de nemátodos. Destes, 9 isolados, representando 8 espécies, revelaram suportar um bom crescimento de nemátodos sobre agar. As 8 espécies de bactérias, que se verificou suportarem um bom crescimento de nemátodos foram as seguintes: δ
Pseudomonas fluorescens Providencia rettgeri Serratia proteomaculans Aeromomas salmonicida Moraxella phenylpyruvica Bacillus cereus Flavobacterium odoratum Flavobacterium brevi A capacidade de nemãtodos criados em diferentes espécies de bactérias para matar lesmas pode ser testada num bioen-saio. Nesse bioensaio as lesmas são expostas a diferentes números de nemãtodos e a mortalidade resultante das lesmas é registada. Usando este método, medições quantitativas da patogenicidade (por exemplo LD^) de nemãtodos contra lesmas podem ser obtidas e usadas para comparar a patogenicidade de nemãtodos criados em diferentes espécies de bactérias. É importante que o nemátodo seja fornecido em associação com bactérias específicas porque as bactérias são essenciais não sómente para o crescimento do nemátodo (tanto in vitro como in vivo) mas também pela sua capacidade para matar lesmas. 0 nemátodo transporta bactérias associadas ao entrar na lesma permitindo assim um rápido estabelecimento e multiplicação do nemátodo levando à morte da lesma.
Exemplos de estirpes bacterianas apropriadas são Moraxella phenylpyruvica estirpe 48 e Pseudomonas fluorescens 9
estirpe 141, cujas amostras foram depositadas sob o Tratado de Budapeste com a National Collection of Industrial and Marine Bactéria sob os Números de Acesso NCIMB 40508 e NCIMB 40509 respectivamente, em 9 de Junho de 1992. A estirpe Pseudomonas fluorescens 141 é uma bactéria gram negativa oxidase positiva, catalase positiva que é não móvel e apresenta valores negativos no teste 0/F (Hugh and Leifson) para decomposição aeróbica e anaeróbica da glucose. A estirpe Moraxella phenylpyruvica 48 é uma bactéria gram negativa, oxidase positiva, catalase positiva que é não móvel e apresenta valores negativos no teste 0/F (Hugh and Leifson). Os perfis bioquímicos de ambas as estirpes em substratos padronizados (tira de teste API ZONE) são indicados mais abaixo. 10
Reacçao Moraxella Pseudomonas fenilpirúvica 48 fluorescens NO3 ~ NO2 + — NO_ - N_ * ò 2 índole - - Ácido a partir de glucose - Dihidrolase da arginina - + Urease - - Hidrólise esculina - - Hidrólise gelatina - + Ã Galactosidase - - Assimilação de: Glucose - + Arabinose - + Manose - + N-acetilglucosamina - + Maltose - - Gluconato - + Caprato - + Adipato - - Malato - + Citrato + + Acetato de fenilo - — * = não testado
Variantes úteis de M. phenylpyruvica estirpe 48 e P. fluorescens estirpe 141 podem ser obtidas por sub-culturas repetidas de culturas puras destas estirpes. As variantes podem também ser obtidas quer por re-isolamento de bactérias a partir de nemátodos Phasmorhabditis préviamente feitos crescer em 11 - t *
associação com uma das estirpes ou por re-isolamento de bactérias a partir de lesmas infectadas com nemátodos. Essas variantes podem ter sofrido alterações genotipicas ou fenotípicas como resultado de influencias ambienteais ou de pressão selectiva. Derivados úteis de M. phenylpyruvica estirpe 48 e P. fluorescens estirpe 141 podem ser obtidos pela introdução de codificação do ADN para atributos desejáveis de outros organismos. Métodos para a introdução de ADN estranho em bactérias são bem conhecidos pelos especialistas nesta técnica e incluem técnicas tais como transferencia, transdução e transfecção de plasmídeo. Mutantes úteis de M. phenylpyruvica estirpe 48 e P. fluorescens estirpe 141 podem ser obtidos por mutagenese usando métodos bem conhecidos pelos especialistas neste método, tais como técnicas químicas (por exemplo nitrosoguanidina), físicas (luz ultravioleta) e genéticas (mutagenese transposon). Essas variantes, derivados e mutantes das estirpes podem ser alterados no que se refere a características tais como taxa de crescimento ou a capacidade para crescer em certas fontes nutritivas mas irão reter características essenciais relevantes para este invento, isto é a capacidade tanto de suporte do crescimento de nemátodos Phasmorhabditis como de indução da patogenicidade em relação aos moluscos.
Para utilização no controlo de pragas agrícolas, são recolhidos nemátodos a partir de fermentadores por centrifugação, filtração ou sedimentação sob a acção da gravidade.Os nemátodos são lavados a fim de remover os componentes do meio gastos e ou formulados imediatamente ou armazenados sob a forma de suspensões aquosas arejadas antes da formulação subsequente. Os nemátodos podem ser formulados para utilização agrícola sob a forma de suspensões aquosas, ou de veículos sólidos tais como carvão, argilas, turfa, vermiculite ou esponja poliéter-poliuretano ou encapsulados em geles tais como alginato ou poliacrilamida. Uma formulação particularmente desejável contem nemátodos dessecados ou parcialmente dessecados.
Os nemátodos formulados podem ser aplicados para o controlo de pragas formando uma suspensão aquosa e aplicando-a à área a ser tratada por pulverização, irrigação ou rega.
Exemplo 1. Método de isolamento de nemátodos Phasmorhabditis
Nemátodos vivos extraídos de lesmas recolhidas do campo usando armadilhas com iscos de farelo são colocados em meio de agar à base de rim misturando rim de porco homogeneizado a 10%, óleo de milho a 3,5%, agar a 2% e água a 84,5% (% em peso) sendo então a mistura esterilizada por meio de autoclave e vertida para placas de petri. 0 meio encoraja o crescimento das bactérias associadas com os nemátodos. Os nemátodos alimentam-se destas bactérias e crescem e reproduzem-se sobre as placas.
Exemplo 2. Isolamento de bactérias associadas com nemátodos ou lesmas infectadas com nemátodos
Bactérias associadas com nemátodos ou lesmas infectadas com nemátodos podem ser isoladas por qualquer um dos métodos . que se seguem: (i) Isolamento de bactérias a partir do interior de nemátodos
Os nemátodos são esterilizados na sua superfície por imersão em etilmercuritiosalicilato de sódio (p/v) a 0,1% (Thimerosal) durante 1 hora sendo então transferidos para
Thimerosal fresco durante mais três horas. As bactérias podem ser libertadas dos nemátodos usando técnicas microbiológicas estéreis num de dois modos: 13
a) Larvas de nemátodos individuais são transferidas para uma gota de solução salina numa lâmina de microscópio esterilizada pela chama. Os nemátodos são então cortados em vários sítios ao longo do comprimento dos seus corpos. A gota de solução salina completada com o cadáver de nemátodo é então transferida usando uma pipeta de pasteur estéril para uma placa de petri com 9 cm com agar nutritivo onde é espalhada sobre a superfície usando um espalhador de vidro submetido a chama com álcool. b) Muitos nemátodos esterilizados superficialmente são suspensos em 1 ml de solução de Ringer estéril que é transferida para um homogeneizador de tecidos de teflon de 5 ml. A suspensão de nemátodo é moida sendo então transferida para 9 ml de um caldo nutritivo estéril. 0 caldo é agitado vigorosamente sendo feitas diluições seriadas. Porções alíquotas de 0,1 ml de cada diluição são colocadas em placas de agar nutritivo e espalhadas usando um espalhador de vidro e incubadas. Após uma incubação de 48 horas a 25%C, diferentes isolados de bactérias podem ser seleccionados tendo como base a morfologia da colónia e subcultivados usando técnicas microbiológicas padronizadas. (ii) Isolamento de bactérias de culturas de tiras de espuma xenicas
Tiras de espuma . contendo nemátodos e bactérias são retiradas de culturas xénicas bem desenvolvidas usando fórceps inflamados com álcool. Cada tira é colocada num tubo contendo 10 ml de um caldo nutritivo estéril e agitada. São feitas diluições seriadas da resultante suspensão de bacterias/nemátodo e porções alíquotas de 0,1 ml de diferentes diluições são espalhadas sobre placas de agar nutritivo e incubadas. (iii) Isolamento de bactérias a partir de lesmas vivas infectadas com nemátodos P. hermaphrodita/P.neopapillosa infecta e multiplica-se na região do manto das lesmas e é a partir desta região que as bactérias podem ser isoladas. 0 manto é primeiro esfregado com bolas de algodão em rama seco a fim de remover tanto muco quanto possível. A superfície do manto é então esfregada com 70% (v/v) de etanol para esterilizar a superfície do manto. Uma agulha montada esterilizada com chama é usada para perfurar o manto sendo dez gotas do fluido na extremidade da agulha transferidas directamente para placas de agar nutritivo onde são espalhadas usando um espalhador de vidro e incubadas. (iv) Isolamento de Bactérias a Partir de Lesmas Mortas
Esfregaços de tecido de cadáveres, de lesmas que morreram a seguir a infecção com nemátodos e que estão cobertos com nemátodos são suspensos em caldo nutritivo usando um gancho bacteriológico. São feitas diluições seriadas a partir desta suspensão e porções alíquotas de 0,1 ml são espalhadas em placas de agar nutritivo e incubadas.
Exemplo 3. Método para seleccionar bactérias que servem de suporte a um bom crescimento de nemátodos
Antes de ser possível selecionar diferentes bactérias quanto à sua capacidade para servirem de suporte ao crescimento de nemátodos é necessário primeiro obter nemátodos livres de bactérias. 0 aparelho reprodutor femenino dos nemátodos é geralmente estéril (Poinar and Hansen, 1986) e assim jovens J1 imediatamente após incubação são estéreis. Nemátodos adultos grávidos individuais seleccionados de entre culturas de nemátodos ou 15
lesmas são transferidos para um vidro de relógio estéril contendo 0,02% (p/v) de Thimerosal, onde são deixados durante a noite a 10hC. Durante este período de tempo ovos incubam nos adultos e os jovens (Jl) são libertados. No dia seguinte os jovens são transferidos por pipeta para tubos de centrífuga cheios com 10 ml de solução de Ringer com um quarto da concentração contendo 500 unidades/ml de penicilina G e sulfato de Estreptomicina. Os jovens são mantidos nesta solução durante mais 24 horas a 10%C. São então concentrados por centrifugação suave (50 x G durante 10 minutos), recolhidos a partir do fundo do tubo, suspensos de novo em solução de Ringer fresca estéril com um quarto da concentração e agitados de novo. A ressuspensão e centrifugação é repetida uma vez mais a fim de remover quaisquer vestígios de antibióticos. As larvas são então colocadas num vidro de relógio estéril. Os nemãtodos podem então ser manipulados individualmente usando micro-pipetas produzidas moldando pipetas para gotejamento numa chama de bunsen até um diâmetro de aproximadamente 0,1 mm. As culturas de nemãtodos são feitas crescer em agar de rim (tal como é descrito no Exemplo 1) em placas de petri de 3 cm. O conteúdo de gancho bacteriológico de cultura em caldo nutritivo de 18 horas das bactérias a serem testadas é aplicado por esfra-gaço sobre metade de placas de rim de 3 0 mm. Os nemãtodos jóvens axenicos, obtidos tal como foi descrito no Exemplo 8, são adicionados na periferia da placa de petri na metade sem bactérias, de modo a que os nemãtodos temham que se mover pelo menos 15 mm através de uma superfície livre de bactérias antes de atingirem a bactéria do teste. As placas são incubadas a 15%C. Quaisquer bactérias presentes com os nemãtodos que não tenham sido mortas durante o processo de axenisação formam colónias visíveis nessa metade da placa e as placas podem ser eliminados. Após uma semana, as placas revelando contaminação bacteriana na metade "limpa" são eliminadas. Após duas semanas os números de nemãtodos presentes nas placas podem ser contados por exame microscópico / ' 16 directo; a tampa da placa de petri é removida e substituída com outra tampa préviamente marcada com uma grelha de contagem. Após três semanas os nemãtodos podem ser contados de novo separando os nemátodos do agar por irrigação com um volume conhecido de água e contando os números presentes na suspensão resultante usando uma câmara de contagem de Peter de 1 ml.
Nove espécies diferentes de bactérias recolhidas usando os métodos descritos foram analisadas guanto à sua capacidade para suportarem o crescimento dos nemátodos. Os resultados são indicados no Quadro 1. 17
Quadro 1. Números de nemátodos Phasmorhabditis por placa de petri após duas e três semanas de crescimento em cultura monoxenica com diferentes bactérias. Os dados foram transformados em logaritmos para análise estatística.
Bactéria Semana 2 Números Log Axénico 2 0,41 Bactéria IA 170 2,18 Bactéria 17 0 0,04 Bactéria 34 1 0,13 Bactéria 48 60 1,70 Bactéria 54 80 1,53 Bactéria 77 1160 3,06 Bactéria 83 520 2,46 Bactéria 141 690 2,77 Bactéria 156 250 2,26 S.E.D para comparação de números 0,204, 128 D .F.
Semana 3 Números Log 0 0,00 18090 4,22 0 0,00 890 1,00 54060 4,73 25950 4,39 86340 4,93 67000 4,78 75220 4,85 83630 4,89 de nemátodos logarítmicos =
Após três semanas existiam diferenças altamente significativas (P <0,001) na capacidade das bactérias para servirem de suporte para o crescimento dos nemátodos.
I
Exemplo 4. Método para cultura em massa de nemátodos Phasmorhabditis por cultura de tiras de espuma
Os nemátodos podem ser cultivados em massa em tiras de espuma de poliéter poliuretano usando técnicas seçelhantes às desenvolvidas para criar em massa nemátodos parasitários de insectos (Bedding, em Nematologica (1981), vol. 27, pp 109-114 e Annals of Applied Biology (1984), vol. 104, pp 117-120). O meio consiste em 65% de rim de porco, 15% de gotejamento de carne de vaca e 25% de água (% em peso). O rim é picado em pequenas peças, a água é adicionada e em seguida a mistura é "liquefeita” num misturador de Waring. O gotejamento da carne de vaca é fundido num tacho grande em lume de gás sendo então o homogenato de rim adicionado e misturado cuidadosamente com a gordura e cozinhado até ficar castanho. A mistura é então devolvida ao misturador de Waring e moida mais uma vez. Esta mistura é então misturada com tiras de espuma, com 12 partes em peso de meio sendo adicionadas a 1 parte de tiras de espuma. Este meio pode ser distribuído por frascos cónicos, ou sacos de autoclave tal como é descrito por Bedding (1984). As culturas de tiras de espuma são inoculadas com nemátodos e bactérias simultâneamente. Cada saco é aberto por incisão no topo adicionando-se 75 ml de uma cultura nocturna de bactérias. A cultura de bactérias pode apresentar-se sob a forma de uma população microbiana mista, obtida tal como é descrito no Exemplo 2, ou como uma cultura pura de uma estirpe bacteriana seleccionada quanto à capacidade para servir de suporte a um bom crescimento de nemátodos tal como é descrito no Exemplo 3. São adicionados nemátodos em agar a partir de placas de petri ou em tiras de espuma a partir de prévias culturas em sacos. Os sacos de cultura são incubados a 15%C durante três semanas e após esse período de tempo muitos jovens infecciosos podem ser observados no interior dos sacos, tendo abandonado o meio consumido. Os nemátodos são recolhidos das tiras de espuma por meio de uma 19
técnica de extracção por funil modificada, semelhante à utilizada para recolher nemátodos a partir de amostras de solo. Crivos para solo de cobre com 17,5 cm de diâmetro são revestidos com um filtro de leite de 17,5 cm e colocados em pratos de vasos de flores de 50 cm. As tiras de espuma dos sacos são colocados em crivos com uma profundidade de aproximadamente 2 cm e os pratos dos vasos de flores são cheios com água até o nível de água atingir o fundo da camada de tira de espuma. Os crivos são então deixados durante a noite e durante esse período de tempo os nemátodos vivos nadam através dos filtros de leite e são recolhidos na água situada mais abaixo. Após limpeza da suspensão de nemátodo do meio gasto e bactérias mudando a água várias vezes, os nemátodos são armazenados em água arejada a 10%C até serem necessários.
Exemplo 5. cultura líquida, de nemátodos Phasmorhabditis monoxé-nicos
Nemátodos axenisados foram cultivados num meio sólido (â base de rim) com as bactérias apropriadas. Após 3 semanas os nemátodos foram transferidos para cultura líquida.
Os nemátodos desenvolveram-se em cultura de frasco agitado nas condições que se seguem:
Meio - 10% de rim, 1% de extracto de levedura, 3,5% de óleo de milho.
Frasco - frascos cónicos de 250 ml com 50 ml de meio.
Temperatura - 15%C
Velocidade da agitação - 200 rpm. 20 -
Os frascos foram inoculados com 1 ml de uma espécie bacteriana feita crescer em caldo nutritivo. Após 24 horas os nemátodos foram lavados para frascos com água corrente estéril e incubados durante três semanas.
Os nemátodos foram lavados duas vezes com água estéril e contados. Os nemátodos foram então usados como inoculo para experimentações de cultura. Os nemátodos foram adicionados aos frascos de cultura â taxa de 3.000 nemãtodos/ml a frascos pré-ino· culados com bactérias.
Os nemátodos foram cultivados com 4 bactérias diferentes. As contagens de nemátodos foram realizadas em tempos diferentes durante o período de cultura. Larvas dauer (também conhecidas como jovens infecciosos) foram avaliadas como nemátodos com uma cuticula de segundo estádio retida.
Os nemátodos foram contados após 20 dias de incubação e os resultados são expressos no Quadro 2.
Quadro 2. Cultura líquida de nemátodos monoxénicos
No. médio de nemátodos por ml Bactéria No. de replicações Larvas Dauer Outros Estádios P. fluorescens 6 1220 110 S. proteomaculans 6 11500 7400 P. rettgeri 6 99900 189000 M. phenylpyruvica 3 72000 223000 A produção em massa do nemátodo por cultura líquida em recipientes de fermentação em grande escala, à base de condições descritas neste Exemplo, pode ser conseguida fácilmente pelos especialistas nesta técnica.
Novo Exemplo 6. Método para seleccionar bactérias que conferem patogenicidade contra lesmas
Nemátodos feitos crescer em cultura monoxemica com duas espécies de bactérias, Providencia rettgeri e Moraxella phenylpyruvica, tal como é descrito no Exemplo 5, foram testados quanto à sua patogenicidade contra a lesma Deroceras reticulatum. Caixas de plástico (135 x 75 x 50 mm( foram cheias com 440 g de agergados do solo secos, com diâmetro de 12,5 - 25 mm, que tinham sido obtidos por passagem por crivo. Os agregados de solo de cada caixa foram removidos e embebidos em 80 ml de água.
Foram usadas caixas não tratadas sem nemátodos adicionados e caixas tratadas com doses de cinco nemátodò (15.000, 23.000, 35.000. 55.000 e 75.000 nemátodos por caixa de plástico). Foram usadas duas réplicas das caixas para a totalidade dos seis tratamentos para ambos os lotes de nemátodos monoxénicos. Os nemátodos foram contados e o número apropriado foi suspenso em 50 ml de água corrente. Os agregados foram substituídos na caixa e a suspensão de nemátodos foi distribuída uniformemente sobre a superfície dos agregados camada por camada. Dez D. reticulatum foram colocados entre as camadas médias de cada caixa. 50 ml de água corrente foram distribuídos uniformemente sobre os agregados nas caixas sem adição de nemátodos de modo a que o conteúdo final de humidade em cada caixa era de aproximadamente 30% (p/p).
As lesmas foram conservadas no solo durante um período de infecção de cinco dias a 10%C e em seguida foram removidas e transferidas para placas de petri onde foram mantidas 22 22
individualmente e alimentadas com discos de couve Chinesa. Após mais nove dias a 10%C (catorze dias após a exposição inicial aos nemátodos), foram registados os números de lesmas mortas e vivas. Os dados sobre a mortalidade foram corrigidos para a mortalidade de fundo tal como se observa nas caixas não tratadas. Os dados de mortalidade corrigidos foram registados contra a dose de nemátodos para nemátodos feitos crescer em cultura monoxénica com ambas as bactérias.
Nesta experimentação nemátodos feitos crescer com M. phenylpyruvica e Pr. rettgeri foram patogénicos em relação a D. reticulatum. Este método pode ser usado para seleccionar outras estirpes de bactérias, por exemplo P.fluorescens estirpe 141, que confere patogenicidade contra as lesmas.
Exemplo 7. Formulação de nemátodos Phasmorhabditis
Nemátodos Phasmorhabditis monoxénicos, que cresceram em associação com M. phenylpyruvica estirpe 48 tal como é descrito no Exemplo 5, foram recolhidos por centrifugação e lavados em água por meio de um processo repetitivo de sedimentação e de ressuspensão em água fresca até os nemátodos se encontrarem livres do meio de crescimento residual. Os nemátodos lavados foram concentrados por centrifugação a fim de produzir uma pasta g aquosa de nemátodos que continha uma gama de 0,1 xlO a2,0 x g 10 nemátodos por grama de pasta. A pasta de nemátodos foi misturada com uma argila montmorillonite de cálcio a fim de produzir uma composição em pó dispersível na água contendo de 0,05 x 10 a 1,8 x 10 nemátodos por grama (peso húmido).
Exemplo 8. A capacidade dos nemátodos Phasmorhabditis produzidos por cultura de tiras de espuma para matar diferentes espécies de lesmas
Os nemátodos Phasmorhabditis que tinham sido cultivados numa flora bacteriana mista usando métodos descritos no Exemplo 4 foram submetidos a bioensaios contra seis espécies de pragas de lesmas. Estas eram Deroceras reticulatum, D. caruanae, Arion ater, A. intermedius, A. distinctus e Tandonia (milax) sowerbyi. As lesmas foram recolhidas a partir de armadilhas com iscos de farelo em Long Ashton Research Station em Novembro 1990. Todas as lesmas eram adultas com excepção de A. ater que eram jovens (peso médio 770 mg). Os nemátodos foram criados em culturas em sacos de tiras de espuma xénica tal como é descrito no Exemplo 4. Agregados de solo grosseiro seco ao ar com diâmetro de 12,5-25 mm que tinham sido obtidos por passagem por crivo foram colocados em caixas de plástico (135 x 75 x 50 mm), com 440 g de agregados de solo seco ao ar por caixa. Aproximadamente 1,9 x 10 larvas infecciosas de Phasmorhabditis foram adicionadas a cada uma das caixas tratadas com nemátodos suspensas em 130 ml de água corrente. 130 ml de água corrente sem nemátodos foram adicionados às caixas não tratadas. Dez lesmas foram colocadas em cada caixa com excepção da espécie de lesma maior (T. sowerbyi e A. ater) e para isso cinco lesmas foram mantidas em cada caixa. Dezassete lesmas A. distinctus foram tratadas com nemátodos e dezoito foram mantidas como testemunhas não tratadas. Para todas as outras espécies vinte lesmas foram tratadas e outras vinte foram deixadas como testemunhas não tratadas. As lesmas foram deixadas no solo durante um período de infecção de cinco dias e em seguida as caixas com solo foram desmanteladas e o número de lesmas mortas foi registado. As lesmas sobreviventes foram transferidas para 9 placas de petri revestidas com papel de filtro húmido onde foram mantidas individualmente e alimetadas com discos de folhas de 24
couve Chinesa. As caixas de solo e as placas de petri foram mantidas a ÍO^C ao longo de cada bioensaio. Os números de lesmas mortas foram registados mais duas vezes com intervalos de três dias. As mortalidades das espécies individuais de lesmas em células tratadas e não tratadas em qualquer altura foram compara-das utilizando um teste chi . Os resultados são indicados no Quadro 3.
Quadro 3. Mortalidade percentual em diferentes espécies de lesmas 8, 11 e 14 dias após tratamento com nemátodos ou deixadas sem tratamento
Dia 5 Dia 8 Dia 11 Espécies de Lesmas Trat . Não Trat. Trat. Não Trat. Trat. Não 1 Deroceras reticulatum 100 10 100 25 100 40 Deroceras caruanae 70 10 100 15 100 20 Arion ater 5 0 40 0 100 0 Arion intermedius 100 40 100 60 100 70 Arion distinctus 6 6 88 11 100 28 Tandonia sowerbyi 20 15 80 15 100 25 25
Após o período de infecção de cinco dias as diferenças na mortalidade entre lesmas tratadas com nemátodos e não tratadas foram altamente significativas (P<0,001) para D. reticulatum, D. caruanae, e A. intermedius. As diferenças das mortalidades entre lesmas tratadas e não tratadas para as outras três espécies não foram significativas neste estádio. Após oito dias as diferenças nas mortalidades entre lesmas tratadas e não tratadas foram significativas para todas as espécies testadas (P<0,001 para D. reticulatum, D. caruanae, T. sowerbyi e A. distinctus, e P<0,01 para D. reticulatum, D. caruanae, T. sowerbyi e A. distinctus, e £<0,01 para A. ater, e A. intermedius). No dia 11 todas as lesmas tratadas com nemátodos tinham morrido. As diferenças nas mortalidades entre lesmas tratadas e não tratadas foram significativas para todas as espécies (£<0,01 para A. intermedius e £<0,001 para todas as outras espécies). A diferença não foi tão grande para A. intermedius porque muitas das lesmas não tratadas tinham morrido. É claro a partir destes resultados que os nemátodos Phasmorhabditis são capazes de matar todas as espécies de lesmas testadas.
Exemplo 9. A capacidade dos nemátodos Phasmorhabditis produzidos por cultura de tiras de espuma para controlar os prejuízos nas plantas causados pela lesma do campo Deroceras reticulatum em condições de campo
Uma experimentação com uma pequena porção de campo foi realizada para comparar os prejuízos causados pelas lesmas às plantas pequenas de couve Chinesa em pequenas porções de campo não tratados, pequenas porções de terreno tratadas com pílulas de metiocarb (geralmente considerado como sendo o melhor produto químico disponível para controlo das lesmas) e pequenas porções de campo tratadas com uma única dose elevada de nemátodos produzidos por cultura de tiras de espuma com uma flora bacteriana mista tal como é descrito no Exemplo 3. 0 teste foi realizado numa série de 40 micro porções de campo contendo um solo de argila numa camada de cascalho grosseiro. As pequenas porções de campo tinham 70 x70x 30 cm de profundidade e encontravam-se separadas por barreiras de madeira ou de cimento, encimadas por uma vedação com 10 cm de altura, de malha de cobre tecida com 0,8 mm para actuar como uma barreira ao movimento das lesmas entre as pequenas porções de campo.
Trinta e seis das pequenas porções de campo foram povoadas com lesmas entre Março e Junho de 1989. Não foram adicionadas lesmas às 4 pequenas porções de campo restantes que foram usadas como uma medição da população de lesmas residente, cinco D. reticulatum adultos colhidos no campo foram adicionados a cada uma das pequenas porções de campo a serem povoadas. Estas lesmas tinham sido mantidas em caixas de quarentena durante pelo menos duas semanas a fim de assegurar que não transportavam quaisquer parasitas. Trinta e quatro D. reticulatum recém nascidos criados em laboratório foram adicionados a cada pequena porção de campo ao longo de um período de três meses de modo a estarem presentes no início da experimentação lesmas em vários estádios de desenvolvimento. O esquema experimental consistia em nove replicações de quatro blocos randomizados, consistindo cada bloco em duas pequenas porções de campo não tratado, sendo uma pequena porção de campo tratada com nemátodos e uma pequena porção de campo tratada com pílulas de metiocarb. 27
6 1,05 χ 10 nemátodos foram suspensos em 900 ml de água corrente e regados sobre cada pequena porção de campo usando um recipiente para regar equipado com um ralo. Outros 100 ml de água corrente foram usados para lavar o recipiente sendo então vertidos para as pequenas porções de campo. Um litro de água corrente foi também adicionado às pequenas porções de campo não tratadas e tratadas com metiocarb. As pílulas de metiocarb foram adicionadas à taxa de campo recomemdada (5,5 kg/ha = 0,275 g/porção de campo). As pílulas foram pesadas e distribuídas uniformemente sobre as pequenas porções de campo à mão. As pequenas porções de campo foram irrigadas através de uma mangueira suspensa ao longo da experimentação, a fim de assegurar que as condições eram favoráveis para a actividade da lesma.
No início da experimentação, plantas pequenas jovens de couve Chinesa que tinham crescido numa estufa foram plantadas fora da estufa, nove pequenas plantas em cada pequena porção de campo distribuídas num quadrado 3 x 3. Estas foram examinadas duas vezes por semana e o nível de prejuízo provocado pelas lesmas em cada pequena planta foi avaliado em cerca de 5 por cento.
Duas semanas após a plantação, as pequenas plantas nalgumas das pequenas porções de campo não tratadas foram completamente destruídas, e assim os restos das anteriores pequenas plantas foram removidos de todas as pequenas porções de campo sendo plantadas novas pequenas plantas. Isto foi repetido após mais duas semanas. Após mais duas semanas a experimentação estava terminada (um total de seis semanas). Os prejuízos nas pequenas plantas foram registados duas vezes por semana ao longo da experimentação. As barreiras de malha de cobre entre as pequenas porções de campo num dos blocos de tratamento (Bloco 9) foram retiradas após as primeiras quatro semanas permitindo o movimento 28
das lesmas entre as porções de campo, e assim estas porções de campo foram ignoradas e os resultados indicados para a quinta e sexta semanas representaram apenas 8 blocos.
No final da experimentação duas amostras de solo com 25 x 25 x 10 cm de profundidade foram retiradas de cada pequena porção de campo dos restantes 8 blocos, sendo uma amostra retirada do centro e uma do canto Sudeste de cada pequena porção de terreno. As amostras foram gradualmente inundadas durante nove dias na unidade de extracção da lesma LARS (Glen & Wiltshire, em Proceedings 1986 British Crop Protection Conference (1986), vol 1, pp 139-144) e as lesmas foram removidas da superfície diáriamente. 0 nível de prejuízo pelas lesmas às pequenas plantas em cada tratamento no decurso da experimentação é indicado na Fig. 1. A análise da variância a seguir a transformação angular para estabilizar a variância revela que tanto as pílulas de metiocarb como o nemátodo reduzem significativamente (P<0,001) o nível de prejuízo nas pequenas plantas provocado pelas lesmas. Na primeira leitura (quatro dias após o tratamento) o nível de prejuízo era significativamente maior (P<0,05) nas pequenas porções de campo tratadas com nemátodos do que nas porções de campo tratadas com metiocarb, mas à medida que as plantas cresciam ultrapassando o prejuízo inicial a diferença entre as pequenas porções de campo tratadas com o nemátodo e com o metiocarb diminuía. No final da primeira semana as pequenas porções de campo tratadas com nemátodos revelavam um menor prejuízo do que as pequenas porções de campo tratadas com metiocarb, mas a diferença não era significativa. Após 17 dias (primeiro exame do segundo lote de pequenas plantas) as pequenas porções de campo 29
tratadas com nemátodos apresentavam um prejuízo significativamente inferior (P<0,05) do que as pequenas porções de campo tratadas com metiocarb, e isto persistiu (P<0,01) até ao fim da experiência.
Foram encontradas três espécies de lesmas nas amostras de solo, Deroceras reticulatum, Deroceras caruanae e Boettgerilla pallens. Em todas as pequenas porções de campo, apenas foram encontradas 2 D. caruanae, mas foram encontradas 89 B. pallens em comparação com 55 D. reticulatum. As B. pallens foram presumivelmente introduzidas nas pequenas porções de campo algum tempo antes tendo-se reproduzido e colonizado uniformemente. A dieta preferida desta lesma não é comhecida mas em testes laboratoriais ela não prejudicou as folhas de couve Chinesa durante três semanas de exposição sem qualquer fonte alternativa de alimento. É assim improvável que esta lesma estivesse causando prejuizo às pequenas plantes neste ensaio. Não foi encontrada D. reticulatum nas amostras de solo das quatro pequenas porções de campo às quais nenhuma tinha sido adicionada. Isto sugere que ao contrário de B. pallens havia poucas ou nenhumas D. reticulatum nas pequenas porções de campo antes do início da experimentação.
Os números totais de lesmas e a biomassa extraídos dos diferentes tratamentos foram transformados em raizes quadradas para análise estatística. Os resultados são indicados na Fig. 2.
Significativamente menos lesmas foram extraídas das pequenas porções de campo tratadas com nemátodos do que das pequenas porções de campo não tratadas (P<0,01 para todas as espécies de lesmas e para D. reticulatum isoladamente) e foram extraídas menos das pequenas porções de campo tratadas com metiocarb do que das pequenas porções de campo não tratadas '"ν' - (Ρ<0,05 para todas as espécies de lesmas e para D. reticulatum isoladamente). Embora fossem extraídas menos lesmas das pequenas porções de campo tratadas com nemátodos do que das tratadas com metiocarb, esta diferença não foi significativa. Não foram extraídas D. reticulatum das pequenas porções de campo tratadas com nemátodos sugerindo que esta espécie tinha sido quase eliminada destas pequenas porções de campo. Os números de B. pallens não foram significativamente afectados pelos nemátodos ou metiocarb embora menos B. pallens tenham sido encontradas em pequenas porções de campo tratadas com nemátodos do que nas pequenas porções de campo não tratadas.
Exemplo 10. Ά capacidade de nemátodos Phasmorhabditis monoxénicos para matar diferentes espécies de pragas de moluscos
Nemátodos Phasmorhabditis monoxénicos, que tinham crescido em associação com M. phenylpyruvica estirpe 48 tal como foi descrito no Exemplo 5, foram bioensaiados contra várias espécies de pragas de moluscos, incluindo Monacha cantiana (o caracol Kentish), tal como é descrito no Exemplo 8. Os resultados são indicados no Quadro 4.
Quadro 4. Percentagem mortalidade em várias espécies de pragas de moluscos após tratamento com nemátodos monoxénicos ou deixadas sem tratamento
Espécies Moluscos Duração Bioensaio (dias) Tratadas Não Tratadas Deroceras reticulatum 11 100 15 Deroceras caruanae 11 100 10 Monacha cantiana 5 100 0 Arion intermedius 5 100 0 Arion distinctus 11 100 0 Tandonia sowerbyi 11 70 5
As diferenças nas mortalidades entre moluscos tratados e não tratados foram significativas para todas as espécies testadas (P<0,001), indicando que todas as espécies de pragas de moluscos testadas foram susceptiveis a Phasmorhabditis espécie monoxenizada com M. phenylpyruvica estirpe 48. 0 espectro de actividade dos nemátodos monoxénicos está inalterado em comparação com nemátodos xénicos.
Nemátodos Phasmorhabditis monoxénicos cresceram em associação com M. phenylpyruvica ou P. rettgeri tal como é descrito no Exemplo 5, e foram bioensaiados em vários níveis de dosagem contra a espécie de lesma D. reticulatum tal como é descrito no Exemplo 8. Os resultados são resumidos na Figura 3. Ambos os tipos de nemátodos monoxénicos são activos contra D. reticulatum
Exemplo 11. A capacidade de nemátodos Phasmorhabditis monoxéni-cos para controlarem os prejuízos nas plantas causados pela lesma do campo Deroceras reticulatum em condições de campo
Foi realizado um ensaio no campo para comparar o prejuízo causado pelas lesmas ao trigo de inverno (cv Mercia) em pequenas porções de campo não tratadas, pequenas porções de campo tratadas com pílulas de metiocarb e pequenas porções de campo tratadas com uma gama de doses de nemátodos. Os nemátodos monoxé-nicos foram produzidos em associação com M. phenylpiruvica estirpe 48 tal como é descrito no Exemplo 5 e formulados em argila, tal como é descrito no Exemplo 7, sob a forma de um pô dispersível na água contendo 0,36 x 10 nemátodos por grama (peso húmido). Os nemátodos foram aplicados imediatamente após sementeira das sementes sob a forma de um spray aquoso num volume equivalente a 1,100 litros/hectare. As pílulas de metiocarb foram aplicadas manualmente à taxa recomendada para o campo (5,5 kg/hectare).
Armadilhas à superfície e amostras de solo foram usadas para monitorizar a população de lesmas nas pequenas porções de campo ensaiadas. Muitas espécies diferentes de lesmas, incluindo Deroceras reticulatum, Arion silvaticus, Arion subfuscus, Arion ater, Tandonia sowerbyi e milax gagates foram encontradas nas porções de campo, mas D. .reticulatum era de longe a espécie predominante.
Seis semanas depois de se ter semeado, as pequenas porções de campo foram avaliadas quanto à emergência de pequenas plantas, que constitui uma estimativa do prejuízo letal das lesmas (isto é uma redução na altura da planta), e foram feitas estimativas do prejuízo sub-letal por lesmas (isto é escoriações das plantas pelas lesmas) por avaliação visual de plantas 33
seleccionadas ao acaso. Os números médios das plantas de trigo que emergiram por 0,5 m de comprimento de sulcos para os diferentes tratamentos são indicados no Quadro 5.
Quadro 5. Números médios de plantas de trigo emergidas por 0,5 m de comprimento de sulcos para os vários tratamentos no ensaio no campo (avaliações feitas 6 semanas após semeadura)
Tratamento Números Médios de Plantes Emergidas Não tratadas Dose nemãtodos 1 X io8 por ha Dose nemãtodos 3 X io8 por ha Dose nemátodos 1 X 109 per ha Dose nemãtodos 3 X 109 por ha Dose nemãtodos 1 X 1010 por ha Metiocarb 12,93 12,78 13,95 13,25 14,88 16,50 14,57 S.E.D. = 1,314, (399 d.f.)
Existe um aumento evidente nos números de plantas emergidas com doses aumentadas de nemãtodos, e consequentemente os tratamentos com nemãtodos levaram a uma redução da acção letal pelas lesmas.
Os dados sobre a percentagem média da área da folha lesada pelas lesmas foram transformados para ângulos antes da análise. Os resultados são indicados no Quadro 6.
Quadro 6. Percentagem angular média da área da folha lesada por lesmas por planta para os vários tratamentos no ensaio de campo (as avaliações foram feitas 6 semanas após a semeadura)
Tratamento Percentagem Angular Média Área Folha
Lesada Por Planta Não tratadas Dose nemátodos 1 X io8 por ha Dose nemátodos 3 X 108 por ha Dose nemátodos 1 X 109 por ha Dose nemátodos 3 X 109 por ha Dose nemátodos 1 X 101 por ha Metiocarb 31,82 29,15 28,87 22,11 18,63 16,49 25,17 S.E.D.=3,395, (24 d.f.)
Verificaram-se diferenças significativas na área da folha lesada por lesmas entre tratamentos (P<0,001) com plantas tratadas com as três doses de nemátodos mais elevadas apresentando lesão pelas lesmas significativamente menor (P=<0,01) do que as plantas das pequenas porções de campo não tratadas. As plantas das pequenas porções de campo tratadas com a dose mais elevada de nemátodos apresentava lesões por lesmas significativamente menores (P<0,05) do que as plantas das pequenas porções de campo tratadas com metiocarb. Assim os nemátodos são capazes de proporcionar um bom controlo da lesão sub-letal por lesmas. 35
Exemplo 12. A capacidade dos nemátodos Phasmorhabditis monoxéni-cos para matar o caracol aquático Lymnaea stagnalis
Nemátodos monoxénicos foram produzidos em associação com M. phenylpyruvica estirpe 48 tal como é descrito no Exemplo 5 e formulados em argila, tal como é descrito no Exemplo 7, sob a forma de um pó dispersível na água contendo aproximadamente 0,36 g x 10 nemátodos por grama (peso húmido). Dez exemplares do caracol aquático Lymnaea stagnalis foram adicionados a cada um de cinco tanques sem peixe que se encontravam meio cheios com água de reservatório contendo algumas plantas aquáticas que serviram de fonte alimentar para os caracóis. Os tanques foram arejados usando uma pequena bomba de ar e mantidos a 15%C. A cada um dos quatro tanques foram adicionados aproxi- g madamente 6 x 10 nemátodos sob a forma de formulação em pó dispersível na água. Os nemátodos foram adicionados ao quinto tanque que serviu de controlo. Após três dias de incubação, a mortalidade média dos caracóis nos tanques tratados com nemátodos foi de 45%, subindo para 100% após seis dias. Não se verificou mortalidade no tanque de controlo não tratado após seis dias de incubação.
Lisboa, 9 de Julho de 1992
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